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A APLICAO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA PRODUO DE ENZIMAS

Carmen Lucia Anto Paiva e Paula S-Pereira

SUMRIO
Este captulo versa sobre a contribuio da biologia molecular na busca, identificao e manipulao de enzimas. Contm um breve histrico da evoluo da biologia molecular, com enfoque na clonagem de genes e sua importncia para a engenharia gentica (tecnologia do DNA recombinante). Mostra como a tecnologia do DNA recombinante pode produzir mudanas genticas em microrganismos com o objetivo de melhorar caractersticas bioqumicas e fisiolgicas que tenham valor para a indstria e possam ser exploradas comercialmente, como o caso da produo de enzimas. Aborda o controle da expresso gnica e sua manipulao em microrganismos de interesse tecnolgico e enfoca os fungos filamentosos como fbricas celulares produtoras de enzimas, alm da produo de enzimas por organismos extremfilos. Enfatiza que as propriedades das enzimas podem ser melhoradas por redesenho racionalizado ou evoluo direcionada e que muito provavelmente a associao das duas estratgias ser a rota de maior sucesso para melhorar as propriedades e funo de uma enzima, ou mesmo criar uma nova funo enzimtica. As plataformas tecnolgicas conhecidas como micas, a genmica, transcriptmica, protemica e metabolmica so ferramentas moleculares que permitem descoberta de novas enzimas e aponta ainda que, atravs da combinao da pesquisa computacional e experimental em biocatlise, h de se aumentar grandemente o nvel de conhecimento dos sistemas biocatalticos e de se diminuir os esforos experimentais e conseqentemente seus custos.

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INTRODUO
Foi Wearren Weaver quem, em 1938, primeiro utilizou o termo Biologia Molecular. Desde ento enormes progressos tm acontecido neste ramo da cincia, que emergiu da associao dos conhecimentos acumulados nas reas de Bioqumica, Biologia Celular e Gentica (WITKOWSKI, 1988). A partir de ento, algumas dcadas foram necessrias para o surgimento da engenharia gentica (ramo da biologia molecular mais apropriadamente denominado de tecnologia do DNA recombinante), que s pde acontecer devido aos avanos da biologia molecular, no que se refere ao conhecimento de como as clulas armazenam, duplicam, transferem, expressam e regulam a expresso da informao gentica. Nas duas ltimas dcadas, a engenharia gentica tem sido empregada intensamente para transferir um gene de interesse biotecnolgico de um organismo a outro, mas foi na dcada de 70 que o primeiro plasmdeo recombinante foi produzido (COHEN et alii, 1973) e a transcriptase reversa foi descoberta (BALTIMORE,1970; TEMIN e MIZUTANI, 1970), abrindo o caminho para a clonagem de genes eucariticos atravs das bibliotecas de DNAc (DNA complementar). Portanto, os plasmdeos e a transcriptase reversa so duas importantes ferramentas da biologia molecular, que juntamente com as enzimas de restrio possibilitaram o desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante. A biologia molecular, atravs da engenharia gentica, tem trazido novas solues para antigos problemas biotecnolgicos. Pode-se, hoje, atravs da tecnologia do DNA recombinante, produzir mudanas genticas nos organismos vivos com o objetivo de melhorar caractersticas bioqumicas e fisiolgicas que tenham valor para a indstria e possam ser exploradas comercialmente. Os microrganismos, tanto procariotos quanto eucariotos, tm sido especialmente teis neste sentido. Vale lembrar que os microrganismos foram usados desde a Antigidade em processos biotecnolgicos, como na produo do po, da cerveja, do vinho, do queijo, do iogurte e na preservao de alimentos. Na atualidade, tm sido tambm utilizados na produo de enzimas, antibiticos, solventes, aminocidos, suprimentos alimentares e muitas outras substncias, concomitantemente com a seleo de cepas altamente eficientes na produo desses produtos (MILLER JR e NAGARAJAN, 2000). importante ressaltar que os nicos produtos gnicos a serem abordados neste captulo sero as enzimas de natureza protica, por serem o principal objeto deste livro. Sero focalizados temas do campo da biologia molecular como a regulao da expresso gnica, a manipulao de genes em microrganismos, a produo de enzimas por microrganismos geneticamente engenheirados e a evoluo das enzimas in vitro, com o objetivo de fornecer uma viso geral da contribuio da biologia molecular ao aprimoramento da produo de enzimas. Sero abordados, tambm, a utilizao de organismos extremfilos na produo desses biocatalisadores e o uso dos fungos como fbricas celulares de enzimas, com nfase nos aspectos relativos biologia molecular. As enzimas so catalisadores biolgicos presentes em todos os seres vivos. Elas so largamente utilizadas, com aplicao em diversos campos, incluindo a biorremediao, a sntese orgnica, as anlises clnicas, a produo de produtos farmacuticos, de deter-

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gentes, de alimentos, de produtos de fermentao, dentre outros. Podem ser usadas de forma muito lucrativa em meio aquoso ou em meio no convencional e, ainda, em meios de reao extremos como, por exemplo, em relao temperatura (BRAIUCA et alii, 2006). Alm disso, cada vez mais tem havido aumento do interesse na utilizao das enzimas conhecidas como catalisadores verdes, tanto em processos tecnolgicos como em biorremediao , como o caso das lacases (ALCALDE et alii, 2006). Estas ltimas so oxidorredutases que utilizam o oxignio do ar e liberam gua como nico produto alm do produto principal da reao (RIVA, 2006).

REGULAO DE EXPRESSO GNICA

O objetivo da engenharia gentica aumentar a produtividade e o rendimento dos produtos gnicos de interesse, o que geralmente requer o aumento da expresso do gene que codifica para o produto gnico em questo, como por exemplo, o aumento da expresso daqueles genes que codificam enzimas de interesse industrial. Microrganismos, tanto os procariotos (bactrias), quanto os eucariotos (fungos e leveduras), tm sido muito teis para a produo de enzimas. Portanto fundamental conhecer os mecanismos bsicos que regulam a expresso gnica nesses organismos. Enfatizamos que este assunto no poderia deixar de ser mencionado neste captulo, pois um importante aspecto da biologia molecular, cujo avano propiciou tambm a evoluo da engenharia gentica, com repercusses na produo de enzimas.

Em procariotos
A idia de que os genes podem ser ligados ou desligados produziu um grande impacto sobre a biologia molecular h aproximadamente quarenta anos atrs. Hoje sabemos que a expresso gnica regulada, o que representa uma enorme economia para as clulas. Uma bactria tpica tem aproximadamente 4.000 genes, sendo que somente uma frao desses genes est sendo expressa em um determinado momento. Vale ressaltar que h duas categorias de genes: os genes constitutivos e os induzveis. Os primeiros so aqueles que so sempre transcritos e cujos produtos gnicos so essenciais durante toda a vida da clula. Os ltimos so aqueles cujos produtos gnicos aumentam ou diminuem de acordo com um sinal molecular, geralmente em resposta ao suprimento de alimento. Embora os genes constitutivos sejam sempre transcritos a concentrao de seus produtos gnicos pode variar bastante de gene para gene. So vrios os mecanismos que regulam a expresso de um gene, compreendendo as etapas da transcrio, da traduo e do processamento do produto gnico. Portanto, a concentrao celular de um determinado produto gnico ativo no depende somente da transcrio, da velocidade e freqncia com que um gene transcrito, mas tambm de mecanismos regulatrios ps-transcricionais. Estes mecanismos envolvem a regulao da biossntese protica, como por exemplo, o controle das funes ribossomais, as modificaes na molcula da protena ocorridas aps a traduo e a velocidade de sua degradao.

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Nesta seo so abordados apenas os mecanismos que regulam a produo do transcrito primrio (RNA mensageiro, RNAm) em procariotos, com foco na unidade de regulao chamada de operon. Embora os demais mecanismos de regulao no sejam menos importantes, no que se refere produo de um produto gnico ativo, eles no so abordados aqui, pois so muitos e envolvem mecanismos muito diversos, como, por exemplo, modificaes ps-traduo por fosforilao, metilao, adenilao, glicosilao, dentre outros.

O operon lac de Escherichia coli

Foram Franois Jacob e Jacques Monod que, em 1961, primeiramente descreveram a regulao da expresso gnica em Escherichia coli. Eles observaram que as clulas de E.coli preferencialmente utilizavam a glicose como fonte de carbono, mesmo em presena de outros carboidratos como, por exemplo, a lactose. Por outro lado, em ausncia de glicose e em presena de lactose havia expresso de trs genes: o gene Z (que codifica para b-galactosidase), o gene Y (para a permease) e o gene A (para transacetilase). Estes genes esto um ao lado do outro no cromossomo bacteriano, so transcritos em conjunto e a b-galactosidase e a permease participam do catabolismo da lactose (JACOB e MONOD, 1961). O termo operon foi cunhado para designar uma unidade de regulao da transcrio. Um operon inclui: 1. Um conjunto de genes contguos chamados de genes estruturais, que codificam polipeptdeos. 2. O stio promotor. 3. As seqncias regulatrias, que atuam em conjunto na regulao da expresso dos genes estruturais. Os operons mais comuns possuem de dois a seis genes que so expressos em conjunto, mas h outros que apresentam 20 ou mais genes estruturais (NEIDHARDT, 1996). Para o entendimento de como, em E.coli, a lactose capaz de induzir, na ausncia de glicose, a sntese de enzimas para seu prprio catabolismo, necessria a compreenso dos elementos que regulam a transcrio dos genes estruturais Z, Y e A, tais como o stio promotor, o operador e demais seqncias regulatrias. Stio promotor: o stio reconhecido pela RNA polimerase como incio do local de transcrio. De modo geral, em bactrias, apresenta seqncias de consenso nas regies 35 e 10, alm do elemento UP (up-stream), que um elemento rico em AT situado entre as posies 40 e 60, que aparece em genes com elevado nvel de expresso. As seqncias de consenso so aquelas preservadas ao longo da evoluo nos diferentes promotores em diferentes genes. A figura 2.1 mostra o promotor do operon lac de E.coli. As seqncias de nucleotdeos de diferentes promotores podem variar bastante, o que determina as diferenas nas velocidades da transcrio. A eficincia com a qual a RNA polimerase se liga ao promotor e inicia a transcrio determinada pelas seqncias de consenso, pelo espaamento entre elas e pela distncia do incio da transcrio.

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A troca de um nico par de nucleotdeos em uma seqncia de consenso pode diminuir a velocidade de transcrio por vrias ordens de magnitude. Por outro lado, h trocas de nucleotdeos no promotor que aumentam a velocidade de transcrio (JENSEN e HAMMERS, 1998).

TTTACA DNA regio - 35

TATGTT regio - 10 operador

5ATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACCTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACAC - 3

stio CRP GTGAGTTAGCTCAC simetria binria AG CTC AC T T GAGT G (a) ATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG Promotor lac TATGTT regio - 10 TATAAT local de ligao da RNA polimerase

TTTACA regio - 35

Seqncias de consenso em um promotor

TTGACA

ATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG (b)

Figura 2.1 a) Representao do stio promotor do operon lac de E.coli; b) comparao entre as regies 35 e 10 do promotor lac e as seqncias de consenso em um promotor genrico.

Operador: O operador definido como a regio do DNA, que interage com uma protena repressora (repressor) que controla a expresso de um gene ou grupo de genes. A seqncia de DNA onde se liga o repressor contm aproximadamente 20 pares de nucleotdeos e inclui o local do incio da transcrio do RNAm. A molcula repressora codificada distncia por um gene chamado de gene regulador. O repressor Lac pode se inativar quando ligado lactose, mas os genes estruturais controlados por ele s sero transcritos se um controle adicional for acionado (KOLB et alii, 1993). Este controle, que inclui a diminuio da concentrao de glicose e o aumento de AMPc na clula, descrito a seguir. Stio CRP (do ingls camp receptor protein): Este stio se situa prximo ao promotor e uma seqncia do DNA com simetria binria, em relao ao eixo (figura 2.1). A protena receptora de AMPc (CRP) tambm designada por CAP (do ingls catabolite gene activator protein). um homodmero com afinidade pelo stio CRP que interage com a RNA polimerase para facilitar a transcrio, quando a fonte de carbono glicose se esgota. Esta protena CRP tem um stio de liga-

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o com o AMPc e este ltimo tem sua sntese inibida e seu efluxo da clula estimulado por glicose. Assim, se a concentrao de glicose alta a de AMPc baixa (conseqentemente CRP est inativa) e se a concentrao de glicose baixa a de AMPc alta (CRP est ativa) (KOLB et alii, 1993). A expresso dos genes estruturais para o catabolismo da lactose depende, portanto, da ao em concerto do repressor, que pode estar ativo (no ligado lactose) ou inativo (ligado lactose) e da CRP, que pode estar ativa (ligada a AMPc) ou inativa (no ligada a AMPc, quando a glicose est presente). Diversos operons catablicos, como, por exemplo, o da arabinose, j foram descritos, assim como, os operons anablicos, como por exemplo, o da sntese do triptofano. O operon lac um dos mais simples, entretanto outros mecanismos de regulao, como o do catabolismo da arabinose, incluem vrios passos regulatrios adicionais, que no sero aqui discutidos por no ser objetivo deste captulo examinar a fundo cada operon conhecido, mas apenas propiciar uma viso geral do controle da expresso gnica, como subsdio para as sees seguintes.

Em eucariotos
A regulao da expresso gnica em eucariotos bastante mais complicada do que em procariotos. Nestes ltimos, as protenas que regulam a transcrio se ligam em locais muito prximos ao stio de incio da transcrio, embora existam excees como a da protena regulatria de bactria, NtrC, que ativa a transcrio distncia. NtrC se situa sobre uma poro do DNA denominada de enhancer (realador). O enhancer uma seqncia regulatria que, em conseqncia de uma dobra no DNA, possibilita o encontro de NtrC com a RNA polimerase, o que ativa a transcrio (NEIDHARDT, 1996). Nesta seo descrevemos apenas a regulao da transcrio em eucariotos realizada pela RNA polimerase II, que transcreve o DNA para os precursores dos RNA mensageiros, no abordando aqui a regulao das RNA polimerases I (transcrio para molculas de RNA ribossomal 18S, 5,8S e 28S) e III (para molculas de RNA transportadores e do RNA ribossomal 5S). Nos eucariotos, as regies que controlam a transcrio de um gene podem estar espalhadas em locais distantes, mas atuando concomitantemente. As regies controladoras da expresso gnica incluem o conjunto formado pelo stio promotor (onde os fatores gerais de transcrio e a RNA polimerase, RNApol, se associam) e todas as demais seqncias regulatrias (onde se ligam protenas que regulam a velocidade de associao dos fatores gerais de transcrio com a RNApol). Muitas protenas regulatrias que se ligam aos enhancers ativam a transcrio, entretanto outras a regulam negativamente (KORNBERG, 1996). A figura 2.2 mostra um esquema da regio de controle de um gene eucaritico, evidenciando a localizao dos fatores gerais de transcrio e da RNApol II no promotor e a localizao das protenas regulatrias nas seqncias regulatrias. Estas ltimas podem se encontrar adjacentes ao promotor, longe dele montante, dentro de introns ou jusante do gene (MENKA e THANOS, 2001).

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Regies Controladoras do Gene A enhancer

ativador fatores gerais de transcrio Mediador protenas regulatrias RNA polimerase II

tran

domnio ativador

scri

protenas regulatrias da expresso genica

TATA promotor

gen eA

seqncia regulatria seqncia regulatria

Figura 2.2 Representao esquemtica do incio da transcrio de um gene eucaritico (gene A) evidenciando a localizao dos fatores gerais de transcrio e da RNApol II no promotor e a localizao das protenas junto s suas seqncias regulatrias e enhancer.

A iniciao da transcrio o principal ponto de regulao da expresso gnica tanto para procariotos como para eucariotos, embora seus respectivos mecanismos de regulao apresentem diferenas marcantes. Em procariotos a RNApol geralmente acessa qualquer promotor e tem a capacidade de iniciar a transcrio mesmo na ausncia de seqncias controladoras. J em eucariotos os promotores so inativos in vivo na ausncia dessas seqncias. H trs classes de protenas que esto envolvidas na regulao da transcrio, que so os fatores gerais de transcrio, os transativadores e os coativadores. Os primeiros se referem aos fatores que se ligam regio TATA para a formao do complexo de pr-iniciao. Os segundos so os que se associam s molculas ativadoras, ou s repressoras, e assim se ligam aos enhancers; eles tm a capacidade de se ligarem a molculas sinalizadoras, ativando ou reprimindo a transcrio, em resposta a modificaes do ambiente celular. Os terceiros so aqueles que agem como intermedirios entre os transativadores e a RNA polimerase. Em leveduras um exemplo de coativador o mediador, um complexo de aproximadamente 20 polipeptdeos, que se liga RNA polimerase II e a transativadores situados nos enhancers (figura 2.2) (MALIK e ROEDER, 2000). Sabemos que uma pliade de protenas atua orquestradamente regulando a transcrio. Elas, entretanto, em conjunto com os stios no DNA a que se ligam, no so os

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nicos elementos na regulao da expresso em nvel da transcrio. H ainda um grande problema a ser resolvido no cromossomo eucaritico, que se refere estrutura da cromatina (formada de DNA e protenas) que tem de ser modificada para liberao da regio de consenso TATA (TATA box) na regio a ser transcrita. O cromossomo eucaritico muito mais complexo do que o de procariotos, pois apresenta estruturas denominadas de nucleossomos (TRAVERS, 1999), que compreendem um octmeros de protenas histonas circundado por DNA. Mais especificamente, a regio TATA presente no promotor deve ser liberada das molculas de histona para se tornar acessvel RNApol. Modificaes epigenticas esto sendo, cada vez mais, consideradas importantes no entendimento dos processos de regulao gnica. Em geral, a metilao do DNA est associada com promotores silenciosos que contm ilhas CpG, sendo, portanto, a represso gnica provavelmente mediada pela ligao de protenas especficas ao DNA metilado. Um outro evento epigentico a acetilao de histonas. Em geral, a acetilao das histonas est associada com a ativao dos genes e a falta de acetilao com represso dos mesmos. A fosforilao das histonas na mitose e a metilao das mesmas tambm participam do silenciamento dos genes (BECK e OLEK, 2001; KWAKS e OTTE, 2006). Todos esses mecanismos, atuando em conjunto, colaboram para a regulao da expresso gnica em resposta ao ambiente celular, o que representa enorme economia para as clulas, e nos eucariotos superiores garante a diferenciao das clulas para produo dos tecidos que formaro os diferentes rgos do indivduo. Vale ressaltar que a manipulao da expresso gnica, especialmente em microrganismos, objeto de enorme interesse por parte dos envolvidos em biotecnologia com foco na produo de enzimas.

MANIPULAO DA EXPRESSO GNICA EM MICRORGANISMOS

Depois de identificado, o gene responsvel pela codificao de uma enzima especfica pode ser isolado e transferido por tcnicas de DNA recombinante para um microrganismo industrial conhecido. Geralmente, atravs dos vetores recombinantes de clonagem, como os plasmdeos, incorpora-se o gene de interesse ao microrganismo hospedeiro que vai express-lo. A produo desses vetores recombinantes se d pelo emprego de enzimas de restrio, que cortam o DNA do vetor em locais especficos onde o gene a ser clonado ser inserido. A enzima DNA ligase, aps pareamento das extremidades do DNA do plasmdeo com as do inserto, faz a ligao do DNA do vetor com o DNA do segmento que contm o gene de interesse. s vezes, inserem-se diversas cpias do gene no microrganismo hospedeiro a fim de se potenciar a produo da enzima. Vale ressaltar que h enzimas codificadas por mais de um gene diferente (as heterodimricas, por exemplo). Para facilitar o entendimento, relatamos, neste pargrafo o exemplo de clonagem de uma enzima codificada por um nico gene. O fato de se conhecerem as condies ideais de trabalho para os microrganismos hospedeiros favorece a produo das enzimas em grande escala. Os principais microrganismos hospedeiros usados so Eschericia coli, estirpes de Bacillus sp., de Aspergillus

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sp. e Saccharomyces cerevisiae. O interesse a respeito da manipulao da expresso gnica em microrganismos surge da necessidade de se obter um determinado produto gnico com alto rendimento. Para que seja produzido um produto novo em uma clula hospedeira, h necessidade da expresso coordenada dos genes que codificam as enzimas envolvidas em sua sntese. H necessidade, tambm, de um forte controle da expresso dos genes em questo e de consistente expresso de um produto gnico ativo. A engenharia metablica tem se utilizado da tecnologia do DNA recombinante para a modificao de microrganismos visando superproduo de substncias como as enzimas. Para a produo de um organismo recombinante com a finalidade de expressar uma protena heterloga so utilizadas diversas ferramentas da biologia molecular apresentadas a seguir.

Vetores de clonagem
Vetores de clonagem so seqncias de DNA s quais sero ligados os genes que se deseja clonare expressar, em uma determinada clula hospedeira. A expresso de um gene originar um produto gnico heterlogo (BAILEY, 1991; COHEN et alii, 1973). Os vetores de clonagem precisam apresentar replicao autnoma na clula viva, propiciando assim a proliferao dos genes neles inseridos (figura 2.3). Eles devem ter stios clivveis por endonucleases de restrio (importantes ferramentas da biologia molecular usadas para cortar DNA em seqncias palindrmicas especficas) em que podem ser inseridos os fragmentos de DNA para a construo do vetor recombinante. Os vetores devem ser pequenos por convenincia de manipulao e eles so escolhidos de acordo com o tamanho do fragmento de DNA a ser clonado. A classificao do tipo de vetor equivalente classificao de seu tamanho.
Construo do vetor plasmidial Produo de Plasmdeo Recombinante Seleo da cepa transformada Optimizao do Meio

Fermentao

Obteno dos Plasmdeos Recombinantes

Purificao

Lise

Figura 2.3 Etapas principais da obteno de plasmdeos recombinantes, que portam o gene da protena heterloga (em vermelho): construo do plasmdeo in vitro; seleo da cepa transformada; otimizao do cultivo das clulas transformadas; fermentao; extrao e purificao dos plasmdeos recombinantes para futura utilizao.

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Os plasmdeos e os transposons so os vetores de clonagem mais usados em engenharia metablica de bactrias. Os primeiros se mantm autonomamente na clula hospedeira. J os transposons se integram no cromossomo bacteriano. Os plasmdeos tm a capacidade de comportar um inserto de at 20 kb, embora o tamanho mdio tpico do inserto seja de aproximadamente 3,5 kb. A engenharia metablica pode ter o interesse de expressar um gene em vrias clulas diferentes para que se possa escolher qual delas apresenta maior produo do produto gnico. Nesse caso, a melhor opo de vetor seria a dos plasmdeos de largo espectro que tm, por definio, a habilidade de se replicar em muitos tipos diferentes de clulas hospedeiras (KEASLING, 1999). necessrio que o vetor plasmidial que carrega o gene heterlogo apresente alta estabilidade segregacional, o que garante que todas as clulas presentes na cultura contm o plasmdeo recombinante. A propriedade de ser segregado nas clulas filhas alcanada pelos plasmdeos atravs de um de dois mecanismos: 1. Atravs de um elemento de partio presente na bactria. 2. Atravs da morte das clulas que no o contm (KIM et alii, 2000; NORDSTROM e AUSTIN, 1989). Os plasmdeos podem ser classificados, quanto ao nmero de cpias por clula, como plasmdeos de grande, mdio e pequeno nmero de cpias. Os de grande nmero de cpias tm mais de 100 cpias por clula e so muito instveis segregacionalmente na ausncia de fatores de seleo, alm de no comportarem longas seqncias de DNA. So pequenos, 2 a 3 kb, incluindo o gene de resistncia a antibitico e o promotor para expresso da protena heterloga (KEASLING, 1999). Os plasmdeos de nmero mdio de cpias apresentam de 5 a 20 cpias por clula. Vrios desse tipo foram construdos a partir de plasmdeos de largo espectro, como o RK2. Miniplasmdeos que contm a origem e o mecanismo de partio de RK2 podem ser estveis durante 200 geraes, aproximadamente, em algumas pseudomonas, na ausncia de presso seletiva. Os plasmdeos derivados de RK2 podem comportar diferentes genes para resistncia a antibitico, diferentes sistemas de expresso induzveis e grupos de incompatibilidade (BLATNEY et alii, 1997). Essas propriedades possibilitam a introduo em uma nica clula de mltiplos plasmdeos (com informao para diferentes passos metablicos ou partes de um mesmo passo) originrios de diferentes grupos de incompatibilidade. Estes plasmdeos de largo espectro tm sido muito utilizados na construo de uma via nova de biodegradao ou de uma via biossinttica, em organismos como E.coli, sendo subseqentemente transferidos para diversos outros organismos onde so expressos (KEASLING, 1999). Os de nmero pequeno de cpias, uma a cinco por clula, so estveis na ausncia de presso seletiva e so alternativas excelentes em relao aos plasmdeos de grande e mdio nmero de cpias, quando h necessidade de alta estabilidade e baixa sobrecarga metablica imposta clula hospedeira. Como esses plasmdeos conseguem replicar fielmente longos segmentos de DNA, eles so capazes de replicar a maior parte dos genes necessrios sntese de produtos complexos em bactrias (KEASLING, 1999).

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O transposon uma seqncia especfica de DNA que catalisa sua prpria movimentao dentro dos cromossomos (CRAIG, 1996; 1997). Os transposons tm sido extremamente teis na transferncia de genes em bactrias porque os genes transferidos por esta via so mais estveis do que os transferidos por plasmdeos. O fenmeno da transposio pode ocorrer praticamente em todas as clulas incluindo as de eucariotos. Entretanto, o fenmeno natural da transposio muito pouco freqente, pois a insero de um transposon dentro de um gene essencial para a clula pode mat-la. Em bactrias, h dois tipos de transposons: 1. Os transposons simples, que so seqncias de insero que contm apenas as seqncias essenciais transposio e os genes para as transposases que catalisam o processo. 2. Os transposons complexos, que contm mais de um gene alm dos necessrios transposio (ALBERTS et alii, 2002). Em comparao com os vetores de clonagem disponveis para E.coli e leveduras, h menos vetores prprios para fungos filamentosos. O alto custo da produo de enzimas para processos industriais torna crtica a seleo apropriada de sistemas compostos de vetores de expresso em fungos filamentosos. Um exemplo de sistema vetor-hospedeiro o proposto por Bergquist et alii (2002) para a expresso, em Trichoderma reesei, de enzimas obtidas de microrganismos termfilos. O Departament of Microbial Genetics, do National Institute of Genetics, Mishima, Shizuoka, no Japo, oferece de forma gratuita, exclusivamente para pesquisa, 386 vetores para clonagem, com indicao de suas propriedades (http://gillnet.lab.ring.ac.jp/ ~cvector/ NIG-cvector/aboute.html). O Instituto Pasteur , tambm, depositrio de vetores de clonagem e de clulas e pode ser acessado atravs do endereo http://www.pasteur.fr. O stio http://vectordb.atcg.com oferece tambm uma lista de mais de 2.600 vetores e as informaes essenciais sobre eles.

Promotores
Na maior parte dos processos que envolvem engenharia gentica necessria a troca do promotor nativo original do gene heterlogo por outro promotor especfico para a clula hospedeira, ou por um promotor que permita algum tipo de controle sobre a expresso do gene. Tratamos aqui de trs tipos de promotores, os induzveis, os constitutivos e os mltiplos. Induzveis: A induo da expresso de um determinado passo metablico em microrganismos geralmente requerida na engenharia metablica. Muitos sistemas indutores de expresso esto atualmente disponveis, como, por exemplo, os de E.coli, que incluem o sistema de expresso da lactose ou da arabinose. Vrios derivados do promotor lac original (Plac), dentre outros, esto disponveis em diferentes plasmideos (KEASLING, 1999). Constitutivos: Esta classe de promotores muito til para a engenharia metablica quando no so necessrios os promotores induzveis. Jensen e Hammers

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(1998), desenvolveram promotores constitutivos para serem usados em E.coli e Lactococcus lactis. Eles alteraram as seqncias de nucleotdeos nas regies 10 ou 35 de um promotor, ou em ambas as regies, assim como na regio espaadora de 16 pb entre estas seqncias, o que levou ao aumento, em vrias ordens de magnitude, da fora do promotor. Mltiplos: A melhor maneira de se conseguir a regulao coordenada de mltiplos genes usar diferentes promotores nduzveis, um para cada gene. A desvantagem desta estratgia que se deve adicionar mltiplos indutores ao meio. Uma estratgia alternativa foi a proposta por Jensen e Hammers (1998), j citada acima, que inclui promotores constitutivos de foras diferentes. Estes seriam induzidos pela mesma molcula indutora, mas os diferentes genes seriam expressos cada um no seu nvel respectivo de acordo com o promotor a que esto associados.

PROTENAS HETERLOGAS
A engenharia gentica tem propiciado nas ltimas dcadas o estudo das mais diferentes protenas, o que antes do desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinanteera muito difcil, pois a maior parte das protenas eucariticas est presente em baixssima quantidade nas clulas. Somente as protenas presentes em grandes quantidades podiam ser purificadas, dando origem a uma massa de aproximadamente 100 mg de protena pura, suficiente para a anlise de sua atividade, seu seqenciamento e para a produo de anticorpos. Atualmente, grandes quantidades de uma determinada protena, at mesmo em escala industrial, podem ser produzidas pela tecnologia do DNA recombinante em clulas geneticamente modificadas. Tais clulas se multiplicam em fermentadores e expressam a referida protena heterloga, que pode ser extrada e purificada. Protenas codificadas por genes eucariticos podem ser expressas em clulas procariticas via DNAc. Esta estratgia lana mo das transcriptases reversas, que so capazes de transcrever reversamente, em DNAc, uma seqncia de RNAm (BALTIMORE, 1970). Portanto, formado o DNAc este pode ser introduzido em um vetor para expresso em bactria. Como as bactrias no so capazes de retirar os introns das molculas de RNA precursoras das de RNAm, o artifcio de usar DNAc, produzido a partir de um molde do RNA sem os introns (RNAm), possibilita a expresso em procariotos de polipeptdeos de origem eucaritica, contendo a seqncia de aminocidos correspondente codificada pelo RNAm da clula eucaritica de origem. Para que uma protena heterloga seja obtida com alto rendimento necessrio: 1. Que o gene que a codifica seja inserido junto a um promotor forte no vetor de expresso. 2. Que este vetor seja incorporado em clulas hospedeiras e que essas clulas se multipliquem eficazmente. 3. Que o vetor seja estvel, se reproduza autonomamente e segregue nas clulas filhas.

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4. Que o gene heterlogo seja transcrito nas clulas hospedeiras com alta eficincia. 5. Que o RNAm seja traduzido em uma protena com a seqncia de aminocidos da forma original. 6. que esta protena seja devidamente processada e possa ser secretada ou extrada da clula e, finalmente, seja purificada. Durante a produo de protenas recombinantes em larga escala, a concentrao do produto talvez o parmetro mais crucial para o monitoramento de rotina. Saber exatamente quando extrair a protena recombinante evita a reduo do rendimento do produto, ocasionada pela extrao prematura ou pela degradao do produto no biorreator. Uma excelente reviso sobre o monitoramento rpido de produtos proticos recombinantes, com comparao entre as tecnologias atuais, foi publicada por Baker et alii (2002). Um exemplo de protena heterloga de importncia industrial e comercial a enzima renina, utilizada na produo de queijo, que pode ser atualmente produzida por microrganismos geneticamente modificados. A renina era previamente retirada do estmago bovino, entretanto, mais recentemente, o gene da enzima foi inserido em clulas de levedura, que passaram a produzir a enzima. Esta enzima conhecida como quimozima e comercialmente utilizada na produo do queijo vegetariano. Este produto teve a liberao autorizada porque idntico ao produto animal natural e, portanto, no necessita de rtulo que identifique sua origem como sendo de organismos geneticamente modificados. Ressaltamos que os alimentos produzidos que envolvem a engenharia gentica so objeto de forte controle. As enzimas obtidas de organismos geneticamente modificados que, entretanto, so inativadas por calor ou pasteurizao do produto final so bem aceitas e sua identificao no necessria. As amilases e proteases so tambm importantes exemplos de enzimas usadas na indstria de alimentos que tm sido produzidas por organismos geneticamente modificados. Atualmente possvel clonar e expressar qualquer enzima em organismos recombinantes, mas somente a expresso com alto rendimento torna a enzima economicamente vivel.

FUNGOS FILAMENTOSOS COMO FBRICAS CELULARES PRODUTORES DE ENZIMAS

Os fungos filamentosos tm sido usados h sculos como fontes de produo de muitos metablitos e enzimas. Eles esto envolvidos no processamento de frutas e legumes, na clarificao de sucos de frutas, na extrao de cafs e na produo de adoantes. Muitos fungos secretam naturalmente protenas e tm sido explorados comercialmente como fbricas de enzimas, tanto as originadas de fungos como das heterlogas, originalmente presentes em outros organismos. Os fungos filamentosos de maior interesse industrial incluem espcies de Aspergillus sp., como A. awamori, A. niger, A. orizae, A. nidulans, de Mucor (M. Michie) e de Trichoderma (T. reesei) (VAN DEN HOMBERGH et alii, 1997).

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Modificaes genticas tm sido usadas para melhorar a capacidade de produo e secreo de enzimas nesses organismos, j que o rendimento da produo em fungos selvagens geralmente baixo. O desenvolvimento de estratgias de biologia molecular, inicialmente para modificao gentica de bactrias (E. coli e Bacillus spp.), e logo depois para a modificao de fungos, rapidamente favoreceu o aprimoramento de certas caractersticas teis do fungo. Estas manipulaes genticas tm o intuito de que o fungo produza e secrete grandes quantidades de enzima, maiores do que no microrganismo selvagem (PUNT et alii, 2002). Muitos fungos convencionais so capazes de produzir grandes quantidades de protenas especficas. Entretanto, eles as secretam juntamente com outras protenas das quais tm que ser separadas, o que aumenta substancialmente o custo de produo. Atravs de tcnicas de biologia molecular, os genes de certas protenas suprfluas podem ser eliminados, resultando em altos nveis da protena de interesse, sem necessidade de purificao adicional. Idealmente, o gene de interesse deve ser clonado e expressado em uma cepa com baixo background de protenas indesejadas, o que elimina etapas adicionais de purificao (www.foodproductdesign.com). Os fungos filamentosos tm sido utilizados tambm como sistemas de expresso de protenas heterlogas no-fngicas. Embora no incio das pesquisas as mesmas estratgias tenham sido usadas para a expresso das protenas fngicas e no-fngicas, o nvel obtido dessas ltimas sempre mais baixo do que o das primeiras. Uma explicao para este fato a presena de proteases produzidas e secretadas pelo fungo hospedeiro (VAN DE HOMBERGH, 1997). Punt el alii (2002) publicaram uma reviso em que relatam suas experincias com cepas deficientes em proteases para a produo de interleucina-6 de origem humana. Eles obtiveram o melhor rendimento com uma cepa transformada de A. niger deficiente em proteases e que era incapaz de acidificar o meio de cultura, impedindo assim a atividade protesica residual sobre a interleucina-6. Recentes pesquisas com fungos filamentosos exploraram sua rica diversidade gentica e os colocaram em evidncia como importantes fontes de clulas hospedeiras para a engenharia gentica e como fontes de novos genes de interesse biotecnolgico. At o momento, entretanto, somente um nmero limitado de espcies de fungos foi explorado como clulas hospedeiras para a produo de protenas recombinantes (PUNT et alii, 2002). Vrias estratgias de biologia molecular tm sido usadas para aumentar a produo de protenas homlogas e heterlogas (NEVALAINEN e THEO, 2003). A introduo de mltiplas cpias de genes sob o controle de um promotor homlogo forte em uma cepa mutante alta secretora de protena uma delas. Vale ressaltar que ainda h uma baixa quantidade de promotores adequados para a expresso de protenas homlogas e heterlogas recombinantes. Esforos importantes esto sendo feitos no sentido de aumentar a seleo de promotores e de conhecer as condies especficas dos promotores atravs da transcriptmica (FOREMAN et alii, 2003) e da protemica (LIM et alii, 2001).

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Outra estratgia o estudo de genes que so ativados na clula em resposta s protenas no-dobradas (UPR, do ingls unfolded protein response). As bases moleculares da UPR tm sido objeto, nos ltimos cinco anos, de importantes estudos realizados, por exemplo, pelo consrcio de 28 laboratrios europeus (Eurofung, Fungal Biotechnology Program, www.eurofung.net) (NEVALAINEN et alii, 2006). O gene que regula a UPR (hac) foi clonado em T. reesei, A. nyger e A. nidulans e os mecanismos de ativao estudados em detalhes (SALOHEIMO et alii, 2003). Alm disso, um outro tipo de resposta regulatria tem sido investigado em fungos. Esta resposta se refere RESS (repression under secretion stress response), que atua ao mesmo tempo em que ocorre a ativao do gene hac 1 que codifica para um fator de transcrio UPR (NEVALAINEN et alii, 2006). A partir dos resultados inconsistentes obtidos atravs das vrias estratgias usadas para aumentar o rendimento da produo de produtos gnicos heterlogos em fungos, tornou-se necessrio mudar a abordagem de estudo gene a gene para uma abordagem mais unificada, ou seja, estudar o organismo como um todo em relao s modificaes ps-traduo e secreo. A coleta de informaes celulares globais, a partir de dados em nvel da transcriptmica, protemica, metabolmica e fluxmica, tarefa da biotecnologia de sistemas, que ainda est em seus estgios iniciais e apresenta uma srie de desafios (LEE et alii, 2005). A modelagem in silico e simulaes tm sido desenvolvidas para anlise quantitativa do metabolismo celular em nvel de sistema. Com base nas informaes globais obtidas ser possvel desenhar clulas com propriedades metablicas melhores para aplicaes industriais. O artigo de Lee et alii (2005) descreve os recentes avanos da biotecnologia de sistemas e discute as perspectivas futuras dessa nova rea para a produo por fungos de protenas de interesse econmico. Se a clula de fungo est sendo apontada como uma importante fbrica celular de protenas de interesse industrial, necessrio que ela seja abordada efetivamente como uma fbrica. O gerenciamento dos processos celulares deve incluir as mais importantes propriedades da fbrica - suas estratgias. A fbrica celular tem a habilidade de desempenhar diferentes estratgias, dependendo de diversos sinais, que so: 1. A capacidade de sentir e fazer entrar as matrias primas disponveis do meio externo. 2. A capacidade e o potencial de alterar ou adicionar funes por induo ou modulao. 3. A capacidade de mudar a maquinaria celular, para que possa lidar com novas situaes desejadas. 4. De gerenciar mudanas em nvel celular. 5. A capacidade de realizar as aes requeridas para sobreviver, crescer e competir.

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6. Produzir produtos secundrios indesejveis, para o estorvo das competidoras, e se tornar inativa sob a forma de esporos se as condies internas e externas no forem timas (GIUSEPPIN, VERRIPS e Van RIEL, 1999).

PRODUO DE ENZIMAS POR EXTREMFILOS

Microrganismos que vivem em condies extremas so, normalmente, uma fonte para obteno de bioprodutos como, por exemplo, amilases, proteases, lipases, xilanases e ligninases atravs do uso da tecnologia do DNA recombinante. Devido a suas propriedades nicas, esses organismos produzem bioprodutos que podem ser empregados nas condies ambientais drsticas que freqentemente ocorrem na prtica industrial (SANTOS et alii, 2001; S-PEREIRA et alii, 2003) Os extremfilos so organismos que vivem e se reproduzem em condies ambientais extremas no que diz respeito a pH, temperatura (calor e frio) e salinidade. Nos ltimos 40 anos tm sido encontrados em fontes de guas quentes, em reas vulcnicas, nos mares profundos, nas regies rtica e antrtica e seus mares, e em outros stios geotrmicos especiais (GERDAY et alii, 2000; SCHIRALDI, e DE ROSA, 2002). Antes desses achados, pensava-se que esses locais eram ambientes incompatveis com a vida (SCHIRALDI e DE ROSA, 2002). A maior parte das enzimas hoje utilizadas extrada de organismos mesfilos, portanto, suas aplicaes so em geral restritas, devido limitada estabilidade nas temperaturas extremas (altas e baixas) e condies adversas de reao, como pH muito alterado e presena de solventes orgnicos, dentre outras (CARRERA e COLOMBO, 2000). As enzimas mesfilas e as extremfilas termfilas so estveis e ativas em diferentes temperaturas, no havendo presso evolutiva para que as mesfilas sejam estveis e ativas em altas temperaturas e as termfilas em baixas temperaturas (S-PEREIRA et alii, 2004; GOMES et alii, 2007). Os ambientes frios so os mais abundantes do globo terrestre e so colonizados por numerosos organismos psicrfilos como bactrias, leveduras, fungos e algas unicelulares. Gerday et alii (2000) relatam as atividades especificas de vrias enzimas psicroflicas selvagens e de algumas de suas formas recombinantes, produzidas por microrganismos das regies rtica e ntrtica. J foram identificadas estirpes representativas de bactrias Gram-negativas (por exemplo, espcies de Pseudoalteromonas, Moraxella, Psychrobacter, Polaromonas, Psychroflexus, Polaribacter, Moritella, Vibrio e Pseudomonas), bactrias Gram-positivas (Arthrobacter sp., Bacillus sp. e Micrococcus sp), Archaea (espcies de Methanogenium, Methanococcoides e Halorubrum), leveduras (Candida sp e Cryptococcus sp), fungos (por exemplo, Penicillium e Cladosporium) e microalgas (Chloromonas) encontrados nestes ambientes inspitos com caractersticas intrnsecas de adaptao ao frio extremo (FELLER e GERDAY, 2003). Estas enzimas incluem a lcool desidrogenase, a -amilase, a aspartato transcarbamilase, a subtilisina, a b-lactamase, a triose fosfato isomerase, a malato desidrogenase e a xilanase. Alguns exemplos de enzimas extradas de organismos termfilos relatadas so a amilase, as lipases, as xilanases (S-PEREIRA et alii, 2002a,b), as Taq polimerase e as celulases (S-PEREIRA, 1994).

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Estas duas ltimas so marcantes exemplos de enzimas extremfilas que atingiram o mercado e tm sido utilisadas em larga escala. A maneira como as enzimas respondem temperatura fundamental para muitas reas da biotecnologia. Screening e seleo de protenas, com uma propriedade trmica particular, so geralmente feitos com o objetivo de obter boa atividade ou resistncia desnaturao em uma dada temperatura (EISENTHAL et alii, 2006). Um exemplo de enzima muito utilizada pela biologia molecular, que resiste a temperaturas acima de 90C a Taq DNA polimerase, tambm denominada Taq polimerase ou, simplesmente, Taq (EC 2.7.7.7). Esta uma DNA polimerase termoestvel, utilizada na amplificao de fragmentos de DNA atravs da tcnica de PCR. Seu nome deve-se a ter sido identificada pela primeira vez na bactria Thermus aquaticus, uma extremfila isolada, em 1965, de uma fonte hidrotrmica do Parque Nacional Yellowstone, nos Estados Unidos da Amrica. A Taq polimerase suporta as elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo uma meia-vida enzimtica de 40 minutos (em 95C). Trata-se de uma enzima importante, que revolucionou a biologia molecular e, conseqentemente, a engenharia gentica, possibilitando a amplificao de molculas de DNA de forma espetacular. Ela permite que muitos ciclos de replicao de DNA (que requerem altas temperaturas) possam ser realizados sem a necessidade de adio de novas molculas da DNA polimerase aps cada etapa de alta temperatura. A tcnica que utiliza esta enzima termo resistente chama-se reao em cadeia da polimerase (PCR- polymerase chain reaction) e foi desenvolvida por Kary Mullis, em 1983, que recebeu por isso o Prmio Nobel de Qumica dez anos depois. Com esta tcnica pode-se conseguir a multiplicao exponencial de molculas de DNA, obtendo-se, assim, massa de material suficiente para as mais diversas finalidades, como por exemplo, o diagnstico de doenas genticas e infecciosas, a identificao de material gentico necessrio medicina forense, o seqenciamento de cidos nuclicos e a engenharia gentica, com evidente repercusso no aprimoramento da produo de enzimas.

DIVERSIDADE MICROBIANA COMO FONTE DE NOVAS ENZIMAS

A diversidade microbiana uma fonte importante de recursos genticos para o avano da biologia e biotecnologia. Nos nossos dias, conhecem-se cerca de 4.300 enzimas (seqenciadas), 300 destas comercializadas (FERRER, 2004). Os microrganismos apresentam imensa diversidade gentica e desempenham funes nicas e cruciais na manuteno de ecossistemas, como componentes fundamentais de cadeias alimentares e ciclos biogeoqumicos (SCHIMEL, 1995; MYERS, 1996). Estudos recentes em ecologia molecular microbiana demonstram que a extenso da diversidade microbiana na natureza muito maior do que previamente pensado. Estratgias tradicionais de isolamento e seleo de microrganismos tm garantido o desenvolvimento de novos frmacos e aplicaes nas reas de sade, agricultura, indstria e meio ambiente.

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Os metagenomas
Os metagenomas so o DNA da comunidade microbiana total extrada diretamente de ambientes como solos ou sedimentos. A anlise dos metagenomas por tecnologia de DNA recombinante permite a explorao do potencial biotecnolgico de organismos no-cultivveis em laboratrio (RODRGUEZ-VALERA, 2002). Metodologias moleculares que independem do cultivo, baseadas em extrao direta de cidos nuclicos de amostras ambientais, associada s tcnicas de hibridizao com sondas grupo-especficas ou PCR, clonagem e seqenciamento vm permitindo a avaliao mais precisa da diversidade microbiana no ambiente e a descoberta de novos grupos de organismos, nunca antes cultivados. Atravs de tcnicas inovadoras como anlises de 16S rDNA (MACRAE, 2000), DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) e hibridao in situ por fluorescncia (FISH), pode ser efetuada a caracterizao filogentica dos microrganismos e posteriormente avaliado o seu potencial enzimtico. Apesar de estas metodologias no permitirem acesso ao potencial metablico destes novos organismos individualmente, uma vez que as etapas de isolamento e cultivo so suprimidas dos estudos, o potencial enzimtico dos consrcios microbianos estudados quase inesgotvel. Uma estratgia alternativa para o conhecimento do potencial de cada microrganismo que constitui o metagenoma a clonagem de fragmentos grandes de DNA (>100 kb) a partir de amostras ambientais no vetor BAC (bacterial artificial chromosome) (figura 2.3). Estes vetores tm a capacidade de albergar fragmentos de DNA exgeno de grande dimenso em hospedeiros como Escherichia coli, e tm sido usados em bibliotecas genmicas de eucariotos. O mtodo consiste na clonagem de fragmentos grandes de DNA, originados de DNA do metagenoma, e anlise das bibliotecas resultantes em busca de uma nova expresso fenotpica na linhagem hospedeira de E. coli. No caso de se usar a estratgia BAC para genomas bacterianos, existe a vantagem de que alguma expresso gnica ocorrer nos clones BAC, pois o DNA inserido procaritico. Este processo usando o sistema BAC abre perspectivas para a descoberta de novos produtos naturais pela expresso por genes localizados em operons ou vias biossintticas complexas. Projetos multidisciplinares que contemplem o desenvolvimento de novas formas de cultura de microrganismos, a descoberta de novas enzimas a partir de todos os genomas de organismos (metagenoma) e a melhoria da sua performance atravs de tcnicas de evoluo dirigida sero projetos ambiciosos e de grande interesse cientfico e social.

AS MICAS, TRANSCRIPTMICA, PROTEMICA E METABOLMICA NA IDENTIFICAO DE NOVAS ENZIMAS

Etimologicamente, a terminao mica (do ingls omics) significa estudo global. Assim, a genmica- de todos os genes, a protemica de todas as proteinas, a transcriptmica de todos os transcriptos e a metabolmica do perfil metablico de uma dada clula, tecido, fluido, rgo ou organismo em um dado instante.

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Esta nova etapa da revoluo biolgica, denominada de era ps-genmica, est associada aos avanos tecnolgicos dos ltimos anos, que foram possibilitados pelo desenvolvimento da genmica, da transcriptmica, da protemica e da metabolmica. As plataformas tecnolgicas conhecidas como micas so ferramentas moleculares que permitem examinar cada estgio do fluxo de informao biolgica, de DNA a RNA e, deste, a protenas e at funo biolgica. Com tais instrumentos, pode-se avaliar a expresso de milhares de genes/protenas em uma nica hibridao, o que muito til no estudo dos mecanismos moleculares das diversas doenas. Alguns investigadores utilizaram tambm a tecnologia array (DNA chip) para determinar as alteraes na expresso de genes (SCHULZE e DOWNWARD, 2001). A tcnica de DNA microarray reduziu muito o tempo de anlise do transcriptoma de uma amostra de DNA e imprescindvel na anlise metabolmica. Desta forma pode-se ter acesso a novos genes codificadores de enzimas que podero revolucionar as indstrias s quais esto destinadas. Esta tcnica extremamente til quando o investigador quer analisar um grande nmero de genes rapidamente, ou quando a amostra a ser estudada muito pequena. Podemos analisar a expresso gnica dentro de uma nica amostra ou comparar a expresso gnica de dois tipos de clulas ou de dois tecidos diferentes. Os microarrays de DNA so pequenos suportes slidos nos quais milhares de seqncias codificadoras de genes esto imobilizadas ou ligadas de forma organizada em posies conhecidas. O suporte slido normalmente uma lmina de vidro especial de microscopia, mas tambm pode ser um a pastilha de silcio. O DNA impresso, depositado ou sintetizado diretamente no suporte. As amostras podem ser DNA, cDNA ou oligonucleotideos.

Genmica funcional e bioinformtica

Por biologia computacional ou bioinformtica entende-se o uso de tcnicas e ferramentas da cincia da computao aplicadas aos problemas da biologia, com maior expresso para as reas de biologia molecular e gentica (THEODORIDIS e KOUTROUMBAS, 1999). Novas abordagens de trabalho envolvendo metodologias de bioinformtica e biologia molecular permitem a prospeco, por computador, de informaes, a partir de bases de dados genmicos, e a anlise de microrganismos sem a necessidade de isolamento e cultura, a partir da clonagem direta de DNA de amostras ambientais. Com isso, so possveis a caracterizao e descoberta de novos genes, enzimas, molculas bioativas e frmacos associados rica diversidade de organismos ainda no-cultivveis e o desenvolvimento de novas estratgias de seleo e triagem de novos produtos, alvos e ensaios a partir do conhecimento da genmica e da expresso gnica de organismos diversos. O estudo de genomas estruturais, atravs de programas de bioinformtica que comparam as seqncias determinadas com as depositadas nas bases de dados disponiveis, como EMBL (COCHRANE et alii, 2006), GenBank (BENSON et alii, 2006) e DNA Databank of Japan (OKUBO et alii, 2006), e que so depois processadas, como o GenScan, identificam novos genes com base na presena de seqncias como: TATAA box; codons de incio; codons de terminao; seqncias sinalizadoras de separao (splicing) entre

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exons e introns. Entretanto, a presena de uma regio codificadora no implica necessariamente em que essa seqncia ser transcrita e traduzida na forma de uma protena, com funo bioqumica e biolgica. A obteno e anotao do genoma estrutural de uma espcie geram um mapa fsico de toda a seqncia de DNA do genoma. Mapas fsicos, em conjunto com mapas de ligao (gerados pelo uso de RFLP, microsatlites, AFLP, etc) so ferramentas cada vez mais teis em programas de melhoramento gentico assistido por marcadores moleculares. A estruturao de bancos de Expressed Sequence Tags (EST) (ISELI et alii, 1999) extremamente til para a identificao da funo bioqumica e biolgica de muitos genes. As EST so seqncias curtas de fragmentos de mRNA. A obteno dos EST um mtodo relativamente simples e rpido, visto que o seqenciamento total do mRNA um trabalho muito complexo, ao passo que a obteno de fragmentos curtos bem mais fcil. A informao gentica contida nestes fragmentos suficiente para a deduo da protena que eles codificam. Aps a obteno dos fragmentos, as seqncias so introduzidas na base de dados de EST, que os investigadores podem utilizar para obter a mensagem completa sobre mRNAs de interesse e, atravs da genmica funcional, podem produzir a enzima codificada. Assim, genes expressos que codificam protenas com funes enzimticas podem ser identificados com o uso destas novas ferramentas da bioinformtica.

EVOLUO DAS ENZIMAS IN VITRO

A expanso contnua do uso de enzimas nas indstrias qumicas, txteis, farmacuticas e de alimentos, cria a necessidade da produo de enzimas com alta estabilidade operacional, alta especificidade e enantiosseletividade, alm de novas atividades sobre substratos naturais e sintticos (COHEN et alii, 2001). A engenharia enzimtica promete uma expanso extraordinria da produo e utilizao de enzimas modificadas. Duas estratgias tm sido utilizadas: a evoluo direcionada e o redesenho racional (rational redesign) (CHEN, 2001). A evoluo direcionada de enzimas surgiu h alguns anos como uma abordagem muito eficaz para a adaptao de biocatalisadores para aplicaes mdicas e industriais. A evoluo direcionada mimetiza o darwinismo in vitro, combinando mutao e recombinao com o screening ou seleo de variantes da enzima com as propriedades desejadas (SCHMIDT-DANNERT e ARNOLD, 1999). Esta estratgia possui vantagens sobre o uso de luz ultravioleta ou de substncias mutagnicas, porque na evoluo direcionada a seqncia de nucleotdeos sujeita mutao ao acaso se restringe ao gene que codifica a protena de interesse ou at mesmo a partes deste gene. J na mutagnese por ultravioleta e agentes qumicos todo o genoma da clula alvo de mutao. A fase crtica da evoluo direcionada achar as variantes de efetivo interesse. Um exemplo marcante a subtilisina, da qual embora formas variantes tinham sido produzidas e secretadas com alto rendimento, nenhuma delas tinha atividade aumentada nos processos utilizados nas lavanderias (SCHMIDT-DANNERT e ARNOLD, 1999).

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No redesenho racional, empregam-se mutaes stio-dirigidas com o intuito de trocar com preciso certos aminocidos da enzima. A nova seqncia concebida com base em conhecimentos detalhados da estrutura protica, sua funo e mecanismo de ao (CHEN, 1999). O poder do redesenho racional foi evidenciado pela produo de uma superxido dismutase redesenhada, muito mais ativa que as j conhecidas (GETZOFF, 1992). Os estudos de mutaes que melhoram as propriedades enzimticas revelaram que em muitas enzimas, mas no em todas, as mutaes prximas do centro ativo podem aumentar drasticamente o sucesso de muitos experimentos que envolvem evoluo direcionada (MORLEY et alii, 2006). Estes autores afirmam que, para a estabilidade trmica e atividade cataltica, tanto as mutaes prximas do centro cataltico como as distantes parecem ser efetivas no melhoramento da enzima. J no caso da enantioseletividade, da seletividade quanto ao substrato e da atividade cataltica alternativa, mutaes prximas ao centro ativo parecem mais efetivas do que as distantes. No se pode deixar de mencionar que avanos recentes no campo da cincia da computao propiciaram a elaborao de novos mtodos, sofisticados e refinados, capazes de descrever a maquinaria dos biocatalisadores com detalhes; embora a previso por computadores da quantidade de atividade enzimtica ainda seja uma formidvel meta a ser atingida. A identificao de motivos estruturais, no substrato e nas enzimas, especficos para o reconhecimento enzima/substrato no nada trivial, porm, cada vez mais, tcnicas de modelagem molecular so usadas como ferramentas rotineiras para a descrio da interao enzima/substrato. Uma excelente reviso dos mtodos computacionais usados para a orientao de estratgias experimentais em biocatlise, foi recentemente publicada por Braiuca et alii (2006). Escolher a abordagem mais adequada para melhorar uma enzima depende de quanto se sabe de seu mecanismo e dos esquemas de seleo disponveis. Com o aumento do nmero de estruturas tridimensionais depositadas nos banco de dados e com o desenvolvimento de ferramentas poderosas para a modelagem de protenas, o redesenho racional tornar-se- mais eficiente e largamente aplicado. Por outro lado, a evoluo direcionada poder ser aplicada cada vez mais a enzimas de interesse industrial quando houver processos de screening ou seleo eficazes das variantes de interesse. Muito provavelmente, a associao das duas estratgias ser uma rota de maior sucesso para melhorar as propriedades e funo de uma enzima, ou at mesmo criar uma nova funo enzimtica. Vale ressaltar que a habilidade de alterar o metabolismo mantendo-se o equilbrio celular em termos de metablitos ser a chave da aplicao de alteraes em vias metablicas de um grande nmero de organismos produtores de enzimas de interesse industrial (CHATTERJEE e YUAN, 2006).

PERSPECTIVAS
Encontrar uma nova enzima significa encontrar uma nova funo microbiana, portanto deve-se examinar o maior nmero possvel de microrganismos, atravs de um potente sistema de screening. Estima-se que 100 milhes de microrganismos esto presentes

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em 1g de solo e que, portanto, h muitas enzimas ainda a serem descobertas. Alm do desafio da descoberta de uma nova enzima, h tambm o desafio de torn-la economicamente vivel para o consumo e, tambm, de modific-la. Os avanos na rea da biologia molecular so contribuies importantes para a produo de microrganismos geneticamente modificados que superexpressam certas enzimas e para a produo de enzimas recombinantes extremfilas, capazes de atuar em processos nos quais as enzimas mesfilas geralmente perdem a atividade. A biologia molecular tambm tem contribudo para a evoluo das enzimas in vitro visando o aumento da atividade e da estabilidade, ou mesmo a aquisio de nova funo. A combinao da pesquisa computacional e experimental em biocatlise oferece a possibilidade de aumentar grandemente o nvel de conhecimento dos sistemas biocatalticos e de reduzir os esforos experimentais e, conseqentemente, seus custos. A coleta de informaes celulares globais a partir de dados em nvel da transcriptmica, protemica, metabolmica e fluxmica tarefa para a biotecnologia de sistemas, que ainda est em seus estgios iniciais, mas que aponta para o fato de que, com base em tais informaes globais, um dia ser possvel desenhar clulas com propriedades metablicas melhores para aplicaes industriais.

REFERNCIAS
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