ULTRAFILTRAÇÃO DE PEROXIDASE DE FARELO DE

ARROZ: DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLAR LIMITE DA

MEMBRANA

G.V.Gautério1, D.S. Malta1, L. Reginatto1, J.G.Buffon1, S.J.Kalil1

1-Laboratório de Microbiologia e Biosseparações – Escola de Química e Alimentos – Universidade Federal do
Rio Grande – CEP: 96203-900 – Rio Grande – RS – Brasil, Telefone: 55 (53) 32935681– Fax: 55 (53) 3233-
8644 – e-mail: (dqmsjk@furg.br)

RESUMO – As peroxidases são enzimas amplamente distribuídas na natureza que catalisam reações
de óxido-redução de substratos orgânicos. Estas enzimas possuem diversas aplicações, e dependendo
do seu uso final é necessário que as mesmas sejam submetidas a processos de purificação. O objetivo
deste trabalho consistiu na concentração e purificação parcial de peroxidase de farelo de arroz por
ultrafiltração, bem como a determinação da massa molar limite da membrana mais adequada ao
processo. Para tal, ensaios utilizando membranas de 10 kDa e 30 kDa e extrato clarificado de
peroxidase foram realizados. As membranas de 10 kDa e 30 kDa apresentaram fatores de purificação
de 1,7 vezes e 1,8 vezes, respectivamente, e recuperação enzimática próxima a 100 %. No entanto, o
uso de membrana de 10 kDa possibilitou menor queda no fluxo de permeado (20,7 %), se mostrando
a mais adequada na concentração e purificação parcial de peroxidase por ultrafiltração.

ABSTRACT – Peroxidases are enzymes widely found in nature whose main function is to catalyze
redox reactions of organic substrates. Several applications are assigned to peroxidases, and
purification necessity of these enzymes is related to their end use. The goal of this work was the
concentration and partial purification of rice bran peroxidases by ultrafiltration, as well as the
determination of the most suitable molecular weight cutoff membrane to this process. Therefore,
assays using 10-kDa and 30-kDa membranes and clarified peroxidase extract were performed. The
10-kDa and 30-kDa membranes showed purification factor of 1.7-fold and 1.8-fold, respectively, and
enzymatic recovery near to 100 %. However, the lower drop in the permeate flux (20.7 %) was
observed for10-kDa membrane, proving to be the most suitable membrane for the concentration and
partial purification of peroxidase by ultrafiltration.

PALAVRAS-CHAVE: farelo de arroz, fluxo de permeado, oxidorredutases.

KEYWORDS: permeate flux, oxidoreductases, rice bran.

1. INTRODUÇÃO

Peroxidases (CE 1.11.1.X) são enzimas que catalisam a oxidação de vários substratos
orgânicos tendo o peróxido de hidrogênio e outros peróxidos como moléculas aceptoras de elétrons
(Mathé et al., 2010). Consideradas em sua maioria heme proteínas de massa molecular entre 30 kDa a
150 kDa, estas enzimas podem ser obtidas de vegetais, tecidos e secreções de mamíferos e micro-
organismos (Balasubramanian e Boopathy, 2013; Higara et al., 2001). Devido ao elevado custo das
peroxidases comerciais, estudos envolvendo a obtenção destas a partir de substratos agroindustriais
têm se tornado cada vez mais frequentes (Vetal e Rathod, 2014). O farelo de arroz, um coproduto do
beneficiamento do arroz, contém diversas enzimas incluindo as peroxidases, o que o torna uma fonte
potencial para a obtenção destas.
A capacidade oxidativa das peroxidases permite que estas sejam aplicadas em áreas como
biomédica, biotecnológica, ambiental, industrial e alimentícia, substituindo as técnicas convencionais
de oxidação química (Somtürk et al., 2014). No entanto, dependendo do seu uso final, é necessário que
estas enzimas sejam submetidas a processos de purificação. Dentre os processos aplicáveis à
purificação parcial de peroxidases tem-se a ultrafiltração, a qual se baseia no princípio da permeação
seletiva de solutos em membranas tendo a pressão mecânica como força motriz (Habert et al., 2006).
A ultrafiltração se destaca na purificação parcial de enzimas devido a sua seletividade, uso
de condições brandas de temperatura e pressão, e por não envolver mudança de fase ou uso de aditivos
químicos. Outras vantagens incluem baixo consumo de energia, facilidade de ampliação ou redução de
escala, e capacidade de integração a outros processos de separação (Saxena et al., 2009; Wibisono
et al., 2014). Para o melhor desempenho da ultrafiltração, é necessária a determinação de alguns
parâmetros operacionais, dentre os quais inclui a massa molar limite da membrana a ser utilizada.
Desta forma, este trabalho teve como objetivo concentrar e purificar peroxidases por ultrafiltração,
bem como determinar a massa molar limite da membrana mais adequada ao processo.

2. MATERIAL E MÉTODOS

1.1 Obtenção do extrato clarificado de peroxidase

A extração de peroxidase foi realizada a partir de farelo de arroz integral (granulometria
inferior a 0,425 mm) e tampão fosfato de sódio 40 mmol/L em pH 5,0, na proporção 1:10,
respectivamente. O extrato permaneceu sob agitação orbital a 100 rpm e 25ºC, durante 60 min. Após,
o extrato foi centrifugado (3300xg) a 4°C por 10 min, e filtrado em sistema a vácuo, tendo-se assim o
extrato clarificado de peroxidase (Feltrin, 2013).

1.2 Purificação e concentração de peroxidase por ultrafiltração

Sistema de ultrafiltração: A purificação e concentração de peroxidase por ultrafiltração foi
realizada em módulo de membrana com configuração do tipo convencional (dead-end). O módulo
possui volume útil de 160 mL, área efetiva de filtração de 0.0019 m² e agitação constante promovida
por barra magnética suspensa, de modo a simular o escoamento em fluxo tangencial. O gás utilizado
para operação do módulo foi o nitrogênio.
Seleção da massa molar limite da membrana: O uso de membranas de celulose regenerada
(Milipore®, Massachusetts, Estados Unidos) de 10 kDa e 30 kDa foi avaliado de modo a selecionar a
massa molar limite mais adequada ao processo de ultrafiltração, a qual permite a passagem de menor
quantidade de enzima para o permeado. Os ensaios consistiram na adição de 40 mL de extrato
enzimático clarificado de peroxidase ao módulo de ultrafiltração, sendo estes realizados a 25ºC e
pressão manométrica de 1,5 kgf/cm². Durante o processo, o volume de permeado foi registrado em
intervalos de tempo pré-determinados. A atividade enzimática de peroxidase (U/mL) e proteínas
solúveis (mg/mL) foram determinados na fração inicial, no retido sob a membrana (fração purificada)
e no permeado. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
Eficiência do processo de ultrafiltração: Para selecionar a membrana mais adequada à
ultrafiltração de peroxidase, o fator de purificação (vezes), recuperação enzimática (%), fator de
concentração de volume, fluxo de permeado (L/h.m2), rejeição da enzima pela membrana (%), fator de
retenção (atividade enzimática ou proteína solúvel) e fator de concentração (atividade enzimática ou
proteína solúvel) foram determinados, conforme as Equações 1 a 7, respectivamente.

(1)

( ) (2)

( ) (3)

(4)
t

pe
( ) (5)
p

pe
( ) (6)

( ) (7)

Onde Aep e Aei são as atividades específicas (U/mg) do extrato purificado e inicial,
respectivamente; Ap e Ai são as atividades enzimáticas (U/mL) do extrato purificado e inicial, nesta
ordem; Vp e Vi são os respectivos volumes (mL) do extrato purificado e inicial (40 mL); Vpe é o
volume de permeado (L); A é a área da membrana (m²); t é o tempo de operação (h); Ape é a atividade
enzimática (U/mL) da fração permeada; Ci e Cpe correspondem a atividade enzimática total (U) ou
proteína solúvel total (mg) do extrato inicial e da fração permeada, respectivamente; e Xp e Xi são as
respectivas atividade enzimática (U/mL), proteína solúvel (mg/mL) ou volume (mL) do extrato
purificado e inicial.

1.3 Determinações analíticas e tratamento dos resultados

Atividade enzimática de peroxidase: A atividade enzimática foi determinada conforme
Devaiah e Shetty (2009) com modificações. A 1 mL de extrato enzimático previamente diluído, foram
adicionados 1,5 mL de tampão fosfato de sódio 5 mmol/L em pH 5,5, 2 mL de água destilada, 0,5 mL
de solução de guaiacol 1% e 1 mL de peróxido de hidrogênio 0,08%. Logo após, a mistura reacional
foi levada a um banho termostático, onde permaneceu por 20 min a 25°C. Ao término da reação, a
transmitância foi lida em espectrofotômetro a 470 nm. Uma unidade da atividade da peroxidase (U)
representa a quant dade de enz ma que catal sa a ox dação de μmol de gua acol em m nuto
(coeficiente de absortividade do tetraguaiacol de 26600 L/mol.cm). A atividade específica (U/mg) foi
calculada pela razão entre a atividade enzimática (U/mL) e a proteína solúvel (mg/mL).
Determinação de proteínas solúveis: A concentração de proteínas solúveis foi determinada
segundo Lowry et al. (1951) utilizando albumina de soro bovino (BSA) como padrão.
Tratamento dos resultados: Os resultados foram tratados por análise de variância (ANOVA)
e teste t-Student, através do software Statistica (Statsoft®, Tulsa, Estados Unidos). A análise
estatística foi realizada considerando um nível de 95% (p<0,05) de confiança.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A escolha das membranas no presente trabalho se deve ao fato de que peroxidases extraídas
de vegetais possuem massa molecular entre 28 kDa e 60 kDa (Higara et al., 2011). Adicionalmente,
Feltrin (2013) e Gautério et al. (2015) verificaram que a peroxidase extraída de farelo de arroz
apresentou massa molecular próxima a 35 kDa. A Figura 1a apresenta os resultados obtidos para o
fator de purificação (FP) e recuperação enzimática (REC) para ambas as membranas avaliadas. Não
houve diferença significativa entre os parâmetros FP e REC para as membranas em estudo. Os baixos
valores de FP obtidos para as membranas de 10 kDa (1,7 vezes) e 30 kDa (1,8 vezes) podem estar
relacionados ao fato das proteínas contaminantes do extrato clarificado possuírem massa molar
semelhante à da enzima de interesse, ou ainda possuírem massa molar menor, mas serem retidas pela
membrana dinâmica formada pela camada de proteínas retidas na superfície da membrana.

Figura 1 – Membranas de celulose regenerada de 10 kDa e 30 kDa: (a) fator de purificação e

recuperação enzimática* (b) fluxo médio de permeado durante o processo de ultrafiltração.
5 120 15
Fator de purificação
A
Recuperação enzimática
A
100
4 12
Recuperação enzimática (%)
Fator de purificação (vezes)

80
Fluxo de permeado (L/h.m²)

3 9

60

2 a a 6
40

1 3
20
Membrana 10 kDa
Membrana 30 kDa
0 0 0
10 kDa 30 kDa 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Membrana Tempo (h)
*
Média de três valores ± desvio padrão. Letras minúsculas iguais para o fator de purificação e letras maiúsculas
iguais para a recuperação não diferem significativamente pelo teste t-Student (p<0,05).

A Tabela 1 mostra os fatores de retenção e concentração para as membranas de 10 kDa e

30 kDa. Para ambos os ensaios, o fator de retenção da atividade enzimática e o percentual de rejeição
da enzima pela membrana foram próximos a 1 e 100 %, nesta ordem, indicando que a peroxidase foi
retida sob ambas as membranas estudadas. Em relação aos valores obtidos para fator de concentração
de atividade enzimática, proteína e volume, os ensaios realizados com ambas as membranas
demonstram a eficiência do processo de ultrafiltração, principalmente quando o intuito é concentrar a
enzima de interesse antes ou após outros processos de purificação.

Tabela 1 – Fatores de retenção e concentração (atividade enzimática, proteínas e volume) e percentual

de rejeição para as membranas de celulose regenerada de 10 kDa e 30 kDa.
Membrana Fator de retenção* Fator de concentração* Rejeição (%)
Atividade Proteínas Atividade Proteínas Volume
enzimática enzimática
10 kDa 0,99a ±0,01 0,61a ±0,05 7,82a±1,08 4,60a±0,79 7,98a±1,35 99,9 ± 0,08
a a a a a
30 kDa 0,99 ±0,01 0,65 ±0,04 6,92 ±0,26 3,77 ±0,19 6,83 ±0,27 99,9 ± 0,10
*
Média de três valores ± desvio padrão. Letras iguais na coluna indicam que não há diferença significativa entre
as médias pelo teste t-Student (p<0,05).
 A Figura 1b apresenta o fluxo médio de permeado durante o processo de ultrafiltração. Nas
duas condições estudadas foi observada a queda do fluxo de permeado com o tempo de permeação,
comportamento este típico dos fenômenos de polarização de concentração e de incrustação da
membrana. Segundo Bacchin et al. (2006), a polarização por concentração se refere ao acúmulo de
solutos próximo à superfície da membrana, devido à sua rejeição pela barreira semipermeável,
causando a diminuição do fluxo de permeado. O fenômeno de incrustação de membrana pode ocorrer
devido à deposição de múltiplas camadas de soluto na superfície da membrana, resultando na
formação de uma camada gel e, consequentemente, na queda da força motriz para o transporte através
da membrana. Em membrana de 10 kDa, o fluxo médio variou entre 9,1 a 7,2 L/h.m², enquanto que
em membrana de 30 kDa esta variação foi de 10,1 a 6,9 L/h.m². A redução do fluxo de permeado para
as membranas de 10 kDa e 30 kDa foi de 20,7 % (desvio padrão de ± 3,9) e 28,9 % (desvio padrão
de ± 1,6), nesta ordem, os quais se diferiram estatisticamente pelo teste t-Student (p<0,05).
Os trabalhos que mencionam o uso da ultrafiltração na concentração e purificação de
peroxidases de vegetais, em sua maioria, utilizam membranas de massa molar limite de 10 kDa, seja
para concentrar o extrato bruto (Zeng et al. 2013) ou purificado por processos cromatográficos (Chen
et al. 2012). No estudo de Gottschalk et al. (2008), o uso da membrana de 10 kDa permitiu a
concentração de lignina peroxidase, proporcionando 90 % de retenção da atividade enzimática, 99 %
de rejeição da enzima pela membrana e 74 % de recuperação enzimática. Apesar das membranas não
apresentarem diferença significativa na maioria dos seus parâmetros de avaliação, optou-se por utilizar
a membrana de 10 kDa em virtude da menor queda de fluxo apresentada por esta.
Al-Senaidy e Ismael (2011) utilizaram membrana de 10 kDa na concentração de extrato
bruto de peroxidases de folhas de palma (Phoenix dactylifera), e obtiveram FP de 1,4 vezes e REC de
96 %. Márquez et al. (2008) concentraram peroxidase de baunilha (Vanilla planifolia) através do uso
de membranas de 10 kDa em ultrafiltração, e obtiveram como FP de 1,9 vezes e REC de 72,7 %. Os
resultados apresentados no presente trabalho se mostram coerentes com o observado na literatura em
termos de FP e REC, o que torna a ultrafiltração um processo possível de purificação parcial e
concentração de peroxidases.

4. CONCLUSÃO

No presente trabalho, a massa molar limite da membrana necessária à purificação parcial de

peroxidases por ultrafiltração foi estabelecida. O uso de membranas de 10 kDa e 30 kDa possibilitou a
purificação de peroxidases em 1,7 e 1,8 vezes, respectivamente, e recuperação enzimática próxima a
100 %; menor queda no fluxo de permeado (20,7 %) foi observada para membrana de10 kDa, sendo
esta a mais adequada ao processo de purificação. A ultrafiltração se mostrou um processo viável para a
concentração e purificação parcial de peroxidases, podendo esta ser utilizada isolada ou
concomitantemente a outros processos de purificação.

5. AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a Capes, CNPq e PDE/EPEM– FURG pelo apoio financeiro.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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