______________________________________________ ENZIMOLOGIA _______________________________________________

Pensa-se que no hajam enzimas solveis, dado que os enzimas esto ligados ao citosqueleto, havendo mltiplas interaces. Tambm no se deve afirmar que existem enzimas isolados, pois as tcnicas que existem no tm capacidade para detectar certas molculas que se encontram perto do enzima. Hoje em dia, podem-se cristalizar enzimas sem estarem puros. Assim, como se fala em cristal no significa que o enzima esteja isolado. a tcnica de Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) que permite estudar o enzima completamente isolado no seu meio ambiente. Por outro lado, tambm importante usar enzimas o mais purificados possvel para se poder detectar a verdadeira aco do enzima. Quando se efectua o processo de purificao, o enzima solvel. Um dos modos de fazer esta purificao retirar o cofactor que activa o enzima. Por exemplo, uma situao em que necessrio estudar o enzima no seu ambiente, quando se est a estudar como este se comporta numa via metablica. ''Enzimas novos'': so enzimas que resultam aps se removerem algumas molculas e/ou se acrescentarem outras. Devido a estas modificaes, verificam-se alteraes na actividade do enzima.

A Gentica Molecular uma ferramenta importante em Enzimologia. A formao de enzimas novos permite que haja enzimas mais ''purificados'' e que no seja necessrio utilizar uma grande quantidade de animais para um determinado estudo. Este procedimento pode ser, por exemplo, substitudo atravs da utilizao de leveduras, desde que se saiba a sequncia de protenas que se pretende obter. Deste modo, j no se fazem purificaes atravs dos rgos/ tecidos originais. -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Nota: o problema do conceito de chave e fechadura ser inflexvel. -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Atravs do estudo de cristais de urease por Sumner, soube-se que os enzimas so protenas. Os enzimas so tambm catalisadores no biolgicos. A enzimologia reducionista pois o estado estacionrio de fluxos metablicos e de concentrao de metabolitos na clula so propriedades do sistema. Por outro lado, o meio celular heterogneo e tem um elevado contedo em protenas. Pensa-se que no h enzimas solveis pois os enzimas esto ligados ao citoesqueleto e h mltiplas interaces.

Novas molculas com actividade cataltica?

Ribozimas; Anticorpos catalticos; Enzimas artificiais.

Ribozimas

Os ribozimas so RNA que tm actividade cataltica. Correctamente, deve-se designar de RNA cataltico. 99,9 % das actividades que ocorrem na clula so catalisadas por enzimas. Os enzimas so protenas e so catalisadores. Contudo, h catalisadores que no so enzimas, como os radicais. O RNA no um enzima mas um catalisador. Os ribozimas so molculas que tm um potencial teraputico e so utilizados como biossensores, para a evoluo da funo cataltica, genmica funcional e para a descoberta de novos genes. Os ribozimas so usados como aminotransferases, pois fazem a transferncia de grupos amina. Anticorpos catalticos Os anticorpos catalticos tm sido explorados in vitro e tambm so utilizados como catalisadores. Os anticorpos catalticos tm a capacidade de ligao (reconhecem molculas) e so importantes para a construo do anlogo do estado de transio que ocorre durante a catlise enzimtica. Utilizam o anticorpo para formarem um composto muito parecido com o do estado de transio que um estado muito reactivo. E + A EA* EA, onde EA* o estado de transio Os anticorpos catalticos so utilizados para destoxificao da cocana. Com estes anticorpos possvel tirar a cocana de um organismo, pois transformam a cocana por aco de anticorpos num composto muito parecido. Anticorpos especficos so utilizados para se ligarem a determinadas substncias e modific-las para ficarem parecidos com a molcula do estado de transio. Enzyme Mimics: Enzimas artificiais Estas substncias mimetizam a aco do enzima. So molculas sintticas de natureza orgnica preparadas para recrear o centro activo do enzima. So preparadas para mimetizar as funes do enzima, mimetizar a reaco qumica (transformaes qumicas ligaes covalentes) e/ou reconhecimentos molecular. Pretendem mimetizar a geometria. O centro activo est bem definido. Exemplo de dois sistemas catalticos biomdicos: Organocatlise com prolina; teres de coroa de Koga.

Estes enzimas artificiais servem para catalisar normalmente o passo inicial do processo. A dimenso tambm importante para a ligao e para a libertao do produto. Ciclodextrinas As ciclodextrinas servem de base para se construir o centro activo. Hoje em dia, so muito utilizadas pois so baratas. Como so feitas a partir do amido so biodegradveis. A ciclodextrina um composto constitudo por um anel com 6, 7 ou 8 resduos de glucose. Tm uma cavidade hidrfoba, estvel e solvel em gua que pode ser modificada. Exemplo de aplicaes: A ligao de grupos imidazolo s ciclodextrinas funcionam como importantes catalisadores; Transaminase artificial.

Criptandos

Os criptandos so ligandos multidentados que ligam caties. Exemplo: hidrlise do ATP mimetizao do ATPase. Qualquer enzima tem um elevado poder cataltico (1017).

Propriedades dos enzimas

Elevado poder cataltico; Especificidade; Capacidade de regulao.

Especificidade
Os enzimas tm especificidade varivel. Especificidade de ligao baixa especificidade Exemplos de enzimas que pertencem a este tipo de especificidade: peptidases, fosfatases, esterases. Ocorrem em vias degradativas. Especificidade de grupo especificidade intermdia Neste tipo de especificidade, o enzima j escolhe um tipo de molcula. Exemplo: hexocinase. Especificidade molecular especificidade absoluta Exemplos de enzimas que pertencem a este tipo de especificidade: urease, o qual s especfica para a ureia. Em substratos de maior massa molecular, h especificidade molecular por regio. Exemplo: endonucleases de restrio, que so especficas para uma determinada regio. Estereoespecificidade de grupo especificidade elevada 3

Este tipo de especificidade ocorre no ciclo do TCA. Consiste na especifidade do enzima em que apenas um dos ismeros da molcula especfico para com o enzima.

Nomenclatura e Classificao
A partir de 1956 criaram-se regras para a nomenclatura de enzimas. E.C.: Enzyme Commission Os enzimas so classificados de acordo com o tipo de reaco que catalisam. Quando se refere pela primeira vez o enzima, deve-se apresentar o nome sistemtico, com o respectivo nmero EC e o nome trivial. A partir desse momento, j se pode tratar o enzima pelo nome trivial. 1 Algarismo: informa sobre a propriedade o tipo de reaco Os enzimas so classificados com quatro algarismos. O primeiro algarismo indica o tipo de reaco catalisada. Os restantes algarismos fornecem informaes adicionais. Liases: so sintases. Catalisam a reaco de substituio a outras substncias atravs de duplas ligaes; Ligases: so sintetases. necessrio intervir ATP.

Exemplo: EC 1.1.1 Nome trivial: lcool desidrogenase Nome sistemtico: lcool: NAD+ oxidoredutase No nome sistemtico, primeiro escreve-se o dador : redutor ou aceitador na forma oxidada. 2 Algarismo: informa sobre o tipo de dador que participa na reaco Tendo-se um oxidoredutase, se se tiver 1.13, ou seja, se o segundo algarismo for um 13, significa que o oxignio participa, ou seja, um enzima que incorpora oxignio. Se se tiver 1.13.11, tem-se um dioxigenase, pois o enzima incorpora dois tomos de oxignio (2O). Se se tiver 1.13.12, tem-se um monoxigenase, pois o enzima incorpora um tomo de oxignio (1O). 3 Algarismo: informa sobre o tipo de aceitador que participa na reaco No exemplo dado, significa que o NAD+ entra na reaco. Oxidase: trata-se de oxidoreductase, pois o oxignio o aceitador; Oxigenase: trata-se de um oxidorectase que trabalha com a incorporao de oxignio, sendo o oxignio um aceitador.

Nome Sistemtico: por regra, o nome correcto : Dador (com H2):aceitador no estado oxidado. Quando os cofactores participam na reaco, na nomenclatura sistemtica, so aceitadores. No nome colocam-se na forma oxidada. Nome trivial: o nome recomendado. H nomes triviais que no so recomendados pois so confusos e errados. O 1 algarismo: EC1 oxidoredutases

Ex: desidrogenases, reductases, EC2 transferases

Ex: transferases, transaminases. Os transaminases so enzimas que fazem a transferncia de um grupo amina para o oxocido. EC3 hidrolases

Fazem a ruptura de uma ligao atravs da introduo de gua. Se a reaco ocorrer sem necessitar de ATP no um sintetase, um sintase. O nome sistemtico do enzima hexocinase que catalisa a reaco apresentada : ATP: D-glucose 6-fosfato transferase. O 6 a localizao para onde vai. N-metil a ligao faz-se a partir do tomo de azoto. Se no se indicar significa que atravs do tomo de carbono. S os hidrolases que podem ser substratases. Por exemplo, o protease um enzima que participa na hidrlise de protenas. Os hidrolases pertencem ao grupo 3 e os hidroliases pertencem ao grupo 4. EC4 liases

Os liases catalisam reaco de adio dupla ligao. Os hidroliases so enzimas em que h a adio de gua a uma dupla ligao. O sintase , na maior parte dos casos, um liase. Dependendo da quantidade de Glutamina/Glutamato, o organismo sabe se deve ou no produzir mais aminocidos.

O sintase tambm pode aparecer noutros grupos, como no grupo dos transferases. Os sintases porque fazem a adio de uma dupla ligao. EC5 isomerases EC6 ligases

Quando se nomeia um enzima pelo seu nome sistemtico deve-se indicar a espcie ou tecido pois pode haver enzimas com o nome sistemtico mas intervm em mecanismos diferentes.

Actividade enzimtica: corresponde ao mximo que a amostra pode dar em relao ao enzima. Corresponde ao mximo da actividade molecular. O substrato tem de estar em excesso. O substrato tem de estar em excesso mas no pode estar em demasia porque pode haver inibio do enzima por excesso de substrato.

Actividade molecular: depende da quantidade de substrato. Nota: exerccio de exame dada um reaco qumica e tem de se saber o nome sistemtico do enzima ou vice-versa. Alguns esto nos slides.

ESTRUTURA DOS ENZIMAS

Os enzimas so protenas globulares mas com propriedades prprias. A finalidade da obteno das estruturas de enzimas : Fornecer informao acerca das propriedades catalticas; Proceder ao desenho racional de drogas; Utilizar enzimas para fins estruturais.

Tendo-se um enzima na forma purificada pode-se: Determinar a sua massa molecular relativa; Esta determinao pode ser feita atravs de ultracentrifugao, havendo a precipitao da protena de acordo com o seu peso. Determinao do nvel de estrutura primrio; Permite saber a sequncia de aminocidos na cadeia. Pode-se fazer por sequenciao directa ou sequenciao indirecta (atravs do DNA). Estudos dos nveis de estrutura secundrio, tercirio e quaternrio.

Enzimas em soluo Os enzimas, sendo protenas globulares, esto em soluo. No entanto, no esto isolados. CD: Dicrosmo Circular (DC) em portugus. Atravs desta tcnica podemos saber qual a estrutura secundria de uma protena, se tem hlices , estruturas , entre outras. Os enzimas so molculas com alteraes conformacionais permanentes, no so estveis, devendo-se falar em conformao mdia no tempo. Os domnios do fosfoglierase so dois, que rodam 32, excluindo a gua. Isto muito importante para que o ATP se possa ligar a este enzima. Caso contrrio, o enzima no activo. Se no houver alteraes conformacionais no enzima lactato desidrogenase, o NADH no sai. A alterao conformacional/ estrutural, o passo mais lento. Sem alterao conformacional, no ocorrem os passos seguintes. Caractersticas estruturais dos enzimas Os enzimas so protenas globulares empacotadas, sem espaos livres. Praticamente, no se encontram molculas de gua dentro dos enzimas. A quantidade de molculas de gua dentro dos enzimas muito menor do que nas protenas globulares. As hlices- so as estruturas mais estveis. A mais comum designada por 3.813, ou seja, h treze aminocidos em cada duas voltas e isto repete-se 3,8 vezes. De um modo geral, a massa molecular maior para enzimas mais complexos. Quando se tem uma estrutura com uma massa molecular relativa de 30 000, pode-se tratar de um enzima pequeno ou de uma subunidade de um enzima grande. Classificao de Clothia e Levitt: Enzimas : so apenas constitudos por hlices do tipo ; Enzimas : so apenas constitudos por hlices do tipo ; Enzimas /: combinam estruturas e estruturas , as quais podem estar alternadas ou misturadas; Enzimas +: estruturas e hlices separadas. H blocos de hlices e blocos de estruturas . No h alternncia entre as estruturas.

Dependendo da funo, as protenas tero determinados arranjos e folds.

FOLDING E UNFOLDING Folding sinnimo de enrolamento e unfolding sinnimo de desenrolamento. No entanto, estas palavras no deve ser traduzidas. Nos estudos de folding e de unfolding pretende-se saber: Como perturbar a conformao; Como readquirir essa conformao.

Um enzima enrolado estvel termodinamicamente semelhante a um enzima desenrolado. As variaes de energia entre o folding e o unfolding so de ordem de grandezas mnimas. As diferenas de energia entre o centro activo de um enzima desnaturado e o centro de um enzima no desnaturado so muito pequenas. Quando se desenrola um enzima, se os enzimas forem comstitudos por subunidades, necessrio dissocia-las. Modelo: Estado fold/ Estado unfold O fold importante e existe nas protenas. Um enzima no estado unfold, ou seja, desenrolado, mesmo que mantenha a sua estrutura perde a especificidade para ligandos. Uma protena em fold tem todas as suas caractersticas funcionais. Do ponto de vista do enzima, muito se perde. O centro activo perde a sua funo, quando o enzima fica num estado unfold. As chaperonas so protenas que se ligam protena quando esta est a adquirir o fold e evitam que se formam estruturas no desejveis. Corpos de incluso: os corpos de incluso so produzidos quando h a sobrexpresso de protenas que no eram produzidas por um determinado organismo. Dois enzimas com a mesma funo e com centro activo muito semelhante tm o mesmo folding? No! No se pode prever estruturas a partir da sequncia de aminocidos. Pode-se ter o mesmo folding e ter funes diferentes. A anlise gentica permite prever padres geomtricos de resduos do centro activo. Estrutura a nvel quaternrio A maior pate dos enzimas tm um nvel quaternrio de estruturas, com interaces fracas entre eles. O nvel quaternrio de estrutura consiste numa associao de subunidades ou protmeros. Os oligmeros podem ser considerados como diferentes domnios numa cadeia polipeptdica. 8

Se houver vrios domnios numa cadeia polipeptdica, os domnios interactuam entre si por ligaes fortes. Subunidade: nas subunidades h interaces fracas a nvel quaternrio, essencialmente. Domnio: consiste num conjunto estrutural de uma molcula de enzima ou protena que pode envolver diferentes subunidades. Regio que tem caractersticas particulares. Protmero: Por exemplo: Tetrmero tem 4 subunidades (azul) e pode s ter um domnio (amarelo)

Quanto maior for a evoluo de um ser vivo, maior ser a sua complexidade. O fosfofrutocinase um tetrmero, tem quatro subunidades. No entanto, em cada subunidade h dois domnios bem caracterizados. Este enzima catalisa a reaco cujos substratos so: 6-fosfato de frutose a reagir com ATP. Para que o fosfato de frutose actue necessria a existncia de duas subunidades para se ligar. Para o ATP necessrio a presena de uma subunidade de cada vez. Este enzima tem um centro cataltico, o qual regula a estrutura que implica as duas subunidades. O ADP funciona como efector positivo e o PEP funciona como efector negativo. Estes efectores ligam-se praticamente no mesmo local. No entanto, aos autores do artigo pareceu que a ligao do PEP implica as duas subunidades. Os autores descobriram que estas subunidades interactuam uma com a outra. Deste modo, concluram que: H enzimas cujos centros catalticos envolvem vrias zonas do centro cataltico; O centro cataltico pode abranger aminocidos de duas subunidades distintas.

Por exemplo, o enzima aldolase tem duas subunidades que quando se dissociam fazem provocam a inactividade do enzima.

Quantas subunidades? Que tipo? Estudos da Massa Molecular

O Cloreto de Guanidina actua nas ligaes fracas que so as que mantm a estrutura quaternria. Estudos cross-linking

O dimetilsuberimidato um reagente que, quando em contacto com uma cadeia polipeptdica, une duas lisinas prximas. Esta ligao mantm-se aps a desnaturao. Ex.: Aplica-se o reagente dimetilsuberimidato a uma protena nativa. Aps a separao com SDS, atravs da tcnica de electroforese de SDS-PAGE, no gel que se obtm formam-se quatro bandas de intensidade crescente no gel de poliacrilamida. Neste exemplo, como as subunidades so todas iguais, significa que o enzima um tetrmero. A intensidade das bandas proporcional ao nmero de ligaes que cruzadas de lisinas. No caso da protena ser constituda por quatro subunidades, iguais duas a duas, pelo estudo da massa molecular obter-se-iam duas bandas e por cross-linking, obter-se-iam muitas bandas. Desta forma, devem-se fazer vrios estudos em paralelo para se proceder ao estudo correcto das estruturas das protenas. Na ligao de ligandos, deve-se utilizar o ligando em concentraes diferentes e, se possvel, testar vrios ligandos. Como esto organizadas as subunidades? Para se saber como esto organizadas as subunidades, normalmente fazem-se estudos de simetria por difraco de raios-X. O facto de o enzima se organizar num tetrmero, por exemplo, para haver um maior contacto entre as subunidades, implicando uma maior estabilidade. Por outro lado, tem de haver tambm uma maior rea superficial disponvel, para que possa haver um maior contacto com o exterior.

O enzima aspartato transcarbamilase, ATCase, um dos poucos enzimas descritos at hoje cuja dissociao das subunidades, faz com que a subunidade cataltica exiba um grfico hiperblico. Este enzima pode ser descrito da seguinte forma: (3)2(2)3. (3)2: significa que tem duas subunidades catalticas; (2)3: significa que tem trs subunidades reguladoras.

Que foras existem para ligar as subunidades? Cerca de 70% das interaces so no polares, como as interaces hidrfobas. Este tipo de interaces fundamental a nvel quaternrio. 10

Porque existe uma pequena margem que no so interaces hidrfobas? Porque h interaces inicas e ligaes de hidrognios que so teis para que a protena consiga adquirir a simetria pretendida. Qual o significado de mltiplas subunidades para o enzima? (pode sair em exame) O facto de um enzima ter vrias subunidades tem as seguintes vantagens: Grande aumento da rea superficial; Aumento da variao da actividade cataltica; Aumento da capacidade de regulao; Aumento da estabilidade (no entanto, ainda no existem provas seguras que permitam afirmar que o facto de um enzima ter mais subunidades aumenta a estabilidade do mesmo). As associao de subunidades geram grandes estruturas com determinada simetria, fazendo com que haja funes biolgicas especficas, como a economia especfica, e a probabilidade de erro menor. A clula tem menor probabilidade de errar na estrutura do enzima. Deste modo, muito importante o rigor gentico da clula. Para a clula, fazer estruturas mais pequenas mais seguro pois menor a probabilidade de erro. Porque so os enzimas to grandes? A uma estrutura secundria estvel correspondem cerca de 20 a 40 resduos de aminocidos. As massas moleculares dos enzimas podem variar de 10000 a 1 milho, o que significa que podem variar entre 100 a 250 resduos. Os enzimas tambm tm de ser grandes para terem capacidade para orientar os substratos. Hipteses: A energia de activao baixa durante a catlise enzimtica devido a flutuaes da parte da protena que diferente do centro activo;

A catlise enzimtica tanto melhor quanto mais dificilmente o substrato entrar dentro do enzima. O enzima garante a orientao do substrato em direco ao centro activo. As ligaes ao acaso do substrato so teis para levar o substrato em direco ao centro cataltico;

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A velocidade de difuso maior para estabilizar a molcula. As interaces electrostticas so teis para estabilizar a molcula; Quanto maior a actividade, maior a especificidade; Localizao dos enzimas na clula; Os enzimas devem interactuar com outros enzimas.

A dimenso do enzima importante para este ter uma rea de superfcie adequada para se ligar a mltiplos locais da clula. Quanto maior for a especificidade de um enzima, maior o nmero de resduos de aminocidos e, consequentemente, maior a dimenso do enzima. No entanto, no de uma forma linear, atravs do aumento do nmero de subunidades. Os enzimas interactuam entre si e entre as estruturas. A rea superficial depende do volume e inversamente proporcional ao raio. Um enzima maior significa que tem uma maior rea superficial. No entanto, no com o aumento do raio que se consegue um aumento da rea de superfcie. Por exemplo,

O citrato cinase tem unteraces entre subunidades de rea de 1670 2 num total de rea de enzima de 5800 2. Em 1983, Mathew et al. concluram que para ver haver interaces adicionais era necessrio haver massas moleculares elevadas. Enzimas em sequncia: os enzimas em sequncia so importantes para a regulao pois estes enzimas interactuam entre si. Os enzimas so associaes supramoleculares. ENZIMAS MULTIFUNCIONAIS MLTIPLOS ENZIMAS Enzimas Multifuncionais: tratam-se de estruturas macromoleculares com diferentes centros catalticos. 12

Exemplo 1: Triptofano sintase Este enzima apresenta efeito de channeling: o produto da primeira subunidade no libertado mas aceite pela segunda subunidade como substrato, o que permite uma maior eficincia do processo. Certos investigadores modificaram uma estirpe de levedura para que este enzima no apresentasse efeito de channeling. Para isso, foi necessrio induzir uma mutao de modo a que as subunidades no estivessem ligadas, no havendo interaces. Do estudo realizado, o grfico experimental foi semelhante ao apresentado em baixo:

O enzima wild-type, apresentou uma curva do tipo da representada pois h efeito de channeling. A reaco que ocorre quando se verifica este efeito a seguinte: Com as subunidades ligadas no se detecta a formao de indolo porque este logo utilizado pela segunda subunidade. O enzima mutado, apresentou a curva do tipo da representada pois no se verifica o efeito de channeling, dado que houve a dissociao das subunidades. Sendo assim, no havendo este efeito, no h a formao de Trp numa primeira fase pois o substrato (produto do primeiro centro cataltico), o indolo, tem de acumular para que a segunda subunidade o possa utilizar como substrato. Assim, s depois de isto ocorrer que h o aumento da actividade enzimtica. Sem efeito, ocorrem as seguintes reaces: Reaco 1: Reaco 2:

Sem efeito de channeling, estas reaces ocorrem de um modo independente. Para a reaco 2 ocorrer, necessrio que o produto da reaco 1, que o substrato da reaco 2, o indolo, esteja em quantidades significativas.

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Exemplo 2: Lactose sintase Este enzima tem duas subunidades, a subunidade e a subunidade . A subunidade ajuda o enzima a ser especfico. No entanto, no tem propriedades catlticas. Quando o enzima tem esta subunidade, a -lactalbumina, h uma alterao da sua especificidade e o enzima fica activo para formar lactose com esta subunidade. A subunidade , -galactosiltransferase faz a biossntese de glicoprotenas e sem estar associada ao enzima catalisa a seguinte reaco:

No entanto, para haver a produo de lactose, o enzima precisa de ambas as subunidades para que ocorra a seguinte reaco: A glucose agarrada pela subunidade . Deste modo, apesar do enzima poder funcionar sem a subunidade , a subunidade no consegue captar sozinha a glucose. Assim, a subunidade que funciona como subunidade reguladora na medida em que activa a subunidade . COFACTORES Os cofactores podem ser: Coenzimas: os quais sofrem modificaes durante o processo cataltico; Vitaminas; Ies metlicos, como Cu, Mn, Mg, ...; Molculas orgnicas, como os fosfatos, flavina, heme,... COENZIMA GRUPO PROSTTICO Grupo prosttico: tem-se um grupo prosttico quando a entidade cofactor est ligada covalentemente estrutura do enzima. Estes cofactores tm a particularidade de seres regenerados aps um ciclo cataltico. Coenzimas: so aquele que sofrem modificaes durante o processo cataltico. Podem ser molculas que fazem a transferncia de grupos ou que participam em reaces de oxidaoreduo. Estas entidades entram e saem durante a catlise. Como exemplos tem-se: NAD, FAD,... As vitaminas podem ser lipossolveis ou hidrossolveis. H ainda um terceiro grupo que no se insere nem em protenas lipossolveis nem em hidrossolveis. Resposta a pergunta para exame: o metal tem como funo actuar durante o mecanismo de catlise. O facto de ter diferentes estados de oxidao faz com que a versatilidade do mecanismo seja maior.

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Relao do metal com o enzima: Existem enzimas que tm metais na sua estrutura. importante para a estrutura da protena. O metal introduzido durante o processo de sntese. H uma diferena entre metaloenzima e enzima activado por um metal em termos de constantes de activao. Um metaloenzima um io metlico que faz parte do centro cataltico do enzima. Mecanismos de catlise enzimtica Em geral, a catlise enzimtica representa um mecanismo complexo. Quando se junta um enzima com um substrato, h complexos de transio que se formam e tm diferentes velocidades de transio. O que comanda esta velocidade a transio que ocorre mais lentamente. Em termos de estratgia de catlise, necessrio ter em conta o efeito de proximidade e o efeito de orientao. A catlise cido-base muito mais rpida que as outras e permite a introduo de protes durante a catlise. Na maior parte dos enzimas, o centro cataltico envolve praticamente toda a estrutura, como, por exemplo, no citrato cinase. Os enzimas misturam, a diferentes tempos, diferentes mecanismos de catlise, como o caso de um enzima muito estudado, o lisozima.

PURIFICAO DE ENZIMAS - ASPECTOS GERAIS Ao longo do processo de purificao necessrio fazer-se um quadro de purificao. necessrio que haja uma grande quantidade de enzima na fonte permitindo obter rendimentos altos. Quando se quer produzir cpias de um gene, coloca-se num vector em E.coli para que as cpias sejam produzidas por este organismo. A presena de inibidores de proteases evita que haja a degradao de protenas. Deve-se usar tampes adequados para manter as protenas activas e em bom estado de conservao. Como avaliar o sucesso de um processo de purificao? SDS-PAGE; Tabela de purificao.

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Escala analtica: Electroforese: permite saber se h enzima puro ou se h contaminaes; Focagem isoelctrica; HPLC.

A espectrometria de massa permite ver se a protena tem ou no modificaes pstraducionais. Anlise da actividade cataltica: Ao longo do tempo, a actividade especfica aumenta medida que o enzima vai sendo cada vez mais purificado. A quantidade de protena total diminui, tal como o volume total. Se a actividade especfica no aumentar, significa que durante o processo de purificao se perdeu o enzima de interesse. Podem-se adicionar detergentes ao tampo quando se quer saber se o enzima hidrfobo ou se se localiza nas regies membranares. Se o enzima tiver muitas modificaes ps-traducionais devem-se utilizar estratgias para que se consiga obter o enzima purificado sem que essas modificaes ocorram. A purificao deve ser mantida o mais simples possvel.

PURIFICAO DE ENZIMAS - EXEMPLOS Purificao do adenilato cinase do msculo de porco: (Anos 60/ 70) Na altura, pensava-se que ter um enzima em cristal significava que o enzima estava puro. (Anos mais tarde) O marcador vai ser a resistncia canamicina. A induo foi feita a partir de 1 L de cultura. S as protenas que tm uma cauda de His que vo agarrar coluna. Num processo de purificao quanto menos etapas se fizer melhor, pois permite aumentar o rendimento do processo, conseguindo-se diminuir as perdas de enzima. O sulfato de amnio permite a precipitao de protenas de um modo gradual. Assim, com o aumento da quantidade de sulfato de amnio, as protenas vo precipitando gradualmente. E se o enzima for secretado para o meio extracelular? As bactrias Lactobacillus produzem -amilases que enviam para o meio extracelular. Assim, pode-se purificar o enzima de interesse a partir do meio extracelular.

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Experincias com Leishmania infantum Glioxilase I e II:

Houve uma grade expresso de protenas insolveis a 37 C, durante 3 h. A 15 C, durante 16 h, verificou-se que a maior parte das protenas estava na fraco solvel. No entanto, a quantidade nesta fraco era menor do que a 37 C, t = 3 h, na fraco solvel. Assim, os autores escolheram fazer os ensaios a 37 C, t = 3 h, pois tinham uma maior quantidade de protenas na fraco solvel, apesar de haver uma grande quantidade de protenas na fraco insolvel. Aldolase redutase:

O enzima foi todo expresso na fraco insolvel, encontrando-se nos corpos de incluso. Foi necessrio mudar de sistema de expresso e de vector. A utilizao de um promotor indutvel permite que haja uma expresso controlada. Assim, foi utilizada a expresso com levedura para se verificar se existia de facto o gene que se queria expressar. Posteriormente, aps se ter verificado que este enzima era expressado pela levedura, utilizou-se um plasmdeo que tem o gene de interesse que vai ser expresso pela bactria. A protena apareceu na fraco solvel, pois j tinha chaperonas para promoverem o folding correcto. E se o gene no estiver no genoma? Heme oxigenase:

Este enzima degrada o hemo para haver a libertao de Fe. Como a L. infantum no sintetiza o hemo, quando infecta outros organismos, faz com que este processo se d, obtendo Fe que necessrio para a sua sobrevivncia. IEX - cromatografia de troca inica; HIC - cromatografia de interaco hidrofbica.

INTRODUO CINTICA A hiptese do quase equilbrio um caso particular da hiptese do estado estacionrio. Pode-se ignorar k2. A temperatura influencia a velocidade da reaco. Nestes estudos, houve trs teorias importantes: Equao de Arrhenius; Teoria da Coliso; Teoria do Estado de Transio. 17

Q10: consiste no aumento da actividade de um enzima quando a temperatura aumenta 10 C. Mecanismo de Catlise Enzimtica A notao de Cleland a mais fcil de ser usada. Nesta notao, o enzima representase por uma linha e todas as formas do enzima so representadas por baixo dessa linha. Na anotao de Ainsworth tem-se, por exemplo: (Y1),(GX1),(11),(1X),(1GY)= Nesta notao, o enzima representa-se pelo nmero 1. (Y1),(GX1) - representa o enzima mais o ligando. (11) - isoenzimas do enzima. = - a reaco reversvel. No mecanismo de Theroell-Chance, no h deteco, em laboratrio, do intermedirio da reaco. Trata-se de um mecanismo de catlise especfica dos lcoois desidrogenases de cadeia curta.

Mecanismo de Theorell-Chance Bibi: a partir de dois substratos formam-se dois produtos. No h intermedirio detectvel. Quando se quer estudar um enzima, deve-se coloc-lo sempre na presena de NAD, para enzimas, como o caso dos desidrogenases, que so dependentes do NAD. Com o enzimas dependentes de FAD, ocorre o mesmo.

CINTICA ENZIMTICA - PARTE 1 "Enzyme kinetics: partial and complete uncompetitive inhibition" - ler o paper para o exame Invertase o nome trivial do hidrolase que catalisa a reaco: "O invertase combina-se com o acar". - Primeira referncia associao de enzima com substrato. 18

Michaelis e Mente definiram a equao de quase equilbrio ou de equilbrio rpido. Foram os primeiros a utilizar tampes e a estudar velocidades iniciais. Kd a constante de dissociao do complexo EA. A0 = A + E No entanto, pode considerar-se que A0 A, quando a [E] << [A], para a determinao de uma velocidade inicial, quando ainda no h a formao de produto ou a reaco est to no incio que esta formao pode ser desprezada. O modelo de Van Slyke foi o primeiro modelo que utilizou a hiptese no estado estacionro para o estudo de um enzima. Quando se escreve uma equao de parmetros enzimticos igual a zero significa que esta se encontrava no estado estacionrio. [E]0 - quantidade de enzima livre. V: velocidade limite. limite para que tende a velocidade inicial com o aumento da concentrao de substrato. a = [A] [A] - concentrao do 1 substrato [B] - concentrao do 2 substrato kcat - considerada uma medida de eficincia cataltica de um enzima. Uma das primeiras coisas a fazer num estudo cintico : varia a quantidade de enzima para concentraes de substrato constantes e ver se a velocidade linear variando-se a concentrao de enzima. Isto permite saber se o enzima tem ou no um comportamento michaeliano. (No teste pode sair uma pergunta do tipo: "elabore um protocolo experimental para caracterizar um enzima") Para 99 % dos enzimas estudados, pode aplicar-se a hiptese do estado estacionrio.

CINTICA ENZIMTICA - PARTE 2 No estado pr-estacionrio, a variao do complexo intermedirio EA encontra-se praticamente constante. Quanto maior for a distncia entre a [E] e a [A], maior a probabilidade de se atingir o estado estacionrio (considera-se que se atingiu este estado quando a ordem de 103). Para intervalos de tempo superiores a 5 ms, a expresso aproximadamente zero, podendo-se admitir que se est no estado estacionrio.

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Eficincia "A proficiency enzyme science" - ler o paper para estudar para exame. Qual o papel da enzima? A eficincia do enzima a capacidade que o enzima tem de catalisar uma reaco para alm da velocidade no catalizada. O que mais difcil? Acelerar um processo lento ou rpido? A importncia do enzima no catalisar todas as reaces mas apenas uma reaco especfica. A constante de especificidade dada pela seguinte expresso:

A constante de especificidade um parmetro que se utiliza para se saber a especificidade de um enzima. Quanto maior for o valor da constante de especificidade, maior ser a especificidade do enzima para a reaco. O que torna um enzima eficiente a sua especificidade para uma determinada reaco. Um enzima muito eficiente dificilmente reconhece o produto da reaco que catalisou, no catalisando a reaco inversa. Knc - constante da reaco no catalisada. Km - constante de equilbrio. A ornitina descarboxilase, como tem um este enzima mais eficiente. Se o valor de Km for baixo, a concentrao de enzima-substrato elevada em relao concentrao de enzima e em relao de substrato. Assim, a ligao enzima-substrato forte e a catlise enzimtica tambm forte. Deve-se evitar falar de afinidades quando se fala de valores de Km. Quando o valor de kcat elevado, permite saber se as reaces so rpidas. Este parmetro indica o nmero de molculas transformadas por quantidade de substrato consumido. 105 - a partir desta ordem de grandeza pode considerar-se que h catlise. Enzimas que tenham uma razo kcat/Km de, aproximadamente, 107 e 108, designam-se por "enzimas maravilha", pois estas ordens de grandeza correspondem s ordens de grandeza da velocidade de difuso do substrato. 20 maior do que para o outro enzima,

A maior parte dos enzimas no possui estes valores to elevados. A razo kcat/Km do fumarato maior que a razo kcat/Km do fluorofumarato, pelo que o substrato mais especfico. Qual o substrato mais especfico? - pergunta que pode sair no teste Aqui, coloca-se o problema da inibio nesta questo, variando a resposta consoante a concentrao de substrato. Quando h dvidas acerca do substrato, pode fazer-se o seguinte ensaio: um dos composto funciona como substrato e o outro como inibidor e fazem-se concentraes crescentes de inibidor. Posteriormente, faz-se o inverso, o que funcionou como inibidor funciona agora como substrato e o outro composto funciona como inibidor. Isto permitir saber qual , de facto, o substrato preferencial. Quando o valor de kcat elevado, h competio por inibio nesta situao, pelo que a reaco mais rpida quando a concentrao de substrato mais elevada.

Linearizaes Mtodo de Lineweaver-Burk: considerado um mau mtodo.

Os resultados aparecem mais condensados na regio apresentada e deve-se trabalhar numa zona mais acima. Como por este mtodo feita a inverso dos valores, os erros que eram pequenos passam a ser maiores. Por outro lado, a variao das concentraes de substrato que era regular, quando se inverte, torna-se irregular e da obter-se um conjunto de pontos concentrados numa regio que no era esperada. Para uma melhor aplicao deste mtodo, em laboratrio, o protocolo experimental deve ser adaptado. Assim, devem fazer-se os clculos para 1/[A] e no para [A] e realizar uma gama alargada de replicados na zona onde os resultados no vo ficar condensados, diminuindo-se assim os erros associados a este mtodo.

CINTICA ENZIMTICA - PARTE 3 O valor do coeficiente angular mximo corresponde ao valor do ponto de inflexo. Grfico de Hanes ou Woolf Representa a/V em funo de a. a - concentrao de substrato Entre os trs mtodos de linearizao, este o mais correcto. 21

Mtodo de Eadie-Hofstee Representa v em funo de v/a. Este mtodo tem alguns problemas. Comparao de Resultados O mtodo de Hanes o melhor mtodo. Neste mtodo, a variao da distribuio do erro menor e homogneo ao longo da linha. No mtodo de Lineweaver-Burk, maiores valores de 1/a tm uma distribuio de erro menor. No mtodo de Eadie e Hofstee, se a distribuio de erro der linear, trata-se de um modelo michaeliano. Se de curvo, o modelo no michaeliano. Regresso no linear: Graficamente, a regresso linear coincide com a distribuio de erro, o que coincide com os dados da distribuio de erro pelo mtodo de Hanes. Regresso "hiperblica": Equao experimental de Michaelis-Menten:

Esta equao no linearizvel. Critrios dos mnimos quadrados partida, a distribuio tem de ser gaussiana ou normal. Sempre que se faz a mdia e se calcula o desvio padro, admite-se que estes critrios so vlidos. No entanto, estes critrios so vlidos se as concentraes de substrato forem mnimas. Mtodos no paramtricos: Estes mtodos s exigem a condio nmero 5 dos critrios anteriores. Mtodo directo (Eisenthal e Cornish-Bowden) Embora seja um mtodo fcil de usar, considera varivel o que constante e o que constante como varivel. Os valores mais provveis correspondem mediana dos valores de Km e de V. Qualquer outlier pode ser ignorado. No entanto, tambm se pode consider-lo porque o objectivo fazer-se a mediana. Os outliers no vo influenciar o valor da mediana.

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Quando h interseco no 2 quadrante, tem-se um valor facial. Este valor deve ser considerado como ele mesmo. Pode desaparecer se se alargar o intervalo de concentraes usadas. A interseco no 3 quadrante pode ser devida a um erro sistemtico ou ao facto de o enzima no seguir uma cintica michaeliana. Este resultado necessrio ser verificado. Se aps a repetio do ensaio continuar a aparecer este resultado, considera-se como sendo um ponto no infinito ( ou ). A mediana de intervalo de valores corresponde ao ponto intermdio. Melhoramento ao mtodo directo por Eisenthal: Para melhorar o mtodo directo, Eisenthal props uma representao de 1/V por Km/V. Com uma representao deste tipo, os pontos que apareciam no 2 e 3 quadrantes deixam de aparecer. Em relao ao mtodo anterior no tem grandes vantagens pois necessrio fazeremse clculos.

MECANISMO REVERSVEL DE MICHAELIS-MENTEN Considera-se que a velocidade da reaco no sentido directo.

Nota: No exame - saber deduzir todas as expresses deste mecanismo e de outros.

Relao de Haldane Relaciona as constantes de equilbrio com as constantes de especificidade. kcat f - forward kcat r - reverse Km - indica apenas uma relao de V em relao a A. Enzimas "One-Way" So enzimas que catalisam reaces apenas em um sentido. Os enzimas reguladores so, normalmente, deste tipo. Porque se podem designar por enzimas "one-way"? (So apenas propostas) (ver slide) Do ponto de vista prtico, a clula no deixa que haja a acumulao de produto, evitando que a reaco inversa ocorra; Do ponto de vista metablico, o enzima no evoluiu no sentido de catalisar a reaco inversa; No h a possibilidade de desenhar estruturas que catalizem as reaces em ambos os sentidos. 23

No caso dos mecanismos ping-pong, os enzimas catalisam as reaces em ambos os sentidos.

Nota: ter em ateno s duas ltimas frases que aparecem no final deste captulo nos slides - comentar no teste.

INIBIDORES O melhor inibidor o que tem como alvo o estado de transio. Com um inibidor reversvel no se consegue eliminar completamente a actividade do enzima. Na inibio linear, os parmetros de inibio variam linearmente com a concentrao de inibidor. Se um inibidor for hiperblico, variando-se as concentraes, pode-se conseguir um inibidor linear, por exemplo, quando se estudam drogas e se quer estudar a inibio, podem utilizar-se intervalos de concentraes muito curtos. Neste tipo de situaes, o inibidor linear. A inibio no competitiva pura um caso particular da inibio mista. Na inibio mista varia V e Km e, consequentemente, V/Km. Na inibio no competitiva pura, no varia o Km e varia apenas o V, variando V/Km. Anti-competitiva (deve dizer-se assim e no incompetitivo) - uncompetitive No competitiva - non-competitive Ki - constante de dissociao do complexo Kii - constante de dissociao do complexo ternrio EAI. Estas duas constantes so iguais na inibio no competitiva pura. Na inibio competitiva, Kii = 00, porque se admite que no se forma o complexo EAI. Para deduzir uma equao emprica que explique o comportamento de um inibidor anti-competitivo, do ponto de vista do modelo tem de haver restries, pelo que o enzima no se pode ligar ao inibidor na forma livre. Inicialmente, o enzima deve sofrer uma modificao. No h a possibilidade de haver a formao de complexos EI e apenas se podem forma complexos EAI. Se o inibidor s se liga a EA para formar EAI, ento pode ocorrer (em termos de reversibilidade): No entanto, segundo o modelo, o produto EI no se pode formar. Assim, como se houvesse uma maior afinidade do complexo A para o enzima na presena de inibidor e como se o A estivesse impedido de sair. Isto permite verificar a artificialidade do modelo. Um modelo deve explicar o comportamento cintico grfico e antes de se idealizar um modelo, deve-se primeiro realizar a experincia em laboratrio. A inibio anti-competitiva rara.

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INIBIO DA ACTIVIDADE ENZIMTICA Inibidores Reversveis ou Irreversveis A actividade cataltica diminui na presena de um inibidor reversvel. Inibio competitiva: a velocidade limite mantm-se constante e afecta a constante de especificidade (Km). Assim, pode-se tambm design-la por inibio especfica. Inibio anti-competitiva: a velocidade limite afectada e a constante de especificidade mantm-se constante. Assim, pode-se tambm design-la por inibio cataltica. Com um ligeiro aumento da concentrao de substrato pode anular-se o efeito do inibidor. Modelo da inibio competitiva Segundo o modelo da inibio competitiva, o inibidor competitivo liga-se ao enzima. No entanto, se a concentrao de substrato for muito maior que a concentrao de inibidor, o efeito do inibidor pode acumular-se. Modelo da inibio anti-competitiva Segundo este modelo, o inibidor deve estar ligado forma modificada do enzima, no se consegue ligar ao enzima livre. Esta forma modificada foi induzida e provocou uma alterao conformacional. Segundo Michaelis-Menten tem-se: E+A EA E+P

Assim, provvel que o inibidor se ligue a EA para formar EAI. No entanto, na realidade, o inibidor vai ligar-se a um enzima modificado (E'). A inibio no competitiva e anti-competitiva so raras! Inibio mista Geralmente ocorre aqui a inibio por produto. Anlise da inibio (e clculo de Ki e Kii

Grficos do mtodo directo: Linhas pretas: sem inibidor. Linhas coloridas: com inibidor.

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Tipo de inibio

Grfico de Dixon (determinar Ki) 1/v0 vs [I] Interseco no 2 quadrante Interseco no 2 quadrante Padro de rectas paralelas

Grfico de Cornish-Bowden (determinar Kii) [A]/v0 vs [I] Padro de rectas paralelas Interseco em um ponto no 2 quadrante Intereseco no 2 quadrante

Competitiva

No h distino

Mista Anti-competitiva

Nota: obrigatrio fazer o grfico de Dixon e de Cornish-Bownden para se poder concluir acerca do tipo de inibio. Quando a concentrao de substrato, [A] aumenta muito: H dificuldade em dissolver os compostos; Implica custos maiores; Pode haver inibio pelo substrato.

3 Km mximo de substrato que se deve utilizar para que no se verifique inibio pelo substrato. A maior parte das drogas no so inibidores competitivos. Quando se pensa num composto e pretende-se torn-lo numa droga, tem de se verificar se naquele local especfico h um transportador para a droga. Se no existir este transportador, no pode ser uma droga.

DEDUO DA EQUAO DE VELOCIDADE DE ESTADO ESTACIONRIO Mtodo de King e Altman E0 Determinante global (resulta do somatrio de todas as espcies); 1 Identificao das espcies enzimticas; 2 Dividir pelo somatrio de todas as espcies (E0) e desenhar a figura geomtrica que corresponde s espcies envolvidas. Quando se tem trs espcies enzimticas, tem-se um tringulo. Pe-se em cima da seta o que leva a passar de uma espcie para a outra. Desenha-se o diagrama de acordo com os fluxos que originam E. Como para a formao de E, no pode haver fluxos divergentes, apenas convergentes. K-3 retirou-se do modelo propositadamente. Do ponto de vista esquemtico, quando falha um, elimina o padro.

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A partir do passo 5, j no corresponde ao modelo. Aplicao:

(Exerccios propostos resolver para o exame)

CINTICA DE REACES COM DOIS SUBSTRATOS OU MAIS A concentrao de substrato tem de ser elevada. No entanto, no demasiado elevada para no se tornar inibitria. Double displacement ou no sequencial: libertao de produtos antes da ligao de todos os substratos. Considera-se um sistema de dois substratos: Sequencial ordenado: primeiro entra o A e depois entra o B; Equilbrio rpido random bibi: tanto faz entrar primeiro o A ou o B; Theorell-Chance: embora se forme, a formao do complexo ternrio to rpida que no se detecta, do ponto de vista cintico. Aplica-se a lcoois desidrogenases de cadeia curta.

Exemplo: o cofactor tem de ser sempre ligado/adicionado primeiro ao enzima antes do substrato, mesmo em laboratrio assim que se faz (importante!!). Mecanismo:

Primeiro, liga-se o enzima. Aps a ligao do enzima, pode primeiro entrar ATP e depois a creatina ou pode ocorrer ao contrrio e o mesmo ocorre na sada dos produtos. Mecanismo ping-pong: no um mecanismo uni-uni porque o enzima no se encontra como no incio. As diferentes linhas tm ordenadas n origem. 27

O coeficiente angular tem includo nele a concentrao de produto. A introduo do produto num sistema com inibio s altera o denominador pois no denominador que se localiza o inibidor. O tipo de inibio por produto, para mecanismo em que a quantidade de produto se mantm constante, o tipo de mecanismo de hibridao ordenada. Equilbrio de Dolziel: equilbrio formado por mecanismos de dois substratos.

SIMULAO DE MEANISMOS ENZIMTICOS Quando h o aumento da concentrao de enzima, deixa de se ter uma recta e passase a ter uma curva, sendo difcil determinar-se a velocidade. Assim, temos de criar situaes para termos rectas, recorrendo-se simulao. A concentrao de enzima deve ser suficientemente baixa em comparao concentrao de substrato. Inicialmente, no se considera a existncia de um estado estacionrio. Posteriormente, que se verifica se possvel existir ou no esse estado estacionrio. No grfico PLAS, implicitamente no eixo dos xx est o tempo. Simulao: e = [E] Descrio das equaes diferenciais subjacentes: (dependo do mecanismo enzimtico a utilizar) A = -vf1 + vr1 vf1: velocidade dos reagentes (velocidade de formao do complexo) vr1: velocidade dos produtos para os reagentes A = (condies iniciais) O enzima, no incio, deve estar em quantidades mnimas. tf: tempo final. Tem de se determinar um tempo para o final do ensaio, pois a constante de tempo no pode ser infinita. Npoints: nmero de pontos que obtemos ao longo do tempo. Temos de ter muitos pontos para se obter uma curva bem definida. O complexo nunca atinge uma concentrao maior que o prpria enzima. 28

!!: filtro do interesse. Ex.: !!APEC = Estou interessado em ver exclusivamente as curvas do APEC. Simulao 2: Varia apenas a escala do eixo dos yy. O complexo ES forma-se muito rapidamente. No final da reaco, o E livre regenerado. Simulao 4: O complexo tem uma variao complementar ao do enzima livre. Simulao 5: Perodo pr-estacionrio A decresce rapidamente mas a variao muito pouca e mantm-se constante. Simulao 6: Diminuio drstica da quantidade de substrato inicial. Nota-se uma zona bifsica. mais fcil determinar a velocidade inicial pela formao de produto. Simulao 7: O que ocorre ao E nestas condies. O E livre nunca chega a zero. Desde o incio, regenera-se como E livre. Por estes resultados, pode dizer-se que no h a formao do estado estacionrio nestas condies. No necessrio que a hiptese do estado estacionrio para se estuda velocidades iniciais. A hiptese do estado estacionrio eliminada quando se diminui a quantidade de substrato inicial. Simulao 8: Aumento drstico da concentrao de enzima. Assim, mais barato diminuir a concentrao de substrato (em termos prticos). Os resultados indicam que se se a aumentar a concentrao de substrato (A), possvel afastarmo-nos da hiptese do estado estacionrio. Simulao 9: Mecanismo a ser simulado: h a formao de dois complexos (observando as equaes diferenciais). No existe um nico passo EA que origine o produto. Kf2 = Kr2 O mecanismo de catlise no define se a reaco ou no irreversvel. K2: define o passo irreversvel. Simulao 10: Concluso: Se [A] >> [E], ento, verifica-se a hiptese do estado estacionrio. [C1] >> [C2] 29

ENZIMOLOGIA IN SITU [protena]intracelular 100 mg/mL (na maior parte das clulas) In vitro: [protena] [substrato] In vivo: [protena] [substrato] Utilizando-se NMR consegue medir-se a concentrao de quase tudo. necessrio preservar a concentrao celular dos enzimas. Como permeabilizar a clula de um modo suave? necessrio ter em conta a concentrao de protena exposta ao meio reaccional. O azul de Comassi constitudo por trs espcies principais e por nove espcies secundrias. A digitonina insolvel em gua temperatura ambiente. Tambm um composto termoestvel. Assim, na preparao da digitonina deve aquecer-se a gua e adicionar-se a digitonina em gua quente para que seja solvel. Tem de se utilizar agitao. Caso contrrio, h sedimentao da levedura na cuvette. METABOLISMO DO GLIOXALATO Esto presentes dois enzimas para os quais necessrio glutationo. O glutationo II o substrato de uma reaco irreversvel. Quando se faz um homogenato, h libertao de grande quantidade de protases. BIOCATALISADORES E ENZIMAS AMBIENTAIS H muitos enzimas que no so inibidos pela concentrao de substrato. necessrio assegurar que os substratos entrem dentro das clulas. Uma das vantagens de se usarem enzimas como catalisadores ter-se poucos ou nenhuns subprodutos. A estreo-especificidade consiste nos ismeros reconhecerem ismeros de enzimas. O enzima fora da clula instvel. Os enzimas necessitam de cofactores e de ser regenerados. Como alternativa, pode fazer-se uma reaco acoplada. 30

IMOBILIZAO DE ENZIMAS Um enzima s cristaliza se todas as molculas estiverem orientadas no mesmo sentido. O carrier no se deve degradar com o tempo, nem na presena, pelo menos, dos reagentes do ensaio, nem com as alteraes de temperatura a que a experincia se vai desenvolver. importante que o enzima esteja bem ligado ao suporte para que o substrato se ligue eficientemente ao enzima. O uso de glutaraldedo permite aumentar a quantidade de enzima disponvel. A dimenso da malha da acrilamida determina o tamanho dos enzimas que ficaro presos aos poros do gel. ENGENHARIA DE PROTENAS O futuro da engenharia de protenas passa por juntar o desenho racional com a evoluo dirigida, ainda que seja necessrio ter equipamento para que esta juno se torne possvel. ENGENAHRIA DAS VIAS METABLICAS O succinato entra no TCA (ciclo dos cidos tricarboxlicos) estando constantemente a ser produzido e eliminado. A artemisina uma droga anti-malrica. REGULAO DA ACTIVIDADE ENZIMTICA Na velocidade limite no h regulao. A clula distingue o tipo de fosforilao/desfosforilao, consoante o tipo de aminocido que atacado. H aminocidos envolvidos em modulao enzimtica por fosforilao/desfosforilao. Pode ter-se cooperatividade numa nica protena como um protmero. Quando no h cooperatividade, tem-se uma hiprbole (Michaelis-Menten). Cooperatividade: alterao conformacional que induzem alteraes de actividade. Cooperatividade negativa: a sigmoicidade quase desaparece. Presena de um efector positivo. Quando aumenta a concentrao de efector positivo, o enzima est muito activo, estando pouco regulado. Se o enzima est activo, est pouco regulado. Cooperatividade positiva: a sigmoicidade aumenta. Este enzima est mais regulado e h uma menor quantidade activa. H a presena de um efector negativo.

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A hemoglobina tem de ligar o oxignio quando a presso de oxignio maior e libertlo quando a presso de oxignio menor. Normalmente, h duas ou trs molculas de oxignio ligadas hemoglobina, que um nmero adequado para que haja maior cooperatividade e maior regulao. K0.5: constante de semi-saturao. H = 1: indica que no h cooperatividade. Equao de Hill = Equao de Michaelis-Menten. H > 1: cooperatividade positiva. H < 1: cooperatividade negativa.

MODELOS EXPLICATIVOS Modelo de Hill

Este modelo implica que ou esto todos os centros activos do enzimas livres ou esto todos com ligandos. n no um nmero inteiro e no tem a ver com os centros de ligao. h coeficiente de Hill. Indica se h ou no cooperatividade. Quando o h diminui, o Ra aumenta e tem-se cooperatividade negativa. Quando o h aumenta, o Ra diminui e tem-se cooperatividade positiva. Modelo de Adair

Supe-se que existem dois centros de ligao no enzima. Este modelo soluciona o problema do modelo de Hill. So as constantes de cooperatividade intrnseca que ao variarem permitem explicar a cooperatividade. Se o valor de K aumentar, tem-se cooperatividade negativa. Se o valor de K diminuir, tem-se cooperatividade positiva. Exemplo: Tetrmero sem ligandos

Tetrmero com um ligando ligado h quatro possibilidades

Tetrmero com dois ligandos ligados h 6 possibilidades

Hill e Adair definiram cooperatividade de maneiras diferentes. A equao de Adair tem mais significado fsico dado que mais adequado pensar-se que os ligandos se ligam a tempos diferentes. Ambos definiram um ndice de cooperatividade: se se observar cooperatividade 32

positiva pela equao de Hill tambm se observar em Adair. No entanto, o valor ser diferente, consoante a equao que se aplique. Induced-fit

Por este modelo, aparece o conceito de flexibilidade e desaparece o modelo de proximidade. H uma alterao na conformao do enzima e posteriormente h a ligao do ligando, segundo o modelo do induced-fit. Modelos modernos de cooperatividade o MWC: a protena tem de ter diferentes conformaes em equilbrio.

Trata-se do modelo concertado ou simtrico ( incorrecto dizer que alostreo). Verificou-se que quando o enzima se encontrava na presena de mercrio, o mercrio no afectava a ligao His, no alterando a actividade do enzima. Este modelo considera que o enzima pode estar, pelo menos, nestas duas conformaes, na ausncia de ligando. (Bola) R relaxado (activo) (Quadrado) T tenso (inactivo) Por este modelo, no h hbridos.

L: constante alostrea. Indica se h ou no cooperatividade. Se L >> => T > R => sigmoicidade grande Se L << => R > T => sigmoicidade pequena Se o enzima tem sigmoicidade, tem vrias conformaes em equilbiro independentemente dos ligandos estarem ou no presentes e ligados. Todos os enzimas na forma relaxada tm um carcter hiperblico, indicando uma maior actividade. possvel aplicar o MWC Hb-O2? Para isso, necessrio considerar que a hemoglobina tem dois estados: o estado T e o estado R. L (Hb) = 9050 (valor muito elevado) A hemoglobina est na maioria das vezes no estado T e a ligao do oxignio muito favorvel ao estado R.

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Por este modelo existem crticas relativamente simetria que por vezes difcil ter numa molcula. Modelo KNF: a protena s pode ter diferentes conformaes na presena de ligandos.

Assim, as diferentes conformaes no esto implcitas na protena e s ocorrem se houver ligandos. A presena de ligandos induz uma alterao conformacional que perpetuada s outras subunidades. Este modelo permite ultrapassar os problemas do modelo MWC, pois admite a existncia de formas hbridas e permite explicar a cooperatividade negativa. Quando A se liga ao enzima na forma T, a forma T passa forma R. Este modelo permite explicar diferentes tipos de fenmenos de cooperatividade das cincias da vida. Ambos os modelos existem porque admitem que as protenas so oligmeros. No entanto, pode haver cooperatividade em protenas s com uma subunidade. Modelos de associao-dissociao

Permitem explicar como protenas com formas mais simples exibem maior sigmoicidade. Modelo de Ferdinand (1966) e Rabin (1967)

A cooperatividade pode surgir pode motivos cinticos. Consequentemente, uma nica cadeia pode ter cooperatividade sem ter uma estrutura quaternria. Modelo de Rabin (ver artigo - importante)

o substrato que provoca alteraes conformacionais no enzima (EA) e s assim que vai ser possvel dar o produto. O enzima tem memria e lembra-se da conformao que tinha quando o substrato estava em baixas concentraes. A este fenmeno designa-se por histerese. Histerese: a tendncia de um material ou sistema de conservar suas propriedades na ausncia de um estmulo que as gerou.

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