19/03/2020 A hidroxicloroquina, um derivado menos tóxico da cloroquina, é eficaz na inibição da infecção por SARS-CoV-2 in vitro | Descobert…

A hidroxicloroquina, um derivado
menos tóxico da cloroquina, é
eficaz na inibição in vitro da
infecção por SARS-CoV-2
Jia Liu ,Ruiyuan Cao ,Mingyue Xu ,Xi Wang ,Huanyu Zhang ,Hengrui Hu ,Yufeng Li ,Zhihong Hu
,Wu Zhong  &Manli Wang  

Cell Discovery 6 , Número do artigo: 16 ( 2020 )

1169 Altmetric

métricas

Download PDF
Caro editor,

O surto da doença de coronavírus 2019 (COVID-19) causado pela síndrome respiratória aguda
grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2/2019-nCoV) representa uma séria ameaça à saúde pública
global e às economias locais. Em 3 de março de 2020, mais de 80.000 casos foram confirmados
na China, incluindo 2946 mortes e mais de 10.566 casos confirmados em 72 outros países. Um
número tão grande de pessoas infectadas e mortas exige uma demanda urgente de medicamentos
eficazes, disponíveis e acessíveis para controlar e diminuir a epidemia.

Recentemente, relatamos que dois medicamentos, o remdesivir (GS-5734) e o fosfato de

cloroquina (CQ), inibiram eficientemente a infecção por SARS-CoV-2 in vitro 1 . O remdesivir é
um pró-fármaco análogo de nucleosídeo desenvolvido pela Gilead Sciences (EUA). Um relato de
caso recente mostrou que o tratamento com remdesivir melhorou a condição clínica do primeiro
paciente infectado por SARS-CoV-2 nos Estados Unidos 2e um ensaio clínico de fase III do
remdesivir contra o SARS-CoV-2 foi lançado em Wuhan em 4 de fevereiro de 2020. No entanto,
como medicamento experimental, não se espera que o remdesivir esteja amplamente disponível
para o tratamento de um número muito grande de pacientes em um maneira oportuna. Portanto,
dos dois medicamentos em potencial, o CQ parece ser o medicamento de escolha para uso em
larga escala devido à sua disponibilidade, registro de segurança comprovado e custo
relativamente baixo. À luz dos dados clínicos preliminares, o CQ foi adicionado à lista de
https://www.nature.com/articles/s41421-020-0156-0 1/8
19/03/2020 A hidroxicloroquina, um derivado menos tóxico da cloroquina, é eficaz na inibição da infecção por SARS-CoV-2 in vitro | Descobert…

medicamentos em estudo nas Diretrizes para o diagnóstico e tratamento do COVID-19 (sexta

edição) publicada pela Comissão Nacional de Saúde da República Popular da China.

CQ (N4- (7-Cloro-4-quinolinil) -N1, N1-dietil-1,4-pentanodiamina) tem sido muito utilizado no

tratamento da malária e da amebíase. No entanto, o Plasmodium falciparum desenvolveu ampla
resistência a ele e, com o desenvolvimento de novos antimaláricos, tornou-se uma opção para a
profilaxia da malária. Além disso, uma overdose de CQ pode causar intoxicação aguda e
morte 3 . Nos últimos anos, devido à utilização pouco frequente de CQ na prática clínica, sua
produção e oferta de mercado foram bastante reduzidas, pelo menos na China. O sulfato de
hidroxicloroquina (HCQ), um derivado da CQ, foi sintetizado pela primeira vez em 1946 pela
introdução de um grupo hidroxila na CQ e demonstrou ser muito menos (~ 40%) tóxico do que a
CQ nos animais 4. Mais importante, o HCQ ainda está amplamente disponível para tratar
doenças autoimunes, como lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatóide. Como o CQ e o
HCQ compartilham estruturas e mecanismos químicos semelhantes, agindo como uma base fraca
e imunomodulador, é fácil evocar a idéia de que o HCQ pode ser um candidato potente para
tratar a infecção por SARS-CoV-2. Na verdade, em 23 de fevereiro de 2020, sete registros de
ensaios clínicos foram encontrados no Chinese Clinical Trial Registry
( http://www.chictr.org.cn ) para o uso do HCQ no tratamento do COVID-19. Se o HCQ é tão
eficaz quanto o CQ no tratamento da infecção por SARS-CoV-2 ainda carece de evidências
experimentais.

Para este fim, avaliamos o efeito antiviral do HCQ contra a infecção por SARS-CoV-2 em
comparação com o CQ in vitro. Primeiro, a citotoxicidade de HCQ e CQ em células VeroE6 de
rim de macaco verde africano (ATCC-1586) foi medida pelo ensaio CCK8 padrão, e o resultado
mostrou que os valores de 50% de concentração citotóxica (CC 50 ) de CQ e HCQ eram 273,20 e
249,50 μM, respectivamente, que não são significativamente diferentes um do outro
(Fig. 1a ). Para comparar melhor a atividade antiviral de CQ versus HCQ, as curvas dose-
resposta dos dois compostos contra SARS-CoV-2 foram determinadas em quatro diferentes
multiplicidades de infecção (MOIs) pela quantificação dos números de cópias de RNA viral no
sobrenadante celular aos 48 anos. h pós-infecção (pi). Os dados resumidos na Fig. 1ae a Tabela
Suplementar S1 mostra que, em todos os MOIs (0,01, 0,02, 0,2 e 0,8), a concentração efetiva
máxima de 50% (CE 50 ) para CQ (2,71, 3,81, 7,14 e 7,36 μM) foi menor que a do HCQ (4,51,
4,06, 17,31 e 12,96 μM). As diferenças na CE 50 os valores foram estatisticamente significativos
a uma MOI de 0,01 ( P  <0,05) e MOI de 0,2 ( P  <0,001) (Tabela Suplementar S1 ). Vale a pena
notar que os valores de CE 50 da CQ pareciam um pouco maiores do que no nosso relatório
anterior (1,13 μM com um MOI de 0,05) 1, provavelmente devido à adaptação do vírus na
cultura de células que aumentou significativamente a infectividade viral após passagem
contínua. Conseqüentemente, o índice de seletividade (SI = CC 50 / EC 50 ) de CQ (100,81,
71,71, 38,26 e 37,12) foi superior ao do HCQ (55,32, 61,45, 14,41, 19,25) em MOIs de 0,01,
0,02, 0,2, e 0,8, respectivamente. Esses resultados foram corroborados por microscopia de
imunofluorescência, como evidenciado por diferentes níveis de expressão da nucleoproteína viral
(NP) nas concentrações indicadas de fármacos às 48 h pi (Fig. Suplementar S1 ). Tomados em
conjunto, os dados sugerem que a atividade anti-SARS-CoV-2 do HCQ parece ser menos potente
em comparação com o CQ, pelo menos em certos MOIs.

https://www.nature.com/articles/s41421-020-0156-0 2/8
19/03/2020 A hidroxicloroquina, um derivado menos tóxico da cloroquina, é eficaz na inibição da infecção por SARS-CoV-2 in vitro | Descobert…

Fig. 1: Eficácia antiviral comparativa e mecanismo de ação de CQ e HCQ contra a

infecção por SARS-CoV-2 in vitro.
figura 1

a Citotoxicidade e atividades antivirais de CQ e HCQ. A citotoxicidade dos dois

fármacos nas células Vero E6 foi determinada por ensaios de CCK-8. As células Vero
E6 foram tratadas com diferentes doses de composto ou com PBS nos controles por
1 h e depois infectadas com SARS-CoV-2 em MOIs de 0,01, 0,02, 0,2 e 0,8. O
rendimento do vírus no sobrenadante celular foi quantificado por qRT-PCR às 48 h
pi- eixo Yrepresenta a média da porcentagem de inibição normalizada no grupo
PBS. As experiências foram repetidas duas vezes. b , cMecanismo de CQ e HCQ na
inibição da entrada de vírus. As células Vero E6 foram tratadas com CQ ou HCQ (50
μM) por 1 h, seguidas pela ligação do vírus (MOI = 10) a 4 ° C por 1 h. Em seguida,
os virions não ligados foram removidos e as células foram suplementadas com meio
fresco contendo medicamento a 37 ° C por 90 min antes de serem fixadas e coradas
com IFA usando anticorpo anti-NP para virions (vermelho) e anticorpos contra EEA1
para EEs ( verde) ou LAMP1 para ELs (verde). Os núcleos (azuis) foram corados com
corante Hoechst. A porção de virions que co-localizou com EEs ou ELs em cada
grupo ( n  > 30 células) foi quantificada e é mostrada em b . Imagens microscópicas
confocais representativas de partículas virais (vermelho), EEA1 + EEs (verde) ou
LAMP1 +ELs (verde) em cada grupo são exibidos em c . As imagens ampliadas nas
caixas indicam um único virião contendo vesícula. As setas indicavam as vesículas
anormalmente aumentadas. Barras, 5 μm. A análise estatística foi realizada usando
uma análise de variância unidirecional (ANOVA) com GraphPad Prism ( F  = 102,8, df
= 5.182, *** P  <0,001).

Tanto o CQ quanto o HCQ são bases fracas, conhecidas por elevar o pH de organelas
intracelulares ácidas, como endossomos / lisossomos, essenciais para a fusão da
membrana 5 . Além disso, o CQ poderia inibir a entrada do SARS-CoV através da alteração da
glicosilação do receptor ACE2 e da proteína de pico 6 . O experimento de tempo de adição
confirmou que o HCQ inibiu efetivamente a etapa de entrada, bem como os estágios pós-entrada
da SARS-CoV-2, que também foram encontrados no tratamento com CQ (Fig.
Suplementar S2) Para explorar ainda mais o mecanismo de ação detalhado de CQ e HCQ na
inibição da entrada de vírus, a co-localização de virions com endossomas precoces (EEs) ou
endolisossomos (ELs) foi analisada por análise de imunofluorescência (IFA) e microscopia
confocal. A análise de quantificação mostrou que, aos 90 min pi nas células não tratadas, 16,2%
dos virions internalizados (anti-NP, vermelho) foram observados nos EEs positivos do antígeno 1
do endossomo 1 (EEA1) (verde), enquanto mais virions (34,3%) foram transportado para a
proteína endossomal-lisossômica tardia LAMP1 + ELs (verde) ( n  > 30 células para cada
grupo). Por outro lado, na presença de CQ ou HCQ, significativamente mais virions (35,3% para
CQ e 29,2% para HCQ; P <0,001) foram detectados nos EEs, enquanto apenas muito poucos
virions (2,4% para CQ e 0,03% para HCQ; P  <0,001) foram co-localizados com
https://www.nature.com/articles/s41421-020-0156-0 3/8
19/03/2020 A hidroxicloroquina, um derivado menos tóxico da cloroquina, é eficaz na inibição da infecção por SARS-CoV-2 in vitro | Descobert…
+
LAMP1 ELs ( n  > 30 células) (Fig. 1b c ) Isso sugeriu que tanto o CQ quanto o HCQ
bloquearam o transporte de SARS-CoV-2 dos EEs para os ELs, o que parece ser um requisito
para liberar o genoma viral, como no caso do SARS-CoV 7 .

Curiosamente, descobrimos que o tratamento com CQ e HCQ causou mudanças visíveis no

número e tamanho / morfologia de EEs e ELs (Fig. 1c ). Nas células não tratadas, a maioria dos
EEs era muito menor que os ELs (Fig. 1c ). Nas células tratadas com CQ e HCQ, foram
observadas vesículas de EE anormalmente aumentadas (Fig. 1c, setas nos painéis superiores),
muitas das quais são ainda maiores que os ELs nas células não tratadas. Isso está de acordo com
relatório anterior de que o tratamento com CQ induziu a formação de vesículas citoplasmáticas
expandidas 8. Dentro das vesículas EE, os virions (vermelhos) foram localizados ao redor da
membrana (verde) da vesícula. O tratamento com CQ não causou mudanças óbvias no número e
tamanho dos ELs; no entanto, a estrutura regular da vesícula parecia ter sido interrompida, pelo
menos parcialmente. Por outro lado, nas células tratadas com HCQ, o tamanho e o número de
ELs aumentaram significativamente (Fig. 1c , setas nos painéis inferiores).

Como a acidificação é crucial para a maturação e função do endossoma, supomos que a

maturação do endossoma possa ser bloqueada em estágios intermediários da endocitose,
resultando em falha no transporte adicional de virions para o local de liberação final. Foi relatado
que o CQ eleva o pH do lisossomo de cerca de 4,5 a 6,5 a 100 μM 9 . Até onde sabemos, faltam
estudos sobre o impacto do HCQ na morfologia e nos valores de pH dos endossomos /
lisossomos. Nossas observações sugeriram que o modo de ação de CQ e HCQ parece ser distinto
em certos aspectos.

Foi relatado que a absorção oral de CQ e HCQ em humanos é muito eficiente. Nos animais, os
dois medicamentos compartilham padrões de distribuição de tecidos semelhantes, com altas
concentrações no fígado, baço, rim e pulmão, atingindo níveis 200 a 700 vezes superiores aos do
plasma 10 . Foi relatado que a dosagem segura (6 a 6,5 mg / kg por dia) de sulfato de HCQ
poderia gerar níveis séricos de 1,4 a 1,5 μM em humanos 11 . Portanto, com uma dosagem
segura, é provável que seja alcançada a concentração de HCQ nos tecidos acima para inibir a
infecção por SARS-CoV-2.

A investigação clínica descobriu que alta concentração de citocinas foi detectada no plasma de
pacientes críticos infectados com SARS-CoV-2, sugerindo que a tempestade de citocinas estava
associada à gravidade da doença 12. Além de sua atividade antiviral direta, o HCQ é um agente
anti-inflamatório seguro e bem-sucedido que tem sido amplamente utilizado em doenças auto-
imunes e pode diminuir significativamente a produção de citocinas e, em particular, fatores pró-
inflamatórios. Portanto, em pacientes com COVID-19, o HCQ também pode contribuir para
atenuar a resposta inflamatória. Em conclusão, nossos resultados mostram que o HCQ pode
inibir eficientemente a infecção por SARS-CoV-2 in vitro. Em combinação com sua função anti-
inflamatória, prevemos que o medicamento tenha um bom potencial para combater a
doença. Esta possibilidade aguarda confirmação por ensaios clínicos. Precisamos ressaltar que,

https://www.nature.com/articles/s41421-020-0156-0 4/8
19/03/2020 A hidroxicloroquina, um derivado menos tóxico da cloroquina, é eficaz na inibição da infecção por SARS-CoV-2 in vitro | Descobert…

embora o HCQ seja menos tóxico que o CQ, o uso prolongado e de overdose ainda pode causar
intoxicação.

Referências
1 Wang, M. et ai. O remdesivir e a cloroquina inibem efetivamente o novo coronavírus recém-
surgido (2019-nCoV) in vitro. Cell Res. 30 , 269–271 (2020).

2) Holshue, ML et al. Primeiro caso do novo coronavírus de 2019 nos Estados Unidos. N.
Engl. J. Med. https://doi.org/10.1056/NEJMoa2001191 (2020).

3) Weniger, H. Revisão dos efeitos colaterais e toxicidade da cloroquina. Touro. World

Health 79 , 906 (1979).

4) McChesney, EW Toxicidade animal e farmacocinética do sulfato de hidroxicloroquina. Sou. J.

Med. 75 , 11-18 (1983).

5) Mauthe, M. et ai. A cloroquina inibe o fluxo autofágico, diminuindo a fusão autofagossomo-

lisossomo. Autophagy 14 , 1.435-1455 (2018).

6 Savarino, A. et ai. Novas idéias sobre os efeitos antivirais da cloroquina. Lancet Infect. Dis. 6 ,
67-69 (2006).

7) Mingo, RM et al. O vírus Ebola e o coronavírus com síndrome respiratória aguda grave
exibem cinética tardia na entrada de células: evidências de que o transporte para os
endolisossomos NPC1 + é uma etapa que define a taxa. J. Virol. 89 , 2931- 2943 (2015).

8) Zheng, N., Zhang, X. & Rosania, GR Efeito da fosfolipidose na farmacocinética celular da

cloroquina. J. Pharmacol. Exp. Ther. 336 , 661–671 (2011).

9 Ohkuma, S. & Poole, B. Medição por sonda de fluorescência do pH intralissossômico em

células vivas e a perturbação do pH por vários agentes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 75, 3327-3331
(1978).

10) Popert, AJ Choloroquine: uma revisão. Rheumatology 15 , 235-238 (1976).

11) Laaksonen, AL, Koskiahde, V. & Juva, K. Dosagem de medicamentos antimaláricos para
crianças com artrite reumatóide juvenil e lúpus eritematoso sistêmico. Estudo clínico com
determinação das concentrações séricas de cloroquina e hidroxicloroquina. Scand. J.
reumatol. 3 , 103-108 (1974).

https://www.nature.com/articles/s41421-020-0156-0 5/8
19/03/2020 A hidroxicloroquina, um derivado menos tóxico da cloroquina, é eficaz na inibição da infecção por SARS-CoV-2 in vitro | Descobert…

12) Huang, C. et ai. Características clínicas de pacientes infectados com o novo coronavírus de
2019 em Wuhan, China. Lancet 395 , 497–506 (2020).

Reconhecimentos
Agradecemos ao professor Zhengli Shi e ao Dr. Xinglou Yang do Instituto de Virologia Wuhan e
ao professor Fei Deng do National Virus Resource Center por fornecer a cepa SARS-CoV-2
(nCoV-2019BetaCoV / Wuhan / WIV04 / 2019); Professor Xiulian Sun, pela gentil ajuda na
análise estatística; Professor Zhenhua Zheng por fornecer gentilmente o anticorpo policlonal de
coelho anti-LAMP1; Zhengli Shi, por gentilmente fornecer o anticorpo policlonal anti-
NP; Beijing Savant Biotechnology Co., ltd por fornecer gentilmente o anticorpo monoclonal
anti-NP; Min Zhou e Xijia Liu por sua assistência neste estudo; Jia Wu, Jun Liu, Hao Tang e Tao
Du, do Laboratório BSL-3, e Dr. Ding Gao, da faculdade principal do Instituto de Virologia
Wuhan, pelo apoio crítico; Professor Gengfu Xiao, O professor Yanyi Wang e outros colegas do
Instituto de Virologia Wuhan e do Laboratório Nacional de Biossegurança de Wuhan pela
excelente coordenação; e Dr. Basil Arif pela edição científica do manuscrito. Este trabalho foi
apoiado em parte por doações dos Principais Projetos Nacionais de Ciência e Tecnologia para
“Inovação e Desenvolvimento de Novas Drogas Principais” (2018ZX09711003 a WZ),
Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31621061 a ZH) e Ciência e Tecnologia de
Hubei Projeto (2020FCA003 a ZH).

Informação sobre o autor

Esses autores contribuíram igualmente: Jia Liu, Ruiyuan Cao, Mingyue Xu

Afiliações
Laboratório Chave Estatal de Virologia, Instituto de Virologia Wuhan, Centro de Mega-Ciência
de Biossegurança, Academia Chinesa de Ciências, 430071, Wuhan, China
Jia Liu, Mingyue XuXi Wang, Huanyu ZhangHengrui HuYufeng Li, Zhihong Hu & Manli Wang

Centro Nacional de Pesquisa de Engenharia para Medicamentos de Emergência, Instituto de

Farmacologia e Toxicologia de Pequim, 100850, Pequim, China
Ruiyuan Cao & Wu Zhong

Universidade da Academia Chinesa de Ciências, 100049, Pequim, China

Mingyue Xu, Huanyu ZhangHengrui Hu & Yufeng Li

https://www.nature.com/articles/s41421-020-0156-0 6/8
19/03/2020 A hidroxicloroquina, um derivado menos tóxico da cloroquina, é eficaz na inibição da infecção por SARS-CoV-2 in vitro | Descobert…

Contribuições
ZH, MW e WZ conceberam e projetaram os experimentos e forneceram a aprovação final do
manuscrito. JL, RC, MX, XW, HZ, HH e YL participaram de várias experiências; todos os
autores analisaram os dados. MW, RC, JL e ZH escreveram o manuscrito.

Autores correspondentes
Correspondência para Zhihong Hu ou Wu Zhong ou Manli Wang .

Declarações de ética

Conflito de interesses
Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Informação adicional
Nota do editor A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais
em mapas publicados e afiliações institucionais.

Informação suplementar

Materiais suplementares

Direitos e permissões

https://www.nature.com/articles/s41421-020-0156-0 7/8
19/03/2020 A hidroxicloroquina, um derivado menos tóxico da cloroquina, é eficaz na inibição da infecção por SARS-CoV-2 in vitro | Descobert…

Acesso aberto Este artigo está licenciado sob uma Licença Internacional Creative Commons
Attribution 4.0, que permite uso, compartilhamento, adaptação, distribuição e reprodução em
qualquer meio ou formato, desde que você dê o crédito apropriado ao (s) autor (es) original (is) e
à fonte, forneça um link para a licença Creative Commons e indique se foram feitas
alterações. As imagens ou outro material de terceiros neste artigo estão incluídos na licença
Creative Commons do artigo, a menos que indicado de outra forma em uma linha de crédito para
o material. Se o material não estiver incluído na licença Creative Commons do artigo e o uso
pretendido não for permitido por regulamentação estatutária ou exceder o uso permitido, você
precisará obter permissão diretamente do detentor dos direitos autorais. Para visualizar uma
cópia desta licença, visitehttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ .

https://www.nature.com/articles/s41421-020-0156-0 8/8