MÉTODOS DE ANÁ

ANÁLISES
MICROBIOLÓ
MICROBIOLÓGICOS
PARA CONTROLE DE
QUALIDADE DE
ALIMENTOS
Controle
Controle de
de Qualidade
Qualidade na
na indústria
indústria Alimentos
Alimentos
USFM-
USFM- 19/09/2009
19/09/2009

Msc. Vania Tronco

VERUS SEGURANÇA AMBIENTAL E ALIMENTAR

ESCOLHA DOS MÉTODOS
MÉTODOS

DE ANÁLISES
ANÁLISES
FERRAMENTAS
FERRAMENTAS PARA
PARA GARANTIR
GARANTIR A
A

QUALIDADE
QUALIDADE DA
DA SUA
SUA PRODU ÇÃO
PRODUÇÃO
 ANÁ
ANÁLISES
MICROBIOLÓ
MICROBIOLÓGICAS SÃO
FUNDAMENTAIS PARA:
- segurança alimentar

- qualidade geral dos alimentos produzidos

- medidas profiláticas

-comercialização no mercado internacional e

nacional
 EFICIÊNCIA E
RAPIDEZ

medidas
medidas tomadas
tomadas na
na
hora
hora certa
certa

Garantia
Garantia de
de
resultados
resultados
 Conceitos básicos de prevenção e controle da
contaminação alimentar e doenças transmitidas
alimentos sugerem:

• Melhorar qualidade
higiênica de alimentos
crus (BPP ou BPA);
• BPF utilizando tecnologias
de processamento
adequadas;
• BP em toda a cadeia
alimentar.....
GAP - Boas Práticas Agrícolas
GMP - Boas Práticas de Fabricação
 SSOP /PPOH
(Sanitation Standard Operating Procedures )
PROCEDIMENTOS PADRONIZADOS DE
OPERAÇÃO DE SANITIZAÇÃO:
PRP - Programa de Redução de
Patógenos
 NOVOS MÉ
MÉTODOS PARA
ANÁ
ANÁLISES DE ALIMENTOS
1. simplificação dos tradicionais

2. atividade enzimática

3. atividade antigênica

4. moleculares

5. combinação
ESCOLHA DO MÉ
MÉTODO
DIAGNÓ
DIAGNÓSTICO
- capacidade física operacional

-volume de testes analíticos

- rastreabilidade

- validações internacionais, nacionais e

internas

-rapidez na liberação de resultados

-Capacidade e custo de estocagem

- custo / benefício
 M é to d o s R á p id o s
M é to d o
R á p id o

P o r q u e u tiliz a r?

E s c o lh a

A p ro v a ç ã o P ra tic id a d e S e n sib ilid a d e

S e le tiv id a d e R a p id e z
 Métodos rápidos:
• Vantagens em tempo de análise e liberação de
resultados analíticos
• Possibilidade de eliminar etapas de trabalho intensivo
• Potencial para automação
• Sempre cumprem com procedimentos de incubação
ainda necessariamente
• ELISA e PCR são dominantes
• Falta de um procedimento comum de validação
• A maioria apresenta dificuldade de aceitação para fins
oficiais
 Métodos rápidos:
• Avanços em Métodos de Contagens de células viáveis
• Miniaturização e Kits de Diagnóstico, Técnicas de
Identificação Bioquímica
• Métodos baseados em anticorpos
• Separação Imunomagnética
• Ensasios baseados em ácidos nucleicos
• Biosensores
• Microships
• Citometria de Fluxo
• Técnicas baseadas em Bacteriófagos
• ATP bioluminescência
• Bioluminescência adenilato quinase
• Riboprinter e Pulse-Field Gel Electroforese
Os Métodos Microbiológicos
podem ser divididos em:

“tradicionais”
(“convencionais”)

métodos rápidos
 IDENTIFICAÇÃO
BACTERIANA pode
ser feita por
avaliação
características
microbianas

FENOTÍPICAS
GENOTÍPICAS
 METODOLOGIAS
DISPONÍVEIS

FENOTÍPICAS - Metodologia tradicional

- Padrão ouro
O QUE CONSIGO - “Kits” prontos
VISUALIZAR ! - ELISA tradicional

- ELISA – kit visual

ou automatizado.
 Problemas com os métodos
tradicionais:

Sensibilidade insuficiente

Especificidade: nem sempre ocorre(podem
haver falsos negativos)

Repetibilidade: nem sempre se o teste for
repetido por um mesmo operador inúmeras
vezes se obtém o mesmo resultado

Reprodutibilidade: capacidade de gerar
resultados estatísticamente iguais (nem
sempre ocorre)
 Métodos convencionais:
• Os métodos convencionais usam a cultura de
microrganismos em placas contendo ágar

• São laboriosos e consomem muito tempo

operacional

• 84% de todos os testes são baseados na

contagem de células viáveis

• Requerem controle de agências regulatórias

nacionais e internacionais para controle oficial
 Depende da integridade fisiológica bacteriana

- Injúria, alterações - processamento;

- Controles - meios de cultura, pessoal e
equipamentos e tempo.

TRADICIONAL –
limitações prováveis:
 L
I
TRADICIONAL M
I
- Quantidade/qualidade T
A
- provas bioquímicas; Ç
Õ
- Padrão de decisão E
S
- Chaves dicotômicas

MULTIPLICIDADE
DE ETAPAS
 L
I
Dependendo do no. de análises: M
I
- perigo de contaminação cruzada; T
- muitas etapas a serem validadas; A
Ç
- limitada área física e pessoal. Õ
E
S

TRADICIONAL
 BIOINDICADORES - KITS
- maior no. análises/dia
- diminuição de etapas validadas
- menor perigo de contaminação
- devem ser aprovados/validados

TRADICIONAL
 Métodos rápidos alternativos como Técnica fluorogênica:
adiciona o MUG ( 4 metil umbeliferil beta-D-glucoronídeo):

• Através da enzima beta-glucoronidase (maioria

das cepas de E.coli) o MUG é transformado em
uma umbiliferona fluorescente quando observada
na luz ultravioleta de onda longa (após 24 hs)

• Aplicação prática: esta determinação é

fundamental na avaliação da condição higiênica
do processamento de alimentos( a técnica
tradicional tubos(NMP) muito lenta pode
durar até 5 dias!
 Métodos para Contagens de
microrganismos:baseados na multiplicação
microbiana

• Método tradicional (plaqueamento);

• Método de plaqueamento em espiral;
• Placas Compact Dry;
• Placas de Petrifilm;
• Placas do Simplate;
• Métodos alternativos: para NMP (técnica
fluorogênica);
• Métodos alternativos: adição de substratos
cromogênicos:(adição de X-Gal, X-Gluc., Salmon.-Gal
no isolamento de microrganismos)
 Enzimas cromogênicas:
COMPACT
DRY revela características

específicos de um grupo,

gênero ou espécie.
Placas de Compact Dry:

- Prontas para uso

- Reduz as horas de trabalho.

- Permite aumento de produtividade e eficiência.

- Uso em análises de matérias primas ou produtos acabados como

alimentos, bebidas, carne e outros.

 VANTAGENS DO COMPACT
DRY
 Shelf life de 18 a 24 meses sem refrigeração.

 Atende às BPL - maior segurança por possuir tampa.

 A amostra se difunde sozinha e rapidamente pela placa, sem

necessitar de difusores ou outros instrumentos.

 Sem limite de empilhamento - menor espaço na incubadora.

 VANTAGENS DO COMPACT DRY
- Espaço tridimensional - excelente crescimento dos bolores e
leveduras.

- Facilidade para checar ou repicar as colônias - forma idêntica

ao que faria nas placas tradicionais.

- Rápida manipulação – sem etapas de preparação de meios

de cultura, esterilização de vidraria, etc.

- Manual traduzido em vários idiomas, inclusive português.

 DISPONIBILIDADE

Contagem
total TC

Bolores e
leveduras YM

Colif. totais
e E. coli EC

Coliformes
termotolerantes CF
O QUE POSSO ANALISAR?

Contagem
total TC

Bolores e
leveduras YM
O QUE POSSO ANALISAR?

Coliformes totais
e E. coli EC

Coliformes
fecais CF
 COMO ANALISAR?

As placas já
possuem tudo o que
você precisa!

É só abrir e adicionar 1mL da amostra ou da diluição e

incubar pelos tempos/temperaturas recomendados!
 Compact Dry TC
Para contagem total
de bactérias viáveis.

Resultados em
24 a 48 horas

Bactérias formam colônias vermelhas

 Compact Dry YM

Contagem de bolores
e leveduras.

Resultados em
3 a 5 dias

Leveduras formam colônias azuis ou verdes

 Compact Dry EC
Contagem de coliformes
totais e E. coli

Resultados em
24 horas

E. coli forma colônia azul

Coliformes totais formam colônias vermelhas
 Compact Dry CF
Contagem de coliformes
totais

Resultados em
18-24 horas

Coliformes totais formam colônias esverdeadas

APROVAÇÕES
Certificado Performance Tested Method AOAC:

- Compact Dry EC:110402

-Compact Dry CF:110401

-- Compact Dry TC: 010404

- Compact Dry YM:100401

 Monitoramento de Higiene

• Necessidade de se desenvolver métodos de

tempo real para monitorar procedimentos de
limpeza e higienização(detecção de resíduos de
matéria orgânica e ATP de células bacterianas

• Métodos devem ser baratos, robustos

• ATP bioluminescência
 Sistema detecta:

ATP residual em superfícies

A molécula de ATP pode ser encontrada em
células viáveis; células não microbianas
(sangue, carne..)

Sistema rápido para monitoramento de
higiene de processos produtivos na indústria
alimentícia

Sistema preventivo para tomada de medidas
rápidas e efetivas(resultado em tempo real)
 PRINCÍPIO DO TESTE

ESTABILIDADE !

TECNOLOGIA
DE
RECICLAGEM
 Mecanismo da reação

Luciferina (LH2)+ATP+Mg++______enzima
luciferase ____forma___complexo
ELH2+AMP+PP

Em presença de oxigênio temos:
oxiluciferina+AMP +CO2+ LUZ (medida com
Luminômetro)

• AMP (Adenosina Monofosfato)

• ATP( Adenosina Trifosfato)
• PP (Pirofosfato)
• ELH2 (complexo luciferase-luciferina-AMP)
LUMITESTER
REALIZANDO O TESTE

Passar o aplicador LuciPac

na superfície previamente definida
REALIZANDO O TESTE

Voltar o aplicador no tubo e injetar

o pino para abrir a cápsula dos reagentes.
REALIZANDO O TESTE

Agitar o LuciPac várias vezes para

que o líquido escoe .
REALIZANDO O TESTE

Colocar o LuciPac na câmara do

Lumitester, fechar a tampa.
ENTER
 LENDO O RESULTADO!

ENTER – LEITURA EM
10 SEGUNDOS !

Limiar 1 ou inferior A (aceito)

Limiar >1 e < 2 B (atenção)
Limiar 2 excedido C (rejeitado)
 RESUMINDO ...

LEITURA DOS
RESULTADOS !

10”
 Imunoensaios:

• ELISA (com tecnologias diversas),

Imunocromatografia

• Sistemas totalmente automatizados

• Novos anticorpos recombinantes e técnicas de

impressão molecular para melhorar a
sensibilidade e versatilidade
 ELISA KIT

FENOTÍPICAS

Devem possuir

APROVAÇÃO !
 ELISA - KIT
- Resultados - qualidade dos anticorpos;
- sensibilidade x especificidade;

- Relação quantitativa Ag x Ac – variabilidade;

- Nível de detecção – pode variar com o sorovar.

FACILITAM A ROTINA
TESTES DE TRIAGEM !
 ELISA - KIT

- Resultados devem ser confirmados;

- Versatilidade quanto aos alvos;

- Capacidade operacional compatível

com o número de análises necessárias.

- LIMITAÇÕES - falsos positivos??

Fundamento dos testes ELISA:
 REAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO
• ELISA: Ensaios Imunoabsorventes de Enzima Ligada

1. Se adiciona a amostra suspeita

2. Ac primários não são facilmente removíveis da fase

sólida

3. No caso de ser positiva, os Ag ficam presos aos Ac

primários fixados

4. Ac primários selecionados se fixam

5. Se adicionan Ac secundários marcados com enzima

contra Ag buscados

6. Os Ac secundários se unen ao AG

7. Se libera substrato complementar a enzima

8. Se o conjugado se formou, reage com o substrato por

colorimetría
 Lateral Flow
System para
Listeria, Salmonella
e E.coli O 157
LFS™ Listeria sp
DuPont

Resultados em 40
a 42 horas.
 LFS™ Listeria sp – minimize

etapas com confiabilidade

a
eri
List
Amostra +
Adicione

LFS
meio LFS Ferva
a fita
c/ em BM
LFS e
suplemento
por 5
aguarde
minutos.
. 10 min.

Adicione Retire a
(-)
Incube fita e
a

eria
ia
a 30ºC - realize

ter
amostra (+)

List
Lis
LFS

LFS
40 – 48 ao tubo. a
leitura.
horas.
LFS™ E. Coli O:157
rapidez na triagem

Resultado em 8 a
18 horas
 LFS™ E. Coli O157
resultados em 8 hs

a
eri
List
Ferva

LFS
Pese a Adicione
amostra em BM a fita
no meio por 5 LFS no
LFS. minutos. tubo

Incube Adicione Após 10

a 42ºC 0,5mL ao min.
por 8 a tubo de realize a
prova. leitura.
18 hs.
 LFS™
Salmonella

Resultados em
27 horas
 LFS™ Salmonella

Amostra + Adicione Ponha a

o meio 1mL do
fita LFS
LFS TT Hajna
no tubo.
ao tubo.

Incube Após 10
Repique
a 42oC / 1mL em TT min
realize a
8 a 18 Hajna, -19
leitura.
hs. hs/42oC
Teste de ELISA (lateral flow system):
 MÉTODOS
GENOTÍPICOS

- Segurança e rapidez nos resultados.

- Disponível para patógenos e bioindicadores.

 METODOLOGIAS
DISPONÍVEIS

GENOTÍPICAS

- PCR tradicional
EFICIÊNCIA NA
- PCR automatizado
DETECÇÃO !
- PCR “real time”
 GENOTÍPICOS – PCR tradicional
- Dependente da seleção e qualidade do “primer”
- Necessidade de otimização das reações;
- Muitas e delicadas etapas.

INCOMPATÍVEL COM A
ROTINA DE UMA INDÚSTRIA
 - Mão de obra especializada; ambiente adequado;

- Perigo de contaminação.

GENOTÍPICOS
PCR
tradicional
 BAX SYSTEM

AUTOMATIZADO

UM MUNDO DE INOVAÇÕES
TECNOLÓGICAS DISPONÍVEL
PARA A GARANTIA DOS
ALIMENTOS !
BAX – PCR automatizado
Qualitativo /Quantitativo

- “Primers” já testados e validados;

- Aprovações e validações.
PESQUISAS CONSTANTES GARANTINDO DIFERENÇAS

TECNOLÓGICAS !

FACILITA A ROTINA
E DIMINUI INTERFERÊNCIAS !
BAX System®

Método de PCR para

análises de patógenos
 BAX® SYSTEM

Detecção de DNA ou RNA

• PCR automatizado
• PCR em tempo real

EFICIÊNCIA NA
DETECÇÃO !
 METODOLOGIAS
DISPONÍVEIS

GENOTÍPICAS

- PCR tradicional
EFICIÊNCIA NA
- PCR automatizado
DETECÇÃO !
- PCR “real time”
BAX® SYSTEM

• “Primers” testados e validados;

• Aprovações e validações.
• PESQUISAS CONSTANTES
GARANTINDO DIFERENÇAS
TECNOLÓGICAS !

FACILITA A ROTINA
E DIMINUI INTERFERÊNCIAS !
 BAX® SYSTEM
POUCAS ETAPAS = MENOR no. DE CONTROLES E
VALIDAÇÕES INTERNAS

ETAPAS
- Pré-enriquecimento;

- Extração do DNA;

- Amplificação;

Resultados rastreáveis
Método automatizado e simplificado

•1. Prepare o DNA

•2. Amplifique o DNA

•3. Detecte o DNA

O que acontece com os tubos no
Bax®?
 INTRODUÇÃO
- O que é PCR?
Reação em Cadeia da Polimerase
Desenvolvido em 1983 por Kary Mullis.
Prêmio Nobel em Química – 1993;
Cópias idênticas de
determinada sequência de
DNA
 CONCEITOS - PCR

ANÁLISE
GENOTÍPICA
 CONCEITOS - PCR

Cópias identicas da sequência

de DNA alvo

ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA
TCCCAGAT

ATCTGCT
TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT
 PRIMER
• Sequência especifica - sequencia do DNA alvo;
• Regiões altamente conservadas.
ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA
TCCCAGAT

PRIMERS

ATCTGCT
TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT
 Como ocorre a reação?
Com o aumento da temperatura, a fita de
DNA se separa.

ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA
TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT

Aumento da
temperatura

ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA

TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT
 Como ocorre a reação?
Com a queda da temperatura, os primers
se ligam a fita de DNA complementar.

ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA
TCCCAGAT

Temperatura mais Baixa

ATCTGCT
TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT
 Como ocorre a reação?
Com o auxílio da Taq polimerase e os dNTPs a
cópia da fita é iniciada

ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA
TCCCAGAT
Polimerase de
T DNA

G C
C A
G
A

A dNTPs

C
C T
A
G
Iniciador
Polimerase de
DNA
ATCTGCT
TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT

Molécula de DNA en cuestión

 Amplificação
De uma molécula de DNA
obtém-se 02 moléculas idênticas!!

ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA
TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT

2 cópias exatas
da molécula de
DNA em
questão
ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA
TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT
 BAX® SYSTEM
Qualitativo /Quantitativo

- “Primers” já testados e

validados;

- Aprovações e validações.
PESQUISAS CONSTANTES
GARANTINDO DIFERENÇAS
FACILITA A ROTINA
TECNOLÓGICAS
E DIMINUI !
INTERFERÊNCIAS !
TRANSCRIPTASE
REVERSA - rRNA
 RiboPrinter® System
• Perfil genético Ribogrupo da bactéria ou
bolores e leveduras;
• Técnica “Southern Blot” resultados em 8hrs;
• Biblioteca Nacional – Lanagro / MAPA;
• Biblioteca atualizável – Mundial!
Como o RiboPrinter® System
Funciona
 COMO FUNCIONA:
• O DNA purificado sofre cortes
por ação enzimática ( EcoRI
ou PstI ou PvulI), neste
processo de preparação do
DNA.
• LISE – rompe a célula
• DESPROTEINIZAÇÃO– limpa
debris
• DIGESTÃO – enzima de
restrição (e.g., EcoRI) “corta”
DNA em fragmentos
específicos.
O QUE ACONTECE:
 COMO FUNCIONA:

• Os fragmentos de DNA
resultantes da ação enzimática
são separados (por peso
molecular) pelo processo de
eletroforese em gel de agarose
e transferidos para a membrana
(Southern Blot), onde sofrem
hibridização com a sonda de
hibridização fluorescente, a qual
seleciona os
fragmentos originários da ação
das enzimas de restrição.
 COMO FUNCIONA:
• Os fragmentos ficam fixados na
membrana e então a câmara
CCD registra a imagem da
membrana.
• É feita análise e interpretação
dos dados.
Imagem Digitalizada
RiboPrint® Patterns Demonstra
Claramente a Diferenciação
Identificação & Caracterização
 Resultados:
• Após 8 horas têm-se a
“impressão digital da bactéria”, sendo
possível identificar a real fonte de
contaminação, melhorar ação de
antibióticos mais específicos, fazer um
estudo completo e confiável da
taxonomia bacteriana e muito mais.
INDÚSTRIA ALIMENTOS NECESSITA MÉTODOS
MICROBIOLÓGICOS QUE SEJAM:

• Precisos
• Rápidos
• Fáceis de utilizar
• Flexíveis
• Confiáveis
• Econômicos
• Acompanhamento e
suporte técnicos
contínuos
 VANTAGENS DOS MÉTODOS
RÁPIDOS:

• Especificidade e
confiabilidade;
• Aprovações e aceitações
internacionais;
• Acompanhamento oficial
de desempenho;
• Rapidez e agilidade na
liberação de resultados!
VANTAGENS DOS MÉTODOS
RÁPIDOS:
• Facilitam a aplicação
das boas práticas de
laboratório;
• Diminuição do número
de etapas de trabalho;
• Diminuição do erro
analítico;
• Melhoria da qualidade
dos processos;
Não ter nenhum resultado é
melhor do que ter um
resultado errado

Nascimento (2005)
 OBRIGADA!

troncovm@terra.com.br

tecnologia@madasa.com.br

www.madasa.com.br