UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E
FITOSSANITARISMO

AF 060- Biotecnologia Vegetal

Técnicas moleculares:
Extração de DNA, detecção de ácidos
nucleicos e sequenciamento

Profa. Renata Faier Calegario

DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

Replicação

DNA DNA

Transcrição

RNA

Tradução

PROTEÍNA
DNA RECOMBINANTE

Planta Transgênica
 INTRODUÇÃO

Planta Transgênica
Isolamento do DNA da planta
Fundamental para analisar se o
DNA exógeno foi inserido no
genoma vegetal

Técnicas de detecção :

• PCR = Presente ou Ausente

• Southern Blot = Nº de cópias
 EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS

Isolamento do DNA da planta

Diferentes protocolos => em função da espécie e do tecido

Maioria => variação de 2 protocolos básicos

• Dellaporta et al. (1983)
Baseado na precipitação de proteínas e polissacarídeos: por acetato de
potássio na presença de SDS

• Doyle & Doyle, (1987)

Baseado na utilização do detergente CTAB
Romper as membranas celulares para liberação do DNA
Romano, 1998
 EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS

Você deve ter em mente:

Isolar o DNA de outros constituintes celulares: lipídeos,

proteínas e polissacarídeos

Manter Integridade: informação/sequência

Comp. fenólicos e polissacarídeos = interferem na atividade

de enzimas usadas para manipulação de DNA
=> ligases, polimerases e enzimas de restrição

Use tubos plástico novos e esterilizados

=> O DNA apresenta grande afinidade pelo vidro (evite-o)
 EXTRAÇÃO DE DNA: MÉTODO CTAB
Romano, 1998 Desnatura proteínas
Evita degradação
do DNA DNA

Lipídeos,
NaCl, Tris, polissacarídeos
Lise celular = liberar o DNA EDTA, βME
H2O

Proteínas

Precipita DNA
 EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS

Etapas básicas de protocolos de extração

Lise celular = liberar o DNA

• N2 líquido
• Diretamente no Tampão de extração

Tampão de extração

• Tris pH 8.0 e 9.0 = mantém pH (desfavorável às DNAses, pH 7.0)

• EDTA = agente quelante Mg+2 e Ca+2 (co-fator de DNAses)
• β-mercaptoetanol = antioxidante e desnatura enzimas
=> DNA oxidado é inacessível às enzimas de restrição
 EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS

Tampão de extração (continuação)

• NaCl = liberação de proteínas ligadas aos ácidos nucleicos (íons

rompem ligações de cadeias polipeptídicas)

• CTAB e SDS = detergentes = lise das membranas celulares (libera

os componentes)
⇒ Junto com NaCl = forma um complexo com o DNA
⇒ Usado para precipitar o DNA seletivamente

• RNAse = elimina RNA

 EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS

Desnaturação das proteínas com solventes orgânicos

• Fenol
• Clorofórmio:álcool isoamílico Centrifugação
⇒ Fase aquosa (superior): DNA + contaminantes (Polissacarídeos e RNAs)
⇒ Interface: proteínas desnaturadas
⇒ Fase orgânica (inferior): Lipídeos, polissacarídeos

Recuperação do DNA: Precipitação

• Isopropanol ou álcool absoluto = DNA desidrata e precipita
• Acetato de amônio = remove fenóis ou polissacarídeos
• Acetato de potássio (+SDS) = precipita proteínas e polissacarídeos

Lavagem do DNA: remoção de sal

• Etanol 70%
 EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS

Problemas comumente encontrados:

Contaminação por polifenóis: cor marrom do DNA

(oxidação)
Co-isolamento de polissacarídeos: aspecto gelatinoso e
muito viscoso
Presença de DNAses endógenas: visualização do DNA
genômico em gel de agarose – degradado (arraste vertical)

Baixa qualidade do DNA

 PROBLEMAS, CAUSAS E SOLUÇÕES

Romano & Brasleiro, 1998

 PROBLEMAS, CAUSAS E SOLUÇÕES
Continuação

Romano & Brasileiro, 1998

 ANÁLISE DA EXTRAÇÃO

Avaliação DNA extraído: Concentração e Pureza

1. Análise da OD em espectrofotômetro

DNA absorve luz no λ 260 nm / Proteínas a 280 nm

• 1 OD 260 = 50 mg de DNA

[DNA]] = leitura OD260 x 50 x fator de diluição

• Parâmetro da qualidade do DNA => Relação OD 260/OD 280

Valores < 1,8 => contaminação com proteínas

Valores >1,8 => contaminação com fenol
 ANÁLISE DA EXTRAÇÃO

2. Eletroforese: Análise em gel de agarose

• Concentração: 0,8% e 1% (varia de acordo com tamanho DNA)

• Marcador: DNA de concentração conhecida = Padrão

• Amostras comparadas aos padrões: possível estimar

concentrações de DNA em cada amostra
ANÁLISE DA EXTRAÇÃO

1Kb = 1000pb
 ANÁLISE DA EXTRAÇÃO

Análise em gel de agarose: DNA genômico de Plantas

Kit de extração DNA

1-4 = DNA Folha Tabaco 5-8 = DNA Arroz Sorgo Folha Arroz Folha Trigo

http://www.uniscience.com/homogeneizador/bullet-blender-next-advance HiPurA™ - Hemedia

 ANÁLISE DA EXTRAÇÃO
Moléculas de DNA de mesmo tamanho = migram com diferentes
velocidades na forma circular relaxada, linear ou supertorcida

A dupla-hélice
enrola-se sob si
mesma

5 Min 30 Min

Tratamento com Topoisomerase

Promovem a quebra transitória nas pontes fosfodiéster adicionando ou
removendo superenrolamentos
 TESTES MOLECULARES DETECÇÃO
PCR: Polymerase Chain Reaction
Reação de Polimerização em cadeia

Método in vitro para produzir DNA

Desnaturação
Baseado nas propriedades do DNA:
Renaturação

Elementos necessários:
⇒ DNA molde: Proveniente de extração
⇒ Componentes da Replicação: DNA polimerase, primers e
nucleotídeos

Karl Mullis: 1983

Prêmio Nobel: 1993
 REPLICAÇÃO X PCR

Quais os elementos necessário para a Replicação do DNA?

CÉLULA IN VITRO
DNA molde DNA: extrair
Abertura das fitas = helicase Temperatura
Nucleotídeos Nt Sintéticos
Primers = Primase Primer: desenhar
Adição de nt = síntese DNA polimerase
 REAÇÃO DE PCR
Todos elementos são adicionados ao tubo (eppendorf)

• DNA extraído: 20 a 200ng

DNA
• dNTPs: Nucleótidos A, T, C, G

Mg+2
• Par de Primers (iniciadores)
=> anelando nas bordas da Taq DNA
região a ser amplificada Tampão 10X Polimerase
dATP

• Taq DNA polimerase: Thermus dTTP H2O

dNTPs
aquaticus (estável em ↑ T°) dCTP
Primer
dGTP
3’ – 5’
• Tampão 10X: estabiliza pH Primer
5’ - 3’

• MgCl2: cofatores (Mg+2) Taq e 25µL

ajuda ligação dos primers
Figura: http://slideplayer.com.br/slide/366864/
 PCR
Equipamento necessário:

⇒ Termociclador
⇒ Propicia temperaturas distintas

Desnaturação = 94°C
1 Ciclo Anelamento = 54°C
Extensão = 72°C

Ao final da Reação:
=> Amplificação da sequência específica do DNA = fragmento
=> Tamanho e sequência definidos
=> Grande quantidade 750 pb
700 pb
500 pb
 PRIMERS

O QUE É UM PRIMER?
Sequência de nucleotídeos complementar às extremidades
da sequência alvo do DNA

Tamanho: 17-25 nucleótidos

Deve corresponder a uma sequência única dentro do DNA a

ser amplificado

COMO FAZER UM PRIMER ?

Conhecer a sequência do gene
Lembrar: Polimerização sempre 5’-3’
 PRIMERS

Sequência do Gene

5’- …GTTCTAGGATCGACTCTAAGTTGAATTATGAGAAATTGTGTGATTTTGTC
AACACTGAGTCGAGACCCCTGGCTAGGACTTTCCGTAGTCCTCCAGATGT
TATGCCTACCGTATGCAGCAAATTTACGGTAAGTCACTTAAAGGCCTGACC
ATACAGTGTTTGAGCAAGAATCAGGACACTTCTCCAAGCGTCTCTAAGCTT
GTTATCACAAAGAATTATAGGTTTGGACAGAATTTTATACGCGAAGTCTTTG
ATAAAATTGGACATGCTTAGCTTTTATGGTAATGGTGGTATGATCTTTACAG
ATTGCTGTAGTACTATACACCAGTTTCAGGGTAGTGACGCTGAATATGTTG
TTGTCATGCGCCTGACATATGCTGAGTAAGTCTATTTTTATGGATGAAAGG
CAATGTCTTGTCGCATAAGACTAGGCACACTATGCGAATGGTCTACG... - 3’
 PRIMERS
Fita 1 - Molde
5’…GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’
Fita 2 - Complementar
3’…CAAGATCCTAGCTGAGATTCATTGAATTATGAGAAATTGTGTGATTTTC.…5’

Sequência do Primer Amplifica

5’- GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’ Fita 5’- 3’
Forward (Left)
molde

Fita 1 - Molde
5’…CAATGTCTTGTCGCATAAGACTAGGCACACTATGCGAATGGTCTACG...3’
Fita 2 - Complementar
3’- GTGATACGCTTACCAGATGC…5’

Sequência do Primer Amplifica

Reverse (Right) 5’- CGTAGACCATTCGCA TAGTG- 3’ Fita 5’ - 3’
Compl.
PRIMERS
 PRIMERS

Características desejáveis dos Primers

Composição: 50% C+G

Extremidade 3’: com G ou C

Evitar três ou mais Gs ou Cs (3´) = Anelamento inespecífico em

regiões ricas em G ou C

Evitar complementaridade de bases no próprio primer (hairpin,

estruturas secundárias)
 PRIMERS

Condições de Anelamento TEMPERATURA

Temperatura alta: maior especificidade

Temperatura baixa: menor especificidade

Temp. Anelamento: ~ 5º C abaixo do menor Tm do par de primers

Tm varia de 55-72oC

Tm dos dois primers próximas

 PRIMERS

Melting Temperature (Tm) = Temperatura Desnaturação

Tm = 2 (A+T) + 4 (G + C)
Fórmula de Wallace

Sequência do Primer
5’- GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3’
Forward (Left)

Tm = 2 (5 + 6) + 4 (5 + 4)

Tm = 58°C TA = 53°C
5º C abaixo da Tm
 PRIMERS

Uso de Programas

Programa Primer 3

http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/

Colar a sequência do gene

Pick Primers (Left e Right)

PROGRAMA: PRIMER 3
PROGRAMA: PRIMER 3
LEGENDA

Len: Oligo Length

tm: Melting Temperature

Any: Self Complementarity - a

measure of its tendency to anneal to
itself or form secondary structure

3' : Self Complementarity-taken as

a measure of its tendency to form a
primer-dimer with itself

rep : Mispriming or Mishyb

Library Similarity - The similarity
to the specified Mispriming or
Mishyb library.

seq : Primer Sequence, 5'->3‘ The

sequence of the selected primer or
oligo, always 5'->3', so the right
primer is on the opposite strand
from the one supplied in the source
input. The right primer sequence is
the sequence you would want
synthesized in a primer order.)
 PCR

⇒ O que acontece dentro do termociclador??

Desnaturação = 94°C
1 Ciclo
Anelamento = 54°C
Extensão = 72°C
 REAÇÃO DE PCR

Anelamento
Reverse
ou

Forward
Primer Forward
Primer Reverse
REAÇÃO DE PCR
1° CICLO
 APÓS REAÇÃO
Quantidade de cópias aumenta em progressão geométrica
Cada uma das novas fitas de DNA sintetizadas a partir dos “primers”
serve como molde para síntese de uma nova fita.

Quantidade de cópias = 2 n
Onde, n = n° de ciclos

2 31 = 2 bilhões de cópias do fragmento

 ANÁLISE DA PCR

Verificar se houve amplificação do fragmento de interesse

Eletroforese: Análise em gel de agarose

• Concentração: 0,8% e 1% (acordo com tamanho fragmento)

• Marcador conhecido: para estimar o peso molecular

Presença de Banda = Positivo

Ausência de Banda = Negativo

• Amostras comparadas ao marcador determinando-se o tamanho

do fragmento de DNA amplificado
 ANÁLISE DA PCR
Detecção do gene Vip3A: Bacillus turingiensis

Primers utilizados para PCR e o

isolamento do Vip3A

Amplificação confirma a presença do gene

Gene 99,8% idêntico à sequência de nt publicada

para o gene Vip3A

Milho Bt - Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

 ANÁLISE DA PCR

Detecção de begomovírus em plantas de Tabaco

Rep
CP

Fragmento com aproximadamente 1.200 nucleotídeos para o DNA A,

compreendendo as extremidades 5' dos genes Rep e Cp e toda região comum

Calegario et al. Pesq. agropec. bras., Brasília, v.42, n.9, p.1335-1343, set. 2007
 PCR
Vantagens:

- Sensível (fentograma: 10-18)

- Rápido
- Grande n° amostras

Desvantagens:

- Apresenta alguns falsos positivos

- Importante controles +/-

Controle negativo = sem DNA

Controle negativo = com DNA, sem primer
Controle positivo = amostra conhecidamente positiva
 PCR

APLICAÇÕES

- Detecção de genes em DNA genômico

- Clonagem de DNA
- Sequenciamento
- Evolução molecular
- Análise de estrutura genômica
- Identificação de mutações
- Diagnóstico de doenças: humanos, animas e de plantas
- Teste de paternidade
.....
 HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Ácidos nucleicos: capacidade de hibridização

Sequências complementares pareiam Estrutura Duplex

Teste de complementaridade

DNA RNA

Southern Blot Northern Blot

 SOUTHERN BLOT

Detecta fragmento do DNA específico no DNA genômico

COMO?

Sonda: sequência complementar de DNA alvo

Introdução de nucleotídeos marcados em sequências de DNA

Sondas Radioativas = nt 32P

Não-Radioativas = nt biotina/digoxigenina (colorimétrica

ou quimioluminescente)
 KIT DE MARCAÇÃO

Kit Dig DNA

Produto PCR purificado

Fervido: 100° C/10 min => Gelo

PCR desnaturado
Nt (primers aleatórios - hexameros)
dNTP- Digoxigenina
Enzima Klenow DNA Polimerase I
Δ 37°C 12hs
 SOUTHERN BLOT
TRANSFERÊNCIA
Tratamentos:
Depurinação
Desnaturação
Neutralização

Gel: Fragmentos DNA

REVELAÇÃO
HIBRIDIZAÇÃO

-- -
-
Lavagens
-
- -
- - -
Retira excesso
de sonda
- - -
 O QUE ACONTECE NA MEMBRANA

Anticorpo contra digoxigenina Nucleotídeos marcados com

ligado a Fosfatase alcalina digoxigenina
DNA (-) imobilizado
E E E
Sonda fria

Membrana (+)

Adição substrato da enzima Fosfatase alcalina (NBT/BCIP)

=> clivagem e precipitação sobre a membrana
 SOUTERN BLOT
Plantas Transgênicas de Soja: seleção de eventos positivos

PCR

Cópias do transgene
DNA total Hind III
Separou o gene

Gel - 3hs

α32P: d-CTP Souther Hibridização

1 3 3 1 1 Blot 18hs
4 4 4 4 6 6
6 6

VIII Jornada Acadêmica da Embrapa Soja

 SOUTERN BLOT
Plantas Transgênicas de Batata

1 e 5: Marcador Peso Molecular

2 e 4: DNA total batata transgênica
digerido co Eco RI
3: DNA total batata Não-transgênica
digerido co Eco RI

DNA total digerido Eco RI Southern Blot do gel

 SOUTERN BLOT
Poucas cópias:
Importante para a expressão estável

Em estudos de expressão gênica => facilita a interpretação da

real interação entre as moléculas

Alto número de inserções do transgene:

Possibilita rearranjos das inserções que podem levar a perda

das mesmas ou ao silenciamento

Pode comprometer o desenvolvimento e metabolismo da

planta, pelo efeito posicional das inserções
 SOUTHERN BLOT
Vantagens:

Sensibilidade (fentograma)
Quantitativa: nº de cópias do gene integradas ao genoma
Envio de membranas para outro laboratório

Desvantagens:
Demorado
Caro
Perigoso (sondas radioativas)
 SOUTHERN BLOT

APLICAÇÕES

- Importante experimentos de Transformação => Prova

molecular da integração do gene exógeno no genoma vegetal

- Bandas com PM diferente do controle + => indicativo de

alterações no material genético

- Detecta fragmento específico em meio a milhões de

fragmentos

- Usado para distinguir estirpes de um organismo

 SEQUENCIAMENTO DO DNA

• Identificação da sequência exata dos nucleotídeos do DNA

Método Enzimático (Sanger): Similar à PCR

Baseado no término da cadeia com um nucleotídeo modificado

Reagentes Necessários => Reação de sequenciamento

• DNA a ser sequenciado
• Primer (aprox. 20nt)
• Nucleotídeos: dATP, dGTP, dTTP e dCTP
• Nucleotídeos modificados: ddATP, ddGTP, ddTTP e ddCTP
• DNA polimerase
 SEQUENCIAMENTO DO DNA

Nucleotídeos modificados: ddNT (didesoxirribonucleotídeos)

Não apresentam OH no Carbono 3’

Uma vez incorporados = impedem a adição de outro nucletídeo

Termina o alongamento da cadeia

São marcados: fluorocromo (emite fluorescência em determinado λ)

 SEQUENCIAMENTO DO DNA

Sequenciador de DNA: leitura dos nucleotídeos marcados

• Deposita amostras em placa (96 cavidades)

• Introduz a placa no equipamento

• Amostras correm pelos capilares preenchidos com um polímero

• Amostras migram ao longo dos capilares até atingirem região do

laser

• Excita fluorocromo => emite fluorescência no λ correspondente a

cada base

• Equipamento traduz e gera um gráfico = Eletroferograma

 SEQUENCIAMENTO DO DNA

Fragmentos de diferentes comprimentos gerados a partir do

primer, interrompidos quando um ddNT é incorporado à fita
 SEQUENCIAMENTO DO DNA

Feixe de laser

Os fragmentos migram no capilar (menores na frente)

São iluminados por um feixe de laser emitem fluorescência
quando atravessam a janela do feixe.
SEQUENCIAMENTO DO DNA

Eletroferograma
SEQUENCIAMENTO DO DNA
 SOMATÓRIO DE CONHECIMENTO

1. Amplificação do gene de interesse

2. Digestão do DNA e do plasmídeo com enzima de restrição

3. Ligação dos produtos de DNA e do vetor plasmídeo

4. Transformação da planta

5. Confirmação da presença do DNA na planta transformada:

PCR, Southern Blot

6. Sequenciamento
 BIBLIOGRAFIA

1. Brasileiro, Ana Cristina Miranda

Manual de Transformação Genética de Plantas
EMBRAPA SPI/EMBRAPA-CENARGEN, 1998

2. Oliveira, Márcia Cristina de Sena

Fundamentos teórico-práticos e protocolos de extração e de
amplificação de DNA por meio da técnica de reação em cadeia da
polimerase. EMBRAPA PECUÁRIA SUDESTE, 2007

3. Lima, et. al
Identificação do número de inserções via Southern blot em
linhagens de soja geneticamente modificadas VIII Jornada
Acadêmica da Embrapa Soja - EMBRAPA SOJA/LONDRINA