INTRODUÇÃO

A técnica de diluição do número mais provável (NMP) é empregada para estimar o número de
microrganismos de uma amostra a partir de respostas onde os resultados são reportados
como positivos ou negativos em única diluição ou para diluições múltiplas em tabela que
foram previamente calculadas estatisticamente.
Suas principais aplicações são a contagem de coliformes totais, coliformes fecais e E.Coli em
água e alimentos (SILVA et al, 2007).
A técnica NMP como qualquer outra técnica, está sujeita a varias fontes de erros.

OBJETIVO

O objetivo do presente trabalho é aplicar a técnica do número mais provável (NMP) na

detecção de coliformes totais e fecais (E.Coli) em uma amostra de água coletada no bebedouro
da granja do IFRS - Campus Bento Gonçalves.

REVISÃO BIBLIOGRAFICA

Técnica de diluição idealizada por McCrady (1915), onde se faz uma estimativa da densidade
média dos microrganismos na amostra.
Segundo a Instrução Normativa Nº 62, DE 26 de agosto de 2003, define a técnica do número
mais prováveis como um método que permite estimar a densidade de microrganismos viáveis
presentes em uma amostra sob análise.
A técnica do número mais provável é um método de análise quantitativo que permite
determinar o número mais provável (NMP) do (s) microrganismo(s) alvo na amostra, através
da inoculação de alíquotas dessa amostra em uma séria de tubos, contendo um meio de
cultura líquido adequado ao seu crescimento (SILVA et al, 2007).
A determinação do número de microrganismos é baseada no princípio de que, subdividindo a
amostra em alíquotas, algumas alíquotas vão conter microrganismos e outras não,
dependendo da quantidade dos microrganismos na amostra. O número de alíquotas com
microrganismos (tubo com crescimento positivo após a incubação) e alíquotas sem
microrganismos (tubos com crescimento negativo após a incubação) permite estimar, por
cálculo de probabilidade, a densidade original dos microrganismos na amostra. Essa aplicação
da teoria da probabilidade depende de que os microrganismos estejam distribuídos ao acaso e
homogeneamente por toda a amostra. No caso de amostras líquidas, essa condição pode ser
atingida sem dificuldade, através da cuidadosa agitação do material. No caso de amostras
sólidas pode ser atingida no preparo e homogeneização da primeira diluição, tomando-se as
alíquotas a partir dessa diluição. HHHHá situações em que as alíquotas da amostra sólida são
inoculadas diretamente no caldo de cultura. A inoculação direta das amostras sólidas,
entretanto, é menos comum e depende do tipo de amostra (SILVA et al, 2007).
Como a inoculação é feita em meios líquidos, a técnica do NMP apresenta algumas vantagens
em relação à contagem padrão em placas. Uma delas é a possibilidade de inocular quantidades
maiores da amostra, aumentando-se proporcionalmente o volume de meio de cultura. Isso
confere a técnica umasensibilidade maior do que a da contagem em placas e em grande
flexibilidade no estabelecimento do limite de detecção. Outra vantagem é que permite a
introdução de etapas de recuperação de injurias, utilizando um meio não seletivo para a
inoculação inicial, mais favorável aos microrganismos injuriados, e depois transferindo a
cultura para meios seletivos (SILVA et al, 2007).
A técnica do NMP é bastante versátil, permitindo a enumeração de diferentes grupos ou
espécies de microrganismos, variando-se o meio de cultura e as condições de incubação(SILVA
et al, 2007). Ela pode detectar microrganismos que turvam o meio, que produzem gás, ácido
ou base, etc.
Suas principais aplicações são a contagem de coliformes totais, coliformes fecais e E. coli em
água e alimentos. Pode também ser utilizada em outros ensaios quantitativos, quando a
contaminação esperada na amostra está abaixo do limite de detecção do plaqueamento ou
quando partículas do alimento interferem na contagem em placas. Outra aplicação é a
adaptação de métodos qualitativos para quantitativos, como a contagem de Salmonella,
Listeria Monocytogenes e outros microrganismos tradicionalmente analisados por métodos de
presença/ ausência (SILVA et al, 2007).
Para a inoculação, a técnica do NMP apresenta dois formatos dependendo de como as
alíquotas são distribuídas. Um é o formato do teste de diluição múltipla, no qual três cinco ou
dez alíquotas de uma diluição são inoculadas numa série de três, cinco ou dez tubos e, depois,
uma nova séria de três, cinco ou dez alíquotas, da diluição subseqüente, são inoculadas em
outra séria detubos e assim por diante. Quanto maior o número de diluições e de tubos por
diluição, maior a precisão da contagem. Para a maioria das situações encontradas nas análises
de alimentos três diluições são suficientes para uma boa estimativa do NMP. O outro formato
é o teste de diluição única que é mais utilizado para amostras com baixo nível de
contaminação, para as quais não há necessidade nem se justifica a preparação de diluições.
Uma de suas principais aplicações são a contagem de coliformes em água tratada e em sucos e
refrigerantes (SILVA et al, 2007).
O grupo dos coliformes totais inclui as bactérias na forma de bastonetes Gram negativos, não
esporogênicos anaeróbios facultativos, capazes de fermentar a lactose com produção de gás,
em 24 a 48 horas a 35°C. O grupo inclui cerca de 20 espécies, dentre as quais encontram-se
tanto bactérias originarias do trato gastrintestinal de humanos e outro animais de sangue
quente, como também diversos gêneros e espécies de bactérias não entéricas, como Serratia e
Aeromona , por exemplo. Por essa razão, sua enumeração em água e alimentos é menos
representativa, como indicação de contaminação fecal, do que a enumeração de coliformes
fecais ou E.Coli (SILVA et al, 2005).
O grupo de coliformes fecais ou coliformes termotolerantes tem a mesma definição de
coliformes totais, porem, restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com
produção de gás, em 24 horas a 44,5- 45,5°C. Essa definição objetivou, em principio, selecionar
apenas os coliformes originários do trato gastrintestinal. Atualmente sabe-se, entretanto, que
o grupo doscoliformes fecais inclui pelo menos três gênero, e Escherichia, Enterobacter e
Klebsiella , dos quais dois (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas de origem não fecal. Por
esse motivo, a presença de coliformes fecais em água e alimentos é menos representativa,
como indicação de contaminação fecal, do que a enumeração direta de E.Coli, porém, muito
mais significativa do que a presença de coliformes totais, dada a alta incidência de E.Coli
dentro do grupo fecal. Cerca de 95% dos coliformes existentes nas fezes humanas e de outros
animais são E.coli ( SILVA et al, 2005).
A portaria Nº 518 de 25 de março de 2004 estabelece os procedimentos e responsabilidade
relativo ao controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de
potabilidade, onde deve apresentar ausência de coliformes fecais (termotolerantes) e totais
em 100 ml de água.
A técnica de enumeração de microrganismos por NMP inclui as seguintes etapas analíticas:
a) Teste presuntivo (leitura dos resultados obtidos na série de tubos múltiplos). Recupera
células injuriadas.
b) Teste confirmatório (subcultivo dos tubos positivos do teste presuntivo em caldo de maior
impediência ou em ágar seletivo diferencial para o microrganismo pesquisado).
c) Teste completo identificação bioquímica da (s) espécie (s) microbiana (s) presente(s).
Para aplicar a técnica NMP e determinar fecais (E.Coli) no teste presuntivo utiliza-se o caldo
lauril triptose (caldo LST) que possibilita a recuperação de células injuriadas e permite uma
adaptação inicial as condições restritas que selecionam os coliformestotais, capazes de
fermentar a lactose com produção de gás (capturado nos tubos de Duran), quando incubadas à
35-37°C, por 48 horas. No teste confirmativo, se tem a confirmação de coliformes fecais,
utiliza-se o caldo lactosado bile verde brilhante (caldo VBBL) com crescimento de gás
(capturado nos tubos de Duran) quando incubados á 35ºC, por 24 á 48 horas. E por fim, o teste
completo utiliza-se o caldo EC, onde os microrganismos continuam fermentando a lactose com
produção de gás (capturado nos tubos de Duran), quando incubados a temperatura de 44,5-
45,5°C por 24 horas tendo como objetivo a E.Coli.
Para determinar os microrganismos produtores de gás através da técnica NMP os tubos
positivos são aqueles que formam uma bolha de gás no tubo de Duran que este, está invertido
dentro do tubo de ensaio como mostra na figura 1. Entretanto, na leitura final do NMP
deverão ser consideradas somente as 3 diluições mais significativas.

Figura 1: tubo positivo

[pic]

A concentração de coliformes totais é relacionada com a qualidade higiênica dos alimentos,

sendo altas concentrações indicativas de limpeza e higienização deficientes, tratamento
térmico ineficiente. Já uma alta concentração de coliformes fecais indica contaminação de um
alimento com matéria de origem fecal, já que assuma-se que haja um alto percentual de E.Coli
dentre os coliformes fecais.
A combinação de tubos negativos e positivos na técnica do NMP permite estimar, por cálculo
de probabilidade, a densidade do (s) microrganismo (s) alvo naamostra. Os cálculos podem ser
feitos usando várias fórmulas, mas, para as combinações de tubos positivo e negativos que
ocorrem com mais freqüência, os valores já foram calculados e tabulados em tabelas de NMP,
não sendo necessário o uso de fórmulas (SILVA et al, 2007).

MATERIAIS E MÉTODO
MATERIAIS
← Estufa a 35°C
← Bico de Bunsen
← Pissetas com álcool 70% iodado
← Algodão
← Tubos de Duran (um para cada tubo de ensaio)
← 9 tubos de ensaio contendo 10 ml de caldo LST
← Pipetas de 10 ml

MEIOS DE CULTURA
← Caldo Lauril Sulfato Triptose (caldo LST)

DESCRIÇÃO DA AMOSTRA
Água coletada por alunos e funcionários no bebedouro da granja do Instituto Federal do Rio
Grande do Sul – Campus Bento Gonçalves.

METODOLOGIA
Teste presuntivo
← Homogeneizou-se a amostra
← Colocou-se 10 ml da amostra nos 9 tubos que contêm o caldo LST
← Incubou-se a 35°C durante 48 horas
← Decorrido o tempo de incubação separar os tubos positivos, ou seja, que apresentarem gás
no interior do tubo de Duran.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise de contagem de microrganismos pelo número mais provável teve de amostra a água
do bebedouro da granja. Em que foi feito por diluição única, pipetando-se 10 ml da amostra
para cada tubo (9 tubos) com caldo LST e posterior incubação a 35°C, onde depois de 24 horas
tivemos a primeira leitura, onde não apresentou formação de gás e turvamento em nenhum
dos tubos. Depois de 48 horas fizemos a segunda leitura tendo como resultado negativo (sem
formação de gás eturvamento nos tubos). Sendo assim, não prosseguindo com o teste
confirmativo e o completo.
Portanto, podemos afirmar que segundo a técnica de NMP a água do bebedouro da granja não
possui coliformes totais, tendo como resultado negativo, sem formação de gás, ou seja, nos
tubos de Duran não houve formação de bolhas de ar.
O resultado encontrado foi o esperado, pois sabemos que na granja não tem ou não teve
surtos de infecção, intoxicação ou toxinfecção por coliformes.

CONCLUSÃO

A determinação do número de microrganismos presentes em um alimento pode ser feito pela

técnica do número mais provável (NMP) que se pode obter informações sobre a população
presuntiva (teste presuntivo), real (teste confirmativo) e a verdadeira espécie (teste completo)
de microrganismos.
A técnica NMP para determinar coliformes (formadores de gás), foi considerada eficiente na
análise da água, onde não foi detectado coliformes totais, sendo assim passando apenas pelo
teste presuntivo.