A microbiota intestinal na colite

colagenosa compartilha
características da disbiose
associada à doença inflamatória
intestinal
Carstens, Adam MD 1,2 ; Dicksved, Johan PhD 3 ; Nelson, Ronald PhD 4 ; Lindqvist,
Mårten PhD 5 ; Andreasson, Anna PhD 6 ; Bohr, Johan MD, PhD 2 ; Tysk, Curt MD,
PhD 2 ; Talley, Nicholas J. MD, PhD 7 ; Agréus, Lars MD, PhD 6 ; Engstrand, Lars MD,
PhD 8 ; Halfvarson, Jonas MD, PhD 2
INTRODUÇÃO: Na doença inflamatória intestinal (DII), uma resposta imune
aberrante à microbiota intestinal é importante, mas o papel da microbiota na
colite colagenosa (CC) é praticamente desconhecido. Nosso objetivo foi
caracterizar a microbiota de pacientes com CC em comparação com o controle
saudável e pacientes com DII.
MÉTODOS: Amostras fecais foram coletadas de pacientes com CC (n = 29),
controles saudáveis pareados por idade e sexo (n = 29), pacientes com doença
de Crohn (n = 32) e pacientes com colite ulcerativa (n = 32) . Os dados da
seqüência foram obtidos pelo sequenciamento de 454 dos amplicons do gene
16S rRNA, e as sequências obtidas foram posteriormente taxonomicamente
classificadas.
RESULTADOS: A análise das estatísticas de similaridade mostrou uma
segregação entre os pacientes com CC e controles saudáveis com resolução
taxonômica crescente, tornando-se significativa a comparação dos dados das
unidades taxonômicas operacionais ( P = 0,006). CC teve uma menor
abundância de 10 táxons diferentes. Análises taxa-específicas revelaram uma
consistente menor abundância de várias unidades taxonômicas operacionais
pertencentes à família Ruminococcaceae em pacientes com CC, q <0,05 após
a correção da falsa taxa de descoberta. A perda desses táxons foi observada
em pacientes com CC com doença ativa e / ou somente tratamento com
corticosteroides e se assemelhou aos achados em pacientes com DII.
DISCUSSÃO: O CC está associado a um microbioma fecal específico, visto
principalmente em pacientes com doença ativa ou tratamento contínuo com
corticosteroides, enquanto o microbioma de pacientes com CC em remissão se
assemelha ao de controles saudáveis. Notavelmente, a mudança nos principais
táxons, incluindo a família Ruminococcaceae, também foi observada no
IBD. Pode haver mecanismos comuns na patogênese da CC e IBD.

INTRODUÇÃO
A colite colagenosa (CC) é uma doença inflamatória crônica do intestino, caracterizada
por uma banda de colágeno subepitelial de ≥10 μm mais infiltração de linfócitos na
lâmina própria. O diagnóstico de CC é definido por fezes moles por mais de 3-4
semanas, uma mucosa colônica que na maioria das vezes tem aparência normal, embora
pequenas alterações como edema e eritema possam estar presentes, combinadas com
critérios histopatológicos específicos ( 1,2 ). . Historicamente, o CC tem sido considerado
raro, mas estudos epidemiológicos indicam um aumento nas taxas de incidência durante
as últimas décadas. Na Europa e na América do Norte, a incidência anual atinge
aproximadamente 5,2 casos por 100.000 habitantes ( 2). A doença afeta principalmente a
população feminina idosa, com uma relação de 3,8: 1, e é um achado relativamente
comum na investigação de diarreia aquosa e não sanguinolenta em uma paciente idosa
do sexo feminino.
A etiologia da CC é praticamente desconhecida, mas há relatos de agregação familiar e
sobreposição com outras doenças inflamatórias crônicas, como doença celíaca, diabetes
mellitus e artrite reumatoide ( 3 ). Imunologicamente, não parece haver uma inflamação
da mucosa descontrolada, sugerindo uma resposta imune aberrante de antigénios
luminais em indivíduos geneticamente predispostos, semelhante à de outras doenças
gastro-intestinais inflamatórias crónicas tais como a doença de Crohn (CD) e colite
ulcerativa (UC) ( 1 ). Esta hipótese é apoiada pelo fato de que o desvio do fluxo fecal
levou à recuperação da inflamação no cólon entre os pacientes com CC e a reconstrução
da continuidade intestinal causou recidiva ( 4,5).). Diversas exposições que têm sido
associadas à doença inflamatória intestinal (DII), como anti-inflamatórios não esteroides
e tabagismo, também têm sido associadas ao CC ( 1 ). Curiosamente, CC foi descrito
para converter em DII ou vice-versa ( 6–10 ). Estas observações sugerem que CC e IBD
podem ter mecanismos fisiopatológicos em comum.
O microbioma intestinal é um fator chave na patogênese da DII e uma disbiose,
caracterizada principalmente pela regulação negativa de espécies produtoras de butirato
como Faecalibacterium prausnitzii , pertencente à família Ruminococcaceae, tem sido
consistentemente relatada em pacientes com DII e especialmente em pacientes com
DC. 11–13 ). A análise de pequenas séries de casos indica que alguns pacientes com CC
podem apresentar um perfil microbiano anormal ( 14,15 ). No entanto, o CC é
caracterizado por um microbioma alterado que compartilha padrões com a disbiose
associada à DII, ainda desconhecido.
Este estudo compara a microbiota fecal de pacientes com CC com a de controles
saudáveis e identifica as possíveis alterações, em comum com DC e RCU, utilizando o
sequenciamento de amplicons do gene 16S rRNA. Além disso, procuramos associar
assinaturas microbianas a variáveis clínicas, incluindo atividade da doença e tratamento
com corticosteroides, em pacientes com CC.
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MÉTODOS

População de estudo
Pacientes com CC, CD e UC estabelecidos foram convidados a participar do estudo
enquanto freqüentavam o Ambulatório de Gastroenterologia do Hospital da
Universidade de Örebro, na Suécia. A coorte de pacientes com CC já foi descrita
anteriormente ( 2 ). O diagnóstico de CC foi baseado na história de diarreia crônica não-
sanguinolenta, mucosa do cólon macroscopicamente normal ou quase normal e achados
histológicos típicos. Os critérios histopatológicos do CC incluíram uma banda de
colágeno subepitelial de ≥ 10 μm, infiltração de linfócitos na lâmina própria e dano
epitelial. Os achados característicos tiveram que estar presentes em pelo menos 2
biópsias, apoiadas por alterações inflamatórias da mucosa em biópsias e segmentos
adicionais ( 1 ). O diagnóstico de DC e RCU foi baseado nos critérios de Lennard-Jones
(16 ). Todos os pacientes assinaram um termo de consentimento informado. A atividade
clínica da doença em pacientes com CC foi definida de acordo com critérios
internacionalmente aceitos, com remissão definida como <3 fezes sem diarreia aquosa
nas últimas 24 horas ( 1 ). Na DC e na RC, o fenótipo e a atividade da doença foram
classificados de acordo com a classificação de Montreal e a avaliação global do médico
( 17 ). Controles saudáveis, pareados por sexo e idade (± 5 anos) ao grupo CC, foram
identificados a partir da co-colonoscopia de base populacional (PopCol), previamente
descrita em detalhes ( 18). Todos os indivíduos foram solicitados a fornecer uma amostra
fecal e preencher um questionário sobre a atividade da doença e uso de drogas,
incluindo antibióticos. O critério de exclusão foi o uso de antibióticos dentro de 3 meses
antes da coleta da amostra fecal. No total, foram incluídos 122 indivíduos (CC: n = 29;
CD: n = 32; UC: n = 32; e controles saudáveis: n = 29).
O Comitê de Ética da Universidade de Uppsala (Dnr 2007/291) e o Comitê de Ética
local do Karolinska Institutet (Forskningskommitté Syd) (Dnr 394/01) aprovaram o
estudo.
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Amostragem e extração de DNA

Informações sobre os procedimentos de coleta foram fornecidas a todos os
participantes. Amostras fecais foram coletadas em tubos plásticos em casa pelos
participantes, enviadas pelo serviço postal e congeladas diretamente na chegada ao
laboratório, onde foram armazenadas a -70 ° C. De cada amostra, 100 mg (± 10 mg) de
fezes foram coletadas em um Kit de Limpeza Ultra Fecal Fecal Isolation Dry (MoBio,
Naxo) e eluídas com 1 mL de Stool Stoolizer (NorDiag). Cada amostra foi
homogeneizada em vortex de 5 minutos, seguida de 5 minutos de centrifugação a
6.000 g. Quinhentos microlitros de cada sobrenadante de fezes foram transferidos para
um tubo de microcentrífuga e colocados em um instrumento Arrow (NorDiag) para
extração de DNA usando o cartucho Arrow Stool DNA para um volume final eluído de
200 μL, de acordo com as instruções do fabricante. O DNA foi extraído
simultaneamente de todas as amostras, de acordo com o mesmo protocolo de extração,
pela mesma pessoa (AC).
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Preparação de bibliotecas de amplicon PCR

Para cada amostra, foram preparadas 3 misturas de reação em cadeia da polimerase
(PCR), 50 μL, contendo 10 μL × 5 de tampão PCR, 200 μM de desoxinucleósido
trifosfato (Pierce Nucleic Acid Technologies, Milwaukee), 25 μM de cada primer, 0,65
μL Phusion F Enzima -530L (Finnzyme, Massachusetts) e 1 μL de DNA modelo. Os
pares de primers usados para amplificar as regiões 16 rRNA hipervariáveis V3-V4
foram 341f (5′CCTACGGGNGGCWGCAG) complementados com adaptador B e 805r
(5′GACTACHVGGGTATCTAATCC) complementados com adaptador A. Além disso,
cada primer reverso tinha um código de barras único com 7 nucleotídeos de
comprimento sequência (no total, 96 primers reversos únicos), permitindo a
multiplexação de amostras. Um modelo de PCR negativo também foi usado para cada
par de primers. Os ciclos de PCR utilizados foram 95 ° C por 5 minutos, seguidos por
25 ciclos de 95 ° C por 40 segundos, 58 ° C por 40 segundos,
Todos os 3 produtos de PCR foram reunidos e 45 μL do produto de PCR reunido foram
então purificados utilizando esferas Agencourt AMPure (Beckman Coulter, CA) de
acordo com o protocolo do fabricante. Os produtos foram finalmente eluídos em tampão
de ácido 1-tris-etilenodiaminotetracético. A concentração de DNA foi determinada por
um fluorômetro Qubit (Invitrogen, CA). Todas as amostras foram diluídas para uma
concentração de 3-4 ng / μL, exceto aquelas em que a quantidade insuficiente de DNA
foi obtida.
Todas as amostras de DNA foram reunidas em 2 tubos, um para cada pista no 454
pyrosequencer. O sequenciamento foi realizado no 454-FLX GS100 da Roche usando o
kit de titânio FLX (Roche 454 Life Sciences, Branford, CT). As leituras de sequência
obtidas foram desmultiplexadas, filtradas a partir de leituras de baixa qualidade e
desarenadas utilizando o pipeline de ruído Amplicon. Apenas amostras contendo> 1.500
leituras foram incluídas no estudo. As sequências foram então taxonomicamente
classificadas usando o banco de dados SILVA conforme descrito anteriormente ( 19 ),
antes de realizar a análise estatística.
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análise estatística
O índice de diversidade de Shannon (SDI) foi calculado e as diferenças entre os grupos
foram comparadas pelo teste H de Kruskal-Wallis e pelo teste de diferença
honestamente significante de Tukey. A análise de similaridade (ANOSIM) foi realizada
para testar dissimilaridades entre os grupos ( 20 ). O método de Benjamini e Hochberg foi
usado para contabilizar comparações múltiplas, baseadas em P globalvalores de todas as
variáveis comparadas, com uma taxa de descoberta falsa de 5%. Usamos testes de
Wilcoxon para testar as diferenças na abundância relativa de taxa bacteriana específica
entre pacientes com CC e controles saudáveis. Apenas os taxa prevalentes em> 20% das
amostras foram incluídos nesta análise. Para correção de múltiplos testes, foram
realizadas 1.000 permutações estratificadas para o nível taxonômico de classificação, ou
seja, gênero e unidade taxonômica operacional (OTU) em um limiar de identidade de
97%. Para cada permutação, os indivíduos doentes e controlados foram randomizados e
testados em relação aos dados de abundância relativa para todas as OTUs. A
distribuição do Pos valores por OTU forneceram um teste exato (valor q) para estimar a
taxa de descoberta falsa em 5% para cada OTU. Usamos o valor q obtido das
permutações para cada OTU para estimar sua significância. Repetimos esta análise
usando a abundância relativa por taxa. Comparações entre subgrupos de pacientes com
CC e controles saudáveis foram realizadas por Kruskal-Wallis e Mann-
Whitney Uteste. Devido ao número limitado de indivíduos em cada grupo, os pacientes
com CC foram categorizados em 2 subgrupos, pacientes em remissão sem
corticosteroides e pacientes com doença ativa ou corticoterapia em curso. A prevalência
de taxa associada a CC foi então avaliada em pacientes com CD e UC para explorar
assinaturas microbianas comuns. Análises estatísticas e processamento de dados foram
realizados na R (Fundação para Estatística Computacional, Viena, Áustria) e no
software SPSS Statistics (Lançado em 2015; IBM, e IBM SPSS Statistics para
Windows, Versão 23.0; IBM, Armonk, NY).
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RESULTADOS
No total, foram incluídos 122 indivíduos (CC: n = 29; CD: n = 32; UC: n = 32; e
controles saudáveis: n = 29). A mediana (faixa) de idade dos pacientes com CC foi de
65 anos (33-89 anos) ( Tabela 1 ). Dos 29 pacientes com CC, 17 estavam em tratamento
com corticosteróides orais e 10 tinham doença clinicamente ativa. Nove pacientes com
CC estavam em remissão clínica, sem qualquer terapia contínua com corticosteróides. A
demografia básica e as características clínicas dos participantes são mostradas na Tabela
1 . Informações detalhadas sobre as características clínicas de pacientes individuais com
CC, CD e UC são fornecidas nas Tabelas Suplementares 1 e 2 (ver Conteúdo Digital
Suplementar, http://links.lww.com/CTG/A61 ).

tabela 1

No total, 119 amostras foram incluídas nas análises, porque 3 amostras (CC: n = 2 e
UC: n = 1) falharam na amplificação por PCR devido à quantidade insuficiente de DNA
extraído. Após a filtragem, o conjunto de dados continha um total de 349.963 leituras,
com uma média (intervalo) de 2941 leituras (1.643 a 5.271 leituras) por amostra. Um
total de 11.799 OTUs diferentes foram observadas, correspondendo a uma média (faixa)
de 286 OTUs (39-578 OTUs) por amostra. Nenhuma correlação entre o número de
leituras e o número de OTUs ou SDI foi observada (ver Figura 1, Conteúdo Digital
Complementar, http://links.lww.com/CTG/A61 ).
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Composição microbiana em diferentes entidades patológicas e controles

saudáveis
O IDS foi calculado para pacientes com CC, DC e RCU e também para controles
saudáveis ( Figura 1 ). Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre pacientes
com CC e controles saudáveis ( P = 0,25). Por outro lado, CD foi significativamente
associado com uma menor diversidade (média P <0,0001).

figura 1

No entanto, um gráfico de análise de coordenadas principais revelou uma separação

entre os pacientes com CC e os controles saudáveis ( Figura 2 ). Consistentemente, a
estatística ANOSIM mostrou que os pacientes com CC segregaram dos controles
saudáveis com resolução taxonômica crescente ( Tabela 2 ), alcançando significância na
maior resolução taxonômica quando as UTOs foram comparadas ( P = 0,006).

Figura 2
mesa 2

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Composição microbiana em pacientes com CC

Um gráfico de dispersão da análise de coordenadas principais (PCoA) indicou que as
amostras pareciam se separar de acordo com CC versus controles saudáveis, e o
ANOSIM confirmou a diferença estatística entre os dois grupos. Para explorar o
impacto de potenciais fatores de confusão, PCoA parcelas e ANOSIM foram avaliados
com base no sexo, idade e índice de massa corporal (IMC) entre os pacientes com CC e
controles saudáveis (ver Figura 2, Suplementar Digital Content, http: //links.lww .com /
CTG / A61 ). Nenhuma separação foi observada com relação ao sexo e idade, mas as
amostras se separaram significativamente quando avaliadas com base no IMC. No
entanto, nenhuma diferença no IMC foi observada entre os pacientes com CC e
controles saudáveis ( P = 0,88).
Com base no ANOSIM, exploramos quais taxa causaram as diferenças observadas entre
pacientes com CC e controles saudáveis. Pacientes com CC apresentaram uma menor
abundância de 11 táxons diferentes (ver Figuras 3, Conteúdo Digital
Complementar, http://links.lww.com/CTG/A61 ) e apresentaram uma abundância
consistente menor de várias UTOs pertencentes à família Ruminococcaceae ( Tabela
3 ). Em contraste, um padrão diverso foi observado para várias outras famílias, onde a
abundância relativa média foi aumentada para algumas UTs, mas diminuiu para outras
UTOs dentro da mesma família ( Tabela 3 ).

Tabela 3

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Associações entre microbiota fecal e dados clínicos em pacientes com

CC
Em seguida, caracterizamos o microbioma de pacientes com CC, estratificando a
atividade da doença e o tratamento com corticosteroides ao analisar os taxa que foram
identificados como associados ao CC. Os pacientes foram categorizados em duas
categorias: pacientes em remissão sem corticosteroides e pacientes com doença ativa ou
corticoterapia em curso.
A abundância relativa de vários taxa diferiu entre os dois grupos ( Figura
3 ). Foi observada associação entre doença ativa / corticoterapia em curso e diminuição
da abundância relativa de Collinsella , Ruminococcaceae não classificada,
Coriobacteriaceae não classificada e Clostridiales não classificada. Consistentemente,
uma abundância diminuída de vários OTUs correspondentes à família
Ruminococcaceae foi observada em pacientes com doença ativa / corticoterapia em
curso, mas não em pacientes com CC em remissão quando os taxa foram comparados
em um nível OTU (ver Figuras 4, Conteúdo Digital Complementar, http :
//links.lww.com/CTG/A61 ).
Figura 3

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Assinaturas microbianas compartilhadas entre pacientes com CD, UC e

CC
Para explorar as possíveis assinaturas microbianas comuns, a composição microbiana
dos pacientes com CC foi comparada com a dos pacientes com CD e UC, restringindo
as análises a taxa que separou pacientes com CC em remissão de pacientes com doença
ativa / tratamento contínuo com corticosteroides. Semelhante ao deslocamento
microbiano observado em pacientes com CC, uma diminuição da abundância de várias
UTOs correspondentes à família Ruminococcaceae também foi encontrada em pacientes
com DII. Dos 10 OTUs dentro da família Ruminococcaceae que foram diminuídos em
pacientes com CC ativo ou tratamento com corticosteroides, 9 também foram
diminuídos em pacientes com CD e 4 em pacientes com UC (ver Figura 5, Conteúdo
Digital Complementar, http: //links.lww .com / CTG / A61 ).
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DISCUSSÃO
Examinando amostras fecais de uma coorte bem caracterizada de pacientes,
demonstramos que o CC está associado a um microbioma intestinal específico e que
esse desvio microbiano é visto principalmente em pacientes com doença ativa ou
tratamento contínuo com corticosteroides. Em contraste, o microbioma fecal de
pacientes com CC em remissão assemelhava-se ao microbioma de controles
saudáveis. Para nosso conhecimento, esta é a primeira caracterização detalhada do
microbioma de pacientes com CC, que também identifica os possíveis desvios
microbianos comuns em pacientes com CC e DII. Dois relatos descritivos de pequenas
séries foram publicados anteriormente ( 14,15 ). Consistente com nossos achados, Fischer
et al. relataram uma redução acentuada de Verrucomicrobia, Akkermansiaspp., em 10
casos com CC. Curiosamente, em nosso estudo, os pacientes com CC mostraram uma
mudança em alguns taxa, como a família Ruminococcaceae, que se assemelha à
disbiose associada à DII descrita anteriormente ( 21,22 ). Isso pode indicar que o
microbioma desempenha um papel semelhante no CC e IBD e que a patogênese das
doenças pode ter mecanismos relacionados ao microbioma intestinal em comum. O fato
de termos observado algumas dessas mudanças microbianas em nossa coorte de
pacientes com DII fortalece ainda mais essa teoria.
Semelhante à hipótese da DII, foi proposto que a colite microscópica poderia resultar de
uma resposta imune aberrante ao microbioma do intestino comensal ( 9 ). Isto é apoiado
pela melhora clínica observada e restauração histológica em pacientes com CC após
desvio de fluxo fecal devido a uma ileostomia. Curiosamente, a recidiva clínica é mais
frequentemente vista na restauração subsequente da continuidade intestinal ( 4,5 ). Uma
etiologia infecciosa para o CC também foi proposta. A linfocitose epitelial na colite
microscópica é semelhante aos achados histológicos de "diarréia Brainerd", ou seja,
surtos de diarreia aquosa aguda de longa duração ( 23). Da mesma forma, a variação
sazonal relatada no início da colite microscópica e possível efeito positivo dos
antibióticos pode apontar para a importância de um agente infeccioso ou um
componente microbiano ( 24,25 ). Em um recente relato de caso sobre o efeito do
transplante fecal, uma conversão de UC para CC foi observada em um paciente que
sofreu uma mudança pronunciada na microbiota intestinal devido ao tratamento
( 26 ). Em outro relato de caso, um efeito benéfico do transplante fecal foi relatado em
um paciente com CC resistente a esteróides ( 27). Com base nessas observações,
objetivou-se caracterizar a microbiota fecal de pacientes com CC comparando-a com
controles saudáveis e identificar possíveis alterações, em comum com pacientes com
DC e RCU, utilizando sequenciamento 16S rRNA. Não foi possível demonstrar
qualquer diferença significativa na composição microbiana global, com base na SDI,
quando os pacientes com CC ou UC foram comparados com controles
saudáveis. Consistente com estudos anteriores ( 11,28,29 ), pacientes com DC apresentaram
uma diversidade significativamente menor em comparação com controles saudáveis. No
entanto, a diversidade global pode ser uma medida muito simplificada da microbiota
intestinal. Na UC, resultados conflitantes com biodiversidade tanto indiferente quanto
reduzida têm sido demonstrados ao comparar a microbiota em pacientes com controles
saudáveis ( 28,30,31). Uma diferença crescente na composição microbiana entre pacientes
com CC e controles saudáveis também foi observada com o grau de resolução
taxonômica, tornando-se significativa quando se compara as UTOs em nossa
coorte. Quando foram comparadas as OTUs específicas entre pacientes com CC e
controles saudáveis, observamos uma diferença na abundância relativa média de 36
OTUs. Para a maioria dessas OTUs, um padrão complexo foi observado ao analisar os
dados em nível familiar, com um aumento da abundância relativa para algumas OTUs,
mas uma diminuição da abundância relativa para outras OTUs dentro da mesma
família. No entanto, com relação à família Ruminococcaceae, foi observada uma
diminuição consistente em várias UTUs.
A família Ruminococcaceae é um membro do filo Firmicutes e compreende um amplo
espectro de espécies com diferentes propriedades funcionais. Uma sub-representação de
espécies pertencentes à família já foi relatada em DII, especialmente em DC ( 22,32 ). Várias
espécies da família Ruminococcaceae, como as espécies de Ruminococcus , são
importantes para a manutenção da homeostase intestinal, pois produzem ácidos graxos
de cadeia curta e principalmente butirato. O butirato é um substrato energético
importante para a mucosa intestinal e de importância para a saúde intestinal, resistência
a micróbios patogênicos e proteção contra a colite ( 11,33,34 ). Tanto in vitro e in vivo dados
indicam queF. prausnitzii , outro membro da família Ruminococcaceae, também parece
ter propriedades anti-inflamatórias ( 11,34,35 ).
Para explorar ainda mais o papel do microbioma no CC, estratificamos os pacientes
com CC com base em variáveis clínicas, isto é, atividade da doença e tratamento com
corticosteroides. A budesonida, um corticosteróide, é a droga de escolha para o
tratamento do CC, porque é eficaz tanto na indução quanto na manutenção da remissão
( 36 ). No entanto, a taxa de recidiva é alta na redução da dose e após a descontinuação
( 37). Portanto, muitos pacientes são mantidos com uma dose mínima de corticosteróide
para manter a remissão. Os pacientes com CC foram divididos em 2
categorias; pacientes em remissão sem corticoterapia e pacientes com doença ativa ou
corticoterapia em curso. Para vários táxons, uma diferença na abundância relativa foi
observada em pacientes com doença ativa ou tratamento contínuo com corticosteróides,
quando comparados com controles saudáveis. Assim, alguns taxa parecem estar
associados à atividade da doença, embora o desenho do nosso estudo não nos permita
confirmar a causalidade. Vários dos taxa que mostraram uma associação com a
atividade da doença ou tratamento contínuo com corticosteróides pertenciam à família
Ruminococcaceae. Entretanto, uma diminuição da abundância relativa de Collinsella,
Clostridiales, Coriobacteriaceae e Erysipelotrichaceae também foram observados neste
subgrupo de pacientes com CC.
Semelhante aos achados em pacientes com CC, uma diminuição na abundância de
várias UTUs correspondentes à família Ruminococcaceae também foi observada em
pacientes com DII. O deslocamento microbiano compartilhado entre CC e IBD é de
grande interesse, porque uma mudança de CC para IBD e vice-versa foi relatada em
alguns pacientes ( 6,7 ). Assim, a caracterização adicional de fatores de virulência e perfis
de expressão gênica de taxa dentro da família Ruminococcaceae pode ser importante
para esclarecer as possíveis vias microbianas comuns de CC e IBD.
A caracterização clínica completa dos pacientes com CC é a maior força do nosso
estudo, embora a atividade clínica na aquisição de amostras fecais não tenha sido
confirmada por avaliação histológica. Comparações com pacientes com DC e RCU e
com controles saudáveis da população geral fortalecem ainda mais os
resultados. Embora nosso estudo incluísse 122 indivíduos, o número de pacientes com
CC em cada subgrupo era limitado quando se estratificava para atividade de doença e
medicação corticosteróide. As comparações de pacientes com CD e UC com controles
saudáveis foram prejudicadas por diferenças de idade e sexo, porque a correspondência
foi realizada com base na idade e sexo dos pacientes com CC. Uma limitação com o
presente estudo foi que, em comum com muitos estudos prévios do microbioma
intestinal em relação a vários diagnósticos, as amostras foram obtidas em um único
ponto no tempo. Análises de amostras sequenciais de pacientes com CC, incluindo
aquelas que cobrem períodos de remissão, recaída e mudanças no tratamento, bem como
amostras casadas obtidas ao longo do tempo a partir de controles saudáveis, seriam um
projeto mais poderoso para revelar a influência do microbioma em CC . O uso de
amostras fecais é outra possível limitação, pois pode-se antecipar que é o microbioma
da mucosa que é mais importante no CC. Mais pesquisas sobre biópsias de mucosa
devem ser realizadas para investigar as interações microbiota do hospedeiro em
pacientes com CC. Alterações na microbiota intestinal secundárias à diarréia induzida e
à diarréia funcional já foram descritas anteriormente.22,38,39 ). Por outro lado, a microbiota
intestinal em pacientes com síndrome do intestino irritável com diarréia mostrou um
padrão diferente. Isso indica que a diarréia por si só pode ter um impacto na composição
microbiana e pode representar uma limitação para este estudo, embora a literatura
anterior seja inconsistente ( 40,41). Os efeitos do crescimento retardado de certas espécies e
o crescimento excessivo de outras espécies devido a fatores ambientais poderiam ter
sido minimizados usando um agente estabilizador de DNA. Em geral, espera-se que as
amostras tenham sido enviadas dentro de 24 horas, mas o fato de a duração das
remessas individuais não ter sido especificamente registrada limita ainda mais o
estudo. Diferenças entre amostras no número de leituras obtidas representam outra fonte
potencial de incerteza, porque não normalizamos os dados escolhendo aleatoriamente
um número fixo de leituras. No entanto, nenhuma correlação entre o número de leituras
e o número de OTUs ou SDI foi observada. O uso do sequenciamento de amplificação
16S pode ter afetado negativamente nossas possibilidades de identificação de táxons
raros, porque a técnica tem limitado a capacidade de detectar táxons de baixa
abundância. Portanto, a ausência de taxa específica de CC deve ser interpretada com
cautela. O enriquecimento de antígenos prevalentes em diferentes espécies de bactérias
também pode ser importante, no que diz respeito à patogênese do CC. No entanto, tal
enriquecimento não pode ser detectado pelo método utilizado, e mais estudos baseados
em sequenciamento metagenômico de espingarda de indivíduos com CC são
garantidos. Outros fatores clínicos, como dieta, características do sangue, idade, sexo,
IMC e genótipo do hospedeiro, também foram associados à composição da microbiota
intestinal (42 ). Especialmente idade, sexo e IMC foram identificados como importantes
fatores de confusão potenciais. Para descartar que os resultados foram confundidos por
qualquer uma dessas variáveis, o impacto da idade, sexo e IMC foi examinado por uma
análise de coordenadas principal e um ANOSIM (ver Figuras 2, Conteúdo Digital
Complementar, http: //links.lww. com / CTG / A61 ). No entanto, não foram
encontradas diferenças, exceto para o IMC, onde foi observada uma diferença entre os
participantes magros (IMC <25) e obesos (IMC> 30). No entanto, como os participantes
obesos foram distribuídos igualmente no grupo CC e nos controles, não esperamos
nenhum impacto nas diferenças observadas entre CC e controles saudáveis.
Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a demonstrar que o CC está associado a um
microbioma intestinal específico e que a microbiota alterada é observada principalmente
em pacientes com doença ativa e / ou tratamento com corticosteroides. Curiosamente, a
mudança em alguns taxa, como a família Ruminococcaceae, se assemelha a uma
disbiose associada à DII e também foi observada em pacientes com DII em nosso
estudo. Isso pode indicar que CC e IBD são sustentados por mecanismos microbianos
similares.
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CONFLITOS DE INTERESSE
Garantidor do artigo: Jonas Halfvarson, MD, PhD.
Contribuições específicas do autor:AC: planejou e conduziu o estudo; coletou,
analisou e interpretou os dados; redigiu o manuscrito; e aprovou a versão final
submetida. JD: planejou o estudo, analisou e interpretou os dados, redigiu o manuscrito
e aprovou a versão final submetida. RN, ML: analisaram e interpretaram os dados e
aprovaram o rascunho final submetido. AA: coletou dados, revisou o manuscrito e
aprovou a versão final submetida. JB: coletou material e dados, revisou o manuscrito e
aprovou o rascunho final submetido. CT: coletou material, interpretou os dados,
planejou, revisou o manuscrito e aprovou o rascunho final submetido. NT, LA: coletou
dados, revisou o manuscrito e aprovou a versão final submetida. NE: planejou e
conduziu o estudo, coletou e interpretou os dados, revisou o manuscrito, e aprovou o
projeto final submetido. JH: planejou e conduziu o estudo, interpretou os dados, redigiu
o manuscrito e aprovou o rascunho final submetido.
Apoio financeiro: Este projecto foi apoiado pela Universidade de Örebro, Fundação de
Investigação do Hospital Universitário de Örebro, Fundação Sueca para Pesquisa
Gastrointestinal, Conselho de Investigação Sueco (521-2011-2764 de JH e 521-2012-
1930 de LE) e Fundação Soderbergs.
Potenciais concorrentes: AC: foi palestrante da Tillotts Pharma. JD, RN, AA, JB:
Nenhuma a declarar. CT: foi oradora do Dr. Falk Pharma, da Tillotts Pharma, da
Ferring, da MSD e da AstraZeneca. NT: nenhum declarado. LA, LE: Nenhum a
declarar. JH: recebeu bolsas de pesquisa do Conselho de Pesquisa Sueco (521-2011-
2764) e da Fundação de Pesquisa do Hospital Universitário de Örebro (concessão OLL-
507001); tem atuado como palestrante, consultor e / ou membro do conselho consultivo
da Abbvie, Celgene, Celltrion, Ferring, Hospira, Janssen, Medivir, MSD, Novartis,
Pfizer, Prometheus, Sandoz, Shire, Takeda, Tillotts Pharma e Vifor. Pharma; e também
recebeu bolsas de pesquisa da Janssen, MSD e Takeda.
Aprovação de ética e consentimento para participar: O Comitê de Ética da
Universidade de Uppsala (Dnr 2007/291) e o Comitê de Ética local no Karolinska
Institutet (Forskningskommitté Syd) (Dnr 394/01) aprovaram o estudo. Todos os
participantes enviaram consentimento por escrito para participar do estudo.
Disponibilidade de dados e materiais: Os conjuntos de dados utilizados e analisados
durante o estudo atual estão disponíveis no autor correspondente mediante solicitação
razoável.
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Destaques do estudo
O QUE É CONHECIDO

o ✓ A microbiota intestinal é importante para a manutenção da saúde.

o ✓ Semelhante ao IBD, o CC é caracterizado por uma resposta imune aberrante aos
fatores luminais.
o ✓ A microbiota intestinal desempenha um papel importante na patogênese da DII,
mas seu papel potencial na CC é praticamente desconhecido.

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O QUE É NOVO AQUI

o ✓ Análise de amostras fecais revelou uma composição microbiana alterada, com

diminuição da abundância de vários membros da família Ruminococcaceae em
pacientes com CC.
o ✓ Alterações na composição da microbiota intestinal estão associadas ao CC ativo ou
tratamento contínuo com corticosteroides, enquanto o microbioma de pacientes com
CC em remissão assemelha-se ao de controles saudáveis.
o ✓ Mecanismos comuns relacionados à patogênese da CC e DII podem existir, pois
alterações semelhantes foram observadas em ambos os grupos.

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IMPACTO TRANSACIONAL

o ✓ Futuras terapias direcionadas à microbiota podem ser de interesse em pacientes

com CC ativa.

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AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Daniel Lundin pelo processamento de dados e identificação
taxonômica. As computações foram realizadas em recursos fornecidos pelo SNIC
através do Centro Multidisciplinar de Ciências Computacionais Avançadas da Uppsala
(UPPMAX). Agradecemos também ao Laboratório de Ciência para a Vida, SciLifeLab,
pelas facilidades de auxílio computacional e pirosequenciamento.
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