MICRO-ALIMENTOS

Determinação De Coliformes Termotolerantes Na Polpa Do Açaí

No primeiro momento deve se obter a amostra de polpa de açaí, em estado
congelado e manter de forma congelada até se iniciar o estudo. Iniciando o trabalho a
amostra deve ser descongelada em temperatura ambiente e pesado 25 mg desta para
passar para um enlermayer contendo 225 mL de água peptonada estéril, o que nos
dará uma diluição de 10-1, sendo a partir desta que se fará mais diluições até a 10 -3
utilizando o mesmo diluente.
O método de quantificação de coliformes termotolerantes será o de
Determinação do Número Mais Provável (NMP), onde alíquotas contendo 1 mL de
cada diluição serão inoculadas em séries de três tubos contendo 9 mL de caldo LST
(Lauril Sulfato Triptose), onde estará dentro deste um tubo Duhran invertido.
Posteriormente os tubos serão incubados em uma temperatura de 35ºC por 24 horas.
Os tubos que tiverem turvação e formação de bolhas serão os resultados positivos do
teste presuntivo.
A partir do teste presuntivo iniciará o teste confirmativo para coliformes
termotolerantes em caldo Escherichia coli incubado a temperatura de 45ºC por 24
horas. As reações positivas serão lidas (tubos com formação de gás) e o número de
tubos positivos serão levados em consideração no cálculo de densidade de bactérias,
sendo necessária a tabela do NMP para ajudar no resultado final.
PREPARO DO MEIO DE CULTURA EM VRBA
1. Suspender 41,6 g do meio em 1 litro de água purificada;
2. Aquecer, agitando frequentemente e ferver por 2 minutos para que haja a
dissolução completa do meio;
3. Resfriar o meio a 45-46 º e despejar nas placas.
COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA
- Digestão enzimática de gelatina
- Extrato de levedura
- Mistura de sais biliares
- Lactose
- Cloreto de sódio
- Vermelho neutro
 - Cristal violeta
- 4-metillumbeliferil-b-DGlicuronídio Agar
APARÊNCIA DAS COLONIAS DE COLIFORMES
A classificação de coliformes apresenta o grupo de Coliformes totais que inclue
as bactérias na forma de bastonetes Gram negativos, não esporogênicos, aeróbios ou
aeróbios facultativos capazes de fermentar ou não a lactose. Dentro desse grupo
apresentam-se cerca de 20 espécies, dentre as quais se encontram tanto bactérias
originárias do trato intestinal de humanos e outros animais de sangue quente.
Conforme descrito no Manual Oxoid, o meio Ágar Vermelho Violeta Bile com
lactose é seletivo para detecção e contagem de coliformes. Os microorganismos
quando presentes fermentam rapidamente a lactose do meio produzindo colônias
púrpuras circundadas por halos purpura (Figura 1), já os que não fermentam lactose ou
que fermentam tardiamente, produzem colônias pálidas com zonas esverdeadas (Figura
2). Quando em Caldo Lauril Triptose incorporado com MUG (4-Metilumbeliferil-β-D-
Glicuronídeo), colônias de E. coli são vermelhas e cercadas por uma zona de
precipitado de bile e apresentam fluorescência azul sob a luz ultravioleta de
comprimento de onda longo (Figura 3).

Fig. 1: Coliformes totais em meio VRBA

Fig.2: Diferença entre E.coli e P. mirabilis (fermentador e não fermentador de lactose,
respectivamente)

Fig.3: E coli apresentando fluorescência quando em meio incorporado com MUG

LIMITE PERMITIDO DE COLIFORMES NAS AMOSTRAS DE AÇAÍ

Segundo a RDC nº 12 a polpa de açaí está na classe de número 17 onde estão
empregados os valores de referência para amostras de sucos, refrescos, refrigerantes e
outros tipos de bebidas que não são alcóolicas. Na RDC há uma divisão para organizar
na análise para definir o limite de tolerância tanto da amostra indicativa como para a
representativa.
Na amostra indicativa os valores são bem diretos e quando não se pode ter
nada de microrganismo naquela determinada amostra o valor de referência é ausente,
representado por “aus”. Já para amostra representativa os valores são classificados de
acordo com os planos de amostragem, dados por m que é o limite em que um plano
de 3 classes, separa o lote aceitável de um lote intermediário e inaceitável; o M é o
valor limite para que essa amostra seja aceitável intermediário tudo que passa desse
valor é inaceitável; o n é o número de unidades a serem colhidas aletoriamente de um
mesmo lote e analisadas individualmente, onde o padrão estabelecido é de ausência
em 25g; e por fim o c é o número máximo aceitável de unidades de amostras com
contagens entre os limites de m e M.
Na análise com polpa de açaí a tolerância para amostra indicativa é ausente
para coliformes a 35ºC/50 ml e salmonella Sp/25 ml. Ou seja não pode haver
unidades formadoras de colônias desses microrganismos na análise. Já nos valores de
tolerância para amostra representativa o valor tem que ser n = 5, c = 0, m e M aus. O
que mostra que em cinco amostras analisadas individualmente nem uma pode ter
esses microrganismos.