UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE VETERINRIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM MEDICINA VETERINRIA
DOUTORADO EM HIGIENE VETERINRIA E PROCESSAMENTO TECNOLGICO
DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL
DISCIPLINA: CONTROLE MICROBIOLGICO DE QUALIDADE
PROFESSORES: CLIO MAURO
LUIZ ANTNIO
ROBSON MAIA

BIOFILME E SUAS IMPLICAES

NA ELABORAO DE P.O.A.

JORGE LUIZ FORTUNA

Niteri-RJ
2009

SUMRIO

LISTA DE FIGURAS, p. 3
INTRODUO, p. 4
COMUNIDADES BACTERIANAS, p. 4
BIOFILMES, p. 5
FORMAO DO BIOFILME, p. 6
FATORES DE CONTRIBUIO PARA A ADESO DO BIOFILME, p. 9
PRINCIPAIS MICRORGANISMOS ENVOLVIDOS, p. 10
BIOFILMES NAS INDSTRIAS DE ALIMENTOS, p. 11
BIOFILMES EM DISPOSITIVOS MDICOS, p. 12
EPIDEMIOLOGIA, p. 14
MTODOS DE AVALIAO, p. 15
PADRES MICROBIOLGICOS, p. 16
REMOO DO BIOFILME E PREVENO, p. 16
CONSIDERAES FINAIS, p. 17
REFERNCIAS, p. 18
ANEXOS, p. 22

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1

Exemplo da ecologia de comunidades microbianas. As quatro

microcolnias centrais correspondem a organismos que geram e
consomem hidrognio. Os fermentadores utilizam acares e
produzem cidos orgnicos, utilizados pelos produtores de
hidrognio. Alm das interaes metablicas, a comunicao intra e
intercelular pode ser mediada por molculas sinalizadoras, p. 22

FIGURA 2

Vista de cultura de 9 dias mostrando material compacto ao redor dos

microrganismos (M). Notar reas vazias ao redor da maioria das
clulas e espesso depsito de polissacardeo (P), p. 22

FIGURA 3

Micrografia eletrnica de estgio de produo de biofilme (9 dias)

caracterizado por reas vazias (V) imediatamente ao redor das
clulas, com material espesso ao redor das reas vazias. Material
polissacardico (P) encontrado entre as clulas, p. 23

FIGURA 4

Amostra contendo clulas rodeadas por reas vazias (V) e conexes

entre clulas pelo material polissacardico (P) dando forma ao
biofilme, p. 23

FIGURA 5

Desenvolvimento de um biofilme. (a) Colonizao primria de um

substrato; (b) crescimento, diviso celular e produo do
exopolissacardeo (EPS), com o desenvolvimento de microcolnias;
(c) coadeso de clulas individuais, de clulas coagregadas e
grupos de clulas idnticas, originando um biofilme jovem, de
mltiplas espcies; (d) maturao e formao de mosaicos clonais
no biofilme maduro, p. 24
Representao esquemtica das vrias etapas de desenvolvimento
de um biofilme de acordo com o modelo aceite para Pseudomonas
aeruginosa, p. 24
Estgios de formao e vida de um biofilme, determinados por
fatores fsicos, biolgicos e ambientais, p. 25
Etapas que uma nova espcie bacteriana realiza, durante sua
incorporao em um biofilme, p. 25

FIGURA 6

FIGURA 7
FIGURA 8
FIGURA 9

Estgios iniciais na formao de biofilmes de Gram negativos

(Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Vibrio cholerae), p. 26

FIGURA 10

Esquema do desenvolvimento temporal de uma placa dental, p. 26

FIGURA 11

Esquema de coagregaes envolvendo bactrias aquticas, p. 27

FIGURA 12

Processo de limpeza e sanitizao, p. 27

INTRODUO

Os estudos em Microbiologia baseiam-se essencialmente no conceito de

culturas puras, onde as clulas dos microrganismos so diludas e estudadas a partir
de meios de culturas geralmente seletivos. No entanto, na realidade, a maioria dos
microrganismos se encontra na natureza vivendo em comunidades, isto , clulas
individuais crescendo de maneira planctnica (livres, em suspenso), raramente so
encontradas na natureza. Na natureza, geralmente os microrganismos formam
comunidades mistas que se aderem s superfcies e interfaces e so envolvidas por
uma densa matriz exopolissacardica (EPS). Estas comunidades denominam-se
BIOFILMES, podendo ser formados por bactrias, fungos filamentosos, leveduras e
protozorios. Quando estes microrganismos crescem de forma isolada ou em
suspenso so denominados de planctnicos.
O processo de higienizao uma das aes mais importantes para a
obteno da segurana alimentar nas indstrias de alimentos, alm de no poder
interferir nas propriedades nutricionais e sensoriais dos alimentos e garantir a
preservao de pureza e caractersticas microbiolgicas desses alimentos. Falhas
no processo de higienizao permite a aderncia de resduos nos equipamentos e
superfcies, permitindo a adeso de microrganismos s superfcies destes
equipamentos, formando biofilmes, sendo um potencial fonte de contaminao na
indstria dos alimentos.
Alm da importncia dos biofilmes na indstria dos alimentos, devido
corroso e obstruo de tubulaes e contaminao de produtos alimentares, em
medicina humana e veterinria, os biofilmes podem ser formados em dispositivos
mdicos implantados nos pacientes (catteres, sondas, implantes, etc.), podendo
ser a causa de infeces nosocomiais.
Considerando que os biofilmes tem implicao na medicina, no meio
ambiente e na indstria, o conhecimento de sua formao e fisiologia necessrio
para o conhecimento de estratgias que possam controlar os seus efeitos nocivos.

COMUNIDADES BACTERIANAS

Os procariotos podem habitar qualquer ambiente adequado s formas de

vida superiores, assim como vrios ambientes inspitos maioria das formas de

vida. Tal fato decorrente de sua inigualvel diversidade metablica e plasticidade

fenotpica. Um dos importantes aspectos associados a esta ubiquidade est
relacionado capacidade destes organismos migrarem para diferentes nichos, onde
podem se propagar. As comunidades bacterianas (FIGURA 1) tm importantes
papis na natureza, seja na produo e degradao de matria orgnica, na
degradao de poluentes, ou na reciclagem de nitrognio, enxofre e vrios metais. A
maioria destes processos requer o esforo coletivo de organismos com diferentes
capacidades metablicas. Assim, os biofilmes participam metabolizando esgotos e
guas contaminadas com petrleo, na nitrificao, na reciclagem de enxofre oriundo
de drenados cidos de minas (pH 0) e em vrios outros processos, que revelam que
nos biofilmes podem ser criadas condies de anaerobiose, em ambientes
normalmente aerbios (KYAW, 2009; DAVEY; OTOOLE, 2000).

BIOFILMES

Um biofilme uma assemblia de clulas microbianas de superfcie que est

envolvida em uma matriz extracelular polimrica. Van Leeuwenhoek (sculo XVII),
considerado o Pai da Microbiologia, usando seu microscpio ptico simples, foi o
primeiro a observar microrganismos em superfcies de dentes e pode ser creditado
como o descobridor dos biofilmes microbianos (DONLAN, 2002).
No meio natural no existem bactrias com clulas isoladas, estas crescem
e sobrevivem em comunidades organizadas. Estas podem formar flculos em
suspenso,

pelculas

em

superfcies

lquidas,

ou

emaranhados,

mas

as

comunidades microbianas que se desenvolvem em superfcies tais como slidolquido ou ar-lquido, so denominadas de biofilmes (JENKINSON; LAPPIN-SCOTT,
2001). Davies et al (1998), descrevem que bactrias na natureza frequentemente
existem como comunidades ssseis chamadas de biofilmes. Estas comunidades
desenvolvem estruturas que so morfologicamente e fisiologicamente diferentes das
bactrias livres.
Rossi e Porto (2009) descrevem que na natureza, os microrganismos podem
ser encontrados em duas formas: no estado planctnico, ou seja, livres, ou em
biofilmes. Os

biofilmes podem ser

definidos como uma comunidade de

microrganismos aderidos a uma superfcie, produzindo polmeros extracelulares

que formam uma matriz que envolve as clulas e interagindo uns com os outros.

Um biofilme consiste no crescimento de bactrias, fungos e/ou protozorios

de modo isolado ou em combinao, ligados por uma matriz extracelular, a qual
presa a slidos ou superfcies slidas. Exemplos comuns incluem a superfcie limosa
de pedras ou pedaos de madeira em leitos de gua corrente, placas dentais e a
camada de limo em carne estragada. Os biofilmes so formados sobre superfcies,
uma vez que h maiores quantidades de nutrientes nestes locais, em comparao
com lquidos (JAY, 2005).
Casalini et al (2008), definem que o biofilme microbiano uma associao
de clulas bacterianas e/ou fungos, fixada s superfcies, biticas ou abiticas,
inclusas em uma complexa matriz extracelular de substncias polimricas,
juntamente com os nutrientes capturados para a formao da matriz. Os biofilmes
so

constitudos

por

microrganismos,

material

polimrico

extracelular

(polissacardeos, protenas, lipdeos) e resduos do ambiente colonizado, agregados

e embebidos em uma matriz polimrica (FIGURAS 2, 3 e 4), aderidos a uma
superfcie slida formando uma estrutura porosa e altamente hidratada, devido a
presena de exopolissacardeos (EPS) e pequenos canais abertos por entre as
microcolnias.
Segundo Oliveira et al (2006), os biofilmes so complexos ecossistemas
microbiolgicos, embebidos em uma matriz de polmeros orgnicos, aderidos a uma
superfcie. A matriz de polmeros extracelulares (exopolissacardeos) expe-se
exteriormente membrana das clulas Gram positivas, sendo sintetizadas por
polimerases, constituindo-se em uma estrutura complexa bem hidratada.
Os biofilmes contm partculas de protenas, lipdeos, fosfolipdeos,
carboidratos, sais minerais e vitaminas, entre outros, que formam uma espcie de
crosta, debaixo da qual, os microrganismos continuam a crescer, formando um
cultivo puro ou uma associao com outros microrganismos. No biofilme os
microrganismos esto mais resistentes ao de agentes qumicos e fsicos, como
aqueles usados no procedimento de higienizao (MACDO, 2000).
Na natureza e nos alimentos, os microrganismos aderem-se s superfcies e
crescem como uma comunidade, resultando no biofilme ou, de modo menos atrativo,
de camada viscosa ou limosa. Quando os biofilmes so prejudiciais, pode-se utilizar
o termo biofouling ou fouling (FORSYTHE, 2002).

FORMAO DO BIOFILME

Os biofilmes podem ser formados por diversos tipos de microrganismos,

deteriorantes ou patognicos, dependendo do tipo de produto processado, e em
diferentes tipos de superfcies, como ao inoxidvel e borracha, materiais
comumente utilizados em equipamentos industriais (ROSSI; PORTO, 2009).
As falhas nos procedimentos de higienizao permitem que os resduos
aderidos aos equipamentos e superfcies transformam-se em potencial fonte de
contaminao. Sob determinadas condies, os microrganismos se aderem,
interagem com as superfcies e iniciam crescimento celular. Essa multiplicao d
origem a colnias e quando a massa celular suficiente para agregar nutrientes,
resduos e outros microrganismos, est formado o biofilme (MACDO, 2000;
ZOTTOLA, 1994).
KYAW (2009), descreve que a formao de biofilmes esteja associada, por
exemplo, proteo contra o ambiente, ou seja, bactrias em um biofilme
encontram-se abrigadas e em relativa homeostase, graas presena da matriz
exopolissacardica (EPS). A matriz contm vrios componentes: exopolissacardeo,
protenas, cidos nuclicos, entre outros. O exopolissacardeo secretado para o
meio externo, sendo de diferentes composies. Ao que parece, o EPS tem
diferentes estruturas e funes, dependendo das comunidades e/ou condies
ambientais. Este polmero pode impedir fisicamente a penetrao de agentes
antimicrobianos no biofilme, principalmente aqueles hidroflicos e carregados
positivamente. Em alguns casos o EPS capaz de sequestrar ctions, metais e
toxinas. Por estas razes, os biofilmes podem corresponder a excelentes
mecanismos de transferncia de metais nos ecossistemas, pois vrios organismos
marinhos pastadores se alimentam de biofilmes. O EPS tambm pode ter papel de
proteo contra radiaes ultravioletas (UV), alteraes de pH, choques osmticos e
dessecao.
Existem vrias teorias propostas para a formao de biofilmes, segundo
Marshal et al (1971), a adeso um processo que ocorre em duas fases, na
primeira fase, o processo ainda reversvel, em funo do processo de adeso do
microrganismo na superfcie ocorrer por foras de Van de Walls e atrao
eletrosttica. Na segunda etapa, ocorre a interao fsica da clula com a superfcie
por meio de material extracelular de natureza polissacardica ou protica, produzida
pela bactria, que denominada matriz de glicoclix, que suporta a formao de
biofilmes.

Outra teoria sugere a formao de biofilmes em cinco etapas: (1)

condicionamento da superfcie pela adsoro de material orgnico; (2) transportes
de clulas e nutrientes para o stio de aderncia; (3) inicia-se o processo de adeso
bacteriana, ainda reversvel, por atrao eletrosttica; (4) crescimento celular,
colonizao e adeso irreversvel; e (5) o biofilme apresenta alta atividade
metablica, ocorrendo liberao de clulas localizadas na periferia (CHARACKLIS1,
1984 apud MACDO, 2000; OLIVEIRA et al, 2006).
A teoria proposta por Notermans2 et al (1991 apud MACDO, 2000;
OLIVEIRA et al, 2006), indica a formao do biofilme em trs etapas: (1) fixao da
bactria; (2) consolidao da bactria na superfcie; (3) a colonizao e crescimento
da bactria. Na etapa de consolidao, ocorre a produo de material extracelular
que facilita a fixao dos microrganismos, nesta fase no se consegue retirar as
clulas fixadas por rinsagem.
Outros autores (RICKARD et al, 2003; GHIGO, 2003; JENKINSON; LAPPINSCOTT, 2001; WATNICK; KOLTER, 2000; DAVEY; OTOOLE, 2000), descrevem
semelhantes formas de desenvolvimento de biofilmes, como demonstrado nos
respectivos esquemas representados nas FIGURAS 5, 6, 7, 8 e 9.
J para Almeida (2008), a formao de biofilme envolve complicadas
interaes fsicas, qumicas e biolgicas obedecendo a seguinte dinmica:
aderncia; colonizao e crescimento. Em um biofilme multiespcies, aps o contato
aleatrio inicial, as bactrias aderem s superfcies biticas ou abiticas por meio de
foras hidrofbicas e inicas no especficas. Um mecanismo subsequente abrange
interaes estereoqumicas especficas que estabilizam as aderncias iniciais. Os
microrganismos

pioneiros

(colonizadores

primrios),

aderidos

inicialmente,

multiplicam-se e aderem-se a novas clulas bacterianas da mesma espcie

(coagregao homotpica) ou de espcies diferentes (coagregao heterotpica). Um
importante passo nessa fase a formao da matriz intercelular. Composta em
grande parte por polissacardeos extracelulares (PEC) a matriz caracteriza e
organiza o biofilme. O processo segue com a adeso dos colonizadores secundrios
e formao de microcolnias ssseis constitudas de 80 a 75% de PEC e 20 a 15%
de bactrias. Os espaos intercoloniais que consistem de uma regio menos densa
1

CHARACKLIS, W. G. Biofilm development: a process analysis. In: Microbial Adhesion and

Aggregation. Ed. K. C. Marshall, Sprieger Verlag, New York, 1984.
2
NOTERMANS, S.; DORNMANS, J. A. M. A.; MEAD, G. C. Contribution of surface attachament to the
establishment of microorganisms in food processing plants: a review. Biofouling. v. 5. 1991, p. 1-16.

da matriz e contendo canais de gua que se anastomosam por toda estrutura do

biofilme permitem o acesso dos fludos circulantes. Instala-se a comunidade clmax
(colonizadores tardios) que atinge um estgio de equilbrio onde h uma constante
adaptao dos microrganismos as alteraes ambientais, sugerindo que, as
variaes fsico-qumicas so detectadas pelas bactrias e a comunicao entre
elas feita por meio de sinais moleculares. Um mecanismo de comunicao
interbacteriana de extrema importncia na formao e desenvolvimento de um
biofilme o sensoriamento populacional (quorum sensing). Esse sistema de
sinalizao populacional dependente pode controlar a expresso de genes
responsveis pelo mecanismo de patogenicidade, competio e sobrevivncia das
bactrias.
Em determinados momentos, os biofilmes sofrem disperso, liberando
microrganismos que podem vir a colonizar novos ambientes. Os mecanismos
genticos associados disperso no so ainda bem conhecidos. Existem trs tipos
de processos de disperso: expansiva, quando parte das clulas de uma
microcolnia sofrem lise e outras retomam a motilidade, sendo ento liberadas da
estrutura. Outro tipo de disperso envolve a fragmentao do biofilme, onde pores
de matriz extracelular associadas a microrganismos so liberadas. Finalmente, o
terceiro tipo de disperso, denominada superficial, ocorre pelo crescimento do
prprio biofilme como um todo (KYAW, 2009).

FATORES DE CONTRIBUIO PARA A ADESO DO BIOFILME

A adeso do biofilme facilitada pela excreo microbiana de uma matriz de

exopolissacardeos (EPS), algumas vezes denominada de glicoclix. Nesse
microambiente so formadas microcolnias, bem como canais de gua entre e em
volta das mesmas. Tal sistema de irrigao que se localiza em volta das
microcolnias tem sido relacionado com um sistema circulatrio primitivo, no qual
nutrientes so trazidos para dentro, produtos txicos so carregados para fora e
comunicao entre outras microcolnias. As clulas microbianas suspensas em
lquidos, que no esto em biofilmes, apresentam-se em estado planctnico ou em
livre flutuao (HERNNDEZ; NOVALEZ, 2007; JAY, 2005).
Pasternak (2009) descreve que bactrias tm sistemas de comunicao
entre si, um dos quais chama-se quorum sensing, a capacidade de inferir-se a

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populao bacteriana maior ou menor no local onde ela est, e provavelmente as

primeiras bactrias que se fixam a uma superfcie emitem sinais qumicos que
juntam a elas outras bactrias da mesma espcie, ou nas microcolnias j
existentes ou em novas microcolnias. Muller e Echeverrigaray (2009) tambm
descrevem que entre o agregado celular existem pequenos canais onde possvel a
passagem de nutrientes para as camadas mais internas da matriz do biofilme e para
que ocorra a aderncia das clulas bacterianas a uma superfcie necessrio que a
concentrao bacteriana no local seja apropriada, fenmeno conhecido com
quorum sensing.
Segundo Kyaw (2009) e Rickard et al (2003), as interaes que permitem a
agregao de diferentes espcies, ou mesmo gneros microbianos em um biofilme
geralmente envolvem a participao de adesinas (molculas de adeso presentes
em fmbrias ou dispersadas ao longo da superfcie celular) (FIGURA 10), que
reconhecem receptores especficos na superfcie de outras clulas, ou em diversos
tipos de substratos. A FIGURA 11 esquematiza a formao de um biofilme aqutico,
revelando a complexidade tanto estrutural como temporal deste ecossistema. As
horas correspondem ao tempo mdio necessrio adeso dos diferentes
microrganismos, revelando a dinmica de formao e estruturao deste biofilme.

PRINCIPAIS MICRORGANISMOS ENVOLVIDOS

Dentre os microrganismos que podem participar de processos de adeso e

podem gerar problemas de sade pblica ou de ordem econmica encontram-se:
Pseudomonas

aeruginosa,

Pseudomonas

fragi,

Pseudomonas

fluorescens,

Micrococcus sp., e Enterococcus faecium. Como exemplos de patognicos podem

ser

citados:

Listeria

monocytogenes,

Yersinia

enterocolitica,

Salmonella

thyphimurium, Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus e Bacillus cereus.

Em encanamentos, na indstria de alimentos, tem ocorrido a predominncia do
gnero Arthrobacter em 20% das bactrias isoladas que cobriam as superfcies
destes encanamentos, onde podem ser observados outros gneros, tais como:
Flavobacterium; Bacillus; Moraxella; Acinetobacter; Achromobacter (OLIVEIRA et al,
2006; MACDO, 2000; CRIADO et al, 1994).
Hernndez e Novales (2007), descrevem que vrias so as bactrias
capazes de formar biofilme, tanto as Gram positivas como as Gram negativas,

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patgenas e no patgenas, sendo que as principais so: Pseudomonas

aeruginosa, P. fluorescens, Escherichia coli, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus,
S. epidermidis, Enterococcus spp. e Streptococcus mutans.

BIOFILMES NAS INDSTRIAS DE ALIMENTOS

Os biofilmes nas indstrias, em alguns casos, podem ser benficos. Como

exemplo, os existentes em biorreatores para a produo de fermentados. Bactrias
que produzem cido actico se agregam em fragmentos de madeira e convertem
diversos substratos em vinagre. Agregados microbianos tambm so usados em
tratamentos aerbios e anaerbios de efluentes domsticos e industriais. No
processo de tratamento de gua potvel, a remoo de nitrognio, carbono
biodegradvel e precursores de trihalometanos pode ser obtida por biofilmes
microbianos submersos (MACDO, 2000).
Casalini et al (2008), descrevem que o biofilme aderido superfcie de
equipamentos utilizados para o processamento de alimentos resulta em graves
problemas, uma vez que o biofilme microbiano tem o potencial de atuar como fonte
crnica de contaminao por patgenos, o que pode comprometer a qualidade do
alimento e representar graves riscos sade do consumidor. Alm disso, pode
ocasionar prejuzos financeiros indstria, em virtude da diminuio do prazo de
validade comercial dos produtos alimentcios. Dentre os benefcios proporcionados
pelos biofilmes, na indstria de alimentos, pode-se citar a produo de fermentados,
o tratamento de efluentes e de gua potvel, assim como a produo de
biopolmeros para usos diversos.
Bactrias encontradas em ambientes de processamento de alimentos
podem ser muito difcil para elimin-las. A adeso bacteriana e subsequente
sobrevivncia

envolve

interaes

entre

clula

bacteriana,

superfcie

microambiente ao redor das clulas (WONG, 1998).

Biofilmes em alimentos processados no so bem entendidos devido a
deficincia de observaes direta destes biofilmes nestes ambientes e deficincia de
pesquisas com modelos de sistemas que simulam o ambiente de processamento de
alimentos. Patgenos de surtos e microrganismos deteriorantes podem se aderir
para produzir EPS em superfcies ambientais e de alimentos, formando biofilmes.
Alm disso, bactrias patognicas podem coexistir dentro do biofilme com outros da

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microflora ambiental, tais como a Listeria monocytogenes que sobrevive em

biofilmes formados por Pseudomonas spp. (CHMIEIEWSKI; FRANK, 2003).
Wong (1998), descreve que a adeso de bactrias com subsequente
desenvolvimento de biofilmes em ambientes de alimentos processados uma
potencial fonte de contaminao que pode levar a deteriora do alimento e/ou
transmisso de doenas. As superfcies de equipamentos usadas por manipuladores
de alimentos, estocagem, ou processadores so reconhecidas como maiores fontes
de contaminao microbiana. Ainda em sistemas com higienizao adequada pode
permanecer

microrganismos

nas

superfcies

dos

equipamentos.

Estes

microrganismos podem sobreviver por longos perodos, dependendo da quantidade

e natureza do resduo slido, temperatura e umidade relativa.
A falta de mtodos eficientes para a identificao de espcies presentes em
biofilmes tem obrigado a indstria a gastar milhes de dlares em tratamentos que
nem sempre so efetivos. A adeso de bactrias em plantas de processamento de
alimentos ou em superfcies de contato dos produtos alimentcios, podem ser a
causa de srios problemas higinicos e/ou econmicos resultando em alteraes
sensoriais destes produtos (CRIADO et al, 1994).

BIOFILMES EM DISPOSITIVOS MDICOS

Biofilmes em dispositivos mdicos podem ser compostos de bactrias Gram

positivas ou Gram negativas ou leveduras. Bactrias geralmente isolados destes
dispositivos incluem as Gram positivas Enterococcus faecalis, Staphylococcus
aureus, S. epidermidis e Streptococcus viridans; e os Gram negativos Escherichia
coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis e Pseudomonas aeruginosa. Estes
microrganismos podem ser originados da pele de pacientes ou de profissionais da
sade, ou de outras fontes no ambiente. Biofilmes podem ser compostos por uma
espcie ou mltiplas espcies dependendo do dispositivo e sua durao de uso no
paciente (DONLAN, 2001).
A importncia para a medicina est na observao de que as bactrias
patognicas se aderem a dispositivos (prteses ortopdicas, vlvulas cardacas
artificiais, marcapassos, lentes de contato, enxertos plsticos e dispositivos
intravenosos temporrios ou permanentes). Uma vez aderidas, comeam a formar o
biofilme, que impedem a ao no s de fagcitos e anticorpos, alm de antibiticos

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indicados como tratamento. As bactrias dos biofilmes, quando cultivadas para

conhecer a antimicrobianoterapia adequada, mostram-se sensveis in vitro,
entretanto as grandes molculas dos antibiticos no conseguem atravessar a
estreita rede de glicoprotenas do biofilme para chegar ao seu stio de ao
(HERNNDEZ; NOVALES, 2007).
Nascimento e Taveira (2001), descrevem que normalmente as infeces
causadas por biofilmes microbianos caracterizam-se pela sua cronicidade, tornando
o diagnstico microbiolgico difcil, alm de elevada resistncia ao tratamento
antibitico. Os biofilmes formados no corpo humano adquirem geralmente, em
comparao com os biofilmes formados sobre superfcies sistemas inertes, uma
estrutura mais complexa, devido ao da fibronectina do hospedeiro, s hemcias
e a outros materiais que, em conjunto com os exopolissacardeos bacterianos
participam na formao do biofilme.
Biofilmes constitudos por microrganismos mistos formam-se em regies de
grande carga e diversidade microbiana e so responsveis, por exemplo, por
doenas da cavidade oral como a placa e crie dentrias. Podem tambm ocorrer
como consequncia da implantao de dispositivos mdicos em regies anatmicas
que possuam uma flora microbiana mista (NASCIMENTO; TAVEIRA, 2001).
Pasternak (2009), cita que as microcolnias dos biofilmes tm ecologia
diferente das formas planctnicas: elas proliferam mais devagar, prejudicando,
portanto, sua resposta a muitos antibiticos que agem essencialmente quando as
clulas se dividem; elas esto mais protegidas tanto dos antibiticos, que tm
dificuldade de acesso aos nichos onde elas esto, quanto da resposta do
hospedeiro, pois as clulas de defesa do hospedeiro, como os neutrfilos, tm maior
dificuldade de entrar nesta matriz para fagocit-las.
As infeces por biofilmes partilham de algumas caractersticas comuns, que
incluem: (1) desenvolvimento preferencial em superfcies inertes, tecidos mortos e
instrumentos mdicos; (2) crescimento lento; (3) liberao de antgenos que levam
produo de anticorpos especficos e formao de imunocomplexos que podem
provocar leses nos tecidos adjacentes; (4) serem agentes causais de infeces
graves em indivduos imunocomprometidos; (5) os antibiticos eliminam os sintomas
da infeco provocada pelos biofilmes mas no o prprio biofilme, levando ao
aparecimento

de

infeces

recorrentes,

tornando

necessrio

recorrer

procedimentos mecnicos para remover o biofilme; (6) as clulas bacterianas podem

14

separar-se da estrutura do biofilme em qualquer fase da infeco e estabelecer uma

nova infeco aguda (NASCIMENTO; TAVEIRA, 2001).
O problema de infeces relacionadas a dispositivos principalmente
catteres venosos, temporrios ou permanentes srio e implica riscos e altos
custos ateno dos pacientes com enfermidades graves ou crnico-degenerativas.
A maioria destas infeces so causadas por Satphylococcus epidermidis e outras
espcies de Staphylococcus coagulase negativa (SCN) e em menor frequncia por
S. aureus. Alm disso, apesar do isolamento do microrganismos causador e
conhecimento da melhor antimicrobianoterapia (sensibilidade in vitro), no se obtm
erradicao microbiolgica do biofilme. Obrigando a retirar o dispositivo, situao
essa que s vezes se torna impossvel em pacientes em estado crtico, com acessos
vasculares limitados e que dependem da infuso intravenosa para manter suas
condies hemodinmicas, ou em pacientes com dispositivos permanentes o qual
implica retardar o tratamento que recebem e aumentar os custos de ateno
(HERNNDEZ; NOVALES, 2007).

EPIDEMIOLOGIA

Bolton et al (1988), isolaram linhagens endmicas de Staphylococcus

aureus, de equipamentos utilizados no processamento de aves, oito vezes mais
resistentes ao cloro do que linhagens de S. aureus isoladas de pele saudvel. A
grande diferena fenotpica entre estas linhagens era a extensa matriz polimrica
associada ao equipamento.
Mafu et al (1990), descreveram que a bactria Listeria monocytogenes
formou biofilme em superfcies de ao inoxidvel, vidro, polipropileno e borracha
dentro de 20 minutos de contato.
Frank e Koffi (1990), observaram que clulas de Listeria monocytogenes no
aderidas foram eliminadas em 30 segundos de contato com o sanificante cloreto de
benzalcnio, j as clulas aderidas resistiram ao mesmo sanificante de 10 a 20
minutos.
Sasahara; Zottola (1993), estudaram formao de biofilme em vidro e ao
inoxidvel por Pseudomonas fragi crescendo com Listeria monocytogenes. Estes
resultados indicaram que quando crescem juntos, estes microrganismos formam um
biofilme mais complexo do que quando crescem de forma independente.

15

Wong (1998) cita que a Listeria monocytogenes pode sobreviver por

perodos longos em ao inoxidvel e borrachas e sob condies favorveis ainda se
multiplica no ao inoxidvel. Lactobacillus curvatus, ainda que em baixos nveis em
superfcies de equipamentos, pode potencialmente causar defeitos de qualidade na
produo de queijo.
Norwood e Gilmour (2000), verificaram reduo nas contagens bacterianas
com exposio a 1.000 mg de cloro livre por litro em biofilmes, enquanto que numa
cultura planctnica equivalente, 100% dos microrganismos foram destrudos quando
expostos a 10 mg de cloro livre por litro por 30 segundos.
Forsythe (2002), afirma que o alimento pode ser contaminado com bactrias
degradadoras e patognicas provenientes dos biofilmes. Dessa maneira, a formao
de biofilme conduz a srios problemas de higiene e perdas econmicas devido
deteriorao do alimento e persistncia de patgenos.
Leal et al (2008), observaram que produtos crneos oferecidos ao consumo
humano podem veicular linhagens de Salmonella capazes de desencadear a
formao de biofilmes.
Manijeh et al (2008), demonstraram, em experimentos, que a densidade
celular de biofilme artificial, aps 2 horas, em vidro, ao e polietileno foi de 1,75x104;
1,94x103 e 8,33x103 UFC/cm2, respectivamente. Aps 20 horas da adeso a
densidade celular do biofilme em vidro, ao e polietileno foi de 1,68x107; 1,47x106 e
2,07x107 UFC/cm2, respectivamente.

MTODOS DE AVALIAO

Segundo Macdo (2000), os mtodos podem ser divididos em dois grupos,

os mtodos visuais e os mtodos no visuais. Como mtodos visuais, a microscopia
de contraste; de epifluorescncia (EPF); microscopia eletrnica de varredura (MEV)
e de transmisso (MET). Os mtodos no visuais aplicados avaliao de
aderncia bacteriana e formao de biofilmes so as medidas da impedncia e de
bioluminescncia.
Guilbaud et al (2005), descrevem que a tcnica da Reao em Cadeia da
Polimerase (PCR) em tempo real pode ser usada para avaliar populaes
microbianas em biofilmes, sendo mais sensvel que os mtodos convencionais de
microbiologia.

16

PADRES MICROBIOLGICOS

Para Andrade et al (1998), considera-se a presena de um biofilme quando

se tem um nmero mnimo de 107 clulas aderidas por cm2 enquanto outros
(WIRTANEM et al, 1996), consideram biofilme um nmero de clulas aderidas de
103 a 105 por cm2. Parizi3 (1998 apud OLIVEIRA et al, 2006; MACDO, 2000),
considera biofilme quando o nmero de clulas aderidas oscila entre 106 a 107
clulas por cm2.

REMOO DO BIOFILME E PREVENO

Os biofilmes constituem uma barreira fsica, protegendo as bactrias de

detergentes e sanitizantes. A resistncia intensificada das clulas no interior dos
biofilmes tambm atribuda a fatores como baixa taxa de crescimento das
bactrias e neutralizao de sanitizantes pela matriz polimtrica, j que a mesma
constituda por matria orgnica. Aquisio de resistncia bacteriana pela exposio
das clulas a concentraes subletais de sanitizantes no interior do biofilme tambm
pode ocorrer. Dessa forma, as bactrias em biofilmes podem permanecer aderidas e
sobreviver por longos perodos mesmo aps procedimentos de higienizao,
representando uma fonte de contaminao para os alimentos, comprometendo a
qualidade e segurana do produto final. Alm disso, a resistncia das populaes
bacterianas em biofilmes a antibiticos e biocidas pode ser de 100 a 1.000 vezes
maior do que a resistncia de populaes equivalentes de bactrias planctnicas
(ROSSI; PORTO, 2009; MAH; OTOOLE, 2001).
Zottola (1994) descreve que os detergentes so usados para remover
resduos slidos, enquanto que os santitizantes so usados para matar clulas
vegetativas e alguns esporos. Dependendo do tipo e concentrao do sanitizante
estas podem permanecer depois do tratamento com um detergente. Estas
observaes e princpios devem ser mantidos em mente quando estuda-se
inativao de biofilmes em processamentos de alimentos. Um biofilme microbiano
coberto com depsito slido composto de gorduras, carboidratos, protenas e

PARIZZI, S. Q. F. Adeso bacteriana em superfcie de servios de alimentao hospitalar avaliada

pela microscopia de epifluorescncia. Viosa-MG: UFV, 1998, 57 f. Dissertao (Mestrado em
Cincia e Tecnologia de Alimentos). Universidade Federal de Viosa, 1998.

17

minerais. Quando tratados com somente um sanitizante, este inativado pelo

depsito slido e incapaz de alcanar e destruir os microrganismos. Quando a
cobertura do biofilme tratada primeiro com um detergente, esta solubilizada.
Logo depois o biofilme rinsado, tornando o sanitizador mais eficaz matando os
microrganismos expostos (FIGURA 9).
No controle para prevenir a formao de biofilme em equipamentos e
superfcies na indstria de alimentos tem sido recomendada a sanitizao adequada
e eficiente. Quando constatada a presena de biofilmes, a remoo pelo uso do iodo
e glutaraldedo considerada a indicao mais eficiente (NOTERMANS4 et al, 1991
apud OLIVEIRA et al, 2006).
O processamento moderno auxilia e seleciona a formao de biofilmes
bacterianos em superfcies de contato com alimentos, devido produo em massa
com vastas superfcies para formao de biofilmes e prolongados ciclos de produo
sem higienizao intermediria. Geralmente os sanitizantes so desenvolvidos com
base em pesquisas que utilizam bactrias planctnicas (livres). Os testes
convencionais que avaliam a eficcia dos sanitizantes so realizados com a
utilizao de bactrias em suspenso e os resultados podem ser pouco aplicados na
prtica, onde h a predominncia de microrganismos em biofilmes. Portanto, a
concentrao de produto ou tempo de contato utilizados durante procedimentos de
higienizao elaborados com base nestas pesquisas podem no ser suficientes para
inativar as clulas em biofilmes. Alm disso, os procedimentos de limpeza efetivos
para a remoo de resduos de alimentos no so necessariamente eficazes na
remoo de biofilmes, em funo das propriedades qumicas dos polmeros da
matriz, que diferem das propriedades das gorduras e protenas alvos do processo de
limpeza (ROSSI; PORTO, 2009).

CONSIDERAES FINAIS

Microrganismos em biofilmes so grandes responsveis por causarem

problemas nas indstrias de alimento, principalmente devido a contaminao dos
produtos alimentcios processados.

Op cit.

18

A adeso de um dado patgeno em superfcies pode ser auxiliada pela

formao de um biofilme de cultura mista.
Microrganismos em biofilmes podem exibir reaes fisiolgicas diferentes
das encontradas naqueles que se apresentam na forma planctnica, e o biofilme
pode conter clulas em estado vivel no cultivvel (VNC).
Em geral, microrganismos em biofilmes so mais dificilmente destrudos por
agentes letais, uma vez que esto protegidos pela matriz do biofilme.
Microrganismos em biofilmes so consideravelmente mais resistentes
remoo por agentes comumente utilizados para limpeza e sanificao.

REFERNCIAS
ALMEIDA, D. Dinmica de formao do biofilme. Congresso Brasileiro de Corroso,
28. International Corrosion Meeting, 2. Anais... Recife-PE. 12 a 16 de maio de
2008.
ANDRADE, N. J.; BRIDGEMAN, J. A.; ZOTTOLA, E. A. Bacteriocidal activity of
sanitizers against Enterococcus faecium attached to stainless steel as determined by
plate count and impedance methods. Journal of Food Protection. v. 61, n. 7. 1998, p.
833-838.
BOLTON, K. J.; DADD, C. E. R.; MEAD, G. C,; WAITES, W. M. Chlorine resistance
of strains of Staphylococcus aureus isolated from poultry processing plnts. Letters in
Applied Microbiology. v. 6, n. 2. 1988, p. 31-34.
CASALINI, J.; FERRI, V. C.; MENDONA, C. R. B. Biofilmes microbianos na
indstria de alimentos. XVII Congresso de Iniciao Cientfica. X Encontro de PsGraduao. UFPEL. 11 a 14 de novembro de 2008. [online]. Disponvel em:
<http://www.ufpel.edu.br/cic/2008/cd/pages/pdf/CA/CA_01414.pdf> Acessado em: 30
de maio de 2009.
CHMIEIEWSKI, R. A. N.; FRANK, J. F. Biofilm formation and control in food
processing facilities. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. v.
2. 2003, p. 22-32.
CRIADO, M. T.; SURES, B; FERREIRS, C. M. The importance of bacterial
adhesion in the dairy industry. Food Technology. v. 48, n. 2. 1994, p. 123-126.
DAVEY, M. E.; OTOOLE, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular
genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. v. 64, n. 4. 2000, p. 847-867.
DAVIES, D. G.; PARSEK, M. R.; PEARSON, J. P.; IGLEWSKI, B. H.; COSTERTON,
J. W.; GREENBERG, E. P. The involvement of cell-to-cell signals in the development
of a bacterial biofilm. Science. v. 280. 1998, p. 295-298.

19

DONLAN, R. M. Biofilms and device-associated infections. Emerging Infectious

Diseases. v. 7, n. 2. 2001, p. 277-281.
_______. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. v. 8, n.
9. 2002, p. 881-890.
FORSYTHE, S. J. Microbiologia da Segurana Alimentar. Porto Alegre: Artmed.
2002, 424 p.
FRANK, J. F.; KOFFI, R. A.; Surface-adherent growth of Listeria monocytogenes in
associated with increased resistance to sanitizers and heat. Journal of Food
Protection. v. 37, n. 7. 1990, p. 550-554.
GHIGO, J. M. Are there biofilm-specific physiological pathways beyond a reasonable
doubt? Research in Microbiology. v. 154, n. 1. 2003, p. 1-8.
GUILBAUD, M.; COPPET, P.; BOURION, F.; RACHMAN, C.; PRVOST, H.;
DOUSSET, X. Quantitative detection of Listeria monocytogenes in biofilms by realtime PCR. Applied and Environmental Microbiology. v. 71, n. 4. 2005, p. 2190-2194.
HERNNDEZ, J. B. B. D.; NOVALES, G. M. Biofilm: amenaza latente o factor de
proteccin? Estado del arte. Enfermedades Infecciosas y Microbiologa. v. 27, n. 1.
2007, p. 22-28.
JAY, J. M. Microbiologia de Alimentos. 6. ed. Porto Alegre: Artmed. 2005, 711 p.
JENKINSON, H. F.; LAPPIN-SCOTT, H. M. Biofilms adhere to stay. Trends in
Microbiology. v. 9, n. 1. 2001, p. 9-10.
JONES, H. C.; ROTH, I. L.; SANDERS III, W. M. Electron microscopic study of a
slime layer. Journal of Bacteriology. v. 99, n. 1. 1969, p. 316-325.
KYAW, C. M. Biofilmes microbianos. Universidade de Braslia (UnB). [online].
Disponvel
em:
<http://www.unb.br/ib/cel/microbiologia/biofilme/biofilme.html>
Acessado em: 30 de maio de 2009.
LEAL, M. C. G. M.; DIAS, P. A.; ZONTA, M. N.; TIMM, C. D. Produo de biofilme
por Salmonella isoladas de produtos de frango, suno e bovino. 2008. [online].
Disponvel
em:
<http://www.sovergs.com.br/conbravet2008/anais/cd/resumos/
R0207-1.pdf> Acessado em: 30 de maio de 2009.
MACDO, J. A. B. Biofilmes bacterianos, uma preocupao da indstria
farmacutica. Revista Frmaco & Medicamentos. v. 2, n. 7. 2000, p. 19-24.
MAFU, A. A.; ROY, D.; GOULET, J.; MAGNY, P. Attachment of Listeria
monocytogenes to stainless steel, glass, polypropylene and rubber surfaces after
short contact time. Journal of Food Protection. v. 53. 1990, p. 742-746.
MAH, T.; OTOOLE, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.
Trends in Microbiology. v. 9, n. 1. 2001, p. 34-39.

20

MANIJEH, M.; MOHAMMAD, J.; ROHA, K. K. Biofilm formation by Salmonella

enteritidis on food contact surfaces. Journal of Biological Sciences. v. 8, n. 2. 2008,
p. 502-505.
MARSHALL, K. C.; STOUT, R.; MITCHELL, R. Mechanism of initial events in the
sorption of marine bacteria to surfaces. Journal General Microbiology. v. 68. 1971, p.
337-348.
MULLER, G.; ECHEVERRIGARAY, S. Formao de biofilmes por isolados de
Staphylococcus epidermidis. Instituto de Biotecnologia (UCS). 2004 [online].
Disponvel
em:
<http://perseu.ucs.br:8080/ucs/tplJovensPesquisadores2004/
pesquisa/jovenspesquisadores2004/trabalhos_pdf/vida/gabrielamuller.pdf>
Acessado em: 30 de maio de 2009.
NASCIMENTO, T.; TAVEIRA, N. Os biofilmes microbianos como agentes causais de
doenas
humanas.
Biologias.
2001.
[online].
Disponvel
em:
<http://www.ordembiologos/Biologias/N4.html> Acessado em: 30 de maio de 2009.
NORWOOD, D. E.; GILMOUR, A. The growth and resistance to sodium hypochlorite
of Listeria monocytogenes in a steady-state. Journal of Applied Microbiology. v. 88,
n. 3. 2000, p. 512-520.
OLIVEIRA, L. A. T.; FRANCO, R. M.; CARVALHO, J. C. A. P.; ALMEIDA FILHO, E.
S.; GONALVES, P. M. R. Biofilme na indstria de alimentos. Reviso. Higiene
Alimentar. v. 20, n. 141. 2006, p. 33-35.
PASTERNAK, J. Biofilmes: um inimigo (in)visvel. Sociedade Brasileira de Controle
de Contaminao. Maro/Abril. 2009, p. 36-38.
RICKARD, A. H.; GILBERT, P.; HIGH, N. J.; KOLENBRANDER, P. E.; HANDLEY, P.
S. Bacterial coaggregation: a integral process in the development of multi-species
biofilms. Trends in Microbiology. v. 11, n. 2. 2003, p. 94-100.
ROSSI, A. C. R.; PORTO, E. A importncia da elaborao de procedimentos de
higienizao considerando a presena de biofilmes. Sociedade Brasileira de
Controle de Contaminao. Maro/Abril. 2009, p. 40-41.
SASAHARA, K. C.; ZOTTOLA, E. A. Biofilm formation by Listeria monocytogenes
utilizes a primary colonizing microorganism in flowing systems. Journal of Food
Protection. v. 56, n. 12. 1993, p. 1022-1028.
WATNICK, P.; KOLTER, R. Biofilm, city of microbes. Journal of Bacteriology. v. 182,
n. 10. 2000, p. 2.675-2.679.
WIRTANEM, G.; HUSMARK, U.; MATTILA-SANDHOL, M. T. Microbial evaluation of
the biotransfer potential from surfaces with Bacillus biofilms after rinsing and cleaning
procedures in closed food-processing systems. Journal of Food Protection. v. 59, n.
7. 1996, p. 727-733.
WONG, A. C. L. Biofilms in food processing environments. Journal Dairy Sciences. v.
81. 1998, p. 2765-2770.

21

ZOTTOLA, E. A. Microbial attachment and biofilm formation: a new problem for the
food industry? Food Technology. v. 48, n. 7. 1994, p. 107-114.

22

ANEXOS

FIGURA 1 Exemplo da ecologia de comunidades microbianas. As quatro microcolnias centrais

correspondem a organismos que geram e consomem hidrognio. Os fermentadores
utilizam acares e produzem cidos orgnicos, utilizados pelos produtores de
hidrognio. Alm das interaes metablicas, a comunicao intra e intercelular
pode ser mediada por molculas sinalizadoras.

Fonte: KYAW, 2009; DAVEY; OTOOLE, 2000.

FIGURA 2 Vista de cultura de 9 dias mostrando material compacto ao redor dos

microrganismos (M). Notar reas vazias ao redor da maioria das clulas e
espesso depsito de polissacardeo (P).

Fonte: JONES et al, 1969.

23

FIGURA 3 Micrografia eletrnica de estgio de produo de biofilme (9 dias)

caracterizado por reas vazias (V) imediatamente ao redor das clulas,
com material espesso ao redor das reas vazias. Material polissacardico
(P) encontrado entre as clulas.

Fonte: JONES et al, 1969.

FIGURA 4 Amostra contendo clulas rodeadas por reas vazias (V) e conexes entre
clulas pelo material polissacardico (P) dando forma ao biofilme.

Fonte: JONES et al, 1969.

24

FIGURA 5 Desenvolvimento de um biofilme. (a) Colonizao primria de um substrato; (b)

crescimento, diviso celular e produo do exopolissacardeo (EPS), com o
desenvolvimento de microcolnias; (c) coadeso de clulas individuais, de clulas
coagregadas e grupos de clulas idnticas, originando um biofilme jovem, de
mltiplas espcies; (d) maturao e formao de mosaicos clonais no biofilme
maduro.

Fonte: KYAW, 2009; RICKARD et al, 2003.

FIGURA 6 Representao esquemtica das vrias etapas de desenvolvimento de um biofilme

de acordo com o modelo aceite para Pseudomonas aeruginosa.

Fonte: GHIGO, 2003.

25

FIGURA 7 Estgios de formao e vida de um biofilme, determinados por fatores fsicos,

biolgicos e ambientais.

Fonte: KYAW, 2009; JENKINSON; LAPPIN-SCOTT, 2001.

FIGURA 8 Etapas que uma nova espcie bacteriana

realiza, durante sua incorporao em um
biofilme

Fonte: KYAW, 2009; WATMICK; KOLTER, 2000.

26

FIGURA 9 Estgios iniciais na formao de biofilmes de Gram negativos (Pseudomonas

aeruginosa, Escherichia coli e Vibrio cholerae).

Fonte: KYAW, 2009; DAVEY; OTOOLE, 2000.

FIGURA 10 Esquema do desenvolvimento temporal de uma placa dental.

Fonte: KYAW (2009); RICKARD et al (2003).

27

FIGURA 11 Esquema de coagregaes envolvendo bactrias aquticas.

Fonte: KYAW (2009); RICKARD et al (2003).

FIGURA 12 Processo de limpeza e sanitizao.

Fonte: ZOTTOLA, 1994.