Departamento de Cincia e Tecnologia

Laboratrios de Engenharia Qumica e Biolgica II

Licenciatura em Engenharia Qumica e Biolgica

Mestre Antnio Jandir Pina Gomes

Actividade da Catalase em Alimentos

Objectivos
Este trabalho visa o estudo da actividade da catalase da batata de casca vermelha, como modelo de tecido vegetal. Sero analisados vrios parmetros tais como o efeito da concentrao de enzima, pH e temperatura na actividade e estabilidade enzimtica.

Introduo
Nos organismos vivos, o perxido de hidrognio (H 2O2) um produto resultante do metabolismo oxidativo, produzido nos peroxissomas (fig.1). Estes organelos celulares esto presentes na maioria dos eucariontes e desempenham um papel essencial no metabolismo dos lpidos (tais como a oxidao de cidos gordos) e na remoo de radicais livres. Sendo txico para a clula, o perxido tem de ser rapidamente convertido numa espcie qumica incua, pois gera radicais livres. Para o efeito, o peroxissoma contm uma variedade de enzimas anti-oxidantes dos quais conta a catalase. Este biocatalisador responsvel pela hidrlise do perxido de hidrognio, resultantes das actividades metablicas, a oxignio molecular e gua.

Figura 1. Representao esquemtica das vias produtoras de radicais de oxignio e respectivas remoes.

O perxido de hidrognio formado por uma variedade de oxidases que degradam diversos metabolitos tais como cidos gordos. Sob aco da catalase e glutationa peroxidase (GPx) so convertidos em radicais hidroxilo (*OH). Parte do perxido poder escapar para o citosol. Aqui removida pela

GPx ou convertido tambm em radicais *OH. Estes radicais, se no forem neutralizados podero destruir as membranas celulares do peroxissoma. A Catalase (EC 1.11.1.6) pertence classe das Oxirredutases (catalisam reaces de transferncia de electres, ou seja reaces de oxidaoreduo), que usam o perxido como aceitador de electres e tambm como dador electrnico. Embora sejam conhecidas vrias estruturas para a catalase, a mais comum composta por um tetrmero com cerca de 60 KDa cada cadeia polipeptdica. Cada qual est ligada a um grupo hemo. Este grupo prosttico consiste num tomo de ferro complexado com uma porfirina (hemoprotena). A reaco catalisada por este enzima uma reaco de dismutao, ou seja, o substrato actua tanto como redutor como oxidante. O mecanismo de aco da catalase ainda no totalmente conhecido. No entanto pensa-se que a reaco de hidrlise do perxido ocorre em duas etapas fundamentais:

Aps colheita dos vegetais, a actividade enzimtica induz a alteraes da cor, sabor, textura e valor nutricional. Este processo ocorre mesmo quando os produtos se encontram congelados. Para evitar esta deteriorao os alimentos so branqueados (blanching) antes de serem congelados e enlatados. O branqueamento um processo trmico de curto tempo de aplicao e visa: Primeiramente a inactivao de enzimas nativos que afectam a qualidade dos produtos durante e depois do processamento; A limpeza do alimento, reduzindo a carga microbiana superfcie; O amolecimento e inchamento dos tecidos, conferindo assim uma distribuio da massa mais uniforme ao alimento embalado; O amolecimento da pele dos vegetais antes do descasque; A remoo de gases contidos nos tecidos vegetais (espaos intercelulares), reduzindo assim a corroso das latas e facilitando a obteno de vcuo no espao livre; O realce da cor dos vegetais por fixao da colorao de certos pigmentos.

O branqueamento poder ser efectuado por gua quente ou vapor. A durao do tratamento depende da consistncia e dimenses do material, podendo variar de 2 min a 10 min, a uma temperatura de 50 C a 100 C. Quando em excesso, poder conduzir perda de nutrientes hidrossolveis e sensveis ao calor e alteraes na textura. Aps o branqueamento, os vegetais so

arrefecidos rapidamente, at temperatura ambiente, para evitar o excessivo amolecimento dos tecidos. A peroxidase e a catalase so enzimas muito resistentes desnaturao trmica, servindo por isso como excelentes indicadores de um bom branqueamento dos vegetais. Este trabalho visa o estudo da actividade da catalase da batata de casca vermelha, como modelo de tecido vegetal. Sero analisados vrios parmetros tais como o efeito da concentrao de enzima, pH e temperatura na actividade e estabilidade enzimtica.

Material e Reagentes
Material Bales volumtricos Banhos termostatizados Tubos de ensaio Pipetas volumtricas Varetas de vidro Balana analtica Papel de filtro Whatman n1 Furador de papel Cronometro Homogeneizador
Nota: previamente calcular as quantidades totais de batata, gua destilada, soluo tampo e perxido de hidrognio necessrias realizao da totalidade das experincias. Os ensaios devero ser efectuados em duplicado. Todas as solues devero ser preparadas com tampo Tris-Hcl

Reagente Batatas de casca vermelha H2O2 gua destilada Soluo tampo tris-HCl (pH 7,4 100mmol/L)

Procedimento Preparao da soluo tampo Tris-HCl 100 mmol/L, pH 7.4

Pesar 12.135 g de base Tris (trishydroxymethylaminomethane) e dissolver em 800 mL de gua destilada; Acertar o pH a 7.4 com cido clordrico (HCl); Perfazer o volume a 1 L com gua destilada.

Nota: o tampo Tris-HCl ajuda a minimizar a desnaturao das protenas

Extraco da catalase
Descascar, cortar e pesar cerca de 100 g de batata (anotar o valor da massa pesada);

Rapidamente colocar a amostra num recipiente de plstico com 100 mL de tampo Tris-HCl a 4 C. Colocar o recipiente num banho frio (arrefecido com gelo) e homogeneizar a amostra durante 30 s a 1 min; Colocar um balo de Erlenmeyer num banho frio e filtrar o extracto de batata com papel de filtro Whatman N 1. Transferir o filtrado para um balo volumtrico e acertar o volume a 200 mL com tampo Tris-HCl a 4 C. Preservar o extracto no banho frio at ser utilizado. Este extracto ir conter a catalase e ser designado por extracto-me.

Efeito da concentrao da catalase na actividade enzimtica

Colocar seis bales volumtricos de 25 mL num banho frio e adicionar o extracto de batata nas seguintes propores: 0 mL, 5 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL e 25 mL, perfazendo o restante volume com tampo Tris-HCl a 4 C. Manter as amostras no banho frio; Colocar 10 V a 20 mL de uma soluo tampo de 3 % (vol/vol; 3 mL/100 mL) perxido de hidrognio, em seis tubos de ensaio. Com um marcador definir uma altura especfica, a contar a partir da base do tubo (5 cm a 10 cm; usar a mesma altura para todas as experincias efectuadas neste trabalho); Com um furador, recolher discos de papel de filtro Whatman; Para cada diluio preparada mergulhar um disco no extracto correspondente, durante 1 min (1 disco por cada diluio preparada), para que o papel de filtro possa absorver a catalase na matriz das fibras. Remover o disco e escoar o excesso de lquido; Colocar o disco na base do tubo de ensaio com uma vareta de vidro. Retirar a vareta (instante zero do ensaio) e registar o tempo que os discos demoram a emergir altura especificada.

Efeito da concentrao do substrato na actividade enzimtica

Preparar em bales de 50 mL, oito solues de perxido de hidrognio com as seguintes propores volumtricas: 0 %; 0.2 %; 0.5 %; 0.8 %; 1 %; 3 %; 6 % e 10 %. Perfazer os volumes com tampo Tris-HCl temperatura ambiente; Retirar 10 mL a 20 mL de cada soluo para tubos de ensaio, registando uma altura a contar a partir da base; Em oito bales de 25 mL, completar o volume com extracto-me (3.1.2). Manter em banho gelado. Para cada concentrao de substrato preparada, mergulhar um disco no extracto enzimtico por 1 min e transferir para a base do tubo de ensaio com uma vareta de vidro. Registar o tempo de emerso do disco.

Efeito do tempo e temperatura na actividade enzimtica

Sero testadas quatro temperaturas: 4 C, temperatura ambiente, 50 C e 80 C. Os ensaios devero ser efectuados sequencialmente.

Preparar quatro bales de 25 mL com extracto-me e preservar num banho frio; Escolher um dos bales, registar a temperatura no seu interior e mergulhar um disco; retirar e determinar a velocidade de emerso do disco (de acordo com o descrito anteriormente: em tubo de ensaio com uma soluo tampo de 3 % (v/v) perxido de hidrognio; Colocar um dos bales temperatura ambiente. Deixar estabilizar e registar a temperatura e o tempo necessrio estabilizao da temperatura. Repetir o procedimento da alnea anterior; Preparar dois banhos com temperaturas de 50 C e 80 C. Para cada um dos banhos: quando a temperatura estabilizar, colocar um balo no banho, deixar estabilizar e registar a temperatura e o tempo necessrio estabilizao da temperatura. Determinar a velocidade de emerso do disco. Repetir o procedimento, para cada temperatura, ao fim de 10 min.

Tratamento dos resultados

Relacionar graficamente a velocidade de emerso dos discos em funo da Concentrao/diluio do extracto enzimtico velocidade (cm/min ou cm/seg) versus 1/Diluio; Relacionar graficamente a velocidade de emerso dos discos com a concentrao de perxido de hidrognio; Relacionar graficamente a velocidade de emerso dos discos com a temperatura. Discutir os resultados obtidos, explicando o efeito da concentrao de catalase, do substrato (perxido) e da temperatura na actividade enzimtica. Analisar o efeito do tempo na estabilidade da catalase, para cada temperatura estudada.

Precipitao qumica e enzimtica da protena do leite

Objectivos
Este trabalho tem como objectivo principal a precipitao qumica (cida) e enzimtica da protena do leite de vaca pasteurizado. Para o efeito, sero investigadas as condies de maximizao da precipitao por ambas metodologias. Os resultados sero comparados.

Introduo
As protenas so compostos orgnicos presentes e vitais ao funcionamento de todas as clulas vivas. Desempenham uma variedade de funes fisiolgicas nomeadamente de proteco, coeso e estrutura em organismos pluricelulares. Na forma de enzimas, hormonas, anticorpos, hemoglobina entre outras, as protenas catalisam e regulam uma variedade de funes nos organismos. Estas macromolculas lineares so constitudas por aminocidos (fig.1a) ligados entre si por ligaes peptdicas, nas quais um grupo carboxlico de um aminocido est ligado covalentemente a um grupo amina do aminocido seguinte (fig. 1b). Os aminocidos tm uma estrutura bsica que inclui um grupo amino (NH2) e um grupo carboxlico (COOH) ambos ligados a um carbono anomrico. A este carbono central est tambm ligado um grupo funcional R que, consoante a sua natureza (OH, NH2, SH, COOH, entre outras) confere ao aminocido propriedades e funcionalidades distintas.

Figura 1. a) Estrutura de um aminocido; b) Estrutura primria de uma protena (ou pptido): sequncias contguas de aminocidos ligados entre si por ligaes peptdicas.

As protenas tambm desempenham um papel importante nos processos alimentares dadas as suas propriedades espessantes, gelificantes,

emulsionantes, texturizantes, retentora de humidade, em produtos crneos, pastelaria e confeitaria, lcteos, molhos, entre outros mais. Da composio do leite de vaca constam aproximadamente 87 % de gua e uma mistura homognea de diferentes substncias, umas em emulso, como o caso das gorduras (rico em cidos gordos saturados, os triglicerdeos) e outras dissolvidas como glcidos (lactose), vitaminas hidrossolveis, protenas (casena, albumina, - lactoglobulina, -lactoalbumina), vitaminas e sais. As protenas representam 3 % a 4 % dos slidos encontrados no leite. Das diferentes protenas existentes a principal a casena, que apresenta alta qualidade nutricional e muito importante na fabricao dos queijos. Existem quatro tipos principais de casena, a -S1, -S2, -, e -casena. Cerca de 95 % da casena total do leite encontra-se organizada na forma de micelas emulsionadas no leite, cuja coeso regulada por clcio, fsforo e outros sais. A estabilidade desta emulso deve-se presena da protena - casena superfcie da micela. No leite de vaca natural as casenas tm carga global negativa. A hidrlise da -casena leva desestabilizao da emulso, que se traduz na formao de uma malha proteica. No fabrico de queijo, a coagulao enzimtica das casenas pode ser feita por enzimas proteolticas de origem animal (renina), vegetal (ciprozinas) ou microbiana. A renina, a mais utilizada, extrada da mucosa gstrica dos bovinos e consiste numa mistura de quimosina (E.C. 3.4.4.3) e pepsina (E.C. 3.4.4.1). Sob aco desta mistura enzimtica ocorre a hidrlise da casena, seguida de uma agregao das micelas da protena modificadas formando uma rede proteica, a coalhada. A coalhada contm essencialmente glbulos de gordura, gua e materiais hidrossolveis. No processo de coagulao por acidificao as casenas precipitam devido aproximao do pH do ponto isoelctrico (pH = 4,6), onde se verifica a neutralizao das cargas negativas da micela de casena e do potencial de superfcie, responsvel pelas repulses electrostticas. O cido pode ser produzido por microrganismos presentes no leite cru ou, caso o leite seja tratado termicamente, por bactrias lcticas selectivamente adicionadas. Estas consomem a lactose do leite, produzindo o cido lctico. Em alternativa adio destes microrganismos pode-se adicionar directamente cido lctico ou cido clordrico. Embora a acidificao directa permita um melhor controlo do processo, as bactrias lcticas permanecem activas durante a maturao do queijo, contribuindo para o desenvolvimento de sabores caractersticos no produto final. Quando o sabor no o mais importante, mas sim a textura recorre-se preferencialmente acidificao directa. A reaco do Biureto (teste do Biureto) permite a deteco da presena de ligaes peptdicas. Em meio alcalino os compostos com duas ou mais ligaes peptdicas tomam uma colorao violeta, por complexao entre cada io de cobre e quatro tomos de azoto (dois de cada ligao). A intensidade da

cor varia com a concentrao de protenas. A absorvncia medida a 550 nm directamente proporcional concentrao de protena na amostra.

Material Gobels de 200 mL Banho termostatizado Gaze Varetas de vidro Pipetas graduadas Placa de agitao Balana analtica Medidor de pH

Reagentes Leite gordo/magro UHT HCL Soluo enzimtica (Coalho) NaOH CuSO4

Procedimentos
Preparar 0.1 mol/L HCl: a 2 L de gua destilada, adicionar lentamente 22.5 mL de HCl (cido clordrico); Agitar e perfazer o volume a 2.5 L.

Preparar reagente de Biureto: Preparar uma soluo de 100 g/L hidrxido de sdio (adicionar lentamente os pellets de NaOH) gua destilada. Preparar uma soluo de 50 g/L sulfato de cobre (II) (esta soluo ter cor azul).

Precipitao qumica (cida) da protena do leite

Colocar 120 mL de leite e anotar o valor exacto da massa correspondente; Colocar o gobel com o leite numa placa com agitao e aquecimento e estabilizar a temperatura a 37 C; Colocar a sonda do medidor do pH e registar o valor quando estabilizar; Sob agitao suave adicionar lentamente 0.1 mol/L HCl at o pH da mistura baixar para 4.6; Registar o volume de cido usado e o tempo necessrio para atingir o pH pretendido; Retirar o magneto e deixar a mistura em repouso, temperatura ambiente, at que forme uma coalhada visvel (5 min a 10 min; registar o tempo de observao at formao da coalhada); Vedar o topo do gobel com gaze e um elstico e inverter para remover o soro. Recuperar a coalhada, lavar com gua destilada fria (4 C) e pressionar contra a gaze para remover ao mximo o excesso de lquido;

Espalhar a coalhada e deixar secar ao ar durante 5 min a 10 min. Registar o valor da massa obtida.

Precipitao enzimtica da protena do leite

Colocar 120 mL de leite e anotar o valor exacto da massa correspondente; Colocar o gobel com o leite numa placa com agitao e aquecimento e estabilizar a temperatura a 37 C; Colocar a sonda do medidor do pH e registar o valor quando estabilizar; Sob agitao suave adicionar 88 L de coalho. Agitar pelo mesmo perodo de tempo que o registado em 3.1 e registar o pH final da mistura; Retirar o magneto e deixar a mistura em repouso, temperatura ambiente, at que forme uma coalhada visvel (5 min a 10 min; registar o tempo de observao at formao da coalhada); Vedar o topo do gobel com gaze e um elstico e inverter para remover o soro. Recuperar a coalhada, lavar com gua destilada fria (4 C) e pressionar contra a gaze para remover ao mximo o excesso de lquido; Espalhar a coalhada e deixar secar ao ar durante 5 min a 10 min. Registar o valor da massa obtida. Repetir a experincia para as temperaturas de 4 C e 60 C.

Teste do biureto
Aps pesagens da coalhadas obtidas por ambos os mtodos, recolher uma fraco para vidros de relgio; Recolher 5 mL de leite para um gobel; Em todas as amostras adicionar 1 mL da soluo de NaOH e homogeneizar. Adicionar 5 gotas da soluo de CuSO 4, homogeneizar e registar as alteraes de cor (teste positivo: colorao violeta; teste negativo: colorao azul).

Tratamento dos resultados

Comparar os rendimentos obtidos por ambos os mtodos e discutir as diferenas obtidas, considerando os mecanismos de precipitao de ambos os mtodos. Analisar o efeito da temperatura na precipitao enzimtica da protena do leite.

Anlise Qumica de Alimentos

Objectivos
A principal finalidade deste trabalho a de efectuar uma anlise qumica global para vrios alimentos especficos, comeando pelo queijo. Para tal, o alimento em questo ser caracterizado em termos de teor de humidade, de cinzas, de protenas, de hidratos de carbono e de lpidos.

Introduo
De forma a cumprir a legislao vigente, a autenticidade e a qualidade do produto, e a assegurar a defesa do consumidor no que respeita segurana alimentar, ou mesmo a fornecer informao detalhada acerca da composio nutricional, os bens alimentares devem ser submetidos a anlises qumicas e/ou sensoriais. A necessidade de propor ao consumidor novos produtos, a caracterizao das matrias-primas e a monitorizao das propriedades dos alimentos durante o processamento, so tambm susceptveis de procedimentos analticos. Neste contexto, as anlises so conduzidas pelos mais variados sectores da indstria alimentar, incluindo fabricantes, fornecedores de ingredientes, laboratrios de anlises, laboratrios do estado, universidades e laboratrios de investigao. Os analistas alimentares esto interessados em obter informao sobre as diferentes caractersticas dos alimentos, incluindo a sua composio, estrutura, propriedades fsico-qumicas e atributos sensoriais. A maioria dos alimentos de composio complexa j que elaborada a partir de constituintes qumicos diversos. A sua composio pode ser especificada de vrias formas dependendo da propriedade de interesse para o analista e do tipo de procedimento adoptado: tomos especficos (e. g. carbono, hidrognio, oxignio, azoto, enxofre, sdio, etc.), molculas especficas (e. g. gua, sacarose, vitamina A, -lactoglobulina) ou tipos de molculas (e. g. lpidos, protenas, hidratos de carbono, fibra, minerais).

Preparao da Amostra
Trabalhar com queijo de pasta dura ou semi-dura a 4 C Retirar a crosta ou a camada superficial untuosa ou bolorenta do queijo de modo a obter uma amostra representativa, tal como habitualmente consumido Cortar em cubos de 1 cm a 3 cm e dilacer-lo com uma varinha mgica (ou picadora) at obter partculas de cerca de 1 mm a 3 mm. Misturar

bem. Alternativamente, amassar e homogeneizar a amostra num almofariz Conservar num recipiente estanque a 4 C at ao momento da anlise, que deve ser no prprio dia

Teor em Humidade e Teor em Cinzas

A humidade de um alimento uma das propriedades mais frequentemente determinadas, por razes que se prendem com questes legais de etiquetagem e de estabilidade microbiolgica, entre outras. O teor em cinzas uma medida da quantidade de minerais presentes no alimento, enquanto o teor em minerais uma medida da quantidade de componentes inorgnicos especficos presentes, como clcio, sdio, potssio e cloro.

Material e reagentes
Material Cadinhos de porcelana Estufa Mufla Exsicador Balana analtica

Procedimento Doseamento da Humidade

Fazer ensaio em triplicado Pesar 3 g de amostra para um cadinho previamente tarado (no caso de queijos de pasta mole ou queijos processados com teor elevado de humidade, pesar 2 g e secar parcialmente num banho-maria) Colocar o cadinho numa estufa a 105 C Secar at peso constante Remover o cadinho da estufa e colocar num exsicador at temperatura ambiente Pesar o conjunto

Doseamento das Cinzas

Usar as amostras de queijo secas, resultantes da medio da humidade Queimar a gordura cuidadosamente, colocando o cadinho sobre um bico de Bunsen, na cmara de exausto Colocar os cadinhos numa mufla a temperatura no superior a 500 C durante 8 h (ou at o resduo ficar branco) Remover o cadinho da mufla e colocar num exsicador at temperatura ambiente Pesar o conjunto

Expresso dos resultados

Expressar a humidade como percentagem da perda de peso aps secagem na estufa Calcular a percentagem de slidos da amostra Calcular o teor de cinzas, correspondente ao peso da matria contida no cadinho aps incinerao na mufla

Teor em Gordura
Os lpidos so constituintes importantes dos alimentos, e tambm so importantes na dieta humana por vrias razes, incluindo o fornecimento de energia. No entanto, o consumo exagerado de alguns deles pode provocar danos na sade, e. g. colesterol e gorduras saturadas. Em muitos alimentos, a componente lipdica desempenha um papel crucial nas caractersticas fsicas do alimento, nomeadamente na textura e na aparncia. Na anlise de um produto alimentar pode ser importante determinar a concentrao total em lpidos, o tipo de lpidos presente e as suas propriedades fsico-qumicas (ponto de fuso, propriedades reolgicas, densidade) e tambm a sua organizao estrutural. Os lpidos so usualmente definidos como sendo os componentes solveis em solventes orgnicos (ter, hexano, clorofrmio) mas insolveis em gua. Este grupo de substncias inclui monocilgliceris, diacilgliceris e triacilgliceris, cidos gordos livres, fosfolpidos, esteris, carotenides e vitamina A e vitamina D.

Material e reagentes
Material Cadinhos de porcelana ou de vidro Reagentes ter dietlico - grau ACS, isento de perxidos e de resduos na evaporao Balana analtica ter de petrleo - grau ACS, gama de ebulio entre 30 C e 60 C, isento de resduos na evaporao Placa de aquecimento ou banho- Etanol 95 %, isento de resduo na maria evaporao Exsicador vermelho-congo 10 g/L Sistema de destilao com balo de gua destilada 250 mL cido clordrico 25 % (m/m) Alternativa Soxtec System HT2

Procedimento Extraco da matria gorda

Fazer a anlise em duplicado (idealmente em triplicado). Paralelamente efectuar um ensaio em branco Pesar aproximadamente 3 g de amostra (com a preciso de 1 mg) para um gobel*, adicionar 9 mL de H2O e homogeneizar, aquecendo a mistura a baixa temperatura (prxima dos 50 C) Adicionar 10 mL de HCl e algumas esferas de vidro**. Cobrir com um vidro de relgio e ferver regularmente durante 5 min, at dissoluo do queijo Arrefecer a soluo. Transferi-la quantitativamente para um funil de separao/decantao Lavar o gobel sucessivamente com 10 mL de etanol, 25 mL de ter dietlico e 25 mL de ter de petrleo, juntando cada uma das lavagens ao funil de separao. Agitar vigorosamente aps adio de cada reagente. Usar cmara de exausto Deixar separar as fases at que a fase superior fique lmpida (para melhor visualizao da linha de separao, adicionar 2 gotas de uma soluo de vermelho-congo a 10 g/L, ou outro corante hidro-solvel) Recolher a fase orgnica para um balo de destilao de 250 mL, previamente tarado Repetir a extraco com ter de petrleo mais 2 vezes

Doseamento
Evaporar os solventes orgnicos, primeiro por destilao e depois em banho-maria a temperatura 100 C, na cmara de exausto Determinar a percentagem de gordura na amostra por pesagem

Nota: a diferena entre determinaes efectuadas simultaneamente pelo mesmo operador deve ser 2 g/kg (massa de gordura por massa de produto analisado)
* a extraco pode ser efectuada num soxhlet ou num sistema automtico (e. g., Soxtec ver manual de operao do Soxtec System HT2) ** as esferas de vidro devem ser previamente lavadas com HCl, seguindo-se lavagem repetida com gua ultra-pura e secagem completa

Teor em Protenas
As protenas so constitudas por polmeros de aminocidos, diferindo entre elas pelo tipo, nmero e sequncia destes. Assim, elas tm diferentes estruturas moleculares, atributos nutricionais e propriedades fsico-qumicas. Alm de serem uma importante fonte de energia, as protenas contm alguns aminocidos essenciais sade humana (lisina, triptofano, metionina, leucina, isoleucina e valina) e que o organismo humano no consegue sintetizar. Alm disso, so constituintes maioritrios em muitos alimentos naturais, determinando a sua estrutura global. Analiticamente pode ser importante conhecer a concentrao total, o tipo, a estrutura molecular e as propriedades funcionais das protenas nos alimentos. O teor em protenas pode ser determinado indirectamente a partir do azoto total de uma amostra. No caso de queijos de pasta dura, semi-dura e processados (com um teor em protena entre 18 % e 36 %), o valor pode ser conseguido multiplicando o teor em azoto total por 6.38.

Material e reagentes
Material
Sistema Tecator Kjeltec constitudo por unidade de digesto Digestion System 6 / 1007 Digestor e por unidade de destilao Kjeltec System / 1026 Distilling Unit Tubos de vidro para digesto, 250 mL Unidade de destilao para tubos de 250 mL bureta para titulao Liquidificadora ou picadora Sacos de plstico com capacidade para 170 g Esptulas Papel de filtro celulsico de 7 cm de dimetro, Whatman n 44 ou equivalente, isento de azoto

Reagentes
H2SO4 concentrado a 98 %, isento de azoto

Soluo de H2SO4 a 200 mL/L soluo-padro de H2SO4 a 0.025 ml/L Pastilhas de catalisador (Kjeltabs com Selnio), 5 g K2SO4 + 5 mg Se Soluo indicadora de verde de bromocresol a 1 g/L (em etanol) Soluo indicadora de vermelho de metilo a 1 g/L (em etanol) Soluo de cido brico a 40 g/L Soluo de NaOH a 400 g/L gua ultra-pura

Preparao da soluo de cido brico:

Dissolver 40.0 g de cido brico em 600 mL de gua fervida e ainda muito quente. Misturar bem e adicionar mais 300 mL da mesma gua quente (soluo incolor). Esperar que a soluo atinja a temperatura ambiente. Adicionar 10 mL de soluo de verde de bromocresol e 7 mL de soluo de vermelho de metilo. Diluir at 1000 mL e mexer cuidadosamente. Transferir 25 mL (com pipeta volumtrica) da soluo obtida para um copo, e acrescentar 100 mL de gua. Se esta soluo permanecer com cor vermelha, titular com NaOH a 4 g/L (ou 0.10 mol/L), at se obter um cinzento neutro. Normalmente gastam-se entre 40 L e 60 L de NaOH, pelo que aconselhvel usar uma micropipeta e ir adicionando 10 L de cada vez. Juntar soluo de 1000 mL de cido brico um volume de NaOH a 40 g/L (1.0 mol/L) igual a 4 vezes o volume de NaOH a 4.0 g/L, gasto nesta titulao. Misturar. A soluo est pronta e tem 1 ms de validade.

Procedimento

Analisar amostras em duplicado (idealmente em triplicado) Se os ensaios no forem efectuados aps preparao da amostra, eliminar a camada superior do queijo (cerca de ). Trabalhar com a restante amostra, enquanto fria Colocar cerca de 21 g num saco de plstico (no demorar mais de 30 s a transferir) Remover o ar do interior do saco manualmente e pressionar at homogeneizar a amostra e uniformizar a consistncia da pasta Pesar cerca de 0.5 g de amostra para um papel de filtro previamente tarado. Anotar o peso com 4 casas decimais Acomodar a amostra, fechando-a no papel de filtro e colocar o conjunto no fundo de um tubo Kjeldahl Preparar um branco (com papel de filtro mas sem amostra) em paralelo Proceder como indicado no manual de operao do Tecator Kjeltec 1026, com as seguintes alteraes: Colocar o bloco para uma temperatura inicial de cerca de 180 C a 230 C de modo a controlar a formao de espuma Digerir durante 30 min ou at ao desenvolvimento de fumo branco Aumentar a temperatura para 410 C a 430 C (gradualmente durante cerca de 20 min) e digerir a amostra at clarificao. Depois, continuar a digesto por mais 1 h pelo menos (tempo total entre 1.75 h e 2.5 h) Arrefecer temperatura ambiente e adicionar 85 mL de H2O (no branco adicionar 100 mL). Misturar e deixar arrefecer novamente

Expresso dos resultados

Calcular o azoto total Kjeldhal na amostra de acordo com o descrito no manual de Operao do Tecator Kjeltec 1026. Para obter a percentagem em protena total, multiplicar a percentagem de azoto na amostra por 6.38

Teor em hidratos de carbono totais

Os hidratos de carbono so tambm constituintes maioritrios em alguns alimentos. Podem estar presentes como molculas isoladas, estar fisicamente associados ou quimicamente ligados a outras molculas. As molculas individuais podem ser classificadas, de acordo com o nmero de monmeros que as constituem, em monossacardeos, oligossacardeos e polissacardeos. As molculas que esto ligadas covalentemente a protenas so conhecidas como glicoprotenas e as que esto ligadas a lpidos so conhecidas como glicolpidos. Os hidratos de carbono passveis de ser digeridos pelo organismo humano constituem uma fonte importante de energia. Na ausncia de um mtodo directo especfico para o alimento em anlise, a totalidade dos hidratos de carbono pode ser determinada indirectamente por diferena. Neste contexto, ao peso total da amostra subtrada a soma dos pesos dos outros constituintes (protena, gordura, gua, cinzas). Nesta estimativa, os hidratos de carbono incluem a fibra bem como alguns componentes no estritamente considerados hidratos de carbono. Assim, sempre que possvel, determinar o teor em fibra diettica total, para subtrair ao peso da amostra e assim obter o teor em hidratos de carbono disponveis.

Expresso dos resultados

Determinar o teor total em hidratos de carbono da amostra

Determinao de constantes cinticas da invertase em clulas livres e imobilizadas em alginato

Objectivos
O objectivo deste trabalho prtico a determinao das constantes cinticas Vmx, Km e K2 da invertase livre, segundo o modelo de Michaelis-Menten e compar-las com as obtidas num sistema de clulas imobilizadas. Pretende-se ainda, atravs da comparao das constantes cinticas, verificar a existncia de limitaes de transferncia de massa interna e determinar os factores de eficincia assim como a difusividade da sacarose no gel de alginato. Por ltimo pretende-se verificar o efeito do dimetro do biocatalizador nas limitaes difusionais internas.

Introduo
A imobilizao de clulas microbianas inteiras muitas vezes utilizada com o fim de evitar o processo de extraco das enzimas das clulas, ou para tirar partido dos sistemas multienzimticos destas ltimas. A cintica de reaces catalisadas por enzimas pode ser descrita segundo o modelo de Michaelis-Menten que se baseia no mecanismo de Briggs-Haldane que pressupe que a reaco enzimtica processa-se segundo as etapas seguintes:

A variao da velocidade da reaco enzimtica com a concentrao de substrato, segundo o modelo de Michaelis-Menten obtida pela equao seguinte:

em que vo a velocidade inicial da reaco, So a concentrao inicial de substrato e Vmax e Km as constantes cinticas, sendo Vmax proporcional concentrao total de enzima E (ver Fig. 1).

Os valores de Vmax e Km podem ser determinadas atravs da medio das velocidades iniciais da reaco a diferentes concentraes iniciais de substrato. Geralmente, recorrese representao grfica de Lineweaver-Burk (Fig.2), derivada da equao de Michaelis - Menten:

Esta equao representa uma recta e as constantes cinticas so calculadas a partir dos valores do declive e da ordenada na origem.

Com biocatalisadores imobilizados, o modelo de Michaelis-Menten aplicvel, em muitos casos, na forma:

em que Vmax.i e Km.i so as constantes cinticas intrnsecas para o sistema imobilizado. Pode calcular-se um factor de eficincia global para o sistema imobilizado, definido por = vo (biocatalisador imobilizado/ vo (biocatalisador livre) que reflecte os efeitos das restries externas e internas transferncia de massa, bem como os efeitos intrnsecos ao sistema de imobilizao utilizado. Este trabalho tem por objectivo a determinao dos parmetros cinticos da hidrlise da sacarose pela invertase:

Sero utilizadas clulas de levedura Saccharomyces cerevisiae como fonte de invertase (enzima intracelular), livres e imobilizadas num gel de alginato. O cido algnico um polissacrido que ocorre naturalmente em alguns tipos de algas. Os alginatos de ies monovalentes (sdio, potssio) so normalmente solveis em gua, ao contrrio dos de ies divalentes. Neste trabalho, as clulas so incorporadas numa soluo de alginato de sdio, qual se adiciona posteriormente uma outra contendo ies clcio. Deste modo ocorre a troca inica entre os ies sdio e clcio, ficando as clulas retidas na malha interna do gel. Uma desvantagem deste mtodo, o facto do gel ter tendncia a dissolver-se em solues diludas, libertando o enzima, se no se tiver o cuidado de incluir nestas ies clcio em concentraes apreciveis.

Materiais e reagentes
Material
Balana Placa de aquecimento com agitao Espectrofotmetro Agitador tipo vrtex Termmetro Cronmetro Banho-maria a 100 0C 2 Banhos da gua temperatura ambiente Reactores termostatizados Barras magnticas Tubos de ensaio Escoador Seringas de 10 ml Pipetas de 1 e 5 ml Gobls de 100 ml Cuvetes Papel de alumnio Papel de filtro

Reagentes
Alginato de sdio Clulas de fermento de padeiro Cloreto de clcio Sacarose Tampo acetato pH 4.5 Reagente de DNS

Procedimento Ensaios com as clulas livres

Preparar 10 ml de uma suspenso de Saccharomyces cerevisiae (fermento de Padeiro) a 2% (p/v), mantendo-a sempre em agitao; Preparar 100 ml de solues de sacarose em tampo acetato pH 4.5, nas seguintes concentraes e contendo 1% de cloreto de clcio: 10; 20; 50; 100; 200 g/l Para cada soluo, proceder como descrito abaixo, executando os ensaios por ordem crescente de concentrao: Medir 50 ml de soluo de sacarose para o reactor, previamente termostatizado a 45oC; Retirar uma amostra de 0.5 ml equivalente ao tempo zero; Manter o meio com agitao e adicionar 0.5 ml da suspenso de clulas, marcando simultaneamente o incio da contagem do tempo; Retirar amostras de 0.5 ml de minuto a minuto, at se completarem 5 minutos de reaco; ao retirar cada amostra, acrescentar-lhe imediatamente 0.5 ml de reagente DNS; processar simultaneamente um branco de tampo acetato pH 4.5 do mesmo modo; Mergulhar os tubos num banho de gua a 100 oC durante 5 minutos, arrefecer a mistura e adicionar-lhe 5 ml de gua destilada; Ler a absorvncia da soluo a 540 nm.

Ensaios com clulas imobilizadas

Preparar 100 ml de uma soluo de cloreto de clcio a 2% (p/v); Preparar uma matriz lquida com: 1 g de alginato de sdio 45 ml de gua destilada. Aquecer ligeiramente para dissolver o alginato e adicionar 2.5 ml de suspenso de clulas; Usando uma seringa, adicionar quantitativamente a matriz gota a gota a cerca de 100 ml de soluo de cloreto de clcio mantida em agitao e temperatura ambiente; Manter as esferas nesta soluo durante 15 minutos para completar a gelificao; Preparar uma soluo de cloreto de clcio 1 % (p/v) em tampo acetato pH 4.5, lavar as esferas com esta soluo e sec-las sobre papel de filtro; Pesar as esferas hmidas, determinar o seu dimetro mdio (de 5 esferas) e dividi-las em 5 pores iguais (equivalente a 0.5 ml de suspenso de clulas cada); Para cada soluo de sacarose preparada anteriormente, medir 50 ml para o reactor, previamente termostatizado a 45oC; Executar os ensaios por ordem crescente de concentrao; Retirar uma amostra de 0.5 ml equivalente ao tempo zero; Manter o meio com agitao e adicionar o correspondente a 0.5 ml da suspenso de clulas imobilizadas, marcando simultaneamente o incio da contagem do tempo; Retirar amostras de 0.5 ml de 3 em 3 minutos, at se completarem 15 minutos de reaco; Determinar os acares redutores nas amostras recolhidas, da mesma forma que anteriormente.

Tratamento dos resultados

Calcular as constantes cinticas atravs da representao de Lineweaver-Burk, para o biocatalisador livre e imobilizado (Km, Vmax, K2); Calcular a actividade especfica (g substrato consumido/g clulas.min) para as duas formas biocatalticas e para as vrias concentraes de substrato; Calcular o factor de eficincia global para cada concentrao de substrato; Determinar o coeficiente de difuso mdio