UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

CENTRO DE TECNOLOGIA - CTEC

ENGENHARIA QUÍMICA

Marília Inês Oliveira Belo

FERMENTAÇÃO SUBMERSA PARA PRODUÇÃO DE LIPASES POR A. niger E

DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Maceió – AL

2018

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 MARÍLIA INÊS OLIVEIRA BELO

FERMENTAÇÃO SUBMERSA PARA PRODUÇÃO DE LIPASES POR A. niger E

DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Relatório apresentado à disciplina

Laboratório de Engenharia Química II, do
curso de Engenharia Química da
Universidade Federal de Alagoas, como
requisito avaliativo para a mesma.

Orientador: Professor Dr. Jorge José de

Brito Silva

Maceió – AL

2018

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 RESUMO

As enzimas são amplamente utilizadas em diferentes indústrias, desde sua

aplicação como catalisadores biológicos de reações, quanto em tantas outras
aplicações nos mais variados setores industriais. Assim, desenvolver um processo de
fácil obtenção de enzimas é de extrema importância econômica. Dentre os métodos
que podem ser citados estão as fermentações – submersas ou sólidas – utilizando
como inóculo fungos ou bactérias. Neste relatório, descrevem-se os resultados da
fermentação submersa para obtenção da enzima lipase a partir do fungo Aspergillus
niger.

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 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO............................................................................................................... 5
2. OBJETIVOS .................................................................................................................. 8
3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................. 8
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................ 10
5. CONCLUSÕES............................................................................................................ 12
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 13

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1. INTRODUÇÃO

A lipase é uma enzima da classe das hidrolases, que catalisam reações de

hidrólise, assim como a sacarase. Enzimas são responsáveis por alterar, conduzir e
regular quase todas as reações químicas das células vivas, estimando-se que, na
natureza, possam existir cerca de dez mil enzimas diferentes. Apesar da variedade,
todas elas atuam como catalisadores biológicos de reações distintas, convertendo
reagentes em produtos rapidamente, sem que elas mesmas sofram qualquer
alteração (RENNEBERG, 2008).

As enzimas são amplamente utilizadas em diferentes indústrias. Por exemplo,

as amilases são usadas na produção de xaropes, papéis especiais e na produção de
glicose a partir de amido. A sua produção, por exemplo, foi a primeira a receber uma
patente. Lipases, por sua vez, têm grande interesse industrial devido à diversidade de
suas propriedades, vasta aplicação e facilidade de produção, sendo ativas em
condições brandas de temperatura e reduzindo a formação de produtos indesejáveis,
devido a sua especificidade (TORTORA, FUNKE, CASE; 2012). Na tabela 1 estão
dispostas algumas aplicações comerciais das lipases, de acordo com o setor, produto
obtido e função que desempenham no processo produtivo:

Tabela 1: Aplicações comerciais de lipases.

Setor Função Produto

Alimentício Laticínios Hidrólise da gordura do Agente
leite aromatizante para
manufatura de
produtos lácteos
Panificação Melhoria do sabor e Confeitos e bolos
qualidade, prolongamento
do tempo de prateleira
Bebida Melhoria do aroma e Bebidas alcoólicas
aceleração da
fermentação, por remoção
de lipídeos
Processamento de Melhoria da qualidade do Maionese, molhos
derivados do ovo ovo por hidrólise dos e cremes
lipídeos
Processamento de Transesterificação de Óleos e gorduras
óleos óleos naturais, hidrólise de modificadas
óleos

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 Processamento de Desenvolvimento de Produtos
carnes aroma e remoção de embutidos
excesso de gorduras
Químico Química fina Síntese de ésteres Ésteres
Farmacêutico Digestão de óleos e Lipídeos especiais,
gorduras de alimentos agentes digestivos
Detergentes Remoção de manchas de Detergentes
óleo e gorduras
Cosméticos Remoção de lipídeos Cosméticos em
geral
Curtume Remoção de gorduras das Produtos de couro
peles dos animais
Papel Hidrólise de lipídeos Papel de melhor
qualidade
Diversos Decomposição e remoção Limpeza de
de substâncias oleosas tubulação e
tratamento de
efluentes.
Fonte: Murici, 2012.

Quanto à obtenção desse tipo de enzimas, as lipases eram obtidas a partir do

pâncreas de animais, mas a dificuldade em conseguir o material por esta via fez com
que formas de produção a partir de microrganismos fossem desenvolvidas.
Atualmente, a maioria das lipases são obtidas utilizando-se fungos e bactérias, sendo
mais usadas devido à grande variedade de propriedades, altos rendimentos
alcançados, facilidade de manipulação genética, estabilidade e fornecimento regular.
Neste sentido a produção realizada por fungos é considerada a melhor, sendo a mais
usada industrialmente, pelo fato de a produção ser extracelular, o que facilita a
extração do meio de fermentação. São fungos produtores de lipases Aspergillus niger,
Rhizopus arrhizus, Antrodia cinnamomea e Penicillium restrictum (MURICI, 2012).

A produção das lipases depende da concentração das fontes de carbono e

nitrogênio, concentração do inóculo, temperatura, pH, condições de agitação e
aeração, entre outras variáveis, podendo ser realizada por fermentação submersa –
caracterizada pelo meio de cultura líquido, com nutrientes solúveis, favorecendo o
controle de alguns dos parâmetros acima mencionados – ou em meios semissólidos
ou sólidos – que envolvem o crescimento e metabolismo dos microrganismos em
substratos com baixas concentrações de água, apresentando diversas vantagens em
relação à fermentação submersa, como baixo custo operacional e maiores
rendimentos. Além disso, atenção especial deve ser dada às condições de

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temperatura e pH, visto que grande parte das enzimas tem pH de operação na faixa
de 4 a 9, sob temperaturas de até 70°C (MURICI, 2012).

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2. OBJETIVOS

Realizar fermentação enzimática submersa com Aspergillus niger e determinar

a atividade enzimática, observando os fatores que exercem influência, como pH,
temperatura ótima e tempo de reação.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Materiais:

• Agitador;
• Água;
• Aspergillus niger;
• Banho termostático;
• Boneca;
• Canudo de plástico;
• Erlenmeyer;
• Fenolftaleína;
• Gazes;
• Goma arábica 7%;
• KOH 0,04M;
• Meio de cultivo para produção de lipases (composição na tabela 2);
• Óleo vegetal;
• Pipetas;
• Recipientes de plástico com tampa;
• Solução de acetona, álcool etílico e água (1:1:1);
• Solução tampão fosfato de sódio (0,1M – pH 7,0).

Tabela 2: Composição do meio de cultivo para produção de lipases.

Composição do meio de cultivo para produção de lipases

Extrato de levedura 10,0g/L
Óleo vegetal como indutor 10,0g/L
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(NH4)2SO4 10,0g/L
NaNO3 1,00g/L
KH2PO4 monobásico 5,00g/L
MgSO4.7H2O 0,50g/L
H2SO4 para ajuste de pH na faixa 5,5 – 6,5
Fonte: Notas de aula – Laboratório de Engenharia Química 2, 2015.

3.2. Métodos:

• Com o auxílio de um canudo de plástico, transferir parte da cultura de

Aspergillus niger para um Erlenmeyer contendo o meio de cultivo para
produção de lipases;
• Fechar o Erlenmeyer com a boneca e colocá-lo no agitador, a cerca de 100
rpm/min;
• Realizar a coleta de 10mL da amostra em fermentação a cada 24h, por 3 dias,
filtrando este volume com gaze para um recipiente plástico com tampa,
armazenando-o na geladeira para posterior análise;
• Para cada coleta realizada e também para o material do Erlenmeyer (que
permaneceu em fermentação no agitador), proceder (em duplicata) com a
determinação de atividade lipolítica, realizando as seguintes operações:
o Misturar, num Erlenmeyer, 5 mL de substrato preparado a partir da
emulsão de água, óleo vegetal e goma arábica a 2mL do tampão fosfato
de sódio e 2mL do meio fermentado (extrato enzimático que foi coletado
e o que permaneceu no agitador);
o Manter a mistura em banho termostático a 38°C, sob agitação constante
de 82 rpm, por cinco minutos;
o Após os cinco minutos, interromper a reação da mistura, adicionando
2mL da solução acetona, álcool etílico e água 1:1:1;
o Titular o material obtido com solução padronizada 0,04M, usando
fenolftaleína como indicador;
o Usar o volume de titulação para o cálculo da atividade enzimática.
• Realizar a titulação de branco, procedendo com os mesmos passos anteriores,
substituindo o extrato enzimático por água destilada.

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4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

A atividade enzimática pode ser calculada através da equação 1, na qual a

razão 𝑈⁄𝑚𝐿 equivale a 1 𝜇𝑚𝑜𝑙⁄𝑚𝐿 ∗ 𝑚𝑖𝑛; 𝑉𝑎 é o volume da amostra titulada, em mL;
𝑉𝑏 é o volume do branco titulado; 𝑉𝑐 , o volume da amostra titulada, 𝑁 é a normalidade
da solução de KOH e 𝑡, o tempo de reação enzimática, em minutos:

𝐴𝐸 (𝑈⁄𝑚𝐿) = (𝑉𝑎 − 𝑉𝑏 ) × 𝑁 × 1000/ (𝑡 × 𝑉𝑐 ) (1)

Na tabela 3 estão dispostos os dados obtidos para cada coleta, após 1, 2, 5 e
7 dias de fermentação.

Tabela 3: dados das coletas de extrato enzimático.

Tempo de fermentação Volume da amostra Volume da amostra Média do volume

submersa titulada (mL) – titulada (mL) – titulado (mL)
Duplicata 1 Duplicata 2
1 dia 3,0 3,0 3,0
2 dias 3,9 3,2 3,55
5 dias 3,0 2,8 2,9
7 dias 3,2 3,1 3,15
Fonte: Autor, 2018.

Sendo o tempo de reação enzimática igual a cinco minutos e os volumes de

amostra iguais a 9 mL (5 mL de substrato + 2 mL do tampão fosfato de sódio + 2 mL
do extrato enzimático) e sabendo que o volume do branco titulado correspondeu a
2,45 mL, a atividade enzimática – considerando como volume titulado a média dos
volumes das duplicatas – é dada pelos valores da tabela 4:

Tabela 4: atividade enzimática média.

Tempo de fermentação Atividade enzimática

submersa (U/mL)
1 dia 0,49
2 dias 0,98
5 dias 0,4
7 dias 0,62
Fonte: Autor, 2018.

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 Os valores obtidos de atividade enzimática demonstram que houve maior ação
das enzimas produzidas nos ensaios com extrato enzimático obtido após 2 e 7 dias
de fermentação submersa. Esperava-se que os maiores valores correspondessem
aos maiores tempos, mas os resultados foram bastante dispersos, levando a crer que
isto se deva à coleta de um extrato com concentrações de enzima não uniformes ou
a erros de identificação do ponto de virada da titulação na etapa final de determinação
de atividade enzimática.

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5. CONCLUSÕES

De acordo com os cálculos de atividade enzimática realizados, pode-se concluir

que houve produção enzimática via fermentação submersa com Aspergillus niger,
embora os valores para tal atividade não tenham demonstrado o padrão esperado.
Assim, a fermentação submersa com este fungo filamentoso se mostra uma
alternativa viável para produção da enzima lipase, a qual pode desempenhar diversas
e importantes funções, dentre elas a de ser um catalisador reacional.

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 REFERÊNCIAS

MURICI, L. N. M. Produção e caracterização de lipase de Aspergillus niger

obtida por fermentação no estado sólido utilizando resíduos da agroindústria.
UFRRJ. Rio de Janeiro, 2012. Disponível em
<https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/79531/1/Tese-LiviaNolasco-
Monica.pdf>. Acesso em 30/09/2018.

RENNEBERG, R. Biotecnologia para principiantes. Reverté. Barcelona, 2008.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 10ª edição. Artmed.

Porto Alegre, 2012.

Universidade Federal de Alagoas. Notas de aula – Laboratório de Engenharia

Química 2. Maceió, 2015.

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