Ciência Animal, 11(2):119-129, 2001

CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN CANINO: REVISÃO

(Canine semen cryopreservation: review)

Alexandre Rodrigues SILVA, Rita de Cássia Soares CARDOSO

& Lúcia Daniel Machado da SILVA

Laboratório de Reprodução de Carnívoros / Universidade Estadual do Ceará

RESUMO

Nos últimos anos, tem-se observado um crescente interesse em técnicas que possibilitem um maior aproveitamento
do material genético oriundo de reprodutores caninos e, dentre estas, destaca-se a criopreservação de sêmen.
Nesse contexto, o presente trabalho apresenta uma revisão sobre diversos aspectos ligados a essa biotécnica,
tais como um breve histórico, protetores de resfriamento, crioprotetores, diluidores, metodologias de congelação,
processos de descongelação, conseqüências do processamento sobre o espermatozóide e avaliação do sucesso
da criopreservação. Assim, essa revisão poderá servir como fonte de consulta para futuras pesquisas na
reprodução canina.
PALAVRAS-CHAVE: cão, sêmen, criopreservação, reprodução.

ABSTRACT

In the last years, a growing interest has been observing in techniques that facilitate a larger use of the genetic
material originating from canine reproducers and, from that, semen cryopreservation can be highlight. So, this
work presents a revision on several aspects tied up to that biotechnique, such as a brief historic, cooling protectors,
cryoprotectors, extenders, freezing methodologies, thaw processes, procedure consequences on the sperm and
evaluation of the cryopreservation success. Thus, that revision can be used as consultation source for future
researches in canine reproduction.
KEY WORDS: dog, semen, cryopreservation, reproduction.

INTRODUÇÃO destacado a criopreservação de sêmen que possibilita

Nos últimos anos, tem-se observado um
crescente interesse em técnicas que possibilitem um
maior aproveitamento do material genético oriundo de
reprodutores de diferentes espécies. Com o
crescimento da cinofilia, o intercâmbio entre os
criadores profissionais de cães (Canis familiaris) em
todo o mundo tem favorecido uma maior cobrança
quanto ao aperfeiçoamento de biotecnologias que
otimizem o potencial reprodutivo nesta espécie. Dentre
as diferentes biotécnicas reprodutivas, tem-se
*Autor para correspondência
legio2000@yahoo.com
um melhor aproveitamento de ejaculados oriundos de
um mesmo reprodutor, bem como facilita a propagação
deste material genético para diferentes regiões do
planeta, mesmo após a morte do animal.
A utilização do sêmen canino congelado tem
a vantagem de possibilitar a manutenção da capacidade
fecundante em animais de alto interesse zootécnico por
um espaço indeterminado de tempo, além de resguardá-
los do estresse causado pelo transporte para fins de
acasalamento. Particularmente para os criadores
radicados em países com leis restritas de quarentena,
a possibilidade de um acesso ao material genético
criopreservado oriundo dos melhores cães do mundo
abriu uma excelente perspectiva na história da criação

119
desta espécie (LINDE-FORSBERG & FORSBERG,
1989).
Além disso, os testes de congelação de gametas
e a posterior fertilização in vitro ou in vivo em cães
servem como base para as pesquisas relacionadas à
indústria de curtume européia, a qual é proprietária de
fazendas onde se criam outros canídeos, como a
Raposa Azul (Alopex lagopogus) e a Raposa Prateada
(Vulpes vulpes), visando a preservação e multiplicação
do material genético de animais portadores de genes
mutantes de alto valor comercial (FARSTAD, 1996).
Sob este ponto de vista, as pesquisas em tecnologia do
sêmen canino abrem a perspectiva de serem adaptadas
à preservação de espécies canídeas ameaçadas de
extinção, como o Lobo Vermelho (Canis rufus), o
Lobo da Etiópia (Canis simensis), o Cão de Caça
Africano (Licaon pictus) e, principalmente, espécies
brasileiras, como o Lobo Guará (Chrysocyon
brachyurus), a Raposinha do Campo (Pseudalopex
sp.) e o Cachorro Vinagre (Speothos venaticus),.
Nesse contexto, o presente trabalho propõe-
se a apresentar uma revisão bibliográfica sobre os
principais aspectos ligados à congelação do sêmen de
cães, visando fornecer um embasamento científico que
sirva como consulta para futuras pesquisas nessa área.
Histórico da criopreservação do sêmen canino
Embora o espermatozóide do cão tenha sido
descrito em 1679 por Leewenhoeck (OETTLLÉ,
1986), apenas em 1780 foram realizadas importantes
investigações sobre o material fecundante nesta espécie
através dos estudos de Spallanzani que conseguiu
sêmen de um animal através de masturbação e injetou-
o no genital de uma fêmea em cio, obtendo o nascimento
de três crias vivas e normais (SOUZA, 1985). Em
1803, esse mesmo pesquisador observou que uma
redução na temperatura diminuía reversivelmente a
atividade metabólica do espermatozóide, possibilitando
assim a sua armazenagem (ENGLAND, 1993).
Com a descoberta acidental da ação
crioprotetora do glicerol por POLGE et al. (1949),
iniciou-se uma era de extenso desenvolvimento de
metodologias de criopreservação de células
espermáticas em diversas espécies, com o primeiro
sucesso na congelação do sêmen canino notificado por
Rowson em 1954. No ano de 1969, SEAGER obteve
a primeira gestação canina, utilizando o sêmen
120
criopreservado diluído em lactose acrescida de 4% de
glicerol e 20% de gema de ovo, o qual apresentou
motilidade espermática entre 40 e 50% após a
descongelação e possibilitou o nascimento de dois
filhotes após inseminação intravaginal (ENGLAND,
1993).
Os primeiros experimentos para a preservação
do sêmen canino por diferentes períodos iniciaram-se
com uma adaptação empírica de diluidores usados para
o resfriamento e congelação do sêmen bovino
utilizando-se tampões à base de leite desnatado
(MARTIN, 1963), citrato (HARROP, 1962), cloreto
de fosfato (WALES & WHITE, 1963), lactose
(SEAGER, 1969), Tris (GILL et al., 1970) e Tris-
frutose-citrato (FOOTE, 1964; ANDERSEN 1975).
Entretanto, a gestação, na maioria das notificações
científicas da atualidade (ROTA et al., 1999; LINDE-
FORSBERG et al., 1999; TSUTSUI et al., 2000),
tem sido alcançada utilizando-se modificações na
metodologia de congelação, preconizando-se o uso do
diluidor Tris-gema-glicerol (DAVIS et al., 1963).
Protetores de resfriamento
A adição de protetores de resfriamento é
necessária para proteger os espermatozóides durante
os processos de resfriamento, bem como durante a
congelação e a descongelação (FARSTAD, 1996). A
gema de ovo de galinha é o componente de origem
biológica mais largamente utilizado na composição dos
diluidores para o sêmen de cães (ENGLAND, 1993).
Ela contém lecitina (fosfatidilcolina), a qual acredita-se
proteger a membrana por restaurar os fosfolipídios
perdidos durante o choque térmico (WATSON &
PLUMMER, 1985; HAMMERSTEDT et al., 1990).
Componentes específicos da gema de ovo
foram identificados por serem responsáveis pela
preservação do espermatozóide ovino e bovino durante
sua estocagem em baixa temperatura. Durante o choque
térmico, os fosfolipídios interagem com a estrutura
lipídica da membrana plasmática das células
espermáticas e proporcionam a proteção da mesma.
As lipoproteínas ligam-se à membrana da célula
espermática e ajudam a preservar a integridade celular
durante o armazenamento (BOUCHARD et al., 1990).
Para a preservação do sêmen canino, uma
variedade de concentrações de gema de ovo tem sido
utilizada. Visto que a mesma também tem uma
capacidade de tampão, sua quantidade no meio varia
de acordo com a capacidade tamponante dos outros
componentes do diluidor (FARSTAD, 1996). Nesse
contexto, a maioria dos autores tem utilizado
concentrações de gema em torno de 20% no diluidor
(ANDERSEN, 1972; FARSTAD & ANDERSEN-
BERG, 1989; LINDE-FORSBERG & FORSBERG,
1989; SILVA et al., 2000).
MOURA (2000) comparou as gemas de ovo
de galinha e codorna como protetores de resfriamento
na congelação do sêmen de cães e observou não
existirem diferenças entre as mesmas quanto à
conservação da motilidade, vigor e morfologia
espermática após a descongelação. Assim, é sugestivo
que a gema de ovo de codorna, que é bastante rica em
ácido ascórbico e outras vitaminas, possa também ser
utilizada na congelação do sêmen canino
Entretanto, sendo a gema de ovo de origem
biológica, esta apresenta uma possibilidade de
transmissão de doenças. Por isto, diversas pesquisas
visando sua substituição por outros lipídios sintéticos e
purificados vêm sendo conduzidas. Interessantes
substitutos são os análogos do hidroxitolueno-butilado
(BHT), os quais têm mostrado proteger a membrana
plasmática da injúria do choque térmico (FARSTAD,
1996). SILVA et al. (2001) observaram que o sêmen
de cães pode também ser congelado na ausência da
gema de ovo, uma vez que esses autores utilizaram um
diluidor composto por Tris e glicerol e verificaram uma
motilidade espermática em torno de 35% após a
descongelação.
Agentes crioprotetores
Para obter-se sucesso com a criopreservação
de sêmen, faz-se necessária a adição de substâncias
denominadas crioprotetores, cuja presença é capaz de
melhorar a sobrevivência celular após os processos de
congelação e descongelação. Os agentes crioprotetores
pertencem a dois grupos: 1) aqueles que penetram nas
células, como o glicerol, o dimetilsulfóxido (DMSO) e
o metanol; 2) aqueles que permanecem no meio
extracelular, como as proteínas, os açúcares e o polivinil-
pirrolidona (ENGLAND, 1993).
O glicerol (CH3H8O3), um álcool polihídrico
altamente permeável, é o crioprotetor mais empregado
na congelação de sêmen nas diferentes espécies
(RODRIGUES, 1997). OLAR et al. (1989)
compararam o glicerol com o dimetil sulfóxido
(DMSO) na criopreservação do sêmen de cães, sendo
este último menos eficiente na preservação da
motilidade espermática. Da mesma forma, KIM & KIM
(1995) observaram que a motilidade e a viabilidade
espermáticas caninas após descongelação foram
melhores preservadas utilizando-se o glicerol do que
no uso do DMSO.
McLAUGHIN et al. (1992), CURRY (2000)
e HOLT (2000) reportaram que o glicerol exerce efeitos
tóxicos sobre os espermatozóides, como alterações
físico-químicas que podem levar à ruptura da membrana
plasmática, à remoção de importantes proteínas
membranárias, ou ainda originar danos acrossomais que
irão se refletir em uma redução da fertilidade. Além
disso, FARSTAD (1996) afirmou que o glicerol altera
a osmolaridade do diluidor, sendo que a osmolaridade
ótima para os espermatozóides caninos parece estar
em torno dos 300mOsm/L.
Segundo ENGLAND (1993), a concentração
ideal de glicerol no diluidor representa um equilíbrio
entre seus efeitos tóxicos e protetores, ressaltando-se
que altas concentrações podem também afetar a
capacidade fertilizante do espermatozóide. Para
WATSON (1979), tal concentração ideal pode ser
influenciada por outros componentes do diluidor, pelo
padrão de resfriamento e pelos métodos de congelação
e descongelação. No entanto, os principais fatores
determinantes seriam ainda as características seminais
de cada espécie.
Tal qual em outras espécies, a ausência de
glicerol durante a criopreservação do sêmen canino
resulta em uma significativa redução na sobrevivência
após a descongelação. OLAR et al. (1989) verificaram
que a motilidade estimada do espermatozóide após a
descongelação em diferentes diluidores, na ausência
de glicerol, fica em torno de 11%. Enquanto na
presença de 6% de glicerol, pode-se obter até 70%
de espermatozóides móveis após a descongelação
(STRÖM et al., 1997).
Vários pesquisadores sugerem o uso de
concentrações de glicerol entre 2 e 16% para a
criopreservação do sêmen canino, dependendo da
composição do diluidor utilizado. RAVASZOVA et al.
(1996) testaram o efeito de 4, 6 e 8% de glicerol no
diluidor à base de Tris e observaram que as
concentrações de 4 e 6 % de glicerol são as mais
121
apropriadas para tal processamento, havendo uma
melhor eficiência da concentração de 6% de glicerol
em preservar a motilidade e o vigor espermático.
O efeito da temperatura e a forma de adição
de glicerol têm sido também investigados em estudos
de criopreservação do sêmen canino. Os agentes
crioprotetores penetrantes, particularmente o glicerol,
protegem a célula da crioinjúria durante a fase de
cristalização que ocorre entre -6o e -10 oC. Dessa
forma, não parece ser lógico adicionar o glicerol à
temperatura de +30oC (COLAS, 1975).
ANDERSEN (1975) notificou a adição de um
diluidor glicerolizado ao sêmen a 37oC. Já PEÑA et
al. (1998) não encontraram diferenças entre a adição
de glicerol ao sêmen a 37° ou a 4°C. Além disso,
FONTBONNE & BADINAND (1993b) não
verificaram diferenças na qualidade do sêmen canino
após a descongelação entre a adição do glicerol de
uma única vez em relação à adição fracionada, tanto à
temperatura ambiente (25oC) quanto a 5°C.
Quando o sêmen é congelado muito
rapidamente, a formação de cristais de gelo
intracelulares constitui um fator letal, enquanto que a
congelação muito lenta resulta no “efeito solução” com
conseqüente queda na viabilidade espermática
(WATSON, 1995). A curva de congelação que
representa a variação da sobrevivência celular após a
descongelação em função do padrão de congelação é,
usualmente, sigmóide, e seu platô varia em duração
dependendo do método de congelação (ENGLAND,
1993). Além do mais, pode ser que o espermatozóide
canino possa sobreviver a uma variação de
concentrações de glicerol e padrões de congelação,
os quais poderiam estar inseridos no platô da curva,
fazendo com que seja difícil identificar os níveis ideais
de glicerol e padrão de congelação dentro da variação
tolerada. Isso poderia explicar a grande divergência
de opiniões quando concentrações de glicerol muito
baixas (1,6 – 2%) ou muito altas (8 – 12%) são
utilizadas (PEÑA et al., 1998).
STRÖM et al. (1997) sugerem que o glicerol
tem a capacidade de penetrar rapidamente no
espermatozóide canino; com base em seu experimento,
onde a sobrevivência espermática durante o teste de
termorresistência foi similar quando esse crioprotetor
foi adicionado ao sêmen uma hora ou imediatamente
antes do envase e subseqüente congelação. Já
122
MARTIN (1963) reportou que o glicerol deveria ser
removido após a descongelação, visto que este poderia
prejudicar a motilidade espermática. No entanto, devido
a uma carência de estudos, esta hipótese não foi ainda
confirmada.
Segundo SANTOS et al. (2001), o etileno-
glicol tem peso molecular menor que o glicerol e,
conseqüentemente, pode atravessar a membrana
plasmática com uma maior facilidade, penetrando e
deixando a célula mais rapidamente. Esses autores
compararam os efeitos do glicerol e do etileno-glicol
na congelação do sêmen de cães e não constataram
diferenças entre os mesmos, sugerindo que ambos os
crioprotetores poderiam ser utilizados para esse
propósito.
Diluidores
O sêmen apropriadamente diluído pode ser
congelado por tempo indeterminado, permanecendo
potencialmente fecundante quando reaquecido e
utilizado em uma inseminação artificial. Desse modo,
faz-se necessário o uso de um bom diluidor, o qual
deve conter nutrientes como uma reserva de energia,
servir como tampão ajustando as alterações do pH;
promover uma pressão osmótica e concentração de
eletrólitos dentro dos padrões fisiológicos; prevenir
o crescimento de bactérias; proteger as células contra
o choque térmico durante o processo de resfriamento
e possuir crioprotetores que reduzam os danos às
células espermáticas durante a congelação e posterior
descongelação (CONCANNON & BATISTA,
1989).
A maioria dos grupos de pesquisa da
atualidade tem utilizado o tampão Tris-frutose original
sem modificações, ou tem continuado a desenvolver
esse tampão, por exemplo, pela substituição do
monossacarídeo frutose pela glicose, a qual tem
atividade nutricional e osmótica, ou ainda pelos
dissacarídeos não penetrantes sacarose e lactose, os
quais agem como crioprotetores extracelulares, além
de proporcionarem um efeito osmótico favorável
(FARSTAD, 1996).
O Tris é um agente emulsificante usado em
medicina para combater a acidose. É solúvel em água
e comporta-se como uma base fraca. São ainda
notórias sua capacidade na redução do índice de
frutólise e sua contribuição na preservação da energia
 espermática. Sua composição, em geral, corresponde
a uma solução constituída por Tris-hidroximetil-
aminometano, ácido cítrico mono-hidratado e D-
frutose, dissolvidos em água destilada (RODRIGUES,
1997; SILVA et al., 2000).
Em 1972, ANDERSEN comparou o diluidor
lactose-gema-glicerol com o Tris-gema-glicerol,
porém não observou diferenças nos resultados de
congelação de sêmen canino obtidos com os mesmos.
Em recentes publicações, o tampão Tris tem-se
mostrado superior a outros tampões, tanto para a
estocagem a curto período do sêmen resfriado, como
para a congelação do sêmen em palhetas
(FARSTAD, 1996; SILVA et al., 2000).
Uma variedade de companhias comerciais
tem também desenvolvido seus próprios diluidores.
Encontra-se disponível comercialmente o Triladyl
(Minitub, Tiefenbach, Alemanha), composto por Tris
como principal agente tamponante, ácido cítrico,
frutose, glicerol, tylosina, gentamicina, espectinomicina
e lincomicina (NOTHLING et al., 1995).
SILVA & VERSTEGEN (1995) realizaram
inseminações artificiais com sêmen congelado tanto
em uma mistura dos tampões Tes/Tris, quanto com
os diluidores comerciais Laiciphos 478 e Biociphos
W482 (IMV, France), tendo sido este último
especialmente desenvolvido para a congelação do
sêmen na espécie canina. Esses autores obtiveram
uma taxa de concepção de 60% com o Laiciphos e
a mistura de Tes/Tris, enquanto que com o uso do
Biociphos obtiveram 100% de concepção. Além
disso, os autores verificaram que os espermatozóides
diluídos e congelados em Biociphos exibiam
motilidade e vigor espermático mais baixos que nos
demais diluidores, provavelmente devido à alta
viscosidade deste diluidor, o que não veio a interferir
nas taxas de concepção.
Um outro meio comercial bastante utilizado
e que vem proporcionando excelentes resultados in
vitro e in vivo é o diluidor CLONE produzido pelo
Cryogenic Laboratories of New England, Inc.
(GOVETTE et al., 1996; STRÖM et al., 1997).
Entretanto, a grande desvantagem dos diluidores
comerciais é que sua exata composição não é
divulgada.
Recentemente, no Brasil, foi descrito o uso
de um diluidor para a congelação do sêmen de cães à
base de água de coco, a qual é uma solução estéril,
ligeiramente ácida, rica em proteínas, sais, açúcares,
vitaminas, fatores de crescimento e pobre em
fosfolipídios. Para uma perfeita compatibilidade dessa
substância com o sêmen canino, faz-se necessário o
preparo de uma solução base contendo em média 50%
de água de coco, 25% de água destilada e 25% de
citrato de sódio a 5%, com a osmolaridade corrigida
para 300 – 310 mOsm/L e o pH para 6,2 – 6,6. Após
a descongelação do sêmen de cães, o diluidor à base
de água de coco proporcionou motilidade e vigor
espermático em torno de 50% e 3,0, respectivamente
(CARDOSO et al., 2000).
Metodologias de congelação
Diversas metodologias têm sido descritas
para a congelação do sêmen de cães e variam de
acordo com o diluidor, protetores de resfriamento e
agentes crioprotetores empregados, preconizando o
uso de diferentes velocidades de congelação.
Dentre os diversos métodos existentes, o mais
usual é o descrito por ANDERSEN (1975). Neste
método, foi realizada a diluição do sêmen na proporção
de 1:4 com Tris-frutose-ácido cítrico, contendo 8%
de glicerol e 20% de gema de ovo. Em seguida,
procedeu-se o período de equilíbrio a 5oC por três
horas, o envase em palhetas de 0,5 mL e a congelação
através da exposição aos vapores de nitrogênio,
seguindo-se o acondicionamento em botijão
criobiológico. Atualmente, essa metodologia tem
servido como base para inúmeros trabalhos, os quais
têm realizado pequenas modificações na mesma e
alcançado excelentes resultados in vitro, tendo sido
verificada motilidade espermática após a descongelação
em torno de 70% (STRÖM et al., 1997), bem como
excelentes taxas de concepção após inseminações
artificiais (ANDERSEN, 1975, FERGUSON et al.,
1989).
O método CLONE é um método comercial
desenvolvido pelo Cryogenic Laboratories of New
England, Inc. (CLONE) e tem sido utilizado desde
1983. Ele consiste na diluição do sêmen à temperatura
ambiente em um diluidor denominado CLONE A,
submetendo-se, em seguida, o sêmen diluído a um
período de equilíbrio por uma hora a 4o C. Faz-se uma
segunda diluição com o diluidor CLONE B e o envase
em palhetas de 0,5 mL, as quais são congeladas através
123
da exposição vagarosa aos vapores de nitrogênio. Esse
método tem também proporcionado motilidade pós-
descongelação em torno de 70% (STRÖM et al.,
1997) e taxas de concepção em torno de 86,4% após
inseminação (GOVETTE et al., 1996).
SILVA et al. (2000) congelaram o sêmen de
cães com diluidores a base de Tris e água de coco,
ambos submetidos a uma modificação da metodologia
descrita por NUNES et al. (1997) para a congelação
do sêmen de caprinos com o diluidor a base de água
de coco. Esse método consistiu em uma primeira
diluição do sêmen a 37oC, seguida de um período de
equilíbrio por 40 minutos a 15°C em caixa térmica e
mais 30 min no banho-maria em um refrigerador a 4
o
C. Adicionou-se então o diluidor glicerolizado, fez-se
o envase e a exposição das palhetas aos vapores de
nitrogênio e procedeu-se o acondicionamento do sêmen
em botijão criobiológico a –196oC. Esses autores
verificaram que o diluidor a base de Tris possibilitou
uma melhor conservação do vigor e da morfologia
espermática do que a água de coco após a
descongelação do sêmen canino.
Dentre os diversos métodos existentes, um
ponto básico de suma importância é o período de
equilíbrio. Entretanto, OLAR (1984) verificou não
existirem diferenças entre amostras de sêmen resfriadas
e equilibradas por uma, duas ou até três horas.
Uma diversidade de pesquisadores tem
investigado diferentes meios para a congelação do
sêmen na forma de pastilhas (BATTISTA et al., 1988)
ou em palhetas com diferentes volumes de sêmen
(BATTISTA et al., 1988; OLAR et al., 1989). Segundo
BATTISTA et al.(1988), diluidores contendo Tris
usados para a congelação de sêmen em palhetas de
0,5 mL conferem uma melhor taxa de motilidade
espermática que o diluidor lactose não tamponado na
forma de pastilha. IVANOVA-KICHEVA et al. (1997)
demonstraram que espermatozóides caninos
criopreservados em tubos de alumínio de 5 mL com
os diluidores Tris-frutose, Tris-glicose e lactose
apresentam melhor qualidade do que aqueles
criopreservados em pastilhas.
As curvas de congelação podem ser
essencialmente diferentes para a congelação em
pastilhas e palhetas, e o uso do mesmo padrão de
descongelação, quando comparando os dois métodos
de envase, poderia complicar a interpretação dos
124
resultados. A congelação em palhetas tem a vantagem
sobre as pastilhas em facilitar a identificação do doador
de sêmen e reduzir a possibilidade de contaminação, a
qual torna-se importante com o movimento de sêmen
congelado entre os países (FARSTAD, 1996).
Processos de descongelação
De maneira análoga ao processo de
congelação espermática, existem vários protocolos
preconizando diferentes temperaturas e velocidades de
descongelação para o sêmen canino. Usualmente, este
processo é realizado sob imersão em banho-maria a
temperaturas que variam de 37 oC (LINDE-
FORSBERG, 1991) a 75oC (OLAR et al., 1988).
OLAR et al. (1988) descongelaram sêmen
canino de forma lenta, a 1oC por 120s; de forma
moderada, a 35oC por 30s; e de forma rápida, a 75oC
por 12s, obtendo bons resultados com os três
processos, mas observando uma tendência à melhor
eficácia do processo rápido. KIM & KIM (1995)
sugerem não existir diferenças quanto a motilidade e
viabilidade no sêmen canino descongelado a 5oC por
30 minutos, 37oC por 30s ou 75oC por 10s.
DOBRINSKY et al. (1993) sugerem a
descongelação moderada a 37oC por 120s, mas
SILVA & VERSTEGEN (1995) recomendam o uso
do processo rápido a 50oC por 30s. SILVA et al.
(1998) compararam o processo de descongelação a
37oC por 1 min com o processo a 50oC por 30s e
observaram que o primeiro procedimento permite uma
melhor conservação da morfologia espermática.
BADINAND et al. (1993) descongelaram
amostras de sêmen a 37oC por 45 segundos e
consideraram esse método mais seguro, pois o tempo
de permanência em temperaturas altas é sempre crítico
e de influência letal sobre a viabilidade dos
espermatozóides. Porém, IVANOVA-KICHEVA et al.
(1995), comparando os processos de descongelação
a 37oC por 8s e 55oC por 5s, observaram que a
motilidade espermática foi melhor preservada a 55oC
e sugeriram que a elevação da temperatura de
descongelação reduz o dano osmótico das células, além
de prevenir a formação de cristais.
Conseqüências do processamento sobre o
espermatozóide
O dano espermático causado pelo
resfriamento da temperatura fisiológica abaixo do ponto
de congelação é denominado choque térmico
(FARSTAD, 1996). A habilidade espermática em
resistir à queda de temperatura difere entre as espécies.
Os espermatozóides do eqüino, felino, canino e humano
são pouco sensíveis ao choque térmico, enquanto que
os do caprino, bovino e ovino têm média sensibilidade
e os do suíno são extremamente sensíveis (WATSON
& PLUMMER, 1985; BWANGA, 1991).
A estabilidade da membrana e a resistência
ao choque térmico parecem estar relacionadas ao
componente fosfolipídico da membrana (BOUCHARD
et al., 1990). Alterações irreversíveis na membrana
espermática, oriundas dos processos de resfriamento,
congelação e descongelação, são caracterizadas por
distúrbios na estrutura de bi-camada proteíno-lipídica,
como um decréscimo na fluidez e aumento na
permeabilidade da membrana, danos acrossômicos,
desidratação, liberação de enzimas e fosfolipídios,
redução da atividade metabólica e diminuição no
consumo de ATP. Tais alterações podem comprometer
parcial ou totalmente a fertilidade do espermatozóide
(FARSTAD, 1996).
A diluição, resfriamento, congelação e
descongelação da célula espermática canina são
processos que provocam mudanças na estrutura da
bicamada e na função da membrana plasmática. Além
disso, o glicerol tem um efeito direto sobre cada zona
da membrana, bem como sobre a suspensão celular
nos compartimentos aquosos. Quando uma membrana
biológica é resfriada, ocorre possivelmente uma
reorganização dos componentes membranários e alguns
lipídios que normalmente encontram-se adjacentes às
proteínas da membrana poderiam agregar-se, deixando
as proteínas livres para ligarem-se a novas substâncias
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al., 1993).
O resultado mais evidente dessas mudanças
é a redução na motilidade espermática, que é a
característica mais freqüentemente avaliada para
determinar-se o sucesso do processo de
criopreservação (ENGLAND, 1993). ENGLAND &
PONZIO (1996) relataram que nas amostras de sêmen
descongeladas existe uma marcada deterioração na
qualidade espermática, a qual é indicada por uma
redução da motilidade espermática, da porcentagem
de espermatozóides morfologicamente normais e do
tempo de sobrevivência espermática, bem como por
um aumento na osmolaridade, se comparados com o
ejaculado original.
Quanto ao aumento na osmolaridade,
RODRIGUES-GIL & RIGAU (1996) observaram que
as células espermáticas caninas e suínas não se alteram
ou se alteram fracamente em meios hiperosmóticos
inferiores a 900 mOsm/L, enquanto que meios
hipoosmóticos podem reduzir sensivelmente a
viabilidade espermática.
Na célula espermática canina, o choque
hiposmótico induz um progressivo desprendimento de
acrossomas, cuja membrana é uma estrutura muito lábil
que pode ser alterada por processos tais como o
resfriamento, a congelação, a descongelação, e a
expansão para inseminação. Por esta razão, para obter-
se sucesso com a criopreservação de soluções
celulares, deve-se permitir a manutenção da
osmolaridade, bem como do pH e do potencial iônico,
além de proporcionar uma fonte energética e prevenir
a crioinjúria (ENGLAND, 1993).
Segundo FARSTAD (1996), uma
preservação bem sucedida de espermatozóides pelo
resfriamento, congelação e descongelação é
dependente de uma série de fatores, como a qualidade
da amostra de sêmen, adição de diluidores, padrão de
diluição, tipo de tampão, protetores de resfriamento
empregados, tempo de equilíbrio, padrão de
congelação e descongelação. A interação desses
fatores objetiva a redução do dano celular, assegurando
uma sobrevivência espermática adequada in vitro e in
vivo.
Avaliação do sucesso da criopreservação
Embora a relação entre a motilidade e a
capacidade fecundante do espermatozóide canino não
está totalmente elucidada, atualmente, a maioria dos
pesquisadores ainda a utilizam como o principal
parâmetro para a avaliação de diluidores, crioprotetores
e técnicas de criopreservação de sêmen canino
(IVANOVA-KICHEVA et al., 1997). Segundo
CONCANNON & BATTISTA (1989), a faixa ideal
de motilidade espermática após descongelação do
sêmen canino, para a realização de inseminação artificial,
é quando esta se apresenta superior a 50%. No entanto,
é ainda aceitável sua realização quando a amostra de
sêmen exibe entre 30 e 50% de espermatozóides
móveis.
125
 OETTLÉ (1986) observou a ocorrência de
alterações na morfologia acrossômica durante o
processo de congelação e verificou que tais mudanças
não pareciam estar correlacionadas com a motilidade
espermática em cães. Ademais, MORTON & BRUCE
(1989) sugeriram que anormalidades morfológicas na
peça intermediária e na cauda do espermatozóide
poderiam reduzir sua motilidade após descongelação.
STRÖM et al. (1997) relataram que apesar
da avaliação da motilidade espermática ser o teste in
vitro mais comumente realizado, outros testes como a
avaliação da integridade da membrana plasmática,
integridade e morfologia acrossômica e a habilidade
do espermatozóide em ligar-se à zona pelúcida de
oócitos podem também ser utilizados. Além disso,
reportam que o teste de termorresistência (TTR) tem
sido mostrado como um teste clínico seguro para
predizer o potencial fertilizante do sêmen humano e que,
tal qual na espécie suína, poderia dar uma melhor
indicação da capacidade fertilizante do espermatozóide
canino do que a simples estimação da motilidade
espermática imediatamente após a descongelação. O
TTR consiste na observação da longevidade espermática
in vitro, através de repetidos exames da motilidade em
diversos tempos após a descongelação e durante
incubação em temperatura uterina, mimetizando
parcialmente uma situação in vivo (PEÑA et al., 1998).
Utilizando a microscopia eletrônica,
RODRIGUES-MARTINEZ et al. (1993) observaram
que o espermatozóide descongelado apresentava um alto
grau de danos acrossômicos, incluindo perda do
conteúdo. Porém, eles verificaram que o plasmalema
aparentemente permanecia intacto na maioria dos casos.
Esses autores sugeriram que tal fato poderia ser a razão
para a baixa porcentagem de anormalidades
acrossômicas normalmente notificadas quando se
utilizava a microscopia de contraste de fase.
Segundo LARSSON & RODRIGUES-
MARTINEZ (2000), testes de penetração e ligação à
zona pelúcida, bem como testes de incubação do sêmen
em hemi-zona (HZT), podem ser utilizados para avaliar
o efeito dos diferentes métodos de tratamento
espermático, tais como o resfriamento e a congelação,
sobre a habilidade fertilizante do espermatozóide canino.
HAY et al. (1997) sugerem que as amostras de
sêmen que retêm a motilidade após a descongelação
também retêm o movimento progressivo, indicando que
se elas sobreviverem a congelação serão capazes de
progredir. Além disso, esses autores verificaram que
126
baixa motilidade e aumento nos danos acrossômicos nas
células espermáticas caninas após a descongelação estão
correlacionadas com penetração reduzida em oócitos
homólogos.
Apesar de inúmeros testes in vitro, a forma mais
segura de avaliar-se o sucesso da criopreservação de
sêmen é através dos resultados obtidos após inseminação
artificial (IA) com o sêmen descongelado. Segundo os
dados da literatura, as taxas de concepção observadas
após IA com sêmen congelado são sensivelmente
inferiores às obtidas após IA com sêmen fresco (LINDE-
FORSBERG & FORSBERG, 1989). Esse fato deve-
se, provavelmente, à viabilidade e fecundidade reduzida
dos espermatozóides descongelados. Isso pode ser
decorrente do processo de congelação e descongelação,
da qualidade do sêmen após congelação, dos tipos de
meios utilizados, dentre outros fatores. De fato, segundo
CONCANNON & BATTISTA (1989) e
FONTBONNE & BADINAND (1993b), a viabilidade
do espermatozóide após descongelação pode variar de
12 a 24 h.
É geralmente aceito que a IA intravaginal com
sêmen congelado resultaria em baixas taxas de
concepção na espécie canina (ANDERSEN, 1972;
LINDE-FORSBERG & FORSBERG, 1989), enquanto
que a IA intrauterina com sêmen congelado culminaria
com melhores resultados (FARSTAD, 1984). No entanto,
essa afirmação está baseada unicamente na análise de
alguns dados clínicos não controlados, observando-se que
a problemática está ligada não somente ao sêmen canino
e às suas características após descongelação mas,
também, às dificuldades ainda encontradas concernentes
à determinação do momento ideal para IA nessa espécie
de fisiologia particular.
FONTBONNE & BADINAND (1993a)
inseminaram 57 cadelas de raças variadas com sêmen
congelado diluído em Tris-gema com 6,4% de glicerol e
obtiveram taxas de concepção de 52,7% utilizando a IA
intravaginal e 73,6% com a IA intrauterina. Enquanto
FARSTAD & ANDERSEN-BERG (1989), ao
inseminarem 36 cadelas por via intrauterina, obtiveram
67% de gestação. KIM et al. (1994) inseminaram sete
cadelas com sêmen descongelado submetido ao metanol
como crioprotetor e obtiveram três cadelas gestantes,
com uma taxa de concepção de (42,8%). TSUTSUI et
al. (2000) realizaram inseminação via intrauterina com
sêmen congelado suplementado com pasta Orvus ES
em dez cadelas e obtiveram uma taxa de concepção de
71%.
NOTHLING & VOLKMANN (1993)
verificaram que a adição do líquido prostático autólogo,
previamente congelado a -18 oC, ao sêmen canino
descongelado, promove taxas de concepção (100%)
maiores do que quando da não utilização desse fluido
(60%). Entretanto, maiores estudos são necessários para
determinar se a melhoria na fertilidade foi causada por
constituintes químicos do líquido prostático ou por um
efeito físico, como um aumento no volume ou um
decréscimo na viscosidade do sêmen.
Considerações finais
Atualmente, presencia-se em todo o mundo um
imenso desenvolvimento de biotecnologias aplicadas à
reprodução dos carnívoros domésticos. O interesse
recente de companhias comerciais, aliado aos recursos
humanos aperfeiçoados nas universidades, possibilita
hoje a implantação de bancos de sêmen canino congelado
em diversos países. Esses bancos de sêmen mantêm,
constantemente, um material genético de alto valor, o
qual pode ser utilizado por populações isoladas
geograficamente a fim de evitar um excessivo cruzamento
consangüíneo, além da eliminação de doenças
sexualmente transmissíveis. Desse modo, entende-se que
a criopreservação de sêmen de cães é apenas o começo
de uma nova era para a reprodução e otimização do
material genético de canídeos domésticos e selvagens.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao Dr. Arlindo Alencar Araripe
Moura (Dept. de Zootecnia/UFC e ao Dr. Ricardo Toniolli (Dept.
de Medicina Veterinária/ UECE) pelos valorosos comentários
nessa revisão de literatura.
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