ChromQuest 4.

1 Tutorial

Introduo
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Este tutorial tem como objetivo facilitar a compreenso dos usurios sobre o uso do programa ChromQuest. As ferramentas bsicas para operao do programa so apresentadas aqui. Os usurios devem, entretanto, O tutorial segue a sequncia de uma anlise quantitativa, desde a criao do mtodo at a gerao do relatrio final.

Acessando o menu principal do ChromQuest

O menu principal do ChromQuest permite: Incluir, excluir e configurar os equipamentos que sero controlados pelo programa; Criar / excluir usurios e permisses; Criar projetos (pastas) e definir os usurios que tero acesso a elas, alm de outras funes. Para acessar o menu principal do ChromQuest, no menu iniciar, clique em Iniciar / Programas / Chromatography / ChromQuest, ou no cone de atalho localizado na rea de trabalho.

Abrindo o ChromQuest
O ChromQuest pode ser aberto de duas maneiras; online e offline. O modo online permite acesso a todas as funes do programa, enquanto que o modo offline permite acesso a quase todas as funes, exceto coleta de dados. O modo offline geralmente utilizado para manipulao de dados previamente coletados, podendo ser utilizado enquanto o ChromQuest estiver coletando dados no modo online. Abrindo o ChromQuest no modo online No menu principal do programa, d um clique duplo no cone do instrumento que voc deseja controlar ou clique com o boto direito sobre este cone e selecione a opo Open. Abrindo o ChromQuest no modo offline No menu principal do programa, clique com o boto direito sobre o cone do instrumento que voc deseja manipular dados coletados e selecione a opo Open Offline.

Criando o mtodo analtico

Diversas janelas compreendem a criao de um mtodo analtico, entre elas: Instrument Setup Permite configurar os parmetros do HPLC para coleta de dados. Integration Events

Permite definir as condies de integrao dos picos de interesse, necessrias para a correta identificao e quantificao dos analtos. Peak / Grou Tables Permite armazenar as informaes sobre cada um dos picos, incluindo o tipo de curva de calibrao, as concentraes dos padres etc. Method Custom Report Permite criar um relatrio padro para o mtodo. Nesta etapa, sero ajustadas apenas as condies do HPLC. Os eventos de integrao e a tabela de picos sero criadas somente aps a injeo de um padro (Consulte o item Executando uma simples injeo). Para criar um novo mtodo analtico, na barra de menus clique em File / Method / New. A janela Instrument Setup do mtodo abrir;

Figura 1 - Janela Instrument Status.

A partir desta janela, configure os detectores, bomba e amostrador automtico de acordo com as condies analticas do mtodo pretendido; A guia Aux Traces permite monitorar a presso e o fluxo do sistema durante uma coleta de dados; A guia Baseline Check permite fazer uma verificao da linha de base de acordo com as condies inseridas na guia; A guia Trigger configurada na instalao do programa e no deve ser alterada. Clique em File / Method / Save As para salvar o mtodo criado.

Executando uma injeo simples (Single Run)

Aps a criao do mtodo, o analista deve injetar um padro para ajustar as condies do HPLC (caso necessrio), ajustar os eventos de integrao e criar a tabela de picos. A quantificao das amostras ser feita aps esta etapa. Insira o vial do padro em uma das posies do amostrador automtico; Na barra de menus, clique em Control / Single Run ou no cone correspondente na barra de ferramentas. A janela Single Run Acquisition abrir;

Run information No campo Sample ID, digite um nome para identificao da amostra; No campo Method, selecione o mtodo de interesse; No campo Data path, selecione a pasta onde ser salvo o cromatograma;

No campo Data file, digite um nome para o arquivo do cromatograma; No campo Number of reps, digite o nmero de replicatas que sero injetadas. Autosampler No campo Vial, digite a localizao do vial no amostrador automtico; No campo Injection volume, digite o volume da amostra que ser injetado. Baseline Check Marque a caixa de opo caso queira verificar a linha de base antes da injeo da amostra, de acordo com as condies inseridas no mtodo. Clique em Start para efetuar a injeo e aguarde o trmino da coleta de dados. Ao final, verifique se os picos foram devidamente separados. Caso necessrio, ajuste as configuraes do HPLC e refaa a injeo.

Integrando o cromatograma
Para integrar um cromatograma preciso estar com o cromatograma aberto. Para isso, na barra de menus, clique em File / Data / Open e selecione o cromatograma desejado; Para facilitar a visualizao das alteraes dos eventos de integrao, feche todas as janelas abertas, com exceo da janela do cromatograma; Observao: Para visualizar todas as janelas abertas, clique em Window / Cascade na barra de menus. Abra a janela Integration Events. Clique em Method / Integration Events na barra de menus ou no cone correspondente na barra de ferramentas; Visualize as duas janelas abertas ao mesmo tempo. Clique em Window / Tile Horizontally na barra de menus;

Figura 2 - Eventos de integrao. Observao: Para cada canal (detector) existe uma janela Integration Events. Certifique-se de selecionar corretamente o detector na caixa de opo localizada na barra de ferramentas (destaque em vermelho na figura 2) antes de alterar os eventos de integrao. H duas maneiras de acrescentar eventos de integrao na tabela. A primeira selecionando as ferramentas e inserindo os valores diretamente na tabela. A segunda usando a barra de ferramentas de eventos de integrao (destaque em azul na figura 2). Esta opo fornece instrues na barra de status de como proceder. A melhor maneira de integrar os cromatogramas comear utilizando a segunda opo e em seguida fazer pequenos ajustes (se necessrio) diretamente na tabela. Altere os eventos de integrao de forma a obter a melhor integrao para os picos de interesse e eliminar a integrao do rudo. Os campos Width e Threshold so obrigatrios; Para inserir novas ferramentas diretamente na tabela Integration Events, clique em uma linha vazia na coluna Event, abra a caixa de opes, selecione a opo desejada e insira um valor adequado na coluna Value; Para que cada alterao feita na janela Integration Events seja aplicada ao cromatograma, clique em Analysis / Analyse na barra de menus, ou no cone correspondente na barra de ferramentas.

Salve o mtodo.

Alterando o modo de exibio do cromatograma

Adicionando traos ao cromatograma Clique com o boto direito sobre o cromatograma e selecione a opo Add Trace; A janela New Trace Properties abrir;

No campo Data Source, clique no boto ao lado do campo e selecione a opo Open Data; Selecione o cromatograma desejado; No campo Trace, clique no boto ao lado do campo e selecione o canal (detector) desejado Clique em OK para sobrepor os cromatogramas. Excluindo traos do cromatograma Clique com o boto direito sobre o cromatograma e selecione a opo Clear Overlays. Alterando os eixos do cromatograma Clique com o boto direito sobre o cromatograma e selecione a opo Axis Setup. A janela Axis Properties abrir;

Selecione o eixo desejado e altere os campos da maneira desejada; Clique em OK para efetuar as alteraes. Alterando as anotaes do cromatograma Clique com o boto direito sobre o cromatograma e selecione a opo Annotations. A janela Trace Annotation Properties abrir;

Na caixa Available Annotations, d um clique duplo sobre a anotao desejada ou selecione a opo e clique na seta verde para envi-la para a caixa Show the following annotations; Clique em OK para efetuar as alteraes. Observao: Consulte o manual impresso do ChromQuest ou o manual on line sobre as demais opes.

Criando a tabela de picos

A tabela de picos faz parte do mtodo, e deve ser criada aps a integrao do cromatograma do padro. Ela contm uma srie de informaes sobre os picos de interesse, entre elas os nomes, tempos de reteno esperados e concentraes dos padres. H duas maneiras (semelhantes) de se adicionar picos integrados na tabela, ambas atravs de ferramentas presentes na barra de ferramentas Integration Events (destaque em amarelo na figura 2). A primeira (cone esquerda), Define Single Peak, permite selecionar os picos que sero acrescentados na tabela. A segunda opo (cone a direita), permite selecionar a faixa de picos que sero acrescentados na tabela. Siga as instrues da barra de status e preencha as informaes necessrias na janela que se abrir no programa. Para visualizar a tabela de picos, clique em Method / (Peak / Groups) na barra de menus ou no cone correspondente na barra de ferramentas. possvel alterar qualquer informao presente na tabela de picos.

Aps inserir os picos na tabela, insira as concentraes dos padres que sero utilizados na criao da curva de calibrao. Navegue pela tabela atravs da barra de rolagem horizontal at que as colunas Level 1 / Level 2 / Level 3 etc. apaream. As colunas Level referemse aos pontos da curva de calibrao, devendo ser preenchidas da menor concentrao para a maior. Para cada pico presente na tabela, ser necessria a criao de uma curva de calibrao. Diferentes curva podem ter diferentes concentraes e diferentes quantidades de pontos (Figura 3).

Figura 3 - Tabela de picos Salve o mtodo.

Injetando padres e amostras

Aps ajustadas as condies do HPLC, criados os eventos de integrao e criada a tabela de picos, a prxima etapa fazer a injeo dos padres para a criao da curva de calibrao e em seguida a injeo das amostras que sero quantificadas. H duas maneiras de se fazer isso. A primeira, atravs da opo Single Run, onde o usurio envia as informaes para o HPLC para coleta de dados de apenas um padro ou amostra por vez. A segunda, mais prtica, principalmente quando h um grande nmero de padres e/ou amostras, envolve a criao de uma seqncia analtica, onde possvel programar o HPLC para que faa as injees de todos os padres e amostras, alm de permitir que outros mtodos sejam analisados na mesma seqncia. Executando injees simples (Single Run) dos padres e amostras Insira os vials dos padres e amostras no amostrador automtico; Na barra de menus, clique em Control / Single Run ou no cone correspondente na barra de ferramentas. A janela Single Run Acquisition abrir;

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Figura X - adfsad Alguns campos presentes nesta janela j foram discutidos no tpico XXX. Consulte-o se necessrio. Calibrate Marque a caixa de seleo Calibrate caso seja feita a injeo de um padro usado para a criao da curva de calibrao. Deixe a caixa desmarcada nas injees das amostras; No campo Calibration Level, digite o ponto da curva a que se refere o padro injetado; Marque a caixa de seleo Clear all calibration caso queira limpar todas as calibraes feitas anteriormente; Marque a caixa de seleo Clear calibration for level caso queira limpar somente as calibraes feitas anteriormente para este ponto da curva;

Para realizarmos injees dos padres:

Clique em , em seguida ter a tela abaixo

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Identificar o cromatograma, informar nessa tela que este vai ser um ponto de calibrao em Calibrate, clicando sobre o cone em branco ao lado da palavra. Em seguida, informar qual nvel de concentrao voc est calibrando. Caso haja necessidade podemos selecionar os seguintes itens:

OBS: Caso no selecionarmos clear all calibration os padres injetados sero adicionados curva de calibrao j existente. Clicar em START e proceder injeo do padro. Caso haja a necessidade de injees de mais um ponto de calibrao ou replicata repetir quantas vezes forem necessrias o procedimento acima, selecionando para cada injeo o nvel correspondente. Aps este evento, verificar a curva de calibrao em: METHOD; REVIEW

CALIBRATION... ou

, para ver a curva de calibrao:

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Aqui, visualiza-se todos os valores referentes curva solicitada (Concentraes, rea, equao, etc...).

Criando uma curva de calibrao com cromatogramas j existentes

Clicar em Analysis; Analysis / Single Level Calibration ou , para acessar a tela:

Em Data file abrir o cromatograma desejado, informar nessa tela que este vai ser um ponto de calibrao em Calibrate, clicando sobre o cone em branco ao lado da palavra. Em seguida, informar qual nvel de concentrao voc est calibrando. Caso haja necessidade podemos selecionar os seguintes itens:

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OBS: Caso no selecionarmos clear all calibration os padres injetados sero adicionados curva de calibrao j existente. Clicar em START. Caso haja a necessidade de adio de mais um ponto de calibrao ou replicata repetir quantas vezes forem necessrias o procedimento acima, selecionando para cada cromatograma o nvel correspondente. Aps este evento, verificar a curva de calibrao em: METHOD; REVIEW

CALIBRATION... ou

, para ver a curva de calibrao:

Imprimindo curvas de calibrao:

Clicar em Review Peak Calibration

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Clique na tela com o boto direito do mouse. Selecione Print All Peaks/ Groups para imprimir todas as curvas de calibrao ou Print Current Peak / Group para imprimir apenas do componente ( substancia ) selecionada.

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CRIANDO UMA SEQUENCIA ANALTICA: Para criar uma nova seqncia

Clicar em FILE; SEQUENCE; SEQUENCE WIZARD ou no cone .

Selecione Create a Sequence Clique em OK

Verificar o mtodo utilizado na seqncia a ser criada; 16

No campo: DATA FILE TYPE, deve-se permanecer em FOR AQUISITION, pois ser feita uma aquisio de dados. AMOUNT VALUES: Este campo destinado para inserir dados da amostra, padro interno, fatores de multiplicao ou diluies. Clicar em AVANAR;

Nesta tela devemos definir: Sample ID: Nome da amostra; Data path: Local de armazenamento da seqncia; Data File: Nome do arquivo seguido da extenso.dat; Number of unknown...: Quantidade de amostras na seqncia; Repetition per run: Quantidade de repeties por amostras (replicatas); Create a separate...: Para cada repetio, criar uma linha. Clicar em AVANAR.

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Caso haja instalado um amostrador automtico devemos na tela baixo, definir a posio do primeiro vial de amostra e o primeiro vial com padro e o incremento dos mesmos.

Clicar em AVANAR.

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Caso haja injeo de padro na seqncia nessa tela devemos definir os seguintes itens: Calibration ID: Nome do padro; Calibration path: Local de armazenamento dos cromatogramas dos padres; Calibration File: Nome do arquivo seguido da extenso.dat; Number of calibration levels: quantidade de pontos (nveis ) da curva de calibrao. Repetition per level: Quantidade de repeties por padro (replicatas); Clear all calibration at start of sequence: Apaga as calibraes anteriores Create a separate...: Para cada repetio, criar uma linha Multiple calibration sets: Selecionar caso acha necessidade de recalibrao entre amostras. Number of unknown runs between sets: Numero de amostras entre as calibraes. Clique em Avanar

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Na tela acima entraremos com informaes sobre o que contara no report System suitabily gera um relatrio sobre o status dos itens definidos como parmetros para amostras ou padres. QC Check Standard: usado caso acha necessidade de se checar a curva de calibrao Clique em concluir

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Nessa tela, nota-se todos os dados necessrios para executar a seqncia (Tipo de anlise, nveis de concentraes, replicatas, mtodos, nome de arquivos). Nomear a seqncia e salv-la.

Executando uma seqncia:

Clicar em CONTROL; SEQUENCE RUN... , ou , seguindo de:

Sendo que nesta tela no necessria nenhuma alterao, clicando apenas em START. Injetar as amostras solicitadas. Na concluso das injees, configurar o REPORT CUSTOM....

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Criando uma seqncia com cromatogramas j existentes.

Clicar em FILE; SEQUENCE; SEQUENCE WIZARD ou no cone .

Selecione Create a Sequence Clique em OK

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Verificar o mtodo utilizado na seqncia a ser criada; No campo: DATA FILE TYPE, deve-se selecionar FROM EXISTING FILES.

Na tela acima clicar em Clicar em concluir

e selecionar os arquivos ( cromatogramas ) de interesse.

Nomear a seqncia e salva-la. Reprocessar uma seqncia de com cromatogramas j existentes Clicar em Sequence / Process

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Caso queira reintegrar os cromatogramas selecionar em Processing mode Reintegrate Clicar em Start Criando REPORT CUSTOM... Na janela principal do Chromquest, clicar em Edit" custon report .

Entrar em Open Report Template

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Selecionar o arquivo base (*.srp , *.brp ou *.rep ) Clicar em Abrir Clicando com o boto direito do mouse sobre a janela podemos modificar/adiciona itens do relatrio.

Para ajustar a janela do cromatograma do relatrio: Dar um click com o boto esquerdo em cima da janela e arrastar ( para arrastar use a seta nos pontos escuros ) p/ o tamanho desejado

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Para ajustar a distribuio dos picos dentro da janela de visualizao do cromatograma, clicar 2 vezes com o boto esquerdo dentro da janela.

Selecionar Axis Setup

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Clicar em X- Axis e selecionar Left Axis

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Selecionar Manually set traces limits to: Definir o valor do mximo atravs do maior pico de interesse + 50%

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Para retirar as linhas de grade do cromatograma desabilite em General Options o cone Show grid

Nomear e salvar o report template

Para calculo da media e desvio Padro :

Ir a tela principal do Chromquest Clique em file Selecione advanced report

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Selecione open se j tiver o arquivo ou new para criar um novo

Selecionar uma clula da planilha (similar ao Excel)

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Selecione table wisard

Clique em avanar 31

Escolher o parmetro desejado para compor os clculos (a media e o desvio padro so automticos) Vamos escolher rea Definir o nmero de casas decimais desejado na janela precision

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Clicar em avanar

Marcar apenas a opo de picos detectados

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Clique em avanar

Selecione a opo sample ID para identificar as amostras/padres (ou outra que melhor convier)

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Modo de exibio do relatrio down exibio por coluna across exibio por linha

Selecione yes para adicionar media e desvio padro nesse relatrio

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Clique em file Selecione advanced report Selecione save as Nomear o arquivo

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Exemplo de aplicao:
Clicar em SEQUENCE / OPEN (para reprocessar uma seqncia) ou NEW ( para criar nova seqncia).

Reprocessar uma seqncia: Selecione o arquivo desejado Nova seqncia: crie uma seqncia normal de analise

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Selecione a 1 corrida da seqncia a ser feito o calculo estatstico e clique na seta azul uma vez com o boto esquerdo do mouse

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Selecione begin summary Na janela Report Template clique na pasta amarela 2 vezes

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Selecione o arquivo desejado Clique duas vezes no arquivo desejado Clique em OK

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Selecione a ultima corrida da seqncia para calculo estatstico e clique na seta azul Selecionar Summary End Clique em OK

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Selecionar o 1 intermedirio Clique uma vez na seta azul Selecione Summary Run Clique em OK

Iluminar todos os intermedirios

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De um clique no boto direito do mouse Selecione Fill Down

Selecione Sequence

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Selecione Process

Clique em sim

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Selecione reprocessar Clique em Start

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Seguir a seqncia

Selecione o arquivo Selecione Print.

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