AULA 2 - Métodos de estudo

 O progresso da biologia celular e molecular deu-se a partir dos métodos de estudo.

• Microscópio óptico:

descobrimento da célula

elaboração da teoria celular;

• Técnicas citoquímicas: identificação e localização de diversas moléculas constituintes das

células:

• Microscópio eletrônico: pormenores da estrutura celular, não imaginados pelos estudos com o
M.O.

aperfeiçoamento de métodos para a separação de organelas celulares e para o estudo

“in vitro” de suas moléculas e respectivas funções.

• Microscópio Eletrônico de Transmissão

• Microscópio Eletrônico de Varredura

 DIMENSÕES EM BIOLOGIA

As dimensões das estruturas biológicas podem ser agrupar-se em dois grandes :

• Macroscópicas - aquelas visíveis ao olho humano,

• Microscópicas - aquelas que são invisíveis ao olho humano, tendo como fronteira o poder de resolução
do olho humano.
  As unidades de medida utilizadas nas dimensões biológicas estão adaptadas:

• micrômetro (mm) para a microscopia óptica,

• nanômetro (nm) e o angstrom (Å) para a microscopia eletrônica.

 A sua relação com a unidade fundamental do sistema métrico, o metro (m) e com o milímetro (mm) é a
seguinte:

• 1 mm = 10-6 m = 10-3 mm (0,001mm)

• 1 nm = 10-9m = 10-6mm (0,000001mm)

• 1 Å = 10-10 m = 10-7mm (0,0000001mm)

Embora seja possível o estudo microscópico de células vivas, existem vantagens em obter um preparo
permanente (lâminas) onde as células são preservadas, fixadas e cortadas, para melhor visualização de seus
componentes.

PREPARADO PERMANENTE IDEAL:

- Deve mostrar as células com a mesma estrutura microscópica e composição química que possuíam
quando vivas.
FIXAÇÃO:

É a primeira etapa para obtenção de uma lâmina permanente e tem por finalidade:

• Evitar a autólise – destruição das células por suas próprias enzimas;

• Impedir a atividade e a proliferação de bactérias;

• Endurecer as células para que elas resistam melhor as etapas seguintes;

• Aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos corantes usados na M.O. e aumentar o contraste
na M.E.

Pode ser realizada:

• calor;

• química:

1. Formol e Glutaraldeído: fixam as células por se combinarem com os agrupamentos

amínicos de cada proteína;

2. Tetróxido de ósmio e Glutaraldeído: coagulam as proteínas, causando modificações

mínimas na estrutura celular ® M.E.

3. Mistura fixadora: contém proporções variáveis dos fixadores simples com finalidades
de compensar-lhes as deficiências.

MICROTOMIA:

Realização de cortes finos para exame ao microscópio, tendo o tecido fixado, denominado de
peça, protegido por um material que o envolve e nele penetra e facilitam o corte por suas propriedades
físicas.

Peças para M.O.: são incluídas em parafina e paraplástico cortada com espessura de 3 a 6 micrômetros;
cortes realizados com navalha de aço.

Peças para M.E.: são incluídas em material duro, como resinas do tipo epóxi (araldite, epon) e cortadas
muito finas, 0,02 a 0,1 micrômetros; cortes realizados com navalha de vidro ou diamante.

Peças para M.O.: são incluídas em parafina e paraplástico cortada com espessura de 3 a 6 micrômetros;
cortes realizados com navalha de aço.

Peças para M.E.: são incluídas em material duro, como resinas do tipo epóxi (araldite, epon) e cortadas
muito finas, 0,02 a 0,1 micrômetros; cortes realizados com navalha de vidro ou diamante.

COLORAÇÃO:

Quase todas as organelas são incolores e transparentes, dificultando, com isso, seu estudo
microscópico.

Os corantes comportam-se como BASE ou como ÁCIDO.

CORANTES BÁSICOS:

O responsável pela cor ou o agrupamento cromóforo (cromo – cor e foro – conduzo) é CATIÔNICO (+).

Os cromóforos destes corantes combinam-se com os grupamentos ácidos (aniônicos (-)) das moléculas
celulares.

Moléculas ácidas como DNA e RNA são basófilas e tem afinidade pelos corantes básicos, tais como: azul-de-
metileno; azul-de-toluidina; hematoxilina.

CORANTES ÁCIDOS:

Cromóforo é ANIÔNICO (-) e tende a combinar com os grupamentos básicos dos componentes celulares.

Estruturas ricas em grupamentos básicos são acidófilas, que tem afinidade pelos corantes ácidos, tais como:
eosina, Orange G, fucsina ácida.

Núcleo = basofilia - Grupamentos ácidos com afinidade por corantes básicos.

Ex: hematoxilina

Citoplasma = acidofilia - Grupamentos básicos com afinidade por corantes ácidos.

Ex: eosina

A coloração das células deve-se principalmente à combinação dos corantes com as proteínas.

A dissociação iônica das proteínas depende do pH. Sua afinidade por um corante varia com o pH da
solução.

Chama-se PONTO ISOELÉTRICO de uma proteína, o valor do pH em que sua dissociação iônica é mínima.

Ponto isoelétrico ® proteínas ® mínima afinidade pelos corantes.

pH (superior) ® PI ® grupos ácidos (COOH) ionizam-se ® BASOFILIA.

pH ¯ (inferior) ® PI ® grupos básicos (NH2) dissociam-se ® ACIDOFILIA.

Estudo de células vivas

Para esse estudo, as células animais ou vegetais devem ser colocadas em meio isotônico, ou seja, que não lhes
altere o volume celular.

Como os constituintes celulares são incolores e transparentes, utiliza-se o microscópio de contraste de

fase.

Em alguns casos, empregam-se corantes supravitais

- são pouco tóxicos,

- penetram na célula viva, corando determinadas estruturas.Ex.: verde-jano ® mitocôndrias

 Para estudar células vivas por um tempo mais longo, utiliza-se a técnica de cultivo “in vitro”, em que o
comportamento e o metabolismo das células são estudados em condições mais bem definidas. Essa
técnica permite o estudo dos movimentos celulares, mitose, etc.

Instruções de utilização do microscópio

• Às dimensões das estruturas celulares que, salvo raras exceções como é o caso da gema do ovo, a
acetabulária, são invisíveis ao olho humano,

• Necessidade de utilização do microscópio uma vez que o limite de resolução do olho humano é de
100mm (0,1 mm).

Em termos de formação de imagem é fundamental percebemos o significado de três conceitos:

• Poder de ampliação: capacidade de um aparelho aumentar n vezes uma imagem. Na microscopia é

dado pelo produto entre a ampliação das oculares e a ampliação das objetivas.

• Poder de resolução: capacidade de um aparelho fornecer imagens distintas de dois pontos distintos.

• Limite de resolução: distância mínima a que dois pontos podem estar para o aparelho os mostrar
individualizados.