Figura 1......................................................................................................

6
Figura 2 : Quimiostato..........................................................................8
1. Introdução

Método: Para a construção desta revisão bibliográfica, critério de inclusão

definido inclui todo o artigo com no máximo 10 anos de publicação, de fonte segura
e literatura especializada como livros e material cinzento, como cartilhas de
congressos e convenções. A busca foi realizada em base de dados publica como:
lilacs, scielo, Medline, Cochrane, DeCS, e em buscadores como o Google scholar.
Objetivos: O objetivo desta revisão bibliográfica foi analisar o material já
publicado sobre o tema, e a produção de conhecimento e sumarização do tema de
forma clara e sucinta em uma revisão detalhada. Analise do material já publicado
sobre o tema.

2. Desenvolvimento

2.1. Aspectos históricos

Muito antes do homem entender a biologia, ele já lidava com a

biotecnologia na produção de vinhos e pães, entretanto não eram conhecidos
os agentes causadores das fermentações que ficaram ocultos. Somente no século
dezessete, o pesquisador Antom Van Leeuwenhock, através da visualização em
microscópio, descreveu a existência de seres tão minúsculos que eram invisíveis a
olho nu. (Karamanou et al., 2010)

Foi somente 200 anos depois que Louis Pasteur, em 1876, provou que a causa
das fermentações era a ação desses seres minúsculos, caindo por terra a teoria, até
então vigente, que a fermentação era um processo puramente químico. Foi ainda
Pasteur que provou que cada tipo de fermentação era realizado por um
microrganismo específico e que estes podiam viver e se reproduzir na ausência de
ar (Martins, 2009). Posteriormente, em 1897, Eduard Buchner, demonstrou ser
possível a conversão de açúcar em álcool, utilizando células de levedura
maceradas. (Buchner, 1907)

A partir da primeira guerra, a Alemanha, que necessitava de grandes

quantidades de glicerol para a fabricação de explosivos, desenvolveu através de
Neuberg, um processo microbiológico de obtenção desse álcool, tendo chegado a
produzir 1.000 toneladas do produto por mês por outro lado, a Inglaterra produziu
em grande quantidade a acetona para o fabrico de munições, tendo essa
fermentação contribuído para o desenvolvimento dos fermentadores industriais e
técnicas de controle de infecções (Oliveira, 1998).
 Foi, todavia, a produção de antibióticos o grande marco de referência na
fermentação industrial. A partir de 1928, com a descoberta da penicilina por
Alexandr Fleming, muitos tipos de antibióticos foram desenvolvidos no mundo
(Gaynes, 2017).

Na década de 40, durante a segunda guerra mundial, os antibióticos

passaram a integrar os processos industriais fermentativos, principalmente nos
Estados Unidos, baseando-se inicialmente na síntese da penicilina e,
posteriormente, da estreptomicina. (Chandler, 1994)

Foi, todavia, a partir da década de 50 que a Biotecnologia, com a descoberta

da síntese química do DNA, e com as técnicas de manipulação genética: DNA
recombinante, fusão celular ou hibridoma, passou de fato a existir. (Góes-Favoni, de,
2017)

2.2. Enzimas de restrição e DNA ligase

Enzimas de restrição são enzimas que cortam o DNA. Cada enzima

reconhece um ou mais sequências alvo e corta o DNA nestas sequências ou perto
delas. Muitas enzimas de restrição fazem cortes escalonados, produzindo
terminações com DNA fita simples. No entanto, algumas produzem extremidades
rombas (Bollon, 2017).

DNA ligase é uma enzima de adesão de DNA. Se dois pedaços de DNA

tiverem terminações complementares, a ligase pode ligá-las para formar uma
molécula de DNA única e contínua. Na clonagem de DNA, enzimas de restrição e
DNA ligases são utilizadas para inserir genes e outras frações de DNA em
plasmídeos (Juhas e Ajioka, 2017).

Na clonagem de DNA, são feitas várias cópias de um pedaço de DNA, tais

como um gene. Em muitos casos, a clonagem envolve a inserção do gene em um
pedaço de DNA circular chamado de plasmídeo, que pode ser copiado em bactérias
(Juhas e Ajioka, 2017)
 A enzima de restrição reconhece e corta DNA em locais específicos. Muitas
enzimas de restrição fazem cortes escalonados no local de seus sítios de
reconhecimento ou perto deles, produzindo terminações de fita simples (Bollon,
2017).

Se duas moléculas de DNA têm terminações que se correspondem, elas

podem ser unidas pela enzima DNA ligase que sela o vão entre as moléculas,
formando um único pedaço de DNA (Bollon, 2017).

2.3. Biolística
A técnica da biolística (balística biológica), também conhecida por biobalística,
aceleração de partículas ou bombardeamento de partículas foi descrita inicialmente
por Sanford em 1987. (Sanford et al., 1987)

O método consiste na aceleração de micropartículas que atravessam a

parede celular e membrana plasmática, de forma não letal, carreando substâncias
adsorvidas, como DNA, RNA ou proteínas, para o interior da célula (Klein et al.,
1987; Sanford et al., 1987)

São utilizados microprojéteis de ouro ou tungstênio, com diâmetro em torno

de 4µm, nos quais são precipitadas as moléculas de DNA. O tipo de aparelho usado
para acelerar as micropartículas envolvidas pelo DNA pode ter propulsão a ar,
pólvora, gás hélio ou eletricidade. Ao atingir a membrana as micropartículas
contendo o DNA continuam em direção às células-alvo, penetrando na parede
celular e membrana plasmática. (Klein et al., 1987; Sanford et al., 1987)

Embora a biobalística tenha sido desenvolvida inicialmente para a introdução

de material genético no genoma nuclear de plantas superiores também tem se
demonstrado efetiva para a introdução e expressão de genes em bactérias,
protozoários, fungos, algas, células e tecidos animais e em organelas como
cloroplastos e mitocôndrias (Butow e Fox, 1990; Klein e Fitzpatrick-Mcelligott, 1993).

biobalística também pode ser utilizada junto com a inoculação com

Agrobacterium, pode penetrar em plantas, esta bactéria possui um plasmídeo
indutor de tumor denominado Ti, parte do qual é incorporado no DNA da planta
hospedeira, que passa a produzir hormônios vegetais e opinas. Através de
engenharia genética o plasmídeo Ti é modificado, de forma que ele deixe de
expressar genes não-essenciais para transformação, por genes de interesse
(García Navarrete, 2017).

2.4. Biotecnologia da fermentação

2.4.1. Crescimento celular

Quando um meio de cultura é formulado e construído com os constituintes

(nutrientes) adequados e é depois semeado com um inóculo de microrganismos
estes vão reproduzir-se com uma dinâmica que é própria do microrganismo e da
composição do substrato (Medeiros, 2010).

A taxa de crescimento de microrganismos pode ser descrita em função de

diversos parâmetros que podem influenciar o crescimento. A Equação de Monod
(figura 1) descreve o crescimento de bactérias em função da concentração de um
único substrato limitante.

Figura 1

Onde µx (h-1) é a velocidade específica de crescimento, µm (h-1) é a

velocidade máxima de crescimento (parâmetro cinético), Ks é a constante de Monod
e S é a concentração de insumo limitante (Monod, 1949).
A utilização do substrato pelo microorganimos é diretamente proporcional com
o aumento da biomassa e da produção de metabolitos primários. Os processos de
utilização do substrato, síntese de biomassa e formação de produto estão ligados
como numa simples reação química. Para uma fermentação específica onde são
formados biomassa e produtos primários, pode ser definido um coeficiente de
rendimento (YP/X) que pode ser definido como a relação entre a quantidade de
produto e o aumento de biomassa (Bailey e Ollis, 1986).

2.4.2. Fermentação em continuo

Os processos contínuos permitem tirar maiores proveitos das designadas

economias de escala. Neste tipo de processos as células são cultivadas até que se
atinja uma pré-determinada concentração de biomassa nesse momento inicia-se o
processo contínuo em que se alimenta o fermentador com subtrsto fresco e se retira
uma quantidade de meio a uma taxa igual de modo a conservar o volume constante.
(Porto, 2006)

Há duas estratégias diferentes geralmente usadas para cultivar

microrganismos em processos contínuos em regime
estacionário: turbidostato e quimiostato. Em qualquer dos casos estamos perante
reatores contínuos perfeitamente agitados e o volume de suspensão no fermentador
é constante (Hernández, 1974).

No turbidostato os canais de entrada e saída são iguais, mas o canal de

entrada é ajustado de modo a manter constante a densidade de células. No
quimiostato o volume de suspensão celular é constante mantendo iguais e
constantes os caudais de entrada e saída: o tempo médio de permanência é
constante e atinge-se o estado estacionário por auto-ajuste da densidade celular ao
caudal de entrada. O quimiostato é, pois, um sistema auto-controlável enquanto o
turbidostato (em que, pelo contrário, é o tempo médio de permanência que se ajusta
à concentração de biomassa) requer uma estratégia de controlo muito mais
complexa e não é, por isso, usado em escala comercial
(Cunha, 2014).
Um quimiostato possui uma entrada onde é inserido o meio de cultura
fresco, e em alguns casos novas células, que tem por finalidade manter a
continuidade da fermentação. Há também uma segunda entrada, na qual é inserida
normalmente gás oxigênio estéril, que tem por finalidade suprir a demanda por
oxigênio das células. E por fim, possui uma saída por onde as células velhas e o
produto de interesse serão lixiviadas (Anton e Johan, 2012).
 Figura 2 : Quimiostato

fermentação em continuo é mais adequada para se produzir compostos que sejam

proporcionais ao crescimento celular, por exemplo, as vitaminas enzimas, álcool etc.
para que o fermentador se mantenha em continuo, é necessário que a quantidade
de substrato inserida no meio, seja igual a velocidade especifica de crescimento.
(Paixão e Santos Castro, dos, 2016)

Quando a quantidade de substrato que é inserida no meio é maior que

a velocidade especifica de crescimento ou taxa específica de crescimento, o meio
será diluído e as celular não terão tempo de completar sua vida útil, sendo lixiviadas
para fora do fermentador. (Paixão e Santos Castro, dos, 2016)

Entretanto se a quantidade de substrato for menor que a velocidade de

crescimento, o consumo será maior que a quantidade fornecida de substrato, assim
em algum momento do processo, haverá uma interrupção no processo por falta de
nutrientes para o crescimento celular. (Paixão e Santos Castro, dos, 2016)

Microorganimos em um meio rico em nutrientes, tendem a apresentar uma

sequência bifásica, onde a primeira faze é a de letargia, e a segunda de crescimento
exponencial. Nesta faze os microorganimos tente a ficar latentes, e crescer em baixa
velocidade. Diminuir o tempo de letargia e de sumo interesse para a indústria, pois
quanto mais rápido um meio de cultura produzir, mais rentável ele se tornar.
 Uma estratégia para se diminuir a faze de letargia é promover Quorum
sinsing entre as células. Quorum sensing pode ser definido como um mecanismo de
comunicação entre bactérias, através da produção e difusão de pequenas moléculas
químicas ou sinalizadoras, através de membranas bacterianas (Miller e Bassler,
2001; Whitehead et al., 2001)

Este sistema de linguagem permite a coordenação do comportamento

bacteriano em relação ao meio ambiente, regulando a expressão de genes
especializados, em resposta à densidade populacional, além da intervenção em
diversos processos fisiológicos como a diferenciação celular e fluxo de nutrientes, a
bioluminescência, indução de fatores de virulência em patógenos de plantas e
animais, biossíntese de antibióticos e a formação de biofilmes (Miller e Bassler,
2001; Whitehead et al., 2001).

A fermentação em continuo é um processo muito utilizado no meio industrial,

pela sua produtividade. Por ser um processo continuo se torna muito eficiente na
produção de álcool, acetona e enzimas. Para a produção de todo o metabolito
primário, a fermentação em continuo é o meio mais rentável e utilizado. (Costa,
2017; Ferreira, 2017; Vieira, 2014)

2.4.3. Fermentação descontinua

Os cultivos descontínuos podem ser considerados como sendo um sistema

fechado, exceto pela aeração e controle de pH através da adição de ácidos e bases,
que contém uma quantidade limitada de meio, e no qual o inóculo passa por um
número de fases, o que pode ser observado pela curva de crescimento celular
 A principal desvantagem da fermentação descontínua, quando utilizada para
a produção de bioprodutos associados ao crescimento celular, é que a formação
eficiente do produto ocorre somente durante uma parte do ciclo de fermentação, o
que promove uma produtividade menor do que a obtida por processos que consigam
prolongar este período.
A quantidade de biomassa alcançada por um processo descontínuo depende da
concentração inicial de substrato limitante do crescimento e da eficácia do
microrganismo para converter o substrato em material celular.

O processo descontínuo-alimentado é definido como uma técnica em

processos microbianos, onde um ou mais nutrientes são adicionados no fermentador
durante o cultivo e em que os produtos aí permanecem até o final da fermentação.
Em alguns casos, todos os nutrientes são adicionados gradualmente à dorna
(YAMANE et al., 1984) ou, então, apenas os chamados aditivos (precursores de
produtos ou nutrientes de menor
 concentração no meio) é que são alimentados. A vazão de alimentação pode
ser constante ou variar com o tempo, sendo que, no caso de a vazão de
alimentação variar com o tempo, esta pode ser regulada em função da concentração
de substrato desejada no meio, podendo-se, inclusive, manter a concentração de
substrato constante durante a alimentação (SENE et al., 2000).
Existem dois sistemas básicos de aplicação para uma fermentação
descontínuo-alimentada (Fed-Batch), que são o de volume fixo e volume variável.
No caso de volume fixo, o substrato é alimentado sem que ocorra diluição da
cultura. O volume de meio de cultura pode ser mantido constante através da
alimentação de substrato na forma de líquido concentrado ou através de diálise. Em
sistemas de volume variável, o volume se altera de acordo com o tempo de
fermentação oportuno para o substrato alimentado. A forma como esse volume se
altera depende de fatores como as exigências, limitações e dos objetivos da
operação. A alimentação pode ser efetuada através da adição com vazão constante,
vazão crescente e vazão decrescente, entre outros. Este processo pode ser
classificado, também, como fermentação decontínuo-alimentada simples ou
repetida, sendo o processo de fermentação repetida aquele onde parte do meio de
cultura é removido do sistema em um certo momento da operação e mais meio
nutriente é então adicionado. A existência de um volume reduzido no início do
cultivo ou uma menor concentração de nutrientes durante o enchimento, promove o
aumento na velocidade específica de crescimento, seguido por um decréscimo
gradual onde se estabelece um estado praticamente constante. No processo
simples, um meio de crescimento complementar é adicionado durante a
fermentação sem retirar-se a cultura até o fim do cultivo. Neste processo, a duração
da fermentação é limitada pelo volume do fermentador.
A fermentação descontínuo-alimentada é uma técnica de produção situada
entre a fermentação descontínua e a contínua, onde é necessária uma vazão de
alimentação apropriada, com a constituição certa dos componentes. Este tipo de
fermentação oferece diversas vantagens em
 relação aos outros processos. Entre as vantagens oferecidas tem-se a
produção de elevadas concentrações de células devido ao extenso tempo de
trabalho (o que é particularmente importante no caso de produtos associados ao
crescimento celular), o melhor controle das condições de adição de substratos
durante a fermentação (particularmente importante no caso das concentrações de
substratos específicos como, por exemplo, a fonte de carbono), o melhor controle
dos produtos obtidos ou dos efeitos da repressão catabólica devido à adição de
substrato ser limitado apenas à quantidade necessária para a formação do produto,
o modo de operação permite dominar e controlar os desvios no crescimento do
microrganismo encontrados na fermentação descontínua, permite a reposição da
água perdida no meio por evaporação, é um modo alternativo de operação para
fermentações que utilizem substratos tóxicos ou de baixa solubilidade e a não
necessidade de peças adicionais especiais como é necessário em uma fermentação
contínua.
Segundo WIN et al. (1996), a produtividade celular (Pr X) alcançada no cultivo
de S.cerevisiae utilizando melaço de cana-de-açúcar em processo descontínuo foi
de 0,31 g/L enquanto que a obtida para processo descontínuo-alimentado foi de
2,33 g/L, implicando num aumento considerável da concentração de biomassa
resultante graças à redução de prováveis efeitos inibitórios que estariam presentes
durante o cultivo descontínuo. É necessário observar-se que este tipo de
fermentação necessita de uma análise prévia do microrganismo, do que é
necessário para o seu crescimento e conhecer-se sua fisiologia com a
produtividade. Também é necessário conhecer-se a técnica de operação para o
início, definição e desenvolvimento do processo.
O substrato é, particularmente, um importante parâmetro para se controlar
este tipo de fermentação devido ao fato de estar, eventualmente, associado à
inibição do crescimento e ao aumento da eficiência do fluxo de carbono, pela
redução da quantidade de produtos derivados formados e a quantidade de dióxido
de carbono envolvido. Um exemplo de controle de concentração
 de glicose é encontrado na produção descontínuo-alimentada de
levedura de panificação (AIBA & NAGAI, 1976).
Segundo KAPAT et al (1998), a alimentação com galactose após o meio
fermentado se mostrar exaurido de glicose mostrou-se a mais eficiente
estratégia de produção de Glicose-Oxidase através do cultivo de
Saccharomyces cerevisiae recombinante em processo descontínuo alimentado.
Nutrientes como metanol, etanol, ácido acético e compostos aromáticos
inibem o crescimento celular, mesmo em concentrações baixas, porém, sabe-
se que qualquer nutriente pode se tornar inibitório, mesmo que somente em
concentrações muito elevadas e esse efeito inibitório é efetivamente reduzido
pelo uso do processo descontínuo alimentado, através do controle das
concentrações destes nutrientes (BORZANI et al., 2001). Outro grande
problema minimizado seria o da formação de produtos metabólicos tóxicos, que
é crítica em processos onde exista a necessidade de se trabalhar com altas
densidades celulares, como no caso de fermentações de microrganismos
modificados geneticamente, onde a concentração celular elevada implica num
aumento significativo na produção, já que o crescimento celular em
microrganismos modificados geneticamente é sempre bem menor do que o
microrganismo selvagem. Problemas de transferência de oxigênio são
acentuados em fermentações em alta concentração celular, de forma que a
velocidade de crescimento celular passa a ser fator determinante para a
eficiência do processo, de forma que se mantenha a mesma em níveis
desejáveis e tenhamos, com isso, a diminuição na produção de produtos
tóxicos, possibilitando que se consiga altas concentrações celulares e,
também, aumento na quantidade de produto formado. No processo
descontínuo alimentado não existem problemas comuns ao processo contínuo,
como os problemas de mutação, contaminação e instabilidade do plasmídeo,
de forma que o processo descontínuo alimentado se torna muitas vezes o mais
viável para a produção de produtos recombinantes (YOON & KANG, 1994).
 Os metabólitos secundários são compostos extracelulares secretados no
meio de cultura, durante o crescimento e diferenciação de um organismo vivo e
têm sido isolados e caracterizados principalmente para fins industriais (Strobel,
2003). Uma das técnicas de maior sucesso para a produção de metabolitos
secundários, é a de aplicação de estresse químico ou físico nas células em
suspenção, assim estas produzem com forma de defesa os metabolitos
secundários.
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