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Pecuria e Abastecimento
ISSN 1517 - 5111
Maio, 2003
Engenharia Gentica:
conceitos bsicos, ferramentas
e aplicaes
Plasmdeo
Plasmdeo
86
ISSN 1517-5111
Maio, 2003
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
Embrapa Cerrados
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
Documentos 86
Engenharia Gentica:
conceitos bsicos,
ferramentas e aplicaes
Planaltina, DF
2003
Catalogao-na-publicao.
Embrapa Cerrados.
Embrapa 2003
Autora
Apresentao
Sumrio
Introduo .................................................................................. 9
Conceito de Engenharia Gentica ................................................ 9
Estrutura dos cidos Nuclicos ................................................... 9
Replicao do DNA .................................................................. 14
Expresso da Informao Gnica ................................................ 15
Histrico .................................................................................... 18
Ferramentas Tcnicas da Engenharia Gentica .................................. 22
Extrao de cidos Nuclicos .................................................... 22
Reao de Polimerase em Cadeia (PCR) ....................................... 24
Eletroforese em gel .................................................................. 25
Anlises moleculares ................................................................ 25
Sistemas de Restrio e Metilao ......................................... 25
Enzimas Modificadoras: polimerases, ligases ................................. 26
Clonagem Molecular ................................................................. 27
Tcnicas Bsicas para caracterizao de genes ............................. 29
Construo de Biblioteca genmica ............................................. 29
Construo de biblioteca de cDNA .............................................. 29
Engenharia Gentica:
conceitos bsicos,
ferramentas e aplicaes
Maria Cristina Rocha Cordeiro
Introduo
Conceito de Engenharia Gentica
A Engenharia Gentica constitui um conjunto de tcnicas de anlises moleculares
que permitem estudos de caracterizao, expresso e modificaes do material
gentico (DNA e RNA) dos seres vivos.
A Engenharia Gentica tem sido tema polmico. A sua prtica levanta aspectos
relacionados tica, pois baseia-se em modificao de material gentico natural
(produo de organismos geneticamente modificados OGMs) ou sua
clonagem. A discusso importante, uma vez que expressa a opinio pblica
comunidade cientfica, suscitando reflexes para a soluo de problemas.
necessrio, portanto, conhecer o seu significado para saber como, e de que
forma, ela pode contribuir como um efetivo benefcio vida.
Esta sntese dos principais temas da engenharia gentica tem como objetivo
divulgar o conhecimento bsico sobre suas possveis contribuies na
agropecuria, a estudantes, outros profissionais no familiarizados com a
biologia molecular, e um apoio didtico a professores.
10
CH2
O
H
O
P
O
C
O
5
Ligao
Fosfodister
CH2
O
P
O
C
O
5
CH2
H
O
H
H
3
O
O
O
A
O
5
CH2
H
H
3
H
H
H
C
Timina
C
H
C
Cadeia
50
O
C
0,2
8n
m
H
0,3
0n
m
Adenina
N
C
N
C
O
1,11
nm H
N
51
Cadeia
Citosina
H
Cadeia
0,2
9n
m
0
N ,30 nm
52
0,2
9n
O
m
H
1,08
nm
Guanina
N
H
N
C
N
54
Cadeia
11
12
DNA
RNA
Principal Funo
Armazenar e perpetuar o
cdigo gentico do ser
Transcrever o cdigo
gentico
Tipos
Genmico, plasmidial,
mitocondrial, de cloroplasto
Ribossmico, Mensageiro,
Transportador
Nmero de cadeias
em geral
Adenina, Timina,
Guanina, Citosina
Adenina, Uracila,
Guanina, Citosina
Tipo de Acar
Deoxiribose
Ribose
que o constituem so: adenina, uracila, citosina, guanina, ligados por ribose. As
principais caractersticas comparativas entre DNA e RNA podem ser observadas
na Tabela 1.
Histona H1
Fita de DNA
Histona H1
Histona H1
13
14
Replicao do DNA
A replicao ou duplicao o processo que permite a perpetuao da molcula
do DNA. Na diviso celular (mitose ou meiose). Subdivide-se em etapas que
sero enumeradas a seguir (Figura 4):
1. O primeiro passo a desespiralizao da molcula por enzimas como as
topoisomerases, helicases e outras;
2. Depois, ocorre a separao das cadeias de nucleotdeos com a ruptura das
pontes de hidrognio. Essa separao faz-se em vrios pontos da molcula,
formando forquilhas ou aberturas onde se origina a replicao;
3. Quando as cadeias esto separadas cada uma associada a um pequeno
RNA chamado iniciador. Este se liga s seqncias presentes em cada
cadeia, sempre no sentido 5 3. A sua presena fundamental para a
posterior associao da enzima DNA polimerase I;
4. Com a associao da enzima, no ponto em que se ligou o iniciador, comea a
polimerizao das novas cadeias do DNA. A mesma fita onde o RNA iniciador
se ligou, serve como molde para a adio, de forma complementar, dos novos
nucleotdeos. A polimerizao se faz no sentido 5 3. Enquanto uma das
cadeias polimerizada de forma contnua, forma-se a outra tambm no sentido
Iniciador
5
3
A
D
Figura 4. Desenho esquemtico das principais fases da replicao do DNA. A
Desespiralizao da cadeia; B Abertura de forquilhas (origem de replicao);
C Polimerizao de novas fitas e D Duas molculas recm-formadas.
15
16
Incio de
transcrio
Gene
E
Regio de trmino
Promotor
RNA-m
recm-transcrito
Regies de splicing
RNA-m
processado
Adio de
Guanina
metilada
(cap)
Adio de
cauda de
poli-A
Sntese de
protena
Figura 5. Desenho esquemtico indicando a estrutura gnica, formao e
modificao ps-transcripcional do RNA-m.
17
18
DNA
RNA
4 (transcriptase reversa)
3 (amplificao com
primers degenerados)
Protena
Histrico
At o sculo 18, a biologia estudava basicamente a relao dos seres vivos com
a natureza. Essa poca destacou-se pelas primeiras observaes de clulas vivas.
Havia grande questionamento de como estavam organizados morfologicamente
os seres vivos. Nessa poca, os nomes que se destacaram foram Leenwenhoek e
Hooke por seus trabalhos de Microscopia. Alm desses autores, Lammarck, com
seus trabalhos, comeava a questionar-se a respeito da evoluo das espcies.
No sculo 19, Charles Darwin consolida a teoria da evoluo dizendo que os
seres vivos evoluem de acordo com a seleo natural do ambiente onde, os mais
adaptados sobrevivem em detrimento dos menos adaptados. Nesse sculo,
apareceram tambm grandes personalidades como Louis Pasteur e Gregor
Mendel. O primeiro, bioqumico, confirmou a presena de seres vivos invisveis
(microrganismos) demonstrando o princpio em que estava baseado os
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20
Ano
Pesquisador
Pesquisa - Descoberta
1632 - 1723
1665
1744 -1829
Leenwenhoek
R. Hooke
Lammarck
1809 - 1882
1822 - 1895
Charles Darwin
Louis Pasteur
1822 - 1884
Gregor Mendel
1833
1903
1944
vrios
W. Sutton
O. Avery; C. Mac Leod;
MacLyn; McCarty;
F. Griffiths
A.Hershey; M.Chase
1952
1953
1956
195-
Tabela 2. Histrico das Principais Descobertas / Estudos de Bioqumica, Gentica e Microscopia que permitiram o
desenvolvimento da Engenharia Gentica.
Tabela 2. Continuao.
Pesquisador
Pesquisa - Descoberta
1957
195-
1960
1970
1973
vrios
Cohen & Boyer
1975
Southern
1976
1977
Sanger
1982
1985
2000
K.B. Mullins
(vrios laboratrios no mundo)
Ano
21
22
Ferramentas Tcnicas da
Engenharia Gentica
Extrao de cidos Nuclicos
A extrao de DNA e RNA so as duas primeiras etapas tcnicas aos
posteriores estudos. Existem inmeros procedimentos adotados para sua
extrao. Nas clulas animais so diferentes daqueles utilizados nas clulas
vegetais. A principal diferena a ruptura da parede celular que uma etapa
comum nas clulas vegetais e no na das clulas animais.
Para a extrao do DNA, podem ser citados protocolos que utilizam o
detergente dodecil sulfato de sdio (SDS) ou o brometo de cetil trietil amneo
(CTAB). Esses procedimentos podem ser utilizados em pequena
(minipreparaes), mdia ou grande escalas. Os de pequena escala tendem a
fornecer uma amostra mais suja (com presena de contaminantes fenlicos,
protenas, acares etc.). Em mdia e grande escala o DNA purificado em
gradientes de cloreto de csio ou em colunas de afinidade e so bastante puros.
Porm, pode-se conseguir DNA com razovel pureza e quantidade para alguns
experimentos de biologia molecular e engenharia gentica em minipreparaes.
Ainda, os diferentes procedimentos de extrao fornecem amostras que variam
em peso molecular. Dependendo da finalidade ou do estudo, necessrio
obteno de DNA genmico de alto peso molecular ou um pouco mais
fragmentado. A fragmentao do DNA genmico causada pela ao dos
agentes utilizados no processo de extrao e, alguns deles, apresenta maior
ao lesiva. Essa leso tambm pode estar relacionada ao tipo de tecido
utilizado. Apesar de determinado grau de fragmentao, o DNA extrado para
23
24
Eletroforese em gel
A eletroforese um procedimento bsico de todas as anlises com cidos
nuclicos. Essa metodologia baseia-se no fato de que essas molculas
apresentam carga eltrica negativa quando solveis em solues aquosas. Essa
carga fornecida pela ionizao dos grupamentos de fosfato presentes em suas
molculas. Essas molculas podem migrar em um suporte slido (agarose ou
poliacrilamida) submetido a um campo eltrico (condio com diferena de
potencial eltrico). Assim, os cidos nuclicos migram em direo ao plo
positivo e se separam dependendo do peso molecular que contm. Molculas
pequenas tendem a migrar com velocidades maiores do que as grandes.
A eletroforese d suporte a outras tcnicas tais como: clonagem e subclonagem
de fragmentos gnicos; construo de bibliotecas genmicas e de DNA
complementar (cDNA); anlises de southern blot e northern blot, tcnicas
baseadas na amplificao via reao de polimerase em cadeia (PCR), no controle
dos procedimentos da extrao do DNA e RNA; em estudos genticos de
caracterizao de germoplasma, mapeamento gentico.
Alm dos processos eletroforticos de cidos nuclicos, tambm so conhecidos
processos eletroforticos de anlises de protenas. Protenas podem ser
separadas em suportes como o papel, o acetato de celulose, o amido, o gar, a
agarose e a poliacrilamida. Em corridas unidimensionais ou bidimensionais ou,
em separaes por peso molecular ou carga eltrica.
Anlises moleculares
25
26
Clonagem Molecular
O que afinal clonagem molecular? Clonagem uma estratgia que se pode
dizer chave da engenharia gentica. Significa cortar determinada seqncia
gnica de um genoma e inseri-la em outro DNA que chamado vetor e , em
geral, um plasmdeo (Figura 7). Esse processo de corte seguido de nova
insero somente foi possvel realizar depois do conhecimento das enzimas de
restrio e das ligases respectivamente.
O gene ou fragmento de DNA a ser retirado do genoma pode ser obtido por
meio de clones em bibliotecas de DNA, cDNA (DNA complementar) ou
amplificaes especficas obtidas em reao de PCR. O novo DNA no qual o
gene ser inserido chamado de vetor de clonagem e pode ser um plasmdeo,
cosmdeo, bacterifago, phagemid ou um cromossoma bacteriano artificial
(BACS). A escolha de cada um deles depende basicamente do tamanho do
fragmento de DNA a ser inserido. Plasmdeos so DNAs pequenos (~3 Kb)
que podem ser naturalmente encontrados em bactrias. Foram descobertos, por
carrear genes que tornam as bactrias portadoras, resistentes a um dado
antibitico. Cosmdeos e phagemdeos so variaes construdas em laboratrio
que permitem a clonagem de fragmentos maiores que contem outros genes que
servem de controle do processo de transformao de bactrias. Alm de genes
27
28
Corte com
enzimas de restrio
Stio de
policlonagem
Gene clonado
Ligao com
a DNA ligase
Plasmdeo
Plasmdeo
Gene de resistncia
a antibitico
Gene de resistncia
a antibitico
Introduo do plasmdeo
contendo o gene e multiplicao em
clulas bacterianas
29
30
Seqenciamento de DNA
A tcnica de seqenciamento de DNA utilizada principalmente para conhecer a
seqncia de bases nitrogenadas correspondente a um gene. Na obteno de
clones especficos, tanto de bibliotecas genmicas quanto de bibliotecas de
cDNA, o seqenciamento a tcnica subseqente. Existem vrias metodologias
para seqenciar cadeias de DNA: mtodo qumico, dideoxi com marcao
radioativa, mtodo dideoxi com marcao fluorescente etc. O mtodo mais
utilizado hoje o de dideoxi com marcao fluorescente automatizado. O que se
faz amplificar a seqncia que se quer estudar utilizando-se misturas contendo
cada uma um dos dNTPs (A, T, C, ou G) e, nessa mistura, alm do nucleotdeo
normal tambm h um desses (A ou T ou C ou G) do tipo dideoxi (contendo
duas hidroxilas na pentose) que impossibilita a ligao de um novo nucleotdeo a
ele. Nesse ponto da amplificao, a cadeia do DNA interrompida. Como h
uma competio entre dNTP dideoxi e o normal o ponto de polimerizao
parado em momentos distintos e no produto final da reao conseguem-se
fragmentos de diferentes tamanhos. Podem ser utilizadas duas formas de realizar
essa reao: a primeira aquela em que se adiciona um iniciador contendo a
marcao fluorescente (tetrametilrodamina) em quatro tubos que contm, cada
um, um dos nucleotdeos dideoxi e os outros normais. A segunda feita
adicionando-se cada um dos quatro nucleotdeos contendo um com uma
marcao fluorescente diferente (fluorescena; NDB 4 cloro, 7-nitrobenzeno,
2-oxal-diazol; tetrametilrodamina e o vermelho do Texas) mais o nucleotdeo
dideoxi adequado em quatro reaes separadas. Assim, para cada seqncia
estudada, realizam-se quatro reaes de PCR que so analisadas em gel de
eletroforese onde os fragmentos constitudos so revelados por seu tamanho
molecular graas marcao fluorescente (diferente). Da segunda maneira, pode-se
31
32
pode ser realizado em temperaturas altas como 80 oC por duas horas ou sob
ao ultravioleta durante alguns segundos ou minutos;
7.
8.
9.
33
34
Northern blotting
Anlise em Northern blotting uma estratgia tecnolgica na qual se caracterizam a
presena e o nvel de expresso de genes em determinado tecido ou clulas. Para a
anlise, necessrio obter o RNA-m presente no tecido e/ou clula e a seqncia
gnica que se quer estudar sua expresso. O RNA-m pode ser obtido de diferentes
tecidos e/ou clulas em diferentes tempos de desenvolvimento.
Para realizar a anlise procede-se ao seguinte esquema de trabalho:
1. Extrao do RNA total do tecido e/ou clula que se quer investigar a
expresso de um gene. Essa amostra de RNA deve estar, de preferncia, pura
e livre de DNA residual;
Anlises em Microarranjos
Microarranjos de DNA ou cDNA so as seqncias representativas de uma
biblioteca genmica ou de cDNA que so colocadas sobre um suporte e, por
meio de hibridaes especficas com seqncias correspondentes primeira fita
de cDNAs, ou fragmentos de DNA pode-se investigar o padro de expresso
gnica e a presena ou a ausncia da expresso de um gene em determinado
sistema. Por exemplo, imaginemos um estudo que objetive investigar quais so
os genes que se expressam em determinada etapa do desenvolvimento de um
ser. Nessa etapa determinada, so isolados os RNA-m presentes no tecido ou
clulas que servem de molde para preparar uma fita de DNA marcada (por
exemplo por fluorescncia). Essa fita uma sonda ou sinal. Quando colocada
sobre o suporte que contm as seqncias provindas de uma biblioteca
genmica, as sondas iro hibridar com aquelas seqncias que lhes so
complementares. Assim, com o isolamento das seqncias complementares do
suporte e seu seqenciamento, podem-se conhecer os genes que so expressos
naquele tecido ou clula, naquela determinada etapa do desenvolvimento. Em
geral, a marcao da sonda utilizada fluorescente e, como existe mais de um
tipo de composto fluorescente associado sonda, geralmente, analisa-se mais de
uma etapa de desenvolvimento ou situao fisiolgica. Assim, sabe-se quais os
genes expressos em distintas etapas de desenvolvimento.
A anlise em microarranjos tende a superar, com o tempo, as anlises em
Southern blotting e Northern blotting tradicionais.
35
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Anlise de Genoma
Biblioteca Genmica/cDNA
Fragmentos de DNA
clones
Genes expressos
em sistemas de
plantas
Lmina
Seleo,
seqenciamento,
anlise
de gentipos que produzem frutos com vida longa de prateleira. Esse aspecto
muito importante na fruticultura, uma vez que nosso pas tem um enorme
potencial para o mercado interno e exportao. A engenharia gentica tambm
pode auxiliar em fases de processamento, por exemplo, selecionando variedades
de frutas com maior teor de aroma especfico (busca-se nesse estudo a
caracterizao dos genes envolvidos nesses sistemas).Tambm pode ser
utilizada, uma abordagem parecida, na horticultura e na olericultura.
Outra potencialidade da engenharia gentica, auxiliada pela tcnica de cultura de
tecidos in vitro a produo das plantas transgnicas. Essa talvez seja a
aplicao mais controversa da atualidade. Plantas resistentes a uma doena ou a
uma praga que ocasiona restries de produo, resistentes ao alumnio trocvel
do solo, resistentes a herbicidas, produtoras de elementos protetores (como
anticorpos, servindo como alimentos protetores), enriquecidas em protenas,
frutas com menor perecibilidade so algumas das possibilidades da transgenia.
Em geral, a produo de plantas transgnicas envolve questes relacionadas com
propriedade intelectual e royalties, assim os pases detentores de mais tecnologia
deste tipo estaro em posio privilegiada no futuro. No entanto, necessrio
que se estabeleam discusses e elaborem-se critrios claros em mbito mundial,
na distino de estratgias biotecnolgicas de produo de transgnicos, bem
como seu controle, de forma que esta no venha a acarretar em perda do
patrimnio biolgico natural do planeta. Alm disso, so necessrios controles e
testes de segurana alimentar e ambiental.
Pecuria
Na pecuria, a engenharia gentica tambm representa uma ferramenta que pode
contribuir gerando benefcios. Como no caso da agricultura, a engenharia gentica
permite estudos genticos e moleculares dos principais patgenos dos diversos
rebanhos (leiteiro, suno, eqino etc). Esses estudos podem propiciar ainda
estratgias de controle biolgico e produo de vacinas DNA (terapia gnica).
Pode auxiliar igualmente os programas de melhoramento gentico animal de
forma a selecionar caractersticas gnicas especficas contidas em raas, em uma
dada prognie, ou relacionadas a doenas genticas. E, finalmente, fundamentar
estudos de produo de animais transgnicos e a clonagem animal. Esses
ltimos aspectos, sem dvida, os mais controversos e polmicos, exigindo-se
ainda, discusses ticas porque, em especial, a clonagem de animais, abre
prerrogativas e estudos que podem subsidiar a clonagem humana.
37
38
Bibliografia Consultada
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39
40
Segunda Letra
Fenilalanina (Fen)
Fenilalanina (Fen)
Leucina (Leu)
Leucina (Leu)
Leucina (Leu)
Leucina (Leu)
Leucina (Leu)
Leucina (Leu)
Isoleucina (Ile)
Isoleucina (Ile)
Isoleucina (Ile)
Metionina (Met)
Valina (Val)
Valina (Val)
Valina (Val)
Valina (Val)
C
Serina (Ser)
Serina (Ser)
Serina (Ser)
Serina (Ser)
Prolina (Pro)
Prolina (Pro)
Prolina (Pro)
Prolina (Pro)
Treonina (Tre)
Treonina (Tre)
Treonina (Tre)
Treonina (Tre)
Alanina (Ala)
Alanina (Ala)
Alanina (Ala)
Alanina (Ala)
A
Tirosina (Tir)
Tirosina (Tir)
Final de Traduo
Final de Traduo
Histidina (His)
Histidina (His)
Glutamina (Glu)
Glutamina (Glu)
Asparagina (Asn)
Asparagina (Asn)
Lisina (Lis)
Lisina (Lis)
cido Asprtico (Asp)
cido Asprtico (Asp)
cido Glutmico (Glu)
cido Glutmico (Glu)
G
Cistena (Cis)
Cistena (Cis)
Final de Traduo
Triptofano (Trp)
Arginina (Arg)
Arginina (Arg)
Arginina (Arg)
Arginina (Arg)
Serina (Ser)
Serina (Ser)
Arginina (Arg)
Arginina (Arg)
Glicina (Gli)
Glicina (Gli)
Glicina (Gli)
Glicina (Gli)
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
Terceira Letra
41
42
Origem
Acc I
5 GTATAC 3
3 CATATG 5
Acinobacter calcoaceticus
Alu I
5 AGCT 3
3 TCGA 5
Arthrobacter luteus
Apa I
5 GGGCC 3
3 CCCGG 5
Acetobacter pasteurianus
Bam H I
5 GGATC 3
3 CCTAG 5
Bacillus amyloliquefaciens
Bgl II
5 AGATCT 3
3 TCTAGA 5
Bacillus globigii
Dra I
5 TTTAAA 3
3 AAATTT 5
Deinococcus radiophilus
ATCC 27603
Eco R I
5 GAATTC 3
3 CTTAAG 5
Escherechia coli
Eco R V
5 GATATC 3
3 CTATAG 5
Escherechia coli
Continua...
Apndice 2. Continuao.
Enzima
Origem
Hind III
5 AAGCT 3
3 TTCGA 5
Haemophilus influenzae
5 GTTAAC 3
Hpa I
3 CAATTG 5
Haemophilus
parainfluenzae
Kpn I
5 GGTACC 3
3 CCATGG 5
Klebisiela pneumoniae
Mse I
5 TTAA 3
3 AATT 5
Micrococcus species
Not I
5 GCGGCCGC 3
3 CGCCGGCG 5
Nocardia ottidis-cavarium
Pst I
5 CTGCAG 3
3 GACGTC 5
Providencia stuartii
Sal I
5 GTCGAC 3
3 CAGCTG 5
Streptomyces albus
5 CCCGGG 3
Sma I
Serratia marcescens
3 GGGCCC 5
Xba I
5 TCTAGA 3
3 AGATCT 5
Xanthomonas badrii
43