2.

Material e Métodos
O protocolo para a execução deste estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê

de Ética em Uso de Animais da UFMA (nº 23115.005413/2015-83).

O protocolo para execução deste estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Uso

de Animais da UFMA (nº 23115.005413/2015-83) e liberado de apreciação pelo motivo

da pesquisa em questão não utilizar vertebrados e sim dentes bovinos como substratos

comercialmente disponíveis.

2.1. Cálculo Amostral

Após a execução do teste piloto, o tamanho da amostra foi calculado adotando-se

α igual a 5%, poder do teste do Kruskal Wallis 80%. Chegou-se a um tamanho (n) de 10

elementos dentais para cada grupo experimental (PASS 11. NCSS, LLC, Kaysville,

Utah, USA).

2.2. Preparação dos espécimes

Oitenta incisivos bovinos extraídos de animais recém-abatidos, com idades entre 2

e 4 anos, foram selecionados. Os dentes foram limpos com lâminas de bisturi nº 11 e

armazenados em água destilada trocada semanalmente até o momento de suas

utilizações, período este que não ultrapassou 6 meses.

Os dentes foram seccionados perpendicularmente abaixo da junção

amelocementária, para remoção da raiz, com o auxílio de um disco diamantado

(Dremel, Campinas, SP, Brasil) acoplado a um torno de alta rotação (Nevoni, São

Paulo, Brasil).
 As coroas foram fixadas a uma base conectada a máquina para cortes de amostras

circulares desenvolvida pelo Prof. Carlos Rocha Gomes Torres e construída com os

recursos de um auxílio à pesquisa financiado pela FAPESP (2010/50912-8). Com

auxílio de uma broca trefina de 6mm de diâmetro interno adaptada à máquina de corte e

sob abundante irrigação foram obtidas amostras circulares de esmalte e dentina da

porção central mais plana da face vestibular das coroas.

Para a padronização da espessura, as amostras foram posicionadas em um

dispositivo metálico, que permitiu a determinação da profundidade. Para isto, a parede

pulpar permaneceu alinhada à superfície externa do dispositivo e esta superfície foi

posicionada para desgaste, em uma politriz circular (DP-10, Panambra, São Paulo, SP,

Brasil) com lixa de carbeto de silício de granulação P1200 (Fepa P, Extec, Enfield, CT,

USA), sob refrigeração constante de água.

Em seguida foi realizado um risco no lado pulpar para posterior identificação, e

as amostras foram novamente posicionadas no dispositivo metálico, previamente

ajustado com a profundidade de 1,1 mm, com a face externa voltada para fora. E estas

foram levadas para desgaste em politriz circular com lixa P1200. Para polimento da

superfície dentinária as amostras foram posicionadas no dispositivo metálico ajustado

com a profundidade de 1 mm e desgastadas na politriz acoplada com lixa P2400 (Fepa

P, Extec, Enfield, CT, USA) por 30 s. Obtendo-se discos de dentina com 1 mm de

espessura e adequada lisura superficial17.

2.3. Abertura dos túbulos dentinários

Para remoção da smear layer e abertura tubular as amostras foram imersas em

solução de ácido fosfórico 37%15 por 30 s. A seguir estas foram abundantemente lavadas
com água deionizada durante 30s e colocadas individualmente em eppendorf

numerados, contendo solução de timol a 0,1%.

2.4. Permeabilidade dentinária inicial

A permeabilidade dentinária inicial foi medida, após a remoção da smear layer e

abertura tubular, utilizando-se o aparelho, modelo câmara dividida, THD 03 (ODEME

Equipamentos médicos e odontológicos Ltda, Joaçaba, SC, Brasil), e, esta medida foi

considerada como 100% do valor da permeabilidade.

As amostras foram colocadas entre dois anéis que permitiram a padronização da

área disponível para filtração da água deionizada com 0,03801 cm² e adequada vedação.

O lado pulpar sempre ficou em contato com o fluido (água deionizada) sob a pressão de

703,1 cmH₂O e o lado externo ficou voltado para o meio ambiente. Durante 2 min a

filtração do fluido através da dentina foi acompanhada pelo deslocamento linear de uma

bolha de ar inserida no capilar de vidro (volume interno de 75µl e comprimento de 101

mm), que une o reservatório de água e a câmara de perfusão, utilizando-se um

paquímetro digital.

Três medidas consecutivas do deslocamento linear da bolha foram registradas

para cada amostra e a média dessas medidas foi utilizada para a determinação da

permeabilidade dentinária. A permeabilidade dentinária foi medida por meio da

condutância hidráulica (Lp) que quantifica o volume de fluido, sob uma pressão

hidrostática definida (703,1 cmH₂O), que atravessa a dentina num intervalo de tempo (2

min). A condutância hidráulica de cada amostra foi calculada utilizando-se a seguinte

fórmula: Lp=Q/(AS.P), onde L=condutância hidráulica expressa em

µl.cm².min‾¹.cmH₂O‾¹, Q= taxa de filtração em μL.min-1, AS= área de superfície

exposta à filtração em cm², P = pressão hidrostática que atravessa a dentina em cmH₂O.

2.5. Distribuição dos grupos experimentais

Após a leitura da permeabilidade inicial os espécimes foram divididos de forma

estratificada em 8 grupos experimentais (n=10) de modo que os grupos tivessem médias

semelhantes de condutância hidráulica inicial e fossem mais homogêneos em termos de

permeabilidade dentinária.

As amostras foram posicionadas em uma matriz de silicone, com as dimensões

exatas dos espécimes, de modo a garantir que somente a face externa das amostras

recebessem o tratamento.

As informações sobre os diferentes tratamentos dentinários estão descritos na

Tabela 1.
 Tabela 1 – Materiais usados nos grupos experimentais
GRUPOS MATERIAL/LOTE COMPOSIÇÃO MODO DE APLICAÇÃO
Primer: 10 –metacriloxidecil
diidrogeniofosfato (MDP),
2- hidroxietil metacrilato
(HEMA), dimetacrilato Secagem com papel absorvente
Clearfil SE Bond
hidrófilo canforoquinona, Aplicação ativa do primer por 20 s
Primer
N,N – dietanol-P-toluidina, Leve jato de ar por 5 s
L: 01245A
água Aplicação ativa do adesivo por 20 s
CSB Adesivo
Adesivo: MDP, bis-fenol A Leve jato de ar por 5 s
L: 01882A
glicidil dimetacrilato (Bis- Fotopolimerização por 10 s
GMA), HEMA,
dimetacrilato hidrófobo,
canforoquinona, N,N –
dietanol-P-toluidina, sílica
coloidal silanizada
Bisfenol A diglicidil éter
dimetacrilato (Bis-GMA),
metacrilato de 2-hidroxietila,
sílica tratada com silício,
álcool etílico, decametileno Secagem da superfície com papel absorvente
Single Bond dimetacrilato, água, 1,10- Aplicação ativa do adesivo com um aplicador
Universal – 3M decanodiol fosfato descartável durante 20 s.
SBU
L: 1432500600 metacrilato, copolímero de Leve jato de ar por 5 s
acrílico e ácido itacônico, Fotopolimerização por 10 s
canforoquinona, N,N-
dimetilbenzocaína,
metacrilato de 2-
dimetilamonoetilo, metil etil
cetona
Primer: água, 2-hidroxietil Secagem da superfície com papel absorvente
metacrilato (HEMA), Aplicação de ácido fosfórico gel a 37% por
Scotchbond
copolímero do ácido 15s
Multipurpose –
polialcenoico Lavagem por 15s e secagem com papel
3M
Adesivo: Bis-GMA, HEMA absorvente
SM Primer
combinados com um sistema Aplicação ativa do primer por 15 s
L: N607969
de iniciação de Leve jato de ar por 5s.
Adesivo
polimerização Aplicação ativa do adesivo por 15 s
L: N551363
Leve jato de ar por 5 s
Fotopolimerização por 10 s.
Etanol, Bis-GMA, silano Secagem da superfície com papel absorvente
tratado com particula de Aplicação de ácido fosfórico a 37% por 15s
sílica, 2- Lavagem com água por 10s e secagem com
Single Bond 2 –
hidrosietilmetacrilato, papel absorvente
3M
SB2 glicerol 1,3 dimetacrilato, Duas camadas de Single Bond 2
L: N587475
copolímero de ácido acrílico consecutivas, aplicadas ativamente por 15s
e ácido itacônico e diuretano Leve jato de ar por 5s
dimetacrilato Fotopolimerização por 10s

50mg/ml de fluoreto de
sódio, colofônia, álcool
Colgate Duraphat
CD etílico, goma-laca, mástica,
L: 071401
sacarina, aroma, cera branca
de abelha
N Dessensibilize Ingredientes ativos: Fosfato
Nano P de cálcio nanométrico (na
L: 250614 forma e hidroxiapatita),
fluoreto de sódio, nitrato de
potássio
Secagem da superfície com papel absorvente
Aplicação do verniz com auxílio de um
microbrush
Secagem da superfície com papel absorvente
Aplicação do produto com microbrush
Fricção da superfície com um disco de feltro
(Diamond flex, FGM) por 10s, adaptado em
baixa rotação com velocidade baixa
 Ingredientes inativos: água Deixar o produto em repouso por 5 min
destilada, espessante, Remoção do excesso com bolinha de algodão
tensoativo, umectante,
aroma, adoçante e
conservante.
Secagem da superfície com papel absorvente.
Pasta A: Pó de vidro
Dispensa de um click do produto no bloco de
silanizado, sílica tratada com
mistura. Liberada a alavanca após parar de
silício, metacrilato 2-
sair o produto (2s)
hidroxietila, água, bisfenol
CLINPRO XT Mistura dos componentes por 10 a 15 s, em
A diglicidil éter
VARNISH área de 2,5 cm de diâmetro, obtendo-se uma
CXV dimetacrilato (BIS-GMA)
L: 1432800813 mistura de aparência lisa e brilhante
Líquido B: Copolímero de
Aplicação da mistura, formando uma camada
ácido acrílico e itacônico,
uniforme de 0,5 mm, com um microbrush
água, metacrilato 2-
Fotoativação por 20s
hidroxietila
Limpeza da superfície com bolinha de
algodão umedecida
NENHUM
C
TRATAMENTO

Após a realização dos diferentes tratamentos dentinários as amostras foram

novamente armazenadas nos eppendorfs devidamente identificados, preenchidos com

água ultrapura, e mantidas, por 24 h, em estufa a 37±1 °C.

2.6. Permeabilidade dentinária após os tratamentos

Após os diferentes tratamentos nas superfícies dentinárias, novas leituras da

permeabilidade dentinária foram realizadas para cada amostra conforme metodologia

acima descrita.

2.7. Desafio ácido

O desafio ácido foi realizado por meio de quatro ciclos diários de erosão durante

cinco dias. Sendo cada ciclo composto pela imersão dos espécimes, posicionados em

matriz de silicone com a face vestibular voltada para cima de modo a garantir que

somente esta face fosse exposta ao desafio, em solução de ácido cítrico a 0,3%, com pH
natural de 2,3 durante 2 minutos. Seguida pela lavagem dos espécimes em água

ultrapura e imersão dos mesmos em saliva artificial (pH=7) formulação proposta por

Gohring et al 2004 durante 1 hora. Após a imersão em saliva artificial os espécimes

foram lavados com água ultrapura e novo ciclo foi iniciado. A solução de ácido cítrico e

de saliva artificial foram trocadas em cada ciclo. Após a realização de quatro ciclos os

espécimes foram mantidos em saliva artificial, trocada diariamente, por 20 horas. A

sequência de 4 ciclos de desafio ácido e 20 horas de imersão em saliva foi repetida por 5

dias consecutivos. Ao final do desafio ácido as amostras foram colocadas em

eppendorfs devidamente identificados contendo água ultrapura e mantidos em estufa a

37±1°.

2.8. Permeabilidade dentinária após os tratamentos

Após o desafio ácido, novas leituras da permeabilidade dentinária foram

realizadas para cada amostra conforme metodologia acima descrita.

2.9. Variação do percentual de permeabilidade

A permeabilidade inicial (Pinicial) obtida após a remoção da smear layer e

abertura tubular foi considerada como sendo o valor de 100% para cada amostra

analisada. Então calculou-se a variação do percentual de permeabilidade dentinária para

cada amostra após o tratamento e após o desafio ácido, sendo que cada amostra foi

controle de si mesmo, utilizando-se a seguinte fórmula: P% = (Lp.100)/Lpinicial, onde

P% = percentual de permeabilidade em relação à permeabilidade inicial, Lp =

condutância hidráulica em cada momento, Lpinicial = condutância hidráulica inicial

considerada após a remoção da smear layer e abertura tubular.

3.0. Avaliação em microscópio eletrônico de varredura (MEV)

 Uma amostra de cada grupo experimental, após os tratamentos dentinários e

o desafio ácido, foi utilizada para a obtenção de imagem em microscopia eletrônica de

varredura (MEV) a fim de se observar o efeito oclusivo dos diferentes tipos de

tratamento e sua durabilidade. Para isso as amostras selecionadas para MEV foram

foram colocadas para secar em uma cuba contendo sílica por 24 h.

Posteriormente, as amostras foram posicionadas em um stub de alumínio

com o auxílio de uma fita de carbono condutora para serem levados a um aparelho

metalizador. (SC7620 Sputter Coater, Emitech). A análise das amostras foi realizada

pela captação das imagens por meio de um software acoplado ao MEV (Inspect 550,

Fei), permitindo a obtenção de fotomicrografias.