PCR

A tcnica da PCR permite que um fragmento especfico da molcula de DNA seja amplificado milhares de vezes em apenas algumas horas. Esta tcnica revolucionou as pesquisas em biologia molecular, pois at ento demorava-se muito tempo para a amplificao do DNA. A partir da PCR possvel obter-se cpias de uma parte do material gentico em quantidade suficiente que permita detectar e analisar a sequncia que alvo do estudo. A reao pode ser comparada a uma procura por uma nica pessoa em uma grande cidade e clon-la ao ponto de poder povoar toda a cidade. A reao explora funo natural da enzima chamada de taqpolimerases, extrada da bactria Thermus aquaticus, que uma enzima termoestvel, fato de imensa importncia uma vez que a reao se processa em ciclos de diferentes temperaturas, como ser dito mais adiante. Este processo de amplificao do DNA foi inventado por Kary Mullis em 1983 e a primeira amplificao feita foi a da betaglobulina humana. Desde ento, houve um aumento exponencial no nmero de publicaes cientficas que relatavam utilizar a tcnica da PCR em experimentos, passando de 3 publicaes em 1986 para 1700 em 1990. Esta descoberta condecorou Kary Mullis com o prmio Nobel de Qumica dez anos aps sua inveno. O fato central que faz a PCR to til que todo organismo vivo possui sequncias de nucleotdeos no DNA que so nicas e especficas para cada espcie. Esta reao permite a amplificao de qualquer seqncia de DNA coletada de amostras de materiais biolgicos como sangue, urina, outros fluidos corporais, cabelo e fragmentos teciduais. Amostras de microorganismos, clulas vegetais ou animais mesmo que com milhares de anos, tambm podem ser detectadas pela PCR. Para a execuo da tcnica da PCR preciso que se tenha conhecimento prvio da seqncia do cido nuclico que se deseja amplificar,dita "seqncia alvo." A partir disto, desenham-se dois iniciadores ("primers") para dar partida ao processo de sntese em um local especfico.Um "primer" serve para sintetizar a seqncia alvo no sentido 3- 5e outro para o sentido inverso isto , 5-3. O "primer" uma pequena seqncia de nucleotdeos que hibridiza no incio da seqncia alvo que se quer amplificar e da qual ele complementar. Ao reconhecer o "primer," a polimerase sintetiza uma cpia

complementar, obedecendo informao contida na seqncia de DNA que ser replicada (sintetizada). Etapas do processo: Extrao do DNA da amostra que se pretende estudar Purificao do DNA Preparao de uma mistura chamada Master Mix, que conter todas as substncias necessrias sintese de novas cpias de DNA Incubao em um termociclador, que o aparelho responsvel pela execuo de todos os ciclos da reao aquecendo e resfriando o/os tubo/s Eletroforese em gel de poliacrilamida dos produtos da PCR Revelao e fixao do gel Reagentes da PCR: Soluo tampo para se garantir pH e concentraes inicas adequadas reao Deoxinucleosdeos trifosfatos ( dATP, dGTP, dCTP, dTTP ) que atuam como tijolos na construo das molculas de DNA Os primers A Taq-polimerase H2O Mg+2 para optimizar a reao (nem sempre usado) O DNA extrado da amostra Alguns adjuvantes quando necessrio A reao em si os ciclos: Existem trs fases bsicas ou ciclos para cada reao de PCR. Cada ciclo contm um ou mais passos e duas variveis em cada passo: a temperatura e a durao. Etapa de desnaturao inicial: consiste de um nico passo de desnaturao a 94C por 5 minutos. Dificilmente altera-se esta etapa. O bojo da PCR toma local neste ciclo, que subdividido em trs: 1)Etapa de anelamento; este o passo que habilita os primers a anelar a fita simples desnaturada. O tempo necessrio para anelamento de 30-45 segundos. 2) Etapa de extenso. neste passo que a Taq polimerase age para estender o molde. Regularmente ela realizada a temperatura de 72 (a atividade enzimtica tima de 76 - 79C), dificilmente altera-se a temperatura de 72. Uma regra para se estimar a extenso do tempo a de que para cada 1000 nucleotdeos atribumos 1 minuto. Outra frmula popular calcular 60 bases por segundo.

3) Etapa de desnaturao: A desnaturao da molcula de DNA formado serve como molde para o prximo ciclo. Ela realizada a temperatura de 93-94C. Nesta temperatura a enzima tem uma meia vida de cerca de 1 hora. Estes trs passos so repetidos 30-40 vezes em particular para anlises de digesto. Se os ciclos excederem esta quantidade eles podero introduzir mutaes com a Taq polimerase. Etapa de extenso final. Isto feito com um nico ciclo em dois passos: um passo de anelamento o qual idntico ao passo de anelamento na segunda etapa de PCR (mesmo tempo e mesma temperatura). O segundo a de extenso longa temperatura idntica ao passo de extenso, porm com durao de 3-5 minutos ( 72C) por 5 minutos. Isto habilita toda amplificao semi-iniciada a se completar.

Diferentes aplicaes da PCR: Estudo do padro de expresso gnica (transcritos raros) Seleo de clones recombinantes Sequenciamento direto de produtos amplificados Deteco de mutaes em genes especficos Estudos diagnsticos de doenas infecciosas, deteco de bactrias, vrus e protozorios parasitas Diagnstico pr-natal em caso de risco Elucidao de relaes evolutivas entre espcies, utilizando material arqueolgico Grande valia na Medicina Forense (impresso digital de DNA)

Revelao da PCR em gel de poliacrilamida;