Tese 2004 Julio C Carvalho PDF

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JLIO CESAR DE CARVALHO
DESENVOLVIMENTO DE BIOPROCESSO PARA A PRODUO DE PIGMENTOS

A PARTIR DE MONASCUS POR FERMENTAO EM SUBSTRATO SLIDO
Tese apresentada ao Curso de PsGraduao em Processos Biotecnolgicos,
Setor de Tecnologia, Universidade Federal
do Paran, como requisito parcial obteno
do grau de Doutor em Processos
Biotecnolgicos.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol
CURITIBA
2004
JLIO CESAR DE CARVALHO
DESENVOLVIMENTO DE BIOPROCESSO PARA A PRODUO DE PIGMENTOS

A PARTIR DE MONASCUS POR FERMENTAO EM SUBSTRATO SLIDO
Orientador:
Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol

Departamento de Engenharia Qumica Setor de Tecnologia, UFPR
Examinadores:
Prof. Dr. Adriane Bianchi Pedroni Medeiros Departamento de Engenharia Qumica UFPR
Prof. Dr. Agenor Furigo Jr. Departamento de Engenharia Qumica e Alimentos UFSC
Prof. Dr. Jorge Alberto Vieira Costa Departamento de Qumica FURG
Prof. Dr. Jose Angel Rodriguez-Len ICIDCA Cuba / Prof. Visitante UFPR
CURITIBA
2004
ii
Termo de Aprovao
iii
AGRADECIMENTOS
Posso me congratular por ter recebido o apoio de muitas pessoas, amigos,
colegas e mestres, que me ajudaram e que so em parte responsveis pelo bom
termo a que chegou este trabalho. Depois de pouco mais de uma dcada, o LPB
conta com uma equipe coesa, onde a regra tem sido a solidariedade no trabalho. A
todos agradeo, e mesmo correndo o risco da omisso de nomes, agradeo
especialmente:
Ao Prof. Soccol, meu orientador neste trabalho, e com cuja orientao para a
carreira acadmica pude contar desde o final da graduao;
profa. Adriane, pela reviso inicial, dando contribuies importantes, e pela
participao nas bancas de avaliao, e aos profs. Jos Angel, que ajudou de forma
entusiasmada na discusso da anlise respiromtrica e nas bancas de avaliao, e
Jean, pelas idias para anlise cromatogrfica;
Ao professor Agenor, amigo e ex-orientador, e ao prof Jorge; ambos se
prontificaram em prazo exguo a contribuir na avaliao deste trabalho;
s professoras Adenise e Luciana, pelo apoio e confiana no dia a dia da
UFPR;
Aos colegas Dbora, pela ajuda com o equipamento de respirometria, e
Radjis, pela ajuda com anlises cromatogrficas, partes crticas do trabalho de
laboratrio;
Aos funcionrios Cludio, Rosane e Cleusa, da PUC-PR, sempre solcitos e
competentes, e Mitiyo, da UFPR, pela inestimvel ajuda, pronta e eficiente, em
todas as etapas prticas do trabalho;
Aos estagirios Carolina e Susan, que trabalharam com disposio nas
etapas iniciais deste projeto, e sobretudo ao Bruno, cuja ajuda, disposio e bom
humor foram vitais para as etapas finais;
E por ltimo, porque em destaque, agradeo minha famlia meus pais
Snia e Csar, e meus irmos Marco, Dayse e Lucrcia pelo apoio em todas as
fases de minha formao, e agradeo minha namorada Llian que muito mais do
que revisar o texto, toda a pacincia, amor e disposio de que eu precisava para
escrever este trabalho.
iv
SUMRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E smbolos ...............................................................viii
RESUMO....................................................................................................................ix
ABSTRACT.................................................................................................................x
1 Introduo.............................................................................................................1
2 Reviso de Literatura ............................................................................................3
2.1 Pigmentos viso geral ............................................................................3
2.1.1 Terminologia...................................................................................................................3
2.1.2 Histrico..........................................................................................................................3
2.1.3 Por que usar corantes em alimentos? ...........................................................................4
2.1.4 Cor e estrutura................................................................................................................5
2.1.5 Pigmentos naturais versus artificiais ..............................................................................7
2.1.6 Pigmentos microbianos ................................................................................................10
2.1.7 Mercado de pigmentos.................................................................................................10
2.2 Pigmentos de Monascus .........................................................................12

2.3 O microorganismo ...................................................................................15
2.3.1 Ocorrncia ....................................................................................................................15
2.3.2 Linhagens usadas para a produo de pigmentos ......................................................15
2.3.3 Morfologia.....................................................................................................................16
2.3.4 Cepas utilizadas ...........................................................................................................17
2.4 Crescimento e produo de metablitos ...............................................18

2.4.1 Condies fsicas de cultivo: ........................................................................................19
2.4.2 Fermentao em meio slido/submerso ......................................................................20
2.4.3 Teor de umidade em meios slidos .............................................................................21
2.4.4 Composio do meio de cultivo ...................................................................................21
2.4.5 Outros fatores nutricionais ...........................................................................................23
2.5 Mtodos de fermentao .........................................................................24

2.6 Toxicidade dos pigmentos e produo de citrinina..............................25
2.6.1 Citrinina propriedades e anlise................................................................................26
2.7 Mtodos de anlise de pigmentos ..........................................................28

2.8 Uso e estabilidade de pigmentos de Monascus ....................................30
2.9 Mtodo de anlise de biomassa .............................................................30

3 Material e Mtodos .............................................................................................33
3.1 Cepas e Manuteno................................................................................33
3.2 Preparao de inculos...........................................................................33
3.2.1 Inculos em meio lquido..............................................................................................33
3.2.2 Suspenses de esporos...............................................................................................34
3.3 Comparao de cepas .............................................................................34

3.3.1 Determinao de crescimento radial............................................................................34
3.3.2 Comparao de cepas quanto produo de pigmentos ...........................................35
3.4 Comparao de mtodos de extrao....................................................35

3.4.1 Extraes esttica, agitada, com Soxhlet, com diferentes solventes ..........................35
3.5 Substratos utilizados ...............................................................................35

3.5.1 FSS em arroz, em coluna, frasco ou bandeja..............................................................35
3.5.2 FSS em bagao de mandioca, em coluna, frasco ou bandeja ....................................36
3.5.3 FSS de diferentes substratos potenciais, em frascos ..................................................36
3.6 Otimizao das condies de cultivo em bagao de mandioca ..........36

3.7 Ensaios de estabilidade de pigmentos ..................................................37
3.7.1 Isolamento da biomassa ..............................................................................................37
3.7.2 Preparao de extratos ................................................................................................37
3.7.3 Solues de pigmentos ................................................................................................37
3.7.4 Anlises de estabilidade...............................................................................................38
3.8 Extrao de pigmentos e anlise da absorbncia.................................38

3.8.1 Extrao de pigmentos na comparao de substratos ................................................40
3.9 Extrao e anlise da citrinina................................................................40

3.9.1 Extrao .......................................................................................................................40
3.9.2 Cromatografia preparativa de citrinina .........................................................................40
3.9.3 Anlise de citrinina .......................................................................................................41
3.10 Anlise de biomassa em FSS................................................................41

3.10.1 Preparo de padro de biomassa ................................................................................41
3.10.2 Extrao da biomassa................................................................................................41
3.10.3 Extrao do ergosterol ...............................................................................................41
3.10.4 Anlise do ergosterol..................................................................................................42
3.11 Anlise respiromtrica...........................................................................42
vi
3.11.1 Respirometria em colunas..........................................................................................42

3.11.2 Respirometria em reator.............................................................................................43
3.12 Clculos - Regresso, ajuste de curvas e parmetros cinticos .......43

4 Resultados e discusso.....................................................................................43
4.1 Isolamento e caracterizao do microorganismo. ................................44
4.2 Comparao de cepas. ............................................................................45
4.3 Otimizao das condies de extrao de pigmentos .........................48
4.3.1 Extraes estticas ou agitadas...................................................................................48
4.3.2 Extrao usando diferentes solventes .........................................................................48
4.3.3 Quantidade de solvente ...............................................................................................51
4.3.4 Eficincia na extrao ..................................................................................................52
4.4 Comparao de diferentes substratos ...................................................53

4.5 Ensaios utilizando bagao de mandioca como substrato....................55
4.5.1 Teor de umidade na FSS de bagao de mandioca .....................................................55
4.5.2 Cintica de produo de pigmentos em bagao de mandioca ....................................56
4.5.3 Otimizao das condies de cultivo em bagao de mandioca. .................................57
4.6 Desenvolvimento do mtodo de anlise de biomassa via ergosterol .62

4.7 Determinao da aerao adequada, em coluna de Raimbault ...........63
4.8 Anlise respiromtrica em colunas ........................................................64
4.8.1 Fases da fermentao:.................................................................................................67
4.8.2 Determinao dos parmetros da fermentao usando o programa FERSOL...........68
4.9 Correlao biomassa-pigmento..............................................................69

4.10 Cintica de fermentao em reator do tipo tambor horizontal ..........70
4.11 Comparao da produo em frascos, colunas, bandeja e reator tipo
tambor horizontal, com arroz como substrato ..................................................74
4.12 Avaliao da estabilidade dos pigmentos ...........................................75
5 Concluses e sugestes ...................................................................................79
5.1.1 LPB 31 uma linhagem adequada para a produo industrial de pigmentos. ...........79
5.1.2 Etanol o solvente orgnico mais adequado para a extrao de pigmentos. ............79
5.1.3 Arroz o substrato bruto mais adequado para a produo de pigmentos. .................79
5.1.4 Bagao de mandioca puro um substrato potencial para produo de extratos.........80
vii
5.1.5 Condies para cultivo em meio slido arroz. ..........................................................80

5.1.6 Estabilidade de pigmentos de Monascus.....................................................................80
5.2 Sugestes para trabalhos futuros ..........................................................81

5.2.1 Gerao e seleo de linhagens mutantes de Monascus ...........................................81
5.2.2 Formulaes com substratos mistos............................................................................81
5.2.3 Desenvolvimento de um condicionador de ar para reatores de FSS ..........................81
6 Referncias Bibliogrficas ................................................................................82
viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

ATCC: American Type Culture Collection, banco de cepas - EUA
BM: bagao de mandioca
ca: circa (cerca de)
CCT: Centro de Culturas Tropicais, banco de cepas daFundao Andr
Tosello Brasil
DMSO: dimetil sulfxido
FL: fermentao lquida
FSS: fermentao em substrato slido
LPB: laboratrio de processos biotecnolgicos
NmL, NL: normal mililitro ou normal litro, volume de gs expresso em
condies padro (0C, 1 atm)
NRRL: Northern Research Regional Laboratories, banco de cepas pblico EUA
PA para anlise
PDA potato dextrose Agar
PTS: protena texturizada de soja
: velocidade especfica de crescimento microbiano (em tempo-1)
max:velocidade
mxima especfica de crescimento microbiano
UA: unidades de absorbncia

UV: ultravioleta
v/v volume por volume
v/m volume por massa
YEA: levedura seca de panificao
ix
RESUMO
Os pigmentos naturais de Monascus apresentam um grande potencial para a
agroindstria, podendo agregar valor a matrias-primas baratas como cereais e
outros substratos amilceos. No presente trabalho, determinou-se meio e condies
de cultivo, extrao, anlise de pigmento e de citrinina e parmetros cinticos para a
linhagem LPB 31, um isolado do gnero Monascus, e estimou-se a estabilidade dos
pigmentos para aplicao em alimentos. Os resultados obtidos indicam que a
linhagem isolada adequada produo de pigmentos por FSS.
O solvente mais adequado para extrao etanol a 60%, com a agitao por
1h do fermentado com o solvente, temperatura ambiente, na proporo de 3 partes
de solvente para 1 parte de fermentado seco. Extraes exausto podem
aumentar o rendimento da extrao em 20%.
A forma de fermentao influencia bastante a produo, devido perda de
umidade e outros fatores fsicos. Comparado a outros substratos, o arroz o
substrato bruto mais adequado fermentao, embora o bagao de mandioca
apresente potencial de aplicao para a produo de extratos de pigmento. Para a
produo de pigmentos de Monascus em FSS, as condies mais adequadas so as
de aerao forada (com ar saturado de umidade) de 1NmL/min.g de substrato
mido, para um leito de 8 cm de altura, durante 8 dias, com inculo vegetativo, a
32C. Obtm-se nessas condies uma velocidade especfica mxima de
crescimento de 0,039h-1, e uma velocidade especfica de produo de pigmentos de
27,5 UA/g biomassa.h-1 e uma produo da ordem de 110UA/g produto seco. A
produo tambm pode ser feita em bandejas, com produo de pigmento inferior,
mas ainda comercialmente adequada. Nesse caso recomenda-se uma altura de leito
de 2 cm. A produo de citrinina pela linhagem LPB 31 inferior s outras
linhagens testadas. Os pigmentos de Monascus so instveis frente a extremos de
pH e temperaturas altas, devendo ser usados em aplicaes a temperaturas
inferiores a 60C e pH prximos da neutralidade.
PALAVRAS-CHAVE
Pigmentos naturais, Monascus, fermentao em substrato slido, arroz,
bagao de mandioca
ABSTRACT
Natural pigments from Monascus present a high potential for agro-industries,
since they may add value to cheap raw materials such as cereals and other starchy
substrates. In the present work, the adequate conditions for cultivation, extraction,
pigment production and citrinin analysis were defined for the strain LPB 31, an isolate
from the genus Monascus. It were also determined the kinetic parameters and
pigment stability for food applications. The results indicate that this strain is
adequate for the production of pigments in SSF (solid substrate fermentation).
The best solvent for extraction is 60% ethanol, with shaking for 1h of the
fermentate with the solvent, at ambient temperature, in the proportion of 3 parts
solvent to 1 part dry fermentate. Exhaustive extractions may improve extraction yield
up to 20%.
The fermentation method highly affects production, an effect due to humidity
loss and other physical factors. Compared to other substrates, rice is the raw material
most adequate to fermentation, although cassava bagasse shows potential use for
the production of pigment extracts.
Regarding the production of Monascus pigments in SSF, the ideal conditions
are forced aeration (with moist air) of 1NmL/min.g dry substrate, for an 8 cm high
bed, for 8 days, with a vegetative inoculum, at 32C. In such conditions, a maximum
specific velocity of 0.039h-1 is obtained, and the maximum specific pigment
production velocity is 27.5 UA/g biomass.h-1, with a production of the order of 110
UA/g dry product. Production may also be accomplished in trays, with a lower
pigment production, but still commercially feasible. In this case, it is recommended a
bed height of 2 cm. Citrinin production by the strain LPB 31 is lower than other tested
strains. Monascus pigments are unstable to extreme pH and high temperature, so
that they should be used in food applications at temperatures lower than 60C and
pH near neutrality.
KEYWORDS
Natural pigments, Monascus, solid substrate fermentation, rice, cassava
bagasse
1 INTRODUO
A cor uma caracterstica essencial dos alimentos. Embora a cor de um
alimento nem sempre tenha relao direta com o valor nutricional, tem importncia
central na sua aceitabilidade. Os pigmentos naturais vm tendo uma participao
cada vez mais importante no mercado, devido s restries cada vez maiores no uso
de corantes sintticos. Esses pigmentos naturais so de origens diversas, como
plantas ou animais.
Pigmentos microbianos, por sua vez, apresentam-se como uma alternativa
vivel aos outros pigmentos de origem animal ou vegetal, porque so considerados
naturais, no apresentam problemas de sazonalidade e possuem produtividade alta.
Entre os pigmentos passveis de produo por fermentao, destacam-se os
pigmentos de Monascus sp, um fungo filamentoso que produz uma srie de
pigmentos de estrutura policetdica, com cores que variam entre tons de amarelo,
laranja e vermelho. Como ocorre com diversos outros fungos, as linhagens de
Monascus produzem tambm micotoxinas, contaminantes cuja quantidade deve ser
a mnima possvel em um produto. No caso de Monascus, a micotoxina produzida
a citrinina, uma substncia nefrotxica que apresenta tambm atividade antibitica.
Os pigmentos de Monascus vm sendo usados em alimentos tradicionais, em
pases orientais, h sculos. No entanto, a pesquisa sobre a produo e aplicao
industrial desses pigmentos bem mais recente e ganhou fora especialmente na
ltima dcada, em conjuno com a produo de outros aditivos alimentares por
fermentao. A produo tradicional desses pigmentos feita por fermentao em
arroz cozido, distribudo em bandejas, ao passo que a pesquisa e a produo
industrial geralmente so voltadas para a fermentao submersa.
Os pigmentos de Monascus apresentam uso potencial em produtos crnicos,
bebidas, molhos e sopas, embora seu uso no seja ainda regulamentado em
diversos pases ocidentais. Tanto a produo em substrato slido, mais eficiente em
termos de quantidade e concentrao de pigmentos, quanto a aplicabilidade desses
pigmentos na indstria de alimentos traduzem-se em um grande potencial de
agregao de valor a matrias-primas abundantes no estado do Paran, motivo pelo
qual adotou-se essa linha de pesquisa.
Este trabalho apresenta, numa abordagem de desenvolvimento de processo,

uma descrio das informaes em que se fundamentou, e os resultados que se
obteve, em um plano de trabalho de doutorado, cujo objetivo era o de produzir
pigmentos de Monascus por fermentao em substrato slido.
A reviso da literatura apresenta algumas informaes importantes e de
domnio pblico sobre pigmentos naturais, a produo de pigmentos por Monascus,
a anlise de biomassa e de citrinina e os mtodos de cultivo.
A seo material e mtodos descreve as tcnicas tradicionais ou
eventualmente desenvolvidas e utilizadas na realizao das etapas de laboratrio
deste trabalho.
A seo resultados e discusso descreve, inicialmente, como se verificou qual
linhagem de Monascus a mais adequada produo isto , com a maior
produo e produtividade de pigmentos e a menor produo possvel de citrinina.
Foi tambm determinada a melhor forma de extrair pigmentos de Monascus para a
preparao de extratos concentrados. Em seguida, trabalhou-se com a formulao
de meios de cultivo adequados produo industrial, levando em conta o custo da
matria prima e o rendimento do processo. Definido o substrato, determinou-se as
condies de fermentao mais adequadas para fermentao em substrato slido,
em termos de aerao. A etapa seguinte consistiu em estudos de respirometria, em
que dados cinticos e de metabolismo do microorganismo puderam ser verificados,
analisando-se a produo de pigmentos e de biomassa como funo do tempo de
fermentao e o consumo de oxignio. Essa etapa de respirometria foi repetida para
uma escala maior de produo, utilizando um reator tipo tambor horizontal. Os
resultados dessa etapa foram confrontados com os obtidos em coluna, em frascos e
em bandeja. Finalmente, verificou-se como a estabilidade dos pigmentos em
solues aquosas, com o objetivo de estimar a aplicabilidade desses pigmentos em
alimentos.
A seo concluso e sugestes sumariza as principais informaes
levantadas a partir dos experimentos realizados, e apresenta novos rumos a se
tomar dentro desta linha de pesquisa.
2 REVISO DE LITERATURA
2.1 Pigmentos viso geral
2.1.1 Terminologia
A palavra pigmento tem origem latina e originalmente denominava uma cor
(no sentido de matria corante), mas foi mais tarde estendida para indicar adereos
coloridos (maquiagem, por exemplo). No incio da Idade Mdia, a palavra foi usada
tambm para descrever os mais diversos tipos de extratos de plantas e vegetais,
especialmente aqueles usados para colorao de alimentos. A palavra pigmento
ainda vem sendo usada nesse sentido na terminologia biolgica: matria corante
presente em animais ou plantas e que ocorre em grnulos dentro das clulas ou
membranas celulares, como depsitos nos tecidos, ou suspensa nos fluidos
corpreos (Ullmann, 1985).
O significado moderno associado palavra pigmento (em ingls, pigment)
foi originado no sculo XX, significando uma substncia constituda de pequenas
partculas que praticamente insolvel no meio aplicado, e usada devido s suas
propriedades corantes, protetivas ou magnticas (Ullmann, 1985). Essa definio
aplica-se bem aos pigmentos de origem mineral, como dixido de titnio ou negro de
fumo; para materiais corantes solveis, geralmente compostos orgnicos, mais
adequado usar a expresso corante (em ingls, dye). No entanto, ambos os termos
(corante e pigmento) so usados para denominar substncias usadas para conferir
cor a alimentos, s vezes indistintamente. No presente trabalho, para manter
consonncia com os termos usados na literatura tcnica, prefere-se citar substncias
corantes vegetais ou animais, indistintamente de sua solubilidade ou insolubilidade,
como pigmentos.
2.1.2 Histrico
Pigmentos naturais inorgnicos provavelmente vm sendo usados desde os
tempos pr-histricos, o que se pde verificar analisando pinturas em cavernas.
Carvo vegetal, ocre, marrom de mangans e argilas esto entre os materiais
usados em pinturas de mais de 30000 anos em cavernas do sul da Frana, norte da

Espanha e norte da frica. H cerca de 2000 anos, alguns desses pigmentos j
eram aquecidos para modificar sua colorao, aumentando assim a variedade de
pigmentos disponveis. Com o desenvolvimento da alquimia e da qumica, diversos
compostos inorgnicos de forte colorao (como o cinbrio, os sulfetos metlicos, os
xidos de chumbo, etc.) foram usados extensivamente como pigmentos, embora a
maioria seja insolvel.
Os pigmentos orgnicos naturais so tambm conhecidos h bastante tempo,
destacando-se os extratos de plantas como o aafro e o ndigo, ou de animais
como a cochonilha. At meados do sculo XIX, os pigmentos orgnicos naturais
eram os mais importantes tanto para alimentos e cosmticos quanto para a indstria
txtil; a indstria de tintas sempre pde contar com vrios pigmentos inorgnicos que
so, no entanto, txicos para o consumo humano. Aps 1850, com a sntese da
malva por W. Perkins, houve o florescimento da indstria de pigmentos orgnicos e,
em contrapartida, o recrudescimento de agroindstrias tradicionais como o ndigo, na
ndia. A variedade de novos pigmentos orgnicos sintticos fez com que muitos
fossem aplicados sem grande preocupao com a toxicidade. Em 1900, cerca de 80
pigmentos artificiais eram usados em alimentos nessa poca, no havia regulao
quanto ao uso ou pureza dessas substncias; hoje, por outro lado, a maioria
desses pigmentos tem uso vetado para alimentos (FDA, 1998).
2.1.3 Por que usar corantes em alimentos?
A cor uma propriedade importante dos alimentos, e a natureza nos ensina
cedo a esperar certas cores em determinados alimentos. Nossa aceitao de
alimentos no futuro acaba dependendo grandemente dessa expectativa. No entanto,
diversos fatores como sazonalidade, armazenamento e efeitos de processamento
podem alterar a cor de um alimento, o que requer que um fabricante adicione
corantes para satisfazer a expectativa dos consumidores.
As razes para adicionar corantes a alimentos incluem (FDA, 1998):
- reforar a cor perdida devido exposio luz, ao ar, e a extremos de
temperatura, umidade e condies de armazenamento.
- corrigir variaes naturais da cor (embora mascarar qualidade inferior seja
inaceitvel).
- reforar cores que ocorrem naturalmente, mas em nveis menores do que
aqueles associados a um determinado alimento.
- conferir cor a alimentos que, de outra forma, seriam quase incolores.
- conferir cores vivas a alimentos divertidos, como doces festivos.
- proteger aromas e vitaminas que podem ser afetados pela luz do sol durante
o armazenamento.
- fornecer uma variedade atrativa de alimentos ao consumidor.
2.1.4 Cor e estrutura
A cor de cada pigmento est associada absoro ou reflexo da luz em
comprimentos de onda determinados, o que uma caracterstica da molcula do
pigmento. A interferncia com a luz visvel est associada a transies eletrnicas
dos eltrons de valncia (Gordon, 1995): a energia (e conseqentemente a
freqncia, e portanto a cor) da luz est associada diferena de energia envolvida
entre os estados dos eltrons nessas transies. A cor percebida depende da cor
absorvida, de acordo com a complementaridade das cores (Figura 1).
Figura 1 cores primrias subtrativas absorvem comprimentos de onda determinados. Cada
crculo representa um filtro absorvendo cor, por isso a combinao das cores a ausncia
de cor, o negro.
filtro
filtro
que
absorve a luz vermelha
que
absorve a luz verde

observa-se magenta
observa-se ciano
filtro
que
absorve a luz azul

observa-se amarelo
As cores primrias subtrativas so o amarelo, o ciano e a magenta. Assim, se

da luz branca for absorvido o componente amarelo, percebe-se a cor azul; de forma
anloga, quando a cor de um composto amarela, esse composto deve absorver luz
no comprimento de onda correspondente ao azul (Bodner e Pardue, 1995). por
isso que, para a anlise de pigmentos vermelhos, a absoro mxima se d para

comprimentos de onda baixos correspondendo ao azul, e vice-versa.
A absoro de ftons de luz com energias especficas um fenmeno bem
conhecido e explorado em tcnicas de anlise como a espectrofotometria. Na
prtica, quando se trata de substncias corantes, h bandas de absoro faixas de
comprimentos de onda, ao invs de linhas espectrais como em ons inorgnicos
simples. No entanto, o princpio de formao da cor o mesmo (Figura 2).
Figura 2 O espectro eletromagntico na faixa visvel. Comprimentos de onda maiores
(700nm) correspondem ao vermelho, enquanto comprimentos de onda menores (400nm)
correspondem ao violeta.
700 nm
400nm
A energia requerida por eltrons capazes de excitao depende do orbital que

esses eltrons ocupam. A energia requerida menor (e, portanto, maiores
comprimentos de onda, menos energticos, sero adequados) quando duplas
ligaes ocorrem. Se uma srie de duplas ligaes duplas conjugadas est
presente, a energia de excitao ainda menor, a ponto de poder ser promovida
pela luz visvel portanto, pode-se observar cor. medida que o comprimento do
sistema de duplas ligaes conjugadas aumenta, o comprimento de onda de mxima
absoro tambm aumenta. (Margalith, 1992). Por exemplo, enquanto o antraceno
(trs anis aromticos lineares) incolor, o naftaceno (4 anis lineares) laranja e o
pentaceno (5 anis lineares) azul (MERCK, 1996). Em pigmentos naturais, esses
sistemas conjugados so observados com freqncia por exemplo, nos
carotenides, compostos que conferem a cor a tomates, cenouras e outros vegetais.
A formao de sistemas conjugados com heterotomos como oxignio ou nitrognio
(apresentando igualmente orbitais p conjugados) tambm relevante em compostos
como quinonas, ndigo e carmim.
2.1.5 Pigmentos naturais versus artificiais

A partir de meados de 1850, com a sntese da malva (o primeiro pigmento
sinttico), a prtica de colorir alimentos tomou um impulso to expressivo que o
aspecto toxicolgico dos corantes nem sempre era considerado. Em alguns casos,
no entanto, existe razovel toxicidade, e desde 1971, o efeito cancergeno de
substncias diversas no organismo humano vem sendo estudado (Nazar, 2001).
Dvidas crescentes concernentes segurana de vrios corantes artificiais
vm estimulando a sua substituio por corantes naturais (Kim et al., 1995). Alguns
dos corantes artificiais, como azorubrina ou tartrazina, podem causar alergias
(Multon, 1992, in Fabre, 1993); mesmo a lista de corantes artificiais permitidos vem
diminuindo devido a novas informaes sobre efeitos adversos de um ou outro
corante. H 9 corantes artificiais correntemente permitidos em medicamentos,
alimentos e cosmticos (FD&C colors) nos EUA, dos quais dois tm uso restrito.
Por outro lado, h 21 tipos de corantes naturais (dos quais cinco tm uso restrito),
liberados para os mesmos usos. Esses corantes naturais so de fontes diversas:
desde sucos de frutas e vegetais e extratos (como o de casca de uva, por exemplo),
at caramelo, o corante mais usado (FDA, 1998).
A tabela na prxima pgina
(Tabela 1) mostra os corantes permitidos para alimentos segundo a legislao

brasileira, pelo estabelecido na Resoluo n 4, da ANVISA, de 24 de novembro de
1988. Essa resoluo foi adaptada em termos de quantidades permitidas de cada
corante, por classe de alimento, atravs de resolues posteriores de 1999, 2000 e
2001. (Anvisa, 2004).
Tabela 1 Corantes de uso permitido em alimentos e bebidas no Brasil (ANVISA, 2004)

Corantes naturais
Corantes
sintticos Corantes artificiais
idnticos aos naturais
Amarelo crepsculo
Azul Brilhante
Bordeaux S ou Amaranto
Eritrosina
Indigotina
Beta-caroteno, Beta-apo- Ponceau 4R
8-carotenal, ster etlico Tartrazina
do cido Beta-apo-8- Vermelho 16.035
carotenico
Aafro
cido carmnico
Antocianinas
Cacau
Carmin
Carotenides: , e -caroteno,
bixina, norbixina, capsantina,
capsorubina, licopeno
Carvo vegetal
Clorofila, clorofilas e clorofilinas
cpricas e seus sais
Choconilha
Corantes caramelo
Crcuma, Curcumina
Hemoglobina
ndigo
Corantes Inorgnicos
Pprica
Alumnio
Riboflavina
Riboflavina e riboflavina Carbonato de clcio
5 fosfato de sdio
Urucum
Dixido de titnio
Urzela: orcena, orcena sulfonada
Ouro
Vermelho de beterraba
xidos e hidrxidos de
ferro
Xantofilas:
cantaxantina, Xantofilas: cantaxantina,
Prata
criptoxantina, flavoxantina, lutena, criptoxantina,
rodoxantina,
rubixantina, flavoxantina,
lutena,
violaxantina
rodoxantina, rubixantina,
violaxantina
A anlise da Tabela 1 mostra que a legislao brasileira permite o uso de

diversos pigmentos naturais, mas bastante restritiva com relao aos artificiais,
com apenas 8 pigmentos artificiais liberados para uso em alimentos.
A tabela a seguir (Tabela 2) mostra os corantes correntemente permitidos
para uso em alimentos na Unio Europia (EU) (Arlt, 1998).
Tabela 2 Corantes permitidos na Unio Europia para uso em alimentos (Arlt, 1998)
Uso at quantum satis Uso permitido at um nvel
em qualquer alimentoa
mximo, em alguns alimentos
especficos
Riboflavina (E101)
Curcumina (E100)
Clorofilas e clorofilinas Amarelo Tartrazina (E102)
(E140)
Complexos de cobre de Amarelo de quinolina (E104)
clorofilas e clorofilinas
(E141)
Caramelo (E150a)
Amarelo crepsculo FCF, laranja
crepsculo S (E110)
Caramelo sulfito (E150b)
Cochonilha, cidos carmnicos,
carmins (E120)
Caramelo amnia (E150c) Azorubina, carmoisina (E122)
Caramelo sulfito-amnia Vermelho
Ponceau
4R,
(E150d)
Vermelho cochonilha A (E124)
Carvo vegetal (E153)
Vermelho allura AC (E129)
Carotenides (E160a)
Azul marinho V (E131)
Extrato
de
pprica, Indigotina, ndigo carmin (E132)
capsantina, capsorubina
(E160c)
Vermelho de beterraba, Azul brilhante FCF (E133)
betaninas (E162)
Antocianinas (E163)
Verde S (E142)
Carbonato
de
clcio Negro brilhante BN, negro PN
(E170)
(E151)
Dixido de titnio (E171)
Marron HT (E155)
xidos e hidrxidos de Licopeno (E160d)
ferro (E172)
Beta 8-carotenal (C30) (E160c)
ster etlico de cido beta-apo8carotenico (C30) (E160f)
Lutena (E161b)
Uso restrito, permitido

apenas
para
alguns
alimentos
Amaranto
(Vermelho
Bordeaux) (E123)
Eritrosina (E127)
Vermelho 2G (E128)
Marron FK (E154)
Cantaxantina (E161g)
Alumnio (E173)
Prata (E174)
Ouro (E 175)
Litorubina BK (E180)
Urucum,
bixina,norbixina
(E160b)
a uso at quantum satis: tanto quanto necessrio, dentro das boas prticas
de fabricao.
A anlise da Tabela 2 mostra que, enquanto vrios pigmentos naturais
apresentam uso liberado na quantidade necessria em alimentos, nenhum dos
pigmentos artificiais (destacados na tabela) tem uso irrestrito: devem ser usados em
quantidades limitadas. A legislao vigente nos EUA, EU e Brasil, exemplificada
atravs da Tabela 1 e da Tabela 2, mostra claramente que o mercado de pigmentos
naturais bastante promissor, inclusive porque os pigmentos naturais ora permitidos
no cobrem toda a faixa espectral (Vargas, 2000). No entanto, interessante notar
10
que, presentemente, o uso de pigmentos de Monascus como aditivo intencional de

cor no est previsto pela legislao vigente nos EUA, EU e Brasil.
2.1.6 Pigmentos microbianos
Pigmentos microbianos so uma classe de pigmentos naturais que apresenta
vantagem em termos de produo em relao aos seus similares extrados de
vegetais ou animais: o desenvolvimento de espcies vegetais superiores mais
lento que a de microorganismos e algas. Assim, a produo de pigmentos por
bioprocessos envolvendo microorganismos, cuja velocidade de crescimento
relativamente alta, pode garantir uma produtividade tal para o processo que o torna
vantajoso. Correntemente, os pigmentos produzidos por via microbiana e utilizados
comercialmente so a riboflavina (vitamina B2, um pigmento amarelo de uso
permitido na maioria dos pases), por Eremothecium ashbyii e Ashbya gossypi; os
pigmentos de Monascus (objeto deste trabalho, discutidos frente), por M.
purpureus e M. ruber; carotenides (pigmentos amarelos produzidos por diversos
microorganismos, mas que at o momento s so economicamente viveis quando
produzidos por microalgas) como -caroteno (por Dunaliella salina e D. bardawil) e
astaxantina (por Haematococcus pluvialis); e ficobiliprotenas como a ficocianina (um
pigmento azul usado em alimentos e cosmticos, produzido por Spirulina sp.; os que
apresentam potencial de uso so os indigides, as antraquinonas e naftoquinonas
(Jacobson e Wasileski, 1994).
2.1.7 Mercado de pigmentos
O mercado para pigmentos naturais produzidos por bioprocessos difcil de
estimar; por um lado, existe uma preferncia cada vez maior por aditivos naturais em
alimentos e cosmticos; por outro, a via de produo natural pode ser, em alguns
casos, 10 vezes mais cara que a via sinttica. O caso mais bem sucedido o do caroteno produzido por microalgas, que tem um custo de cerca de U$1000/kg contra
U$ 500/kg por via sinttica; apesar do preo maior, o -caroteno produzido por via
biotecnolgica pode competir em nichos onde importante que todos os
ingredientes sejam naturais; alm disso, o pigmento microbiano uma mistura de
ismeros cis- e trans, com efeitos teraputicos contra o cncer que o
-caroteno
11
sinttico, predominantemente cis-, no apresenta. O mercado para pigmentos no

mundo foi estimado, em 1987, em U$ 320 milhes dos quais cerca de 1/3 (U$120
milhes) era de corantes naturais ou idnticos a naturais. Desses, por sua vez, cerca
de U$ 35 milhes eram de corantes extrados de fontes naturais, U$35 milhes de
idnticos aos naturais e U$ 50 milhes em corantes derivados de processamento
(como caramelos). Como o mercado de pigmentos, similarmente ao de aromas, tem
tido um crescimento de aproximadamente 10% ao ano (Jacobson e Wasileski,
1994), o mercado atual deve ser expressivamente maior, algo entre U$700 milhes e
U$1,5 bilhes. De fato, de acordo com Downham e Collins (2000), uma razovel
estimativa para o mercado global de alimentos hoje da ordem de U$ 940 milhes,
distribudos em 400 milhes para pigmentos sintticos, 250 milhes para pigmentos
naturais, 189 milhes para pigmentos idnticos aos naturais e 100 milhes para
caramelos (Figura 3).
Figura 3 - Participao de cada classe no mercado mundial de pigmentos, em 1987 e 2000
Artificiais
42%
Artificiais
62%
Caramel
os
16%
Idnticos aos
naturais
20%
Naturais
11%
Idnticos
aos
Caramelos
naturais
11%
11%
Mercado mundial em 1987: total U$ 320 milhes

pigmentos naturais: U$ 35 milhes
Naturais
27%
Mercado mundial em 2000: total U$ 940 milhes
pigmentos naturais: U$ 250 milhes
Nota-se, analisando a Figura 3, que a participao proporcional dos

pigmentos naturais aumentou nas ltimas dcadas. Enquanto a produo mundial
de pigmentos aumentou cerca de 3 vezes entre 1987 e 2000, a produo de
pigmentos naturais aumentou mais de 7 vezes no mesmo perodo.
Os maiores mercados para pigmentos so a Europa e os Estados Unidos. A
distribuio de consumo no proporcional ao consumo de alimentos, porque
pigmentos so usados em alimentos processados: existe uma demanda potencial
grande em pases em desenvolvimento, como o Brasil, nos quais uma melhora no
12
perfil econmico deve garantir o aumento no consumo de alimentos processados.

No caso especfico de pigmentos de Monascus, o consumo anual desses
pigmentos no Japo subiu de 100 t em 1981 para 600 t em 1992 e foi avaliado em
cerca de U$12 milhes, de acordo com um levantamento publicado nesse mesmo
ano (Lee et al, 1995; Hajjaj et al., 1997)
2.2 Pigmentos de Monascus
Pigmentos de Monascus so usados h centenas de anos como corantes
para alimentos, em pases orientais. Os fungos do gnero Monascus produzem uma
srie de pigmentos policetdicos de estruturas relacionadas (Figura 4). Embora por
muito tempo se tenha reconhecido que h 6 pigmentos, na ltima dcada foram
descobertos alguns novos, como a xantomonascina e o amarelo II, possivelmente
derivados da rubropunctatina (Sato et al., 1992; J szlov et al., 1996; Watanabe et
al., 1997). Recentemente duas novas estruturas, chamadas monascopiridinas A e B,
anlogos
hidrogenados
dos
pigmentos
vermelhos, foram
descritas. Esses
compostos apresentam mximos de absoro em UV a 306 nm, e a sua contribuio

na colorao de Monascus ainda no foi investigada (Wild et al., 2003). Segundo
alguns autores, h mais de 10 pigmentos, embora nem todos de estrutura conhecida
(Shin et al., 1998).
13
Figura 4 estruturas de pigmentos de Monascus sp.

R
NH
RR== C
monascin
monascina
C55H11
11
R = C7H15 ankaflavin
R = C7H15 ankaflavina
R =RC=5H
C11
rubropunctatin
5H
11 rubropunctatina
R = C7H15 monascorubrin
R = C7H15 monascorubrina
(yellow)
(amarelo)
(orange)
(laranja)
rubropunctmina
RR==CC5H
rubropunctamine
5H
1111
R = C7H15 monascorubramine
R = C7H15 monascorubramina
(red)
(vermelho)
C5H11
O
C7H15
HO
O
HO
HO
CHO
Yellow Amarelo
II
II
(yellow)
(amarelo)
Os
pigmentos
R
A A RR
=C
monascopyridine A
R == CC55HH1111xanthomonascin
xantomonascina
=5H
C11
5H11 monascopiridina A
R = C7H15 xanthomonascin B
R = C7H15 monascopyridine B
R = C7H15 xantomonascina B R = C7H15 monascopiridina B
(yellow)
(amarelo)
alaranjados,
monascorubrina
rubropunctatina,
so
sintetizados no citosol a partir da acetil coenzima A, pelo complexo multienzimtico

policetdeo sintase. Esses pigmentos no so hidrossolveis e so instveis em pH
extremos (Hajjaj, 2000), mas apresentam estruturas responsveis pela sua alta
afinidade com compostos contendo grupos amino primrios (so por isso chamados
de aminfilos). Reaes com aminocidos levam formao de pigmentos
vermelhos hidrossolveis, monascorubramina e rubropunctamina. O mecanismo de
formao dos pigmentos amarelos no est ainda claro; alguns autores consideram
que estes so produtos da alterao dos pigmentos alaranjados, enquanto outros
acreditam que se trata de pigmentos com uma rota metablica prpria (Lin e
Demain, 1991; J zlov et al., 1996). A via metablica das policetdeo sintases
razoavelmente bem conhecida, mas elucidar os detalhes da biossntese de
pigmentos de Monascus necessrio para permitir melhor manipulao das
14
condies e composio do meio de cultivo, com base no metabolismo do fungo. H

trabalhos sobre anlogos de pigmentos de Monascus produzidos por um fungo de
outro gnero, Penicillium sp. AZ, usando vias metablicas similares (Ogihara et al,
2000).
Devido afinidade por grupos amino, os pigmentos de Monascus esto
associados freqentemente a protenas (Wong e Koehler, 1981) ou parede celular,
formando um complexo que pode ser de difcil extrao. Outros autores consideram
que pode haver fixao dos pigmentos a lipdios da biomassa fngica, de forma que
a extrao envolveria rompimento celular e dissoluo em solvente orgnico (St.
Martin et al, 1990). Ainda devido a essa afinidade por grupos amino, possvel
converter
pigmentos
alaranjados
lipossolveis
em
pigmentos
vermelhos
hidrossolveis por reao com aminocidos e compostos anlogos in vitro (St.

Martin et al, 1991). Nesse caso, o nitrognio do grupo amino (do aminocido ou
anlogo) substitui o oxignio do anel da rubropunctatina ou da monascorubrina,
fornecendo anlogos da rubropunctamina ou da monascorubramina, mas com um
radical ligado ao N em substituio ao H dos pigmentos vermelhos naturais.
Entre os possveis aminocidos que podem ser usados para induzir a
formao de pigmentos hidrossolveis in vivo est o cido glutmico, na forma de
glutamato monossdico (MSG) (Lin e Demain, 1992). Em um estudo usando glucose
como fonte de carbono em um meio lquido contendo MSG, observou-se a formao
de N-glucosil derivados dos pigmentos vermelhos, correspondendo a at 10% dos
pigmentos totais (Hajjaj et al, 1997).
Entre os pigmentos produzidos por Monascus so geralmente de maior
interesse os vermelhos, que so possveis substitutos de corantes sintticos como a
eritrosina (FD & C vermelho no. 3) (Johns & Stuart, 1991); trata-se de pigmentos
estveis na faixa de pH 2-10, termoestveis e que podem ser autoclavados (op. cit.
em Lin e Demain, 1992). Alguns estudos mostram que pigmentos de Monascus
podem ser usados como substitutos de aditivos alimentares tradicionais, como
nitritos e cochonilha, em pats e embutidos (Fabre et al, 1993). H outros estudos
em curso verificando resposta sensorial, testes de alergenicidade e toxicidade,
embora pases orientais como o Japo faam uso extensivo desses pigmentos h
muitas dcadas por exemplo, pigmentos amarelos hidrossolveis para doces
(Watanabe et al, 1997), ou pigmentos vermelhos para vinho de arroz.
15
2.3 O microorganismo
2.3.1 Ocorrncia
Facilmente encontrado em diversos ecossistemas, fungos do gnero
Monascus so usados tradicionalmente em pases orientais, originalmente na China
e Tailndia, para preparar um arroz fermentado de forte colorao vermelha e que
encontra aplicaes diversas, desde conferir cor a outros produtos como vinho,
queijo e carne, at usos medicinais e como preservativo de carne (Wong e Koehler,
1981). Enquanto alguns metablitos do fungo so importantes devido forte
colorao, outros possuem atividade hipocolestermica e antimicrobiana, e vm
sendo estudados com mais intensidade na ltima dcada (Martnkova et al, 1995;
Zhang et al, 2000). No momento, diversas empresas comercializam o arroz vermelho
seco e pulverizado como um suplemento alimentar natural com capacidade para
diminuir o colesterol, e outras vendem o produto seco ou os extratos purificados
como corantes alimentcios (Allok, 2003).
O gnero Monascus compreende trs espcies pertencentes famlia
Monascaceae e classe Ascomyceta (M. pilosus, M. purpureus e M. ruber) (Pitt,
1997), cuja caracterstica mais importante a capacidade de produzir metablitos
secundrios de estrutura policetdica (J zlov et al, 1996), alguns com forte
pigmentao amarela, alaranjada ou vermelha. As duas primeiras espcies so mais
importantes na produo de pigmentos, enquanto M. ruber associado
decomposio de diversos alimentos. Uma espcie nova foi isolada de solo no
Iraque, mas esta no importante para alimentos (Pitt e Hocking, 1997).
2.3.2 Linhagens usadas para a produo de pigmentos
Cepas utilizadas: geralmente so isolados, provenientes do Japo, China,
Tailndia ou Indonsia, de diversos alimentos fermentados: queijo de soja, koji
vermelho para fabricao de queijo de soja ou kaoliang, e a fonte mais comum,
angkak ou anka (arroz vermelho) (ATCC, 1987). As cepas variam na capacidade de
produo e tonalidade dos pigmentos, alm de outros fatores como velocidade de
crescimento e o perfil de metablitos. A temperatura, pH e umidade so fatores que
alteram tambm pigmentao e crescimento do fungo.
16
Figura 5 cultura de Monascus em PDA, aps 7 dias de incubao a 32C. Nota-se o halo
de difuso de pigmentos hidrossolveis e a cor caracterstica do miclio.
2.3.3 Morfologia
Colnias de 20 a 30 mm de dimetro em PDA, aps 7 dias. As colnias so
planas, eventualmente com pequeno desenvolvimento areo, esparsas, com textura
superficial floculenta, miclio inicialmente branco (1 a 2 dias), passando para laranja
a vermelho pardo medida que a cultura se desenvolve, com a formao de
cleistotcios e aleuriocondias (Figura 5). Geralmente h formao de pigmentos
solveis que difundem-se pelo gar. Os cleistotcios so esfricos, de 30 a 60m de
dimetro, formados como um n de hifas a partir de um pednculo bem definido,
com paredes celulares tornando-se marrons com a maturao; ascosporos
elipsides, hialinos, 5-7 x 4-4,5m, parede celular lisa (Figura 6). Pode haver
formao de aleuriocondias em pedculos laterais s hifas, mas mais comumente
terminais, s vezes nascendo isolados mas mais comumente em cadeias de at 10
clulas de comprimento, esfricas a piriformes, freqentemente arredondando na
maturao, com 10-14m de dimetro ou 10-18 x 8-14m, com paredes espessas,
lisas e marrons. A maioria das espcies produz tambm clamidocondias e
artrosporos. As colnias de M. ruber so de crescimento mais rpido que outras
espcies (Pitt e Hocking, 1997).
17
Figura 6 - Cultura de Monascus observada ao microscpio (aumento de 400 vezes). Note

em a um cleistotcio rompido e diversos esporos. Em b, observa-se a colorao difusa do
miclio e um cleistotcio intacto.
2.3.4 Cepas utilizadas

Excludas
aquelas
que
so
exclusivas
de
institutos
de
pesquisa,
universidades ou empresas, as cepas mais referenciadas na literatura de Monascus

so as listadas a seguir (Tabela 3). Note que a mesma cepa apresenta diversas
denominaes, dependendo da instituio em que est conservada. Algumas
dessas cepas foram depositadas com um nome diferente do aceito hoje; a tabela
mostra a denominao aceita em 2004, e algumas referncias relacionadas
especificamente com a produo de pigmentos (j que algumas linhagens foram
usadas para estudos metablicos e de produo de anti-hiperlipidmicos).
18
Tabela 3 Cepas mais utilizadas na pesquisa com Monascus, fonte de origem, sinonmia e
algumas referncias (em destaque, linhagens utilizadas neste trabalho).
Cepa
ATCC16360
CBS 283.34
ATCC 26311
IFO 4478
ATCC 16362
CBS 285.34
ATCC 36927
DSM 1603
IFO 4485
ATCC 16365
CBS 109.07
ATCC 16426
IFO 4513
IMI 210765
NRRL 1596
ATCC 16367
CBS 288.34
DSM 1604
IFO 4484
ATCC 16427
NRRL 2897
ATCC 16435
NRRL 1991
ATCC 36928
IFO 6540
CCT 3802
ATCC 96218
MR1
Espcie, origem e depositante

Monascus purpureus Went
depositado no CBS.
Isolado de Angkak (gros de arroz fermentado)
Referncias
Miyake et al., 1984

depositado no CBS.
Isolado de Angkak (gros de arroz fermentado)
Sheperd e Carels, 1979

Rosenblitt et al. 2000.

Miyake et al., 1984
depositado no CBS.
Isolado de Angkak (gros de arroz fermentado),
Java
depositado no CBS.
Isolado
de kyokusi (massa de leveduras
fermentadas, China)
depositado no NRRL.
Broder e Koehler, 1980.
Monascus sp.
depositado no NRRL.
Isolado de koji para manufatura de vinho tinto de
arroz, China.
Yamaguchi et al. 1973
Miyake et al., 1984
depositado no IFO.
Miyashira et al., 2003
Santerre et al., 1994
Fabre et al., 1993
depositado na ATCC. Por PJ Blanc
Isolado de arroz fermentado, China
Fonte: ATCC, maro de 2004
2.4 Crescimento e produo de metablitos

O crescimento e produo de metablitos dos fungos do gnero Monascus se
do em condies diversas. H vrios meios de cultivo adequados, mas os mais
comuns so PDA (gar batata dextrosada) e MEA (gar extrato de malte) (ATCC,
2004). O crescimento se d de 15-18C (mnimo) at cerca de 45C (mximo), (Pitt e
Hocking, 1997) com a produo de pigmentos variando largamente com a espcie e
com as condies de cultivo. Entre os metablitos importantes de Monascus esto
os pigmentos j descritos, a citrinina (uma micotoxina que ser abordada adiante), e
19
uma srie de substncias anti-hiperlipidmicas como monacolinas K e L (Ma et al,

2000), que no sero discutidas neste trabalho. Durante o cultivo de Monascus,
CO2, etanol e acetato tambm so produzidos. Ao trabalhar com FSS em arroz,
Rosenblitt et al (2000) mostraram que ao final de uma fermentao de 240h, o
balano de carbono : cerca de 23% do carbono convertido a biomassa, 35% a
CO2, 15% a etanol, 1% a cido actico e 17% permanece no convertido. Esses
resultados contabilizam 91% da fonte de carbono; a diferena (para 100%)
provavelmente devida a mudanas nas vazes de aerao e uma subestimao do
etanol produzido.
2.4.1 Condies fsicas de cultivo:
Temperatura: A faixa de temperatura tima , em mdia, de 28-32C, em
acordo com os registros de cada espcie em bancos de cepas, embora essa
temperatura varie dependendo da linhagem entre 25C e 37C (Lin, 1991). No caso
de M. purpureus CBS 109.7, por exemplo, a temperatura tima de 34C; a
temperatura mnima de 18C e a mxima, de 46C (Rasheva et al, 1997). Essas
temperaturas so timas para crescimento, mas para produo de pigmento
geralmente uma temperatura mais alta mais adequada.
Presena de oxignio: Os fungos do gnero Monascus so incapazes de
crescimento estritamente anaerbio usando glicose como substrato, mas podem
crescer em condies de limitao de oxignio. Nessas condies, aumenta a
produo de etanol e de CO2, mas h menor produo de pigmento; em condio de
maior aerao, a produo de etanol diminui enquanto a de pigmento aumenta.
Observou-se ainda que um aumento na presso parcial do CO2 aumenta a produo
de pigmento (Pastrana et al, 1995). Em altas concentraes de glucose (acima de
20g/L, em cultura lquida) ocorre um efeito tipo Crabtree, isto , o desvio para um
metabolismo predominantemente anaerbio, com a produo de etanol, mesmo em
condies de boa aerao (Chen e Johns, 1994). Com concentraes mais baixas
de glucose ou com outros acares, possvel dividir a produo em duas fases:
inicialmente a glucose sendo convertida a etanol e biomassa, e em seguida o etanol
sendo convertido a biomassa e pigmento (Hamdi et al, 1996). Em um meio de
composio definida, em condies de limitao de oxignio, a produo de
20
pigmentos vermelhos associada ao crescimento, enquanto em excesso de

oxignio a produo de pigmentos pode ser inibida pelo efeito de um produto
desconhecido (Hajjaj et al, 2000). A influncia da concentrao de oxignio em
fermentao em substrato slido tambm foi investigada; a uma presso de 0,02 atm
CO2, um aumento da presso parcial de oxignio at 0,5 atm forneceu alto
rendimento em pigmentos, enquanto baixas presses de CO2 com presso de 0,21
atm de O2 forneceu rendimento ainda maior (Han e Mudgett, 1992).
pH inicial: Em diferentes trabalhos observou-se crescimento em uma ampla
faixa de pH, desde 2,5 at 8,0, sendo a faixa ideal de 4,0 a 7,0 (Yongsmith et al,
1993). Dentro dessa faixa a variao no crescimento pequena, com desempenho
ligeiramente melhor em pH 4,0 (Lin et al, 1991; Chen e Johns, 1993). Embora o
crescimento seja melhor em pH 4, o rendimento em biomassa maior em pH 6,5
(Chen e Johns, 1993). A produo de pigmentos afetada de forma diversa, sendo
que em pH mais baixo h predominncia de colorao amarela e em pH mais alto
predominncia de colorao vermelha. Em pH 2,5 h produo principalmente de
um pigmento amarelo brilhante com esqueleto semelhante ao dos pigmentos
tradicionais (Yongsmith et al, 1993); em pH 4 h favorecimento da produo de
ankaflavina (amarelo), e a produo total de pigmentos aumenta com o aumento de
pH at 5,5; acima desse valor, h diminuio na produo de pigmentos (Lin et al,
1991), embora a produo de pigmento vermelho seja maior em relao aos
amarelos. Em pH 7, j no h produo importante de pigmentos amarelos
(Yongsmith et al, 1993).
pH durante o crescimento: A mudana de pH durante o crescimento depende
das fontes de nitrognio, em primeiro lugar, e em segundo das de carbono.
Independentemente do pH inicial, o pH final tende a ser o mesmo (Juslov, 1996),
na faixa de 7 a 8. (Yongsmith et al, 1993).
2.4.2 Fermentao em meio slido/submerso
Embora a produo tradicional de angkak para uso como corante seja sobre
um suporte slido (arroz), a maioria dos estudos feitos em laboratrio foi realizada
com meios de cultivo lquidos. Ocorre que na fermentao slida, embora obtenhase produtividade de pigmento muito maior que na submersa, geralmente so
21
utilizados meios naturais de formulao complexa, o que dificulta as anlises

necessrias para desvendar rotas metablicas e outros fatores durante o
crescimento. Em um estudo foram comparados meios lquidos com meios slidos de
mesma composio, obtidos pela adio de gelificante ao meio lquido e extruso
em partculas com tamanho prximo s de arroz. Os meios slidos assim
preparados forneceram produo at trs vezes maior de pigmento que o meio
lquido, mas os cultivos feitos em arroz ainda foram superiores (Johns e Stuart,
1991).
2.4.3 Teor de umidade em meios slidos
O processo tradicional de produo de angkak o mesmo usado para outras
variedades de koji (arroz fermentado com diferentes espcies de fungos, geralmente
Aspergillus), da o nome alternativo "koji vermelho". O processo de produo
consiste em manter arroz no aglutinante imergido em gua por at 24h, com
posterior cozimento por vapor (ou, mais recentemente, autoclavagem), adio de um
inculo (uma poro de arroz anteriormente fermentado), e adio de gua a
intervalos determinados para manter a umidade. (Palo et al, 1960; Wong e Koehler,
1981). A umidade exigida na fermentao de arroz varia dependendo da descrio
tradicional, mas recomenda-se que a umidade seja suficiente para garantir o
crescimento do miclio pelo gro sem a desintegrao dos gros. O teor de umidade
ideal para a produo de pigmentos da faixa de 56%, com pH 6, segundo Johns e
Stuart (1991).
2.4.4 Composio do meio de cultivo
Fontes de carbono diversas vm sendo usadas como substrato para o
crescimento de Monascus, sendo as mais comuns a glucose, a sacarose e o amido.
O melhor crescimento geralmente observado com glucose (St. Martin et al, 1990).
A produo de pigmentos, no entanto, depende de fatores diversos como a natureza
e a concentrao do substrato, alm da fonte de nitrognio e do pH. A produo
volumtrica de pigmento em meio submerso melhor com amido e dextrina,
enquanto a produo especfica melhor com maltose e quase to boa quanto com
glucose (Lin e Demain, 1991), mas essa comparao entre acares deve ser feita
22
verificando-se cuidadosamente as concentraes. Em concentraes de glucose

inferiores a 20g/L, o crescimento e a produo de pigmento vermelho so
excelentes;
concentraes
de
glucose
superiores
20g/L
levam
um
comportamento tipo Crabtree, com produo significativa de etanol, e crescimento

celular e produo de pigmento reduzidos, mesmo em presena de oxignio. Isso
indica que pode haver efeito repressor da glucose e que o uso de outro acar
pode evitar esse efeito. De fato, em altas concentraes (50g/L), a maltose melhor
que a glucose, especialmente em presena de peptona. Essas diferentes
concentraes de acares tm mais efeito sobre os pigmentos amarelos que
vermelhos, embora quando se use maltose a produo de pigmentos vermelhos seja
estimulada. (Chen e Johns, 1994). Uma boa fonte alternativa de carbono o etanol
(J zlov et al, 1996), que , afinal, produzido naturalmente pelo fungo em condies
de limitao de oxignio ou excesso de glucose (Pastrana et al, 1995; Hamdi et al,
1997). Como a produo de biomassa favorecida com o uso de carboidratos,
pode-se fazer a cultura em dois estgios (por exemplo, maltose-etanol) para
aumentar a eficincia no uso de etanol para produo de pigmentos (Juszlov et al,
1996). H algumas contradies no que se refere ao efeito de fontes de carbono; por
exemplo, Lin e Demain (1991) no encontraram efeito repressor para nenhuma fonte
de carbono, trabalhando com concentraes de at 10% de carboidratos. Essas
contradies podem ser possivelmente atribudas a diferenas entre organismos e
taxas de aerao empregadas.
Fontes de nitrognio usadas para o crescimento de Monascus vo desde
nitrognio inorgnico (amnia e nitratos) at peptonas (Carvalho et al, 2003). Na
produo tradicional de angkak, no h necessidade de adio de fonte de
nitrognio, j que o arroz possui de 5 a 8% de protenas, (base seca) (Franco, 1992).
Ao usar outros substratos, a adio de uma fonte de nitrognio (especialmente N
orgnico) estimula a produo de pigmentos. Segundo Lin (1991) o uso de
glutamato monossdico como fonte de nitrognio estimula fortemente a produo de
pigmentos, o que foi confirmado em diversos trabalhos posteriores por outros
autores. O tipo de pigmento e a sua excreo pela clula so tambm relacionados
fonte de nitrognio: usar nitrognio orgnico, como em aminocidos, favorece a
formao de pigmentos vermelhos (Yongsmith et al, 1993; Juslov et al, 1996), e o
uso de peptonas melhor para a produo de pigmento e para o crescimento
23
celular, bem como para a secreo de pigmentos a pH 6,5 (Chen e Johns, 1993),
embora o uso de polipeptonas favorea a formao de pigmentos amarelos (Juzlov
et al, 1996). Tentou-se justificar o efeito estimulante de aminocidos sobre a
produo ou liberao de pigmentos postulando que os derivados dos pigmentos,
ligados a aminocidos, so mais solveis que os pigmentos originais. Na verdade,
esse efeito dos aminocidos sobre a produo ou liberao de pigmentos talvez no
exista, ou deva ser explicado de outra forma, j que trabalhos usando vrios
aminocidos revelaram que h forte influncia, positiva ou negativa, de aminocidos
diversos sobre a produo de pigmento. O derivado com leucina, por exemplo,
hidrossolvel e ainda assim causa represso da produo de pigmento (Lin e
Demain, 1994). O uso de nitrognio inorgnico (nitratos, amnia e seus sais)
estimula o crescimento celular (Lin e Demain, 1991), embora a amnia seja melhor
que o nitrato (Chen e Johns, 1993). Estudos demonstram que o uso de amnia
como fonte de nitrognio pode favorecer a produo de pigmento alaranjado
(Juzlov et al, 1996). Uma comparao das quantidades relativas e da qualidade de
cor de pigmentos produzidos usando diversos aminocidos mostra que pigmentos
amarelos e alaranjados no so afetados pela fonte de nitrognio, enquanto que os
pigmentos vermelhos diferem em tonalidade e solubilidade (Jung et al, 2003).
2.4.5 Outros fatores nutricionais
Diversos outros fatores podem afetar o crescimento do fungo e a produo de
pigmentos. Segundo Lin e Demain (1991), altas concentraes de fosfato e de
sulfato de magnsio so inibidoras da produo de pigmentos; por outro lado, o
crescimento uma funo linear e crescente da concentrao de MgSO4, na faixa
de 0,5-16mM.
A adio de leo de milho estimula (dobra) a produo de
pigmento,
enquanto a adio de 0,4% de tween 80 no afeta o consumo de glicose nem

retarda a taxa de crescimento, mas aumenta a produtividade de pigmento (6 a 8
vezes, atingindo 8535 unidades de absorbncia/g matria seca) (Chiu e Poon,
1993).
Meios de cultivo adequados para a produo de pigmentos de Monascus so
os mais diversos, desde os de composio definida at os naturais; como este fungo
24
um contaminante comum em gros e isolado de diversos substratos com alta

concentrao de slidos, trata-se de um fungo xeroflico (Pitt e Hocking, 1997), que
cresce em uma larga variedade de substratos naturais. Alguns substratos naturais j
experimentados, alm do arroz e outros cereais, so o amido de mandioca
(Yongsmith et al, 1993; Lee et al, 1995; Carvalho et al, 2001), o suco de figo da ndia
(Hamdi et al, 1996), e o soro de leite (Kujumdzieva et al, 1997). Em alguns casos,
como no amido de mandioca, necessrio suplementar esses substratos com
extrato de levedura e peptonas, como fontes de vitaminas e nitrognio orgnico. Os
componentes dos meios de fermentao complexos usados, j discutidos no texto,
compreendem uma srie de acares (mais comumente glicose), oligoelementos e
fontes de nitrognio orgnico (aminocidos, peptonas) ou inorgnico (amnio,
nitratos). Um meio usado em alguns trabalhos composto de: glucose 40g/L;
NH4NO3 3 g/L; K2HPO4
6g/L; KH2PO4 6g/L; MgSO4.7H2O 0,5g/L; KCl 0,5g/L;
FeSO4.7H2O 10mg/L; ZnSO4.7H2O 10 mg/L; MnSO4.H2O 3mg/L; pH final 6,3 (Wong

1981, op.cit. em Lin, 1991).
2.5 Mtodos de fermentao
A fermentao em substrato slido (FSS, tambm conhecida como
fermentao em meio slido, FMS e fermentao em estado slido, FES) um
mtodo tradicional de fermentao, usado h sculos para a produo de alimentos
tradicionais orientais, como o prprio angkak (Pandey, 1992; Pandey et al 2000,
2001). Existem vantagens na produo de pigmentos de Monascus por FMS: o
habitat mais natural para fungos (Pandey, 2001; Soccol e Vandenberghe, 2003),
com alta produtividade de pigmentos em processo relativamente barato
fermentao em bandejas, por exemplo. Esse mtodo o mais vantajoso quando o
pigmento a ser usado pode conter resduos do substrato como amido e fibras, bem
como o prprio miclio.
Caso seja necessria apenas a frao corante para uso em bebidas, por
exemplo o pigmento precisa ser extrado por um solvente orgnico, e em seguida o
solvente deve ser evaporado, por exemplo em um spray drier. Nesse caso, pode ser
interessante trabalhar com fermentao submersa, que embora apresente o
pigmento diludo em um grande volume de lquido, pode ter a biomassa e outros
25
eventuais componentes insolveis prontamente retirados por filtrao, e em seguida

pode-se efetuar a evaporao do solvente. Segundo Lee et al (1995), a produo de
pigmentos de Monascus, embora tradicionalmente feita em fermentao slida,
industrialmente levada a cabo em fermentadores submersos. Isso se deve ao fato de
que a fermentao slida de difcil controle de aerao, umidade, temperatura e
pH, enquanto que a fermentao submersa tem parmetros controlados com
facilidade; uma planta de fermentao submersa flexvel pode usar o mesmo
fermentador para culturas diversas, o que interessante em termos operacionais. O
controle de pH, por exemplo, pode permitir o direcionamento da fermentao no
sentido de favorecer a produo de pigmentos vermelhos (Santerre et al, 1995).
Ainda assim, pesquisa-se modelos de reatores e mtodos de fermentao slida
devido ao potencial desta forma de operao. No caso de Monascus, inclusive,
obteve-se produo at 3 vezes maior de pigmentos em meio slido, comparado
com meio lquido de mesma composio (Johns e Stuart, 1991). Mais recentemente,
usou-se uma fermentao submersa com um bloco de amido de mandioca
gelatinizado, numa tentativa de aumentar a concentrao de acares usando esse
substrato, que barato e incolor. Usando o amido em um bloco, h bastante fonte
de carbono disponvel, mas sem aumentar a viscosidade do meio com amido livre, o
que no compromete a transferncia de oxignio, sabidamente necessria (Lee et
al, 1995). Fermentaes usando mandioca e derivados em fermentao slida so
alternativas ao uso de arroz (Carvalho, 2001).
2.6 Toxicidade dos pigmentos e produo de citrinina
Diversos trabalhos foram j realizados com relao ao estudo da toxicidade
de pigmentos de Monascus, que aparentemente so incuos nas quantidades
testadas. O longo tempo pelo qual os pigmentos de Monascus j vm sendo usados
depem a favor da sua toxicidade baixa ou inexistente (Lin, 1991a). Por algum
tempo, desde que os fungos do gnero Monascus comearam a ser estudados
sistematicamente, acreditou-se que os pigmentos produzidos apresentavam tambm
propriedades antibiticas; mais tarde, verificou-se que essa atividade deve-se
principalmente a outra substncia, chamada monascidina A (Wong e Koehler, 1981).
Estudos posteriores mostraram que essa substncia na verdade a citrinina,
26
micotoxina de ao nefrotxica produzida por diversos fungos (Blanc et al., 1995a), e

que nem todas as cepas de Monascus produzem citrinina. Verificou-se ainda que a
fonte de nitrognio usada pode influenciar a produo de citrinina: para a mesma
cepa de M. ruber em meio sinttico com etanol, a produo de citrinina vai de 0mg/L
usando metionina como fonte de nitrognio at a 100mg/L usando nitrato de amnio
como fonte de nitrognio (Blanc et al., 1995). Finalmente, estudos sobre a toxicidade
de fraes purificadas dos pigmentos mostraram que h atividade biolgica para os
pigmentos de Monascus, especialmente os alaranjados e, em menor grau, os
vermelhos (Martnkov et al., 1995).
Embora no haja uma concluso definitiva sobre a toxicidade dos pigmentos
e da produo de citrinina em processos industriais, diversas aes podem ser
tomadas para evitar ou minorar a produo de toxinas: o uso de cepas que no
produzam citrinina; o controle da fonte de nitrognio (fontes de nitrognio orgnico
favorecem a produo de pigmentos vermelhos e desfavorecem a produo de
citrinina); o controle das condies de cultivo (aerao, pH, fermentao slida ou
submersa); a transformao de pigmentos laranja em complexos vermelhos,
atxicos, usando aminocidos (Blanc et al., 1995, 1995a; Juzlov et al.,1996) e a
extrao em condies de baixa solubilidade de citrinina, o que pode ser feito
controlando-se o pH, j que a citrinina apresenta carter fortemente cido (Merck,
1996).
2.6.1 Citrinina propriedades e anlise
A citrinina um metablito fngico conhecido desde 1931, quando foi isolada
de Penicillium citrinum e mais tarde da planta australiana Crotolaria crispata. Dez
anos mais tarde foi caracterizada como um antibitico e antibacteriano, e mais tarde
testada para atividade contra bacterifagos, sarcomas, protozorios, clulas animais
e clulas de plantas superiores. A citrinina foi implicada na nefropatia porcina e foi
encontrada como contaminante de milho, arroz, trigo e outros cereais, e em tomates
podres. Assim, a citrinina uma micotoxina potencialmente importante que pode ser
ingerida por animais e pelo homem e poderia causar doenas. Em adio, efeitos
fitotxicos da citrinina foram reportados (Betina, 1984). A estrutura da citrinina
ilustrada a seguir (Figura 7):
27
Figura 7 Estrutura da Citrinina
O
HO
OH
O
CH3
CH3 CH3
A citrinina tem carter cido pronunciado, praticamente insolvel em gua,

solvel em lcool a quente, dioxano e solventes apolares. Devido s duplas ligaes
conjugadas, a citrinina absorve luz no comprimento de onda visvel a sua
colorao varia de amarelo-limo em pH 4,6 a vermelho-cereja em pH 9,9 e seus
mximos de absoro encontram-se na faixa de ultravioleta: 250 e 331nm.
Apresenta ponto de fuso 175C e massa molar 250,25 g/mol (Merck, 1996).
Derivados da citrinina como decarboxicitrinina tm funo metablica
desconhecida, mas diversos estudos em sistemas in vivo e in vitro indicam que a
citrinina em si possui ao biolgica pela inibio da sntese de colesterol e
triglicerdeos, esta inibio sendo possivelmente causada por danos a sistemas de
transporte e/ou interferncias no metabolismo energtico (Betina, 1984).
A produo da citrinina se d de forma incidental em cereais contaminados
por fungos, ou no apodrecimento de frutas. uma das toxinas microbianas menos
comuns como contaminante em safras do Ocidente, se comparada com aflatoxinas e
ocratoxinas, embora aparea como metablito secundrio em algumas cepas de
microorganismos comuns no Oriente. A produo proposital se d em meios
lquidos, em condio esttica ou submersa, e em cereais por fermentao slida. A
ordem de produo em cultura esttica, para P. citrinum de at 1,75g/L em meio
com 4% de sacarose e 2% de extrato de levedura, inoculados com suspenses de
esporos de culturas com 10 a 14 dias. A produo mxima de citrinina se d aps 21
dias de fermentao. (Davis et al., op.cit. em Betina, 1984).
A anlise da estrutura da citrinina mostra que, em meio bsico, a citrinina
pode ter at dois grupos OH ionizados, o que aumenta a sua solubilidade em gua,
e em meio cido deve possuir os grupos no ionizados (Figura 7). Assim, acidificase o meio a pH 4,5 e extrai-se com um solvente apolar. Esse solvente dissolve
28
tambm os lipdios e outros compostos apolares, de forma que uma purificao

posterior necessria. Essa purificao pode ser feita atravs de cromatografia
preparativa em camada delgada, em que a toxina pode ser identificada pelo ndice
de reteno e pela fluorescncia caracterstica em luz UV (ultravioleta).
A anlise de citrinina em culturas slidas de fungos filamentosos pode ser
feita
pela
extrao
direta
com
acetonitrila.
extrato,
aps
filtrao,
desengordurado duas vezes com isooctano. Aps a adio de um volume igual de

gua e acidificao a pH 4,5 com cido sulfrico 50% (v/v), o extrato particionado
com CHCl3. A fase inferior evaporada at a secura, redissolvida em metanol (Blanc
et al., 1995). A anlise da soluo pode ser feita por HPLC, mas a tcnica inicial
mais simples a cromatografia em camada delgada (CCD).
Anlise qualitativa: por CCD. A fase fixa compe-se de placas de slica gel 60
com espessura 0,2mm, impregnadas antes do uso com cido oxlico (soluo a
10% em metanol). Padres e amostras da soluo so colocados usando
micropipetas com ponteiras descartveis (de 5L). O desenvolvimento da amostra
pode ser feito em uma dimenso usando clorofrmio-acetona (90:10, v/v) ou em
duas dimenses (clorofrmio-acetona 90:10, depois tolueno-acetato de etila-cido
frmico 60:30:30 v/v/v) (Blanc et al., 1995a).
Anlise quantitativa: por espectrofotometria ou HPLC. Aps a identificao,
por fluorescncia em luz UV, da citrinina (comparada com um padro na mesma
placa ou pelo clculo do tempo de reteno, de 0,6) a citrinina pode ser isolada da
fase estacionria pelo cuidadoso corte da placa de alumnio e a ressuspenso da
amostra em solvente adequado, por exemplo CHCl3, e a anlise contra uma curva
padro de citrinina no mesmo solvente, para 250 ou 331nm (Blanc et al., 1995a).
2.7 Mtodos de anlise de pigmentos
A anlise da produo de pigmentos de Monascus geralmente feita pela
medida da absorbncia do pigmento nas faixas prximas a 400, 470 e 500nm para
pigmentos amarelos, alaranjados e vermelhos respectivamente (Johns e Stuart,
1991; Lin 1992). A relao absorbncia
a 500nm /absorbncia a 400nm d,
supostamente, a relao entre pigmento vermelho e amarelo (Wong e Koehler,

1981). Alguns autores analisam pigmentos totais extracelulares e intracelulares
29
somando as absorbncias de pigmentos extracelulares ( medida a absorbncia do

meio de cultivo lquido, filtrado) e intracelulares ( medida a absorbncia de um
extrato etanlico do miclio, filtrado) (Lin, 1991; Juzlov et al., 1994). Quando se
trata de fermentao slida, o mtodo usado tem de ser a extrao por solvente para
posterior leitura da absorbncia. A quantidade de solvente usada , geralmente, de
5mL de solvente para cada grama de material fermentado, e o tempo de extrao
varia de 1 a 12h, dependendo do autor. Como as amostras precisam em muitos
casos ser diludas para que se faa a leitura, os valores de absorbncia no devem
ser diretamente comparados e podem ser extrapolados para absorbncia especfica,
levando em conta o fator de diluio da amostra (Chiu, 1993). A separao dos
pigmentos pode ser feita usando CCD (cromatografia em camada delgada) com
slica gel 60 e desenvolvendo o cromatograma com clorofrmio:metanol:cido
actico 285:21:9 (Carels, 1977, op. cit em Martnkov, 1995). Os pigmentos podem
tambm ser analisados por cromatografia lquida, usando uma coluna C18 e um
detector adequado. Note-se que a solubilidade do pigmento vermelho mais
elevada em uma soluo aquosa contendo 60-70% de etanol (Carvalho et al., 2002).
Outros solventes podem ser usados (acetonitrila, dimetilsulfxido, isopropanol), mas
o nico solvente comum que extrai pigmentos melhor que o etanol o metanol
que, porm, no recomendado para uso alimentcio por ser txico.
O fato de que os pigmentos amarelos, alaranjados e vermelhos de Monascus
so produzidos como uma mistura provavelmente afeta a anlise por simples
medida de absorbncia. No entanto, a grande maioria dos pesquisadores de
Monascus estimam a produo de pigmento por esse mtodo, com produes de
pigmento variando na faixa de centenas de unidades de absorbncia/mL de meio de
cultivo em fermentaes submersas (por exemplo, 220 UA510/mL, em condies
timas, por Kim et al, 2002, a milhares de unidades de absorbncia/g de substrato
seco, em FSS (por exemplo, 5430 UA500/g matria seca, por Lin e Demain [1992]). O
melhor procedimento para a anlise de pigmentos provavelmente a cromatografia
lquida, que permite separar e quantificar pigmentos individuais; usando este
mtodo, Hajjaj (2000) determinou que 1 unidade UA480 correspondente a 15 mg/L de
pigmento vermelho com M = 498 g/mol, e usou essa equivalncia para converso de
medidas de absorbncia de extratos em medidas de massa de pigmentos.
30
2.8 Uso e estabilidade de pigmentos de Monascus

Surpreendentemente,
poucos
trabalhos
tratam
da
estabilidade
de
preparaes base de Monascus, considerando que diversas indstrias produzem

esse pigmento. Alguma documentao pode ser obtida por consulta ao site
www.allok.com. De acordo com Lin e
Demain (1992), esses pigmentos so
razoavelmente estveis autoclavagem e em uma ampla faixa de pH. De acordo

com Fabre (1993), molhos ou pats coloridos com pigmentos vermelhos de
Monascus apresentam uma cor residual de 92 a 98% aps trs meses a 4C, com
boa aceitao sensorial. Os pigmentos so, no entanto, instveis frente luz
(apenas 20% de cor residual aps 50 dias) e calor (45% de cor residual aps 2h a
100C). Esses pigmentos so mais estveis em pH bsico ou neutro (Fabre et al.,
1993; Lee e Chen, 2000).
2.9 Mtodo de anlise de biomassa
Na fermentao em estado slido geralmente no possvel fazer uma
determinao
direta
da
biomassa,
devido
impossibilidade
de
separar
eficientemente a biomassa da matriz do substrato, o que descarta os mtodos

gravimtricos. A biomassa pode ser medida de forma indireta pela determinao de
componentes celulares como a glicosamina (presente na quitina, componente da
parede celular de fungos), do ergosterol (presente na membrana celular), de
protenas ou de cidos nuclicos (Pandey et al., 2001). possvel ainda estimar a
biomassa produzida atravs de um balano de CO2, levando em conta a composio
da biomassa e estequiometria do processo. Nas anlises por componentes
celulares, necessrio levar em conta as possveis interferncias da composio do
substrato: por exemplo, em fermentaes usando quitina como parte do substrato,
haver provvel interferncia na anlise de glicosamina; de forma semelhante, a
anlise de protena sofre interferncia das protenas do substrato, especialmente
quando no h adio de fontes de nitrognio.
O ergosterol
(Figura 8) um componente celular que pode ser
vantajosamente utilizado para a determinao indireta de biomassa fngica, devido

sua facilidade de extrao e anlise. Esse componente comumente quantificado
para a determinao de biomassa fngica em solos, porque o esterol mais
31
importante na membrana celular de fungos e de algumas microalgas (Gong et al.,

2001), mas praticamente ausente em plantas e animais superiores (Mattila et al.,
2002). A anlise de ergosterol foi proposta inicialmente para estimar a contaminao
de cereais por fungos, mas logo foi adotada como um mtodo para estimar a
biomassa fngica viva em solos, pressupondo que o ergosterol um marcador lbil,
que sofre rpida decomposio aps a morte da clula.
Figura 8 - Estrutura do ergosterol
HO
Outra aplicao para a dosagem de ergosterol a determinao de biomassa
e de esporos em superfcies de materiais paredes, tijolos, etc. Em trabalhos
recentes, determinou-se que o ergosterol no lbil persistindo em quantidades
importantes dependendo das condies a que submetido o que exige cuidado
quando se pretende us-lo como marcador para clulas vivas (Lindblom et al., 2004,
Zhao et al., 2004). Isso, no entanto, refora a utilidade em FMS, j que se garante a
quantificao da biomassa total, com a permanncia do ergosterol durante o
processo.
A extrao do ergosterol varia dependendo do grupo de pesquisa, mas de
uma forma geral baseia-se no mtodo de Seitz et al. (1979), que consiste em extrair
os lipdios de uma amostra (de gros) com metanol em refluxo, saponificar a
amostra com soluo de KOH a 70C por 30 min e fazer uma nova extrao com um
solvente apolar, como o ciclohexano. Na tentativa de acelerar a extrao, diversos
autores usaram tratamentos trmicos ou mecnicos alternativos, com bons
resultados por exemplo, aquecendo o material em um forno de microondas
(Montgomery et al., 2000), situao em que a temperatura aumenta muito
rapidamente e a recuperao de ergosterol quase total. Outro mtodo consiste na
32
agitao em vrtex da amostra com metanol e prolas de vidro, seguida de

centrifugao - sem saponificao ou extrao posterior (Gong et al, 2001), com
recuperao de 100%; outro trabalho usa o mtodo de Seitz, mas substituindo o
aquecimento em refluxo pela sonicao da amostra, seguida de resfriamento e
saponificao (Zhao et al., 2004). Para amostras secas (liofilizadas), a extrao com
hexano pode ser feita antes da saponificao, como em Klamer e Bth (2004).
A anlise do ergosterol nos extratos feita em geral por HPLC, com detector
PDA (matriz de fotodiodos) a 282nm, que o maior pico de absorbncia para o
ergosterol. A Tabela 4 mostra as condies de anlise para algumas referncias
selecionadas:
Tabela 4 Condies de anlise de ergosterol em HPLC
Coluna
Fase mvel (V/V)
C18
C18
C18 4 m
C18 5 m
Acetonitrila : metanol 98:2

Metanol
Metanol
Metanol
Vazo,
mL/min
2
1,0
1,5
1
C18
Acetonitrila metanol (gradiente)
Tr,
Referncia
min
Montgomery (2000)
15
Gong (2001)
7-8
Zhao (2004)
12,5 / Lindblom (2004)
13,7
12 a Este trabalho
13
ainda possvel estimar a quantidade de ergosterol pela anlise usando um

espectrofotmetro, como fizeram Gutarowska e Zakowska (2002), embora isso
inclua a absorbncia por eventuais contaminantes, e exija, portanto, uma consistente
extrao prvia.
O teor de ergosterol varia bastante para diferentes espcies de fungos: na
faixa de 3 a 5 mg/g biomassa seca em alguns basidiomicetos (Matilla et al., 2002), 4
mg/g biomassa seca em alguns actinomicetos (Montgomery et al., 2000) e em mdia
3,1 mg/g biomassa seca (numa faixa de 1 a 24 mg/g biomassa seca) para uma srie
de fungos presentes em composto, mais 2 basidiomicetos (Klamer e Bth, 2004)
No caso especfico de Monascus em FMS sobre arroz, a anlise de biomassa
via quantificao ergosterol um mtodo prtico, j que a de nitrognio protico
invivel pois o prprio substrato possui um teor de protenas da ordem de 1%, que
seria convertido parcialmente biomassa e necessariamente quantificado
indistintamente com a mesma. A anlise de glicosamina, alm de tediosa, feita a
530 nm (Germano, 2000), podendo sofrer interferncia dos pigmentos de Monascus.
33
3 MATERIAL E MTODOS
Todos os experimentos descritos neste trabalho foram realizados no
Laboratrio de Processos Biotecnolgicos (LPB) da Diviso de Engenharia de
Bioprocessos e Biotecnologia da UFPR.
3.1 Cepas e Manuteno
Um total de 4 cepas (linhagens) de Monascus foi utilizado neste trabalho:
duas cepas fornecidas pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, NRRL
1991 (Monascus. sp) e
NRRL 2897 (M. purpureus), uma cepa fornecida pela
Fundao Andr Tosello, CCT 3802 (M. purpureus), e LPB 31, uma cepa isolada no
LPB da UFPR atravs da tcnica de repiques sucessivos em meio PDA, at
obteno de uma cultura pura, a partir de miclio de Monascus sobre arroz. A
manuteno foi feita atravs de repiques peridicos (em intervalos de 3 a 4 meses)
em PDA, com incubao a 30-32C durante 10 dias e refrigerao no perodo
subseqente, at o repique seguinte.
3.2 Preparao de inculos
Para as fermentaes, dois tipos de inculos foram usados, dependendo do
experimento: 1) inculo em meio lquido, para inoculao de fermentaes em meio
lquido (com volume superior a 500mL), fermentao em frascos para comparao
de substratos, e fermentaes em bandeja, e 2) suspenso de esporos/miclio
extrados de culturas em placa de Petri, para as fermentaes em colunas, frascos,
reator e culturas lquidas em erlenmeyer.
3.2.1 Inculos em meio lquido
Foram obtidos pela inoculao com suspenso de esporos (obtidos de
culturas em gar PDA), de meio lquido com composio conforme Lin e Demain,
1991: para 1 litro de meio, so adicionados 40g de glicose, 3g de NH4NO3, 6g de
K2HPO4, 6g de KH2PO4, 0,5g de MgSO4.7H2O, 0,5g de KCl, 10mg de FeSO4.7H2O,
10mg de ZnSO4.7H2O, 3mg de MnSO4.H2O, pH ajustado com NaOH ou HCl a 5,5-
34
6,3; aps inoculao, o meio incubado por 3 dias a 100rpm e 32C, em shaker, e
utilizado para inoculao na proporo de 5% em relao massa ou volume do
meio de cultivo a inocular, imediatamente antes do perodo de incubao, por
transferncia com pipetas (para meios slidos) ou bomba peristltica (para
fermentador de bancada).
3.2.2 Suspenses de esporos
Estes inculos foram preparados imediatamente antes do seu uso, e obtidos a
partir das culturas-estoque por inoculao, com ala metlica, sobre gar PDA
estril, em placas de Petri, e incubadas por 8 a 10 dias. Aps a incubao, foi feita a
suspenso de esporos atravs da adio de 5 mL de Tween 80 a 0,1% sobre as
placas, com o auxlio de uma ala de Drigalski. As suspenses de esporos foram
padronizadas pela adio de gua, para 0,5 a 1.106 esporos/mL, contando como
esporos os prprios esporos e tambm fragmentos miceliais intactos. A contagem
foi feita por microscopia, utilizando-se uma cmara de Neubauer (Leica DMLS). Os
inculos foram transferidos aos frascos ou colunas em que foram feitas as
fermentaes, usando pipetas, com posterior homogeneizao do meio. A taxa de
inoculao utilizada foi equivalente a 5% do volume (em fermentao lquida em
erlenmeyer) ou da massa (em FSS) do material a fermentar. Por exemplo, em FSS
de 20g de arroz em frascos foi utilizado 20 x 5% = 1mL de suspenso de esporos.
3.3 Comparao de cepas
3.3.1 Determinao de crescimento radial
O crescimento radial das linhagens foi medido inoculando-se placas com meio
PDA com as respectivas linhagens, em um nico ponto no centro de cada placa, em
duplicata (8 placas). As placas foram incubadas a 30C, por 12dias. A medida das
colnias foi feita com rgua, a partir do centro da placa, ao longo de 2 eixos
perpendiculares (4 medidas por placa), a intervalos de cerca de 24h. Os valores
obtidos foram usados para compor valores mdios (mdia aritmtica) de
comprimento x tempo de incubao.
35
3.3.2 Comparao de cepas quanto produo de pigmentos

A comparao foi feita incubando 10g de meio (arroz com 56% de umidade
ou bagao de mandioca com 70% de umidade) a 32C em frascos de vidro de
600mL, aps inoculao com suspenses de esporos das diferentes cepas, por 8
dias (arroz) e 10 dias (bagao de mandioca). Aps a incubao, os fermentados
foram secos, e determinou-se o teor de pigmentos (mtodo na pgina 39) e de
citrinina (mtodo na pgina 40).
3.4 Comparao de mtodos de extrao
3.4.1 Extraes esttica, agitada, com Soxhlet, com diferentes solventes
Como trata-se de desenvolvimento de mtodo, os mtodos utilizados
encontram-se na seo Resultados e Discusso (pgina 48). Os solventes utilizados
foram dimetil sulfxido (DMSO, (CH3)2SO); n-hexano, ter etlico, lcool etlico,
acetonitrila, metanol, clorofrmio e isopropanol. Todos os solventes utilizados eram
PA. A gua utilizada para extraes era deionizada. Quando necessrio, o pH da
gua foi ajustado com HCl ou NaOH.
3.5 Substratos utilizados
Alm dos meios de cultivo utilizados para inculos (vide seo anterior), foram
usados os seguintes meios, dependendo do objetivo do experimento:
3.5.1 FSS em arroz, em coluna, frasco ou bandeja
Arroz cateto integral umedecido com gua deionizada, at 56% de umidade,
com ajuste do pH para 6,5 com adio de HCl ou NaOH, e posterior autoclavagem a
121C por 15 minutos. O ciclo da autoclave garante o cozimento do arroz e a
gelatinizao do amido, mas para melhores resultados necessrio permitir que o
arroz absorva parte da gua antes da esterilizao, deixando-o em repouso por 2 a
4 horas. O meio de cultivo assim preparado deve ser usado logo depois do
resfriamento, para evitar aglutinao excessiva. O mtodo tradicional de preparo de
inculo consiste em deixar o arroz de molho em gua, por 24h, e posteriormente
36
cozinh-lo com vapor (Palo et al, 1960; Wong e Koehler, 1981); esse mtodo,
embora eficiente, inconveniente para os ensaios com umidade controlada, devido
impossibilidade de controlar a absoro de vapor pelo arroz.
3.5.2 FSS em bagao de mandioca, em coluna, frasco ou bandeja
Bagao de mandioca com granulometria entre 0,8 e 2,0 mm, adicionado de
gua deionizada at 70% de umidade, com ajuste de pH para 6,5 com adio de
HCl ou NaOH e posterior esterilizao em autoclave por 15 min a 121C.
3.5.3 FSS de diferentes substratos potenciais, em frascos
Foram usados como substratos quirera de milho, quirera de arroz, trigo para
quibe, soja moda, farelo de soja, protena texturizada de soja, tapioca, mandioca
crua, bagao de mandioca, farinha dgua e batata seca. Esses substratos foram
modos e classificados por peneiramento, utilizando-se a frao de granulometria
entre 0,8 e 2,0mm. Os meios foram preparados pela mistura de 10g de substrato
com gua suficiente para completar 56% de umidade, ajustando o pH para 6,5
quando necessrio e prosseguindo com a esterilizao a 121 C por 15 min. Os
experimentos foram feitos em triplicata, inoculados com 5% v/m de uma cultura ativa
em meio lquido (Lin e Demain, 1991) e incubados a 30-32C por 8 dias.
3.6 Otimizao das condies de cultivo em bagao de mandioca
Para os planejamentos experimentais descritos na seo Resultados e
Discusso (item 4.5.3) foram utilizados meios preparados com bagao de mandioca
de granulometria 0,8-2,0 mm, adicionados de levedura seca (fermento biolgico
Burgemann) e protena texturizada de soja, micronizada com um moinho de lminas
no LPB. Os componentes dos meios foram adicionados a frascos de vidro de
600mL, autoclavados e inoculados com suspenses de esporos, e incubados por 10
dias a 32C. A anlise de pigmentos foi feita como descrito no mtodo da pgina 39.
37
3.7 Ensaios de estabilidade de pigmentos

Os pigmentos usados para ensaios de estabilidade foram extrados de
biomassa pura, obtida de uma fermentao lquida. O inculo para esta fermentao
foi uma cultura ativa de 3 dias, em meio lquido (conforme descrito na pgina 33). A
fermentao foi feita em um fermentador Bio-Flo de 15L, com 12L de meio lquido,
com um aerao de 10 NLPM (litros normais por minuto, isto , a aerao
equivalente a 10 litros de ar a 0C e 1atm, por minuto), controlado atravs de um
rotmetro com vlvula. A agitao foi de 100 rpm, a 32C, por 10 dias. O meio
utilizado foi o de Lin e Demain (1991).
3.7.1 Isolamento da biomassa
Aps o cultivo, o meio de fermentao foi filtrado atravs de um filtro de
tecido, e a biomassa lavada com gua deionizada, drenada e congelada a -20C.
Essa biomassa foi posteriormente utilizada para os ensaios de estabilidade de
pigmentos.
3.7.2 Preparao de extratos
Uma amostra de 5g de biomassa drenada e congelada foi misturada com
25_mL de etanol 95%. Aps 1h de extrao com agitao peridica, a mistura foi
filtrada atravs de uma membrana de 0,47m, e o filtrado foi usado como extrato
bruto de pigmentos.
3.7.3 Solues de pigmentos
Um volume de 5mL do extrato alcolico bruto foi diludo com gua suficiente
para completar 500g. A partir dessa soluo, foram preparadas outras solues com
a mesma concentrao, mas com pH ajustado a valores diversos 4,1; 4,7; 6,0; 7,3
e 7,9 pela adio de solues de NaOH ou HCl. A diluio causada pela adio de
cido ou base foi estimada como sendo da ordem de 0,5% em peso. Uma soluo
alcolica foi preparada de forma similar, diluindo 1mL de extrato alcolico bruto em
lcool 95%, at um volume final de 100mL.
38
3.7.4 Anlises de estabilidade

As solues aquosas e alcolicas foram armazenadas em tubos de ensaio de
mesmo tamanho, cor e espessura, com tampa, e incubadas a diferentes
temperaturas por vrias horas. A intensidade de cor foi lida como absorbncia a
500nm, diretamente para cada tubo, contra gua como branco. Com esse
procedimento, evitou-se a alterao da absorbncia dos extratos por transferncias
sucessivas para a cubeta de leitura do espectrofotmetro. Os resultados foram
normalizados dividindo a absorbncia obtida para cada tubo ao longo da incubao,
pela absorbncia inicial nesse mesmo tubo.
3.8 Extrao de pigmentos e anlise da absorbncia
Os pigmentos de Monascus foram extrados de meios fermentados por FSS
ou de biomassa separada por filtrao de fermentados de FL. O solvente utilizado foi
etanol a 95%, exceto para experimentos de comparao de solventes. A proporo
de etanol:fermentado utilizada foi de 5mL etanol para cada grama de fermentado
seco, ou maior (quando se desejava realizar uma diluio do pigmento no mesmo
passo da extrao), exceto para ensaios de proporo solvente:substrato na
extrao. O tempo de extrao foi de 12 a 24h, em extrao esttica.
A produo de pigmentos nos experimentos foi estimada atravs da leitura da
absorbncia a 500nm (expressa como UA, unidades de absorbncia). Os valores
obtidos para ensaios em condies idnticas podem ser comparados diretamente,
apenas corrigindo o valor de absorbncia para a diluio. Se for necessrio
comparar ensaios diferentes (inclusive quando varia o inculo de uma duplicata de
experimento), os resultados devem ser transformados em uma absorbncia
especfica, isto , corrigidos pela diluio e pela quantidade de fermentado do qual
se extraiu o pigmento. A Figura 9 ilustra um exemplo em que 1g de meio fermentado
extrado, filtrado, diludo e analisado.
39
Figura 9 Procedimento de extrao e anlise de pigmentos de Monascus para

determinao da produo de pigmentos vermelhos
5mL
Amostr
Diluio:
de
suficiente
12-24h de
extrao esttica
Meio
fermentado,
para
Ler
Filtra
10g de
o
absorbncia
e/ou
a
da
A leitura de absorbncia dos extratos dos diversos ensaios foi feita no

comprimento de onda de 500 nm, correspondendo a um mximo de absorbncia
para os pigmentos vermelhos (Johns e Stuart, 1991; Lin e Demain 1992), aps
filtrao com membrana (0,47 m) ou centrifugao por 15 min a 10.000g. Quando
necessrio, os extratos foram diludos com etanol. A absorbncia obtida foi corrigida
contra branco (etanol 95%) e multiplicada pela diluio, pelo volume de solvente
usado na extrao e dividida pela massa seca inicial de substrato, para fornecer o
que chamamos de absorbncia especfica. Por exemplo, para uma extrao de 10g
de fermentado seco, extrado com 50mL de etanol 95%, diludo a 1:20 e com a
absorbncia da amostra sendo 0,354:
ABS especfica = 0,354 x 20 x 50 / 10 = 35,4 UA/g
sendo o resultado dado em UA/g, unidades de absorbncia por massa seca
de
substrato.
Esse
resultado
comparado
diretamente
para
diferentes
experimentos, sendo considerado como proporcional quantidade de pigmentos

vermelhos produzidos na fermentao (Johns e Stuart, 1991; Lin e Demain, 1992;
Chiu e Poon, 1993). Embora a maioria dos pesquisadores de Monascus trabalhe
com a produo de pigmentos expressa como UA/frasco ou UA/g fermentado seco,
alguns pesquisadores especialmente os que utilizam fermentao lquida
convertem os valores de UA em massa de pigmento. Hajjaj et al. (2000) consideram
que 1UA480 ~ 15mg/L. A partir dessa considerao, pode-se concluir que a
absorbncia especfica do pigmento puro de 66,7kUA/g pigmento. Usando esse
fator de converso para estimar a massa de pigmentos em FSS, possvel
comparar a produo obtida em experimentos usando FSS (onde a produo de
40
pigmentos geralmente expressa em funo da absorbncia) com resultados de

fermentao submersa (onde a produo expressa como concentrao em mg/L).
A absorbncia relativa , dentro de um conjunto de valores de absorbncia
especfica, a porcentagem em relao ao valor mais alto.
3.8.1 Extrao de pigmentos na comparao de substratos
Os meios fermentados foram secos a 55C por 24h, seguindo-se extrao
esttica com etanol a 95% por 12h, e finalmente centrifugao dos extratos a
10000g por 15 minutos para precipitar partculas. Quando necessrio, as amostras
foram diludas para permitir leitura no espectrofotmetro.
3.9 Extrao e anlise da citrinina
3.9.1 Extrao
Para verificar a produo de citrinina nas culturas de Monascus, necessrio
efetuar uma extrao; o mtodo consiste em efetuar uma extrao aquosa a partir
das culturas slidas, deixando-as por 1h em contato com gua, sob agitao a
100_rpm, na proporo de 10 mL de gua/ g de substrato seco original. O extrato
filtrado e extrado duas vezes com 10 mL de n-butanol saturado com gua. A fase
orgnica , em seguida, seca com Na2SO4 anidro, e a soluo concentrada por
secagem a vcuo (a uma temperatura mxima de 45C). O resduo seco
redissolvido em 50 mL de gua deionizada, que acidificada at pH 2 (medido com
papel de pH universal), usando HCl 3M. A soluo extrada 2 vezes com acetato
de etila (2x10mL), seca com Na2SO4 e evaporada sob vcuo reduzido, e finalmente
ressuspendida em metanol (500 L/g de substrato seco original) para anlise
cromatogrfica.
3.9.2 Cromatografia preparativa de citrinina
Para separar melhor a frao correspondente citrinina no extrato em
anlise, procedeu-se aplicao de uma alquota de 200 L de soluo metanlica
em placas de slica gel 60 (Merck & Co, NJ EUA) em paralelo com um alquota de
41
50 L de citrinina 2000ppm em metanol. A corrida foi feita com uma mistura gua
metanol 1:1 (v/v) acidificada com HCl (pH 3). A regio da placa contendo a frao
correspondente citrinina foi recortada, ressuspendida em metanol (2mL), filtrada,
evaporada at secagem, ressuspendida em 20 L de metanol e injetada como
amostra no HPLC.
3.9.3 Anlise de citrinina
Aps a extrao, o resduo ressuspendido que pode conter citrinina
analisado por cromatografia em HPLC usando uma coluna C18 com um gradiente de
concentrao de H2O/MeOH temperatura ambiente, com vazo de 0,8mL/min, com
a leitura sendo feita a 260 nm. (Blanc et al., 1995a). O padro de citrinina usado
para comparao foi citrinina PA, Sigma.
3.10 Anlise de biomassa em FSS
Foi utilizado 1g de amostra de cada coluna sob anlise (as mesmas amostras
usadas na respirometria).
3.10.1 Preparo de padro de biomassa
Foram preparados 100 mL de meio lquido (Lin e Demain, 1991), que foram
em seguida autoclavados e inoculados com um pedao de miclio em gar (cerca de
0,5 cm2), incubado sob agitao (120 rpm) por um dia e de forma esttica por mais 7
dias, a 32C.
3.10.2 Extrao da biomassa
A biomassa obtida na fermentao anterior foi filtrada em papel e seca a 40C
em dessecador com slica gel como adsorvente, por 12 horas.
3.10.3 Extrao do ergosterol
Mtodo adaptado de Seitz (1979): 0,5 g das amostras de fermentado e 0,4 g
de biomassa seca foram colocados em frascos de vidro, aos quais adicionou-se 2mL
42
de etanol P.A. e 1 mL de soluo de NaOH 2M. Os frascos foram agitados,

tampados e incubados a 70C por 30 min., com agitao peridica. Aps a
incubao, adicionou-se a cada frasco 2mL de cido clordrico 1M, agitou-se,
adicionou-se 1mL de KHCO3 1M e 2 mL de n-hexano. A mistura foi agitada,
transferida para um tubo de ensaio e centrifugada para separar as fases leve e
pesada. A fase leve (n-hexano) foi recolhida, e procedeu-se a nova extrao com
mais 2mL de n-hexano, e uma ltima extrao com 1mL de n-hexano. O extrato na
fase orgnica foi evaporado a vcuo (200mmHg) a 35C, ressuspendido em 200mL
de n-hexano e filtrado em membrana de PVDF.
3.10.4 Anlise do ergosterol
A anlise dos extratos foi feita em um HPLC Varian ProStar, com coluna C18 e
detetor PDA (matriz de fotodiodos) regulado a 282 nm. As condies de eluio do
analito foram desenvolvidas a partir de Montgomery et al., (2000); Gong et al.,
(2001); Zhao et al., (2004); e Lindblom et al., (2004) e ajustadas para o equipamento
usado no LPB.
Utilizou-se 10 L de amostra. A fase mvel utilizada foi metanol puro (de 0 a 3
min), acetonitrila pura de 3 a 10 minutos, e metanol puro de 10 a 15 minutos com
vazo de 2mL/min, para eluir outros componentes presentes na amostra. O tempo
de reteno obtido foi de 3,35 minutos. Como amostra padro foi utilizada uma
soluo de ergosterol PA a 10000 g/mL , com diluies a 5000 e 1000 g/mL. Como
amostra para a linha base utilizou-se 10 mL de hexano puro.
3.11 Anlise respiromtrica
3.11.1 Respirometria em colunas
Com o objetivo de determinar parmetros cinticos de crescimento e
produo de pigmentos por Monascus LPB 31, foi utilizado um sistema de
fermentao em colunas, com banho de temperatura controlado a 32C. Foram
utilizadas 10 colunas, contendo 60g de arroz com 53% de umidade inicial + 3 mL de
inculo lquido com 2,5.106 esporos/mL (aumentando portanto a umidade para cerca
de 56%). O meio de cultivo inoculado foi pesado dentro de uma cmara de fluxo
43
laminar. As colunas foram fechadas em ambas as extremidades com filtros de

algodo, e ligadas a umidificadores para saturar o ar com umidade. A aerao
utilizada foi de 1NmL.min-1.g-1 de substrato para cada coluna, medido usando-se um
rotmetro; a temperatura foi controlada em 32C. O CO2 produzido e o O2
consumido pelas culturas foram medidos atravs de um sistema de cromatografia
gasosa (Shimadzu GC-8A, Shimadzu Co., Japo) acoplado a um programa de
controle
do
cromatgrafo,
integrao
registro
dos
resultados
(Chroma
Biosystmes, Ltd., Frana). A coluna utilizada no cromatgrafo foi uma Porapak

80/100 a 60C, com 2m de comprimento, com hlio como gs de arraste e detector
de condutividade trmica. medida que os meios foram fermentando, as colunas
foram retiradas uma a uma, a intervalos de cerca de 24h, e congeladas a -20C em
freezer para posterior anlise. Antes das extraes, os fermentados das colunas
foram secos a vcuo (10mmHg) a 45C por 24 horas, para posterior anlise dos
pigmentos e da biomassa (via anlise do ergosterol).
3.11.2 Respirometria em reator
Uma segunda anlise respiromtrica foi feita usando um reator desenvolvido
no LPB, com 2400g de arroz com 56% de umidade, fermentado com uma
temperatura controlada em 32C. Amostras foram retiradas diariamente do reator e
congeladas a -20C em freezer, para posterior secagem a vcuo (10mmHg) a 45C
por 24 horas. Para este experimento foi feito o mesmo acompanhamento e anlises
feitas para o sistema em coluna, exceto a anlise de biomassa.
3.12 Clculos - Regresso, ajuste de curvas e parmetros cinticos
Quatro programas de computador foram utilizados para a determinao dos
parmetros cinticos, superfcies de resposta, etc. Para os grficos de planejamento
experimental YEA-PTS-H2O foi utilizado o software Statistica 4.3 (STATSOFT). Para
os ajustes sigmoidais de biomassa e pigmentos foi utilizado o software Origin Pro 6.1
(OriginLab); para ajustes de regresso linear e demais grficos foi utilizado o
software Excel 2002 (Microsoft). Para determinao de parmetros cinticos, de
acordo com Pandey et al. (2001), foi utilizado o programa FERSOL (RodriguezLen,_1988).
44
4 RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 Isolamento e caracterizao do microorganismo.
A linhagem LPB 31 foi isolada a partir de arroz contaminado com fungos
vermelhos. Pores do miclio e esporos foram retirados da amostra com uma ala
metlica, e inoculadas em um tubo com gar PDA inclinado, com incubao a 28C.
Aps o crescimento, uma alada do miclio foi repicada em gar PDA, que foi
incubado novamente. O processo foi repetido sucessivamente at a obteno de
culturas de aspecto homogneo, consideradas como culturas puras. A observao
dessas culturas revela que o microorganismo isolado apresenta as caractersticas
tpicas
de
culturas
de
Monascus,
isto
colnias
planas,
com
algum
desenvolvimento areo, miclio inicialmente branco, ganhando pigmentao ao

longo do envelhecimento (do centro para a borda), pigmentao caracterstica
pardo-avermelhada, com difuso de pigmentos pelo gar. A Figura 10a mostra uma
placa de gar PDA com algumas colnias bem desenvolvidas. Nota-se um halo de
pigmentao, bem difundido por quase toda a placa, e o aspecto floculento do
miclio areo.
Figura 10 (a) aspecto macroscpico e (b,c) microscpico, com aumento de 400 vezes, da
cepa LPB 31 aps 7 dias, em PDA a 30C
45
O exame microscpico mostra um miclio com pigmentao pardoavermelhada, cleistotcios com paredes finas e ascsporos hialinos de forma
ovalada. A Figura 10b mostra uma poro isolada do miclio areo, com a formao
de aleuriocondias terminais, piriformes e isoladas. A Figura 10c mostra um
cleistotcio intacto e outro rompido, com a liberao de esporos.
O aspecto das culturas da linhagem isolada em placa tambm remete a
outras espcies de Monascus, inclusive pela produo de pigmentos de colorao
tpica. A Figura 11 mostra as 4 linhagens de Monascus usadas neste trabalho,
incubadas a 30-32C.
Figura 11 Diferentes linhagens de Monascus em PDA, incubadas por 8 dias a 30-32C
4.2 Comparao de cepas

As quatro cepas de Monascus utilizadas foram comparadas quanto
velocidade de crescimento em PDA, medido atravs do crescimento radial (Figura
12) e pela produo de pigmentos vermelhos em arroz e em bagao de mandioca,
aps 7 e 11 dias de fermentao, respectivamente.
46
Figura 12 raio mdio das colnias (mm) x tempo de incubao (h) para as linhagens
comparadas
40
raio mdio x tempo
raio mdio das colnias, mm
35
30
25
1991
2897
3802
LPB31
20
15
10
5
0
0
50
100
150
200
250
300
tempo de incubao, h
A anlise do grfico mostra que as linhagens 1991, 2897 e LPB 31

desenvolvem-se de forma comparvel, com tamanho de colnia um pouco maior
para LPB 31, enquanto a linhagem CCT 3802 apresenta colnias cerca de 30%
menores.
Os resultados da Figura 12 mostram que a cepa isolada, LPB 31, apresenta
velocidade mdia de crescimento similar das cepas NRRL 2897 e NRRL 1991, e
superior linhagem CCT 3802.
Tabela 5 Crescimento, produo de pigmentos e produo de citrinina pelas linhagens
testadas, aps 7 dias de incubao (arroz) e 11 dias (bagao de mandioca).
Cepa
NRRL 1991
NRRL 2897
CCT3802
LPB 31
Crescimento Coeficiente de Produo de pigmento (UA

radial mdio regresso para / g de produto seco)
(mm/dia)
o crescimento
radial, R2
Arroz,
56% BM,
70%
umidade
umidade
2,9
0,983
16,9
2,4
3,0
0,998
14,1
13,0
2,3
0,980
15,5
2,1
3,1
0,994
89,3
20,0
Produo de
citrinina em
arroz
g/g produto
seco
25
22
20
18
A Tabela 5 indica ainda que a cepa isolada apresenta tambm produo de

pigmento expressivamente superior s outras testadas, em bagao de mandioca e
47
especialmente em arroz (o bagao de mandioca foi utilizado por ser um substrato

tradicional usado em FSS no LPB, enquanto o arroz o substrato tradicional para a
produo de pigmentos de Monascus). Comparando as caractersticas das
linhagens testadas com outras linhagens avaliadas por Miyashira et al. (2003),
tambm em FSS de arroz, verifica-se que a linhagem isolada, LPB 31, superior s
outras linhagens de Monascus testadas, e apresenta nessas condies pigmentao
apenas 13% inferior a um produto comercial (Tabela 6):
Tabela 6 Comparao de linhagens diversas quanto produo relativa de pigmentos, a
produtividade e a produo de citrinina, para fermentao em arroz.
Linhagem
Absorbncia
relativa (500nm)
CCT 3802
0,15a
ATCC 6405
0,47 a
ATCC 16365
0,47 a
UFPE 3196
0,14 a
Produto comercial 1,00 a
NRRL 1991
0,16
NRRL 2897
0,14
CCT 3802
0,15
LPB 31
0,87
a valores extrados de Miyashira, 2003
Produtividade
dia-1
0,021
0,047
0,067
0,01
0,07
0,023
0,020
0,021
0,124
Citrinina
g/g produto
20
23
83
29
31
25
22
20
18
A absorbncia relativa a absorbncia obtida para cada cepa, nas mesmas

condies, dividida pelo maior valor (o do produto comercial). A produtividade foi
calculada dividindo-se a absorbncia relativa pelo tempo de fermentao. Verifica-se
pela anlise da Tabela 6 que a melhor linhagem testada o isolado LPB 31, tanto
em termos de produo relativa inferior apenas ao produto comercial, em ca 13%
quanto em produtividade de pigmento, superior aos demais, e produo de citrinina,
a menor entre todas. Isso mostra que um produto fabricado a partir dessa linhagem
pode ser similar ao comercial em termos de cor, e melhor em termos de toxicidade,
apresentando cerca de 40% menos citrinina que o produto comercial. Assim, a cepa
LPB 31 foi selecionada para os demais ensaios, visando o desenvolvimento de um
bioprocesso para a produo desses pigmentos.
48
4.3 Otimizao das condies de extrao de pigmentos

Todos os ensaios de comparao de substratos, formulao de meios de
cultivo, cintica de produo de pigmentos e a prpria separao e formulao de
um produto baseado em Monascus dependem da extrao eficiente dos pigmentos.
Os experimentos a seguir foram realizados para definir as melhores condies de
extrao de pigmentos de Monascus, a partir de fermentados obtidos em frascos de
vidro como descrito em Material e mtodos.
4.3.1 Extraes estticas ou agitadas
A extrao de pigmentos de Monascus pode ser feita de forma esttica com
agitao ocasional, por perodo de 1h ou mais, ou esttica por 12 horas, (Chiu e
Poon, 1993) com resultados equivalentes. Uma forma de aumentar a eficincia da
extrao usar um extrator de Soxhlet (realizando extraes sucessivas,
exausto) o que apresenta um grau de extrao superior em cerca de 20% s
extraes estticas, mas com aparato mais complexo (dados no publicados). Os
ensaios a seguir foram feitos com fermentados diversos, mas sempre em condies
idnticas dentro de um mesmo ensaio, com tempo de extrao de 24h, para garantir
a eficincia na extrao.
4.3.2 Extrao usando diferentes solventes
Analisando as estruturas dos pigmentos vermelhos produzidos por Monascus,
pode-se concluir que as molculas so pouco polares, devido aos trs grupos
carbonila presentes na molcula e ao grupo amino (Figura 13); como existe uma
cadeia apolar (de
7 carbonos
na monascorubramina e 5 carbonos
na
rubropunctamina), difcil prever a solubilidade desses pigmentos pela mera

inspeo da estrutura.
49
Figura 13 Estrutura dos pigmentos vermelhos de Monascus
O
O
NH
O
O
A solubilidade dos pigmentos vermelhos em diferentes solventes foi testada

usando bagao de mandioca fermentado, previamente seco (para evitar a
interferncia de umidade) para diferentes quantidades e tipos de solventes, de
acordo com o descrito na seo Material e Mtodos. Os resultados dos
experimentos so ilustrados a seguir (Tabela 7). Os solventes esto listados em
ordem decrescente de ndice de polaridade de Snyder.
Tabela 7 Absorbncia relativa de pigmentos vermelhos extrados com
diferentes solventes, a partir de 1g de substrato seco fermentado
Solvente
gua, pH 1
gua, pH 3
gua, pH 7
gua, pH 11
gua, pH 12,3
DMSO
Acetonitrila
Etanol 95%
ter etlico
Hexano
Absorbncia relativa
(% do mximo
extrado)
2,2
6,2
5,6
3,8
19,7
100
70,8
96,6
76,7
8,3
Os resultados indicam que a gua no um solvente adequado para a

extrao de pigmentos de Monascus produzidos em FSS. A mudana na cor em pH
12,3 indicada na Tabela 7, pode ser devida a mudanas em componentes do
substrato ou na estrutura dos pigmentos, o que merece investigao futura. Outra
possibilidade que em pH 12,3 ocorra saponificao dos lipdios da membrana
celular dos microorganismos, com maior disperso dos pigmentos intracelulares. Se
50
for esse o caso, significa que os pigmentos so melhor extrados por lcoois no s
pela sua solubilidade intrnseca, melhor que a da gua (Hajjaj, 2000 postula que os
pigmentos de Monascus no so hidrossolveis), mas tambm pelo efeito de
permeao da membrana celular.
Como parece haver um grau de correlao entre o ndice de polaridade dos
solventes e a capacidade de solubilizar pigmentos de Monascus, mais algumas
extraes foram feitas, usando tambm como solventes clorofrmio, isopropanol e
metanol. A Figura 14 mostra a quantidade de pigmentos extrados, na forma de
absorbncia especfica, em funo do ndice de polaridade dos solventes.
Aparentemente pode haver correlao entre as duas grandezas, verificando-se um
mximo para a faixa prxima a IP = 6,51, e uma menor eficincia na extrao para
IP acima e abaixo dessa faixa.
Figura 14 Quantidade de pigmentos extrados (como ABS SP) em funo do ndice de
polaridade dos solventes.
300,0
metanol
DMSO
etanol
ABS SP (AU/g)
250,0
200,0
ter
acetonitrila
150,0
isopropanol
100,0
CHCl3
gua
gua
50,0
hexano
0,0
0
10
ndice de polaridade (de Snyder)
Entre os solventes orgnicos, o dimetil sulfxido (DMSO) e o etanol tiveram

os melhores resultados, quase equivalentes entre si, perdendo apenas para o
metanol. Apesar do melhor desempenho, o metanol um solvente txico, cujo uso
51
no liberado para preparao de pigmentos para alimentos (ANVISA, 2004). O

dimetil sulfxido, embora pouco txico, menos voltil que os lcoois, mais caro e
tambm no liberado para uso em alimentos. Como o etanol mais barato, voltil,
atxico e de uso liberado para preparao de formulaes de pigmentos (ANVISA,
2004), foi usado para os experimentos subseqentes. Esses resultados esto em
concordncia com experimentos realizados por Lin (1992) com etanol e metanol.
4.3.3 Quantidade de solvente
As condies tpicas de extrao usadas por diversos autores so: extrao
com etanol 95%, em proporo 1:5 g substrato fermentado:mL de solvente. Com o
objetivo de determinar se h saturao do solvente com os pigmentos nessas
condies de extrao, e em que grau, foram feitas extraes agitadas usando
diferentes quantidades de solvente (etanol 95%). Os resultados obtidos so
apresentados a seguir (Tabela 8)
Tabela 8 Influncia da quantidade de solvente (etanol 95%) usada na
extrao de pigmentos vermelhos de Monascus
Massa de Massa de
fermentado solvente
(g)
(BM) (g)
5
15
5
20
5
28
10
90
5
95
5
95
4
96
3
97
2
98
2
98
1
99
0,8
99,2
0,4
99,6
0,2
99,8
Razo
solvente /
substrato
3
4
5,6
9
19
19
24
32,3
49
49
99
124
249
499
Pigmentos
UA extradas por
(UA500/g
1g de solvente
substrato seco)
(UA/g)
16,2
5,40
15,5
3,87
15,0
2,65
16,6
1,85
16,0
0,84
18,1
0,95
16,6
0,69
16,3
0,50
16,0
0,33
17,5
0,36
15,2
0,15
15,3
0,12
15,8
0,06
18,3
0,04
Pode-se concluir, analisando a Tabela 8, que h pouca diferena na

absorbncia especfica usando grandes quantidades de solvente. Isso mostra que o
solvente extraiu, dentro da faixa de propores solvente:fermentado testada,
52
praticamente todo o pigmento que poderia ser dissolvido de forma que a

absorbncia proporcional no quantidade de solvente, mas quantidade de
substrato usado para a extrao. Esses resultados indicam que, embora a relao
5:1, freqentemente usada, seja adequada, menos solvente poderia ser utilizado.
Uma proporo 3:1 de solvente:substrato fermentado seco apresenta boa eficincia
na extrao. Isso significa menos solvente a utilizar durante o processamento
industrial, alm de menor quantidade de solvente a extrair em uma eventual etapa
de evaporao. A maior eficincia poderia eventualmente implicar em menor tempo
de extrao (embora isso no tenha sido especificamente testado).
4.3.4 Eficincia na extrao
Extraes estticas usando etanol 95% por 24h no mostraram efeito
significativo da temperatura, em uma faixa de cerca de 60C, com valores de teste
de 2, 22, 32, 39 e 58C. Assim sendo, as extraes feitas nas etapas subseqentes
deste trabalho foram feitas sem controle de temperatura.
Misturas de solventes etanol/gua. Com o objetivo de verificar se lcool
anidro, etanol 70%, etanol 95% ou outra concentrao podem ser mais ou menos
eficientes na extrao de pigmentos, um ensaio foi realizado com 1g de fermentado
sendo extrado por misturas de gua-etanol com diferentes propores, em extrao
esttica (Tabela 9):
Tabela 9 efeito da composio do solvente (misturas de etanol e gua) na eficincia na
extrao (como absorbncia relativa) de pigmentos vermelhos produzidos por Monascus
Etanol (g)
gua (g)
10
0
9
1
8
2
7
3
6
4
5
5
4
6
3
7
2
8
1
9
0
10
95% etanol, soxhlet
ndice de
polaridade
estimado
5,6
5,9
6,3
6,6
7
7,3
7,6
8,0
8,3
8,7
9
5,8
Absorbncia
relativa (%)
76,8
81,3
94,5
88,5
100,0
83,3
74,4
47,4
36,0
30,0
18,0
95,5
53
Os resultados mostrados na Tabela 9 indicam que h uma faixa de eficincia

mxima na extrao usando etanol a cerca de 60% (g/g) em gua. Este tambm
um resultado importante em termos de processo, j que significa que menos
solvente orgnico que a quantidade normalmente utilizada necessrio; alm disso,
o uso de um solvente com maior quantidade de gua pode prevenir a dissoluo de
outros componentes do fermentado (lipdios, por exemplo) no solvente, fornecendo
um extrato mais puro. Por outro lado, esse resultado mostra que o fermentado no
precisa passar por secagem prvia extrao com etanol, desde que se utilize
solvente mais concentrado, levando em conta a incorporao de gua da massa
fermentada: pode-se chegar aos mesmos 60% de concentrao ao adicionar, por
exemplo, etanol a 95% ao fermentado mido. Finalmente, o ndice de polaridade
estimado para etanol a 60% fica tambm prxima a 6,5 como o metanol e o DMSO.
Isso corrobora a hiptese levantada de relao IP x capacidade de extrao de
pigmento.
Em sntese, as condies mais adequadas extrao de pigmentos de
Monascus so etanol a 60%, na proporo 3:1 em massa de solvente em relao
massa de fermentado seco, por 12h esttica ou 1h com agitao.
importante notar que nos experimentos subseqentes no foram utilizadas
essas condies, mas sim etanol a 95%, por praticidade (j que a concentrao do
produto comercial), e para uma comparao direta com outros dados de FSS obtidos
anteriormente no LPB e por outros autores.
4.4 Comparao de diferentes substratos
Com o objetivo de comparar diferentes substratos potenciais para a produo
de pigmentos de Monascus, 11 diferentes substratos foram testados. Esses
substratos foram escolhidos por serem substratos tradicionais para FSS (no caso de
arroz e trigo), resduos agroindustriais baratos (no caso do bagao de mandioca), ou
ricos em amido e protenas. O teor de umidade de 56% foi escolhido por ser a faixa
ideal para o arroz, um pouco baixa para o bagao de mandioca mas possivelmente
prxima do ideal para outras fontes amilceas pouco fibrosas. A quantidade de
pigmentos produzida com diferentes substratos (expressa como absorbncia
especfica a 500nm) variou bastante, como se v na_
54
Tabela 10. A mesma tabela mostra tambm a composio aproximada dos

substratos (Franco, 1992). Nota-se que so todos substratos muito ricos em
carboidratos (de 33 a 91%) e protenas (9 a 48%), exceo da mandioca e seus
derivados, que possuem sobretudo amido.
Tabela 10 Produo de pigmentos (UA500/g substrato seco) e composio do substrato
Substrato
Composio aproximada (g/kg base seca)

carboidratos
protenas
fsforo
Arroz
Trigo
Milho (quirera)
Soja
Farelo de soja
PTS
Mandioca
Tapioca
Farinha dgua
Bagao de
mandioca
Batata
Fonte: Franco, 1992.
820
770
780
330
400
320
900
910
660
90
140
130
400
480
7
20
14
11
1,14
3,63
3,19
6,00
7,00
0,407
0,33
2,20
-
Absorbncia
especfica mdia
(UA500/g substrato
seco)
216
79
60
13
22
12,6
119,6
38,5
98,1
15,7
800
100
0,96
4,7
Esperava-se que todos os cereais fossem bons substratos, j que o arroz (um
cereal, com composio centesimal no to distante do milho e do trigo) o
substrato tradicional para o cultivo de Monascus. O desempenho do trigo e do milho,
embora superior ao bagao de mandioca ou a batata, por exemplo, foi baixo em
comparao com o do arroz. Era de se esperar tambm que substratos com um
maior teor de carboidratos, protenas ou fsforo (elemento tipicamente limitante no
desenvolvimento de organismos) poderiam ser melhores meios de fermentao para
Monascus, em comparao com o arroz. Isto tambm no ocorreu, como uma
inspeo dos valores mostra: trigo, milho ou batata so similares ao arroz (com
relao a esses nutrientes), mas apresentaram desempenho fraco. Finalmente, notase que para outros substratos testados a produo de cor bastante inferior
produzida no arroz, com exceo da mandioca cuja produo de pigmentos,
embora cerca de 55% menor que a do arroz, ainda significativamente superior de
vrios outros substratos. Possivelmente o teor de umidade, sempre 56%, no foi
adequado para todas as fermentaes; de fato, a soja, a tapioca e a batata
55
aglutinaram muito mais que os outros substratos, deixando at gua livre nos
frascos. possvel que o desempenho desses substratos possa melhorar
combinando componentes: por exemplo, misturando batata, cuja estrutura frgil, a
bagao de mandioca. Ainda assim, os resultados da Tabela 10 permitem concluir
que, em FSS de substratos puros, adequado trabalhar com arroz ou mandioca.
Finalmente, questiona-se: o que torna o arroz um substrato superior? Vrias
hipteses podem ser aventadas, desde a diferena na estrutura fsica do suporte at
a composio qumica. Por exemplo: o arroz o cereal de maior poder diastsico
(Aquarone et al., 2002) entre os substratos testados. Assim, concebvel que haja
enzimas residuais no inativadas na autoclavagem, ou que atuaram parcialmente
sobre o substrato na preparao do meio de cultivo. Isso poderia aumentar a
biodisponibilidade da fonte de carbono para o fungo na fermentao. Outra
possibilidade que o fungo tenha se desenvolvido nos outros substratos, mas com
menor produo de cor, devido diferente composio dos substratos.
4.5 Ensaios utilizando bagao de mandioca como substrato
Entre os substratos testados na etapa anterior para a produo de pigmentos,
o bagao de mandioca foi escolhido para fermentaes adicionais, numa tentativa
de determinar condies timas de produo. A razo que o bagao de mandioca
um substrato barato (na verdade, um resduo) de forma que mesmo uma produo
mais baixa que o arroz poderia justificar seu uso economicamente.
4.5.1 Teor de umidade na FSS de bagao de mandioca
De forma a verificar a
influncia do teor de umidade na produo de
pigmentos, foram preparadas formulaes com diferentes teores de umidade, na

faixa de 60 a 90%. A 80% ou mais de umidade, os meios de cultivo tornam-se muito
midos, com gua visivelmente livre e aglutinao do substrato. A composio dos
meios de cultivo e os resultados obtidos so mostrados na Tabela 11.
56
Tabela 11 Absorbncia especfica (UA500/g substrato seco) de pigmentos extrados com

etanol a 95%, produzidos em FSS em bagao de mandioca com diferentes teores de
umidade
Substrato
Bagao de
mandioca
60%
13,2
70%
25,2
Teor de umidade, %
80%
6,5
85%
3,5
90%
10,7
Como se esperava, o bagao de mandioca, por ser mais poroso que o arroz e
apresentar um teor de fibras maior, apresenta melhor produo de pigmentos em um
teor de umidade superior ao necessrio para FSS em arroz. Esses resultados esto
em concordncia com Johns e Stuart (1991), para arroz, e Soccol e Vandenberghe
(2003) para bagao de mandioca. A partir desses resultados, as condies de
fermentao (FSS) para a produo de pigmentos foram estabelecidas como: arroz,
56% de umidade (Johns e Stuart, 1991) - confirmada em experimento no LPB
(dados no apresentados) e bagao de mandioca, 70% de umidade com pH
ajustado, quando necessrio, a 6,5, e temperatura de incubao de 32C. Esse
experimento foi feito em 7 dias; como o tempo de fermentao ideal depende
largamente da qualidade do inculo e do substrato, para a produo industrial
necessrio acompanhar a cintica de produo de pigmento em cada fermentao.
Ainda assim, dados cinticos podem ser levantados para permitir uma avaliao do
perodo mdio de fermentao:
4.5.2 Cintica de produo de pigmentos em bagao de mandioca
Com o objetivo de determinar a cintica de produo de pigmentos em
bagao de mandioca, uma fermentao foi feita com a durao de 24 dias, obtendose como resultados as curvas de produo de pigmentos apresentadas na Figura
15. A produo mxima de pigmentos (ABS SP 500 = 47UA/g) se d com 10 a 11
dias, o que um perodo superior ao de fermentao de arroz usando o mesmo
inculo (dados no ilustrados). Esse resultado pode ser devido a uma
biodisponibilidade maior do amido de arroz em relao ao de mandioca, ou a uma
menor quantidade de oligoelementos ou vitaminas.
57
absorbncia especfica (AU/g biomassa seca)
Figura 15 Produo de pigmentos de Monascus em FSS de bagao de mandioca,

expressa como absorbncia especfica (em UA/g substrato seco) em funo do tempo (em
horas)
200
180
160
140
120
100
SP ABS 400
SP ABS 500
80
60
40
20
0
0,00
100,00
200,00
300,00
400,00
500,00
tempo de fermentao (h)
A anlise da Figura 15 tambm mostra que a absorbncia dos pigmentos

maior a 400nm, comparando com a absorbncia a 500nm, mas com uma boa
proporcionalidade. Muitos autores usam a relao ABS500/ABS400 para indicar a
proporo de pigmentos vermelhos em relao aos amarelos; como nesta
fermentao a relao aproximadamente constante, a ABS400 pode ser usada para
mostrar a evoluo da formao de pigmentos para baixas concentraes, por
apresentar resposta mais sensvel.
Para utilizar bagao de mandioca como substrato para produo de
pigmentos por Monascus, o meio de cultivo teria de ser suplementado com uma
fonte de nitrognio, fsforo ou oligoelementos, que poderia melhorar a produo ou
produtividade de pigmentos; os experimentos a seguir pretendem avaliar essa
possibilidade.
4.5.3 Otimizao das condies de cultivo em bagao de mandioca.
O bagao de mandioca um substrato rico em amido, que foi usado com
sucesso em diversos processos de fermentao em substrato slido. Com o objetivo
de maximizar a produo de pigmento a partir do bagao de mandioca, um
planejamento experimental 33-1 com 10 pontos extras (6 pontos completando os
58
centros dos planos, uma repetio do ponto central e trs repeties dos nveis
mnimos, totalizando 9 + 6 + 1 + 3 = 19 pontos) foi realizado utilizando bagao de
mandioca em quantidade fixa, teor de umidade varivel e protena texturizada de
soja (PTS) e levedura de panificao inativada (YEA) como aditivos, em nveis
variveis. Tanto PTS como YEA so fontes de nitrognio orgnico de custo
relativamente baixo, e YEA representa tambm uma fonte de oligoelementos e
vitaminas. A Tabela 12 mostra a composio dos meios de cultivo e os resultados
obtidos.
Tabela 12 Composio dos meios de cultivo e produo de pigmentos no planejamento
experimental 33-1 umidade, PTS, YEA para fermentao de bagao de mandioca
frasco
%
H2O
%
PTS
%
YEA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
50
50
50
50
50
60
60
60
60
60
0
10
5
0
10
5
0
5
5
10
0
0
2
4
4
0
2
2
2
2
Produo de
pigmento
(UA500/g
matria seca
inicial)
0,40
0,55
0,20
0,70
0,10
3,40
3,65
4,80
20,50
3,05
frasco
%
H2O
%
PTS
%
YEA
11
12
13
14
15
16
17
18
19
60
70
70
70
70
70
50
60
70
5
0
10
5
0
10
0
0
0
4
0
0
2
4
4
0
0
0
Produo de
pigmento
(UA500/g
matria seca
inicial)
8,00
23,70
23,00
23,70
15,30
18,05
0,30
15,85
20,50
A anlise dos resultados mostra uma grande variao de valores para a

absorbncia especfica; fica claro, no entanto, que para teores mais baixos (50 e
60%) de umidade, todos os experimentos apresentam baixa produo de pigmentos,
enquanto para 70% de umidade a produo mais alta. A Figura 16 mostra no
apenas que a maior umidade favorece a produo de pigmentos (com um efeito
positivo, ao nvel de 95% de confiana), como a presena YEA e PTS no afeta a
produo de pigmentos.
59
Figura 16 Diagrama de Pareto para os efeitos lineares e quadrticos dos fatores avaliados,
correspondentes ao planejamento 33-1,
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: ABS_SP
3 3-level factors, 1 Blocks, 19 Runs; MS Residual=32,10884
DV: ABS_SP
p=,05
(1)%_H2O(L)
5,948958
%_H2O(Q)
-,947688
1Lby3L
-,779114
(3)%_YEA(L)
-,738168
%_PTS(Q)
,6740258
2Lby3L
,4188584
1Lby2L
,281562
(2)%_PTS(L)
-,146655
%_YEA(Q)
-,01539
-1
Effect Estimate (Absolute Value)
Efeito estimado (valor absoluto)

O resultado mostrado por esse planejamento foi inesperado, na medida em
que, supunha-se, os aditivos YEA e PTS favoreceriam o crescimento do fungo ou
pelo menos no atrapalhariam. Como a umidade mostrou-se o fator determinante,
com maior eficincia ao nvel de 70%, preparou-se um novo plano experimental, com
o teor de umidade nesse patamar e pesquisando melhor uma rea de valores de
YEA x PTS. A Tabela 13 mostra os valores usados de YEA e PTS, e a resposta
correspondente aps 11 dias de fermentao, tempo suficiente para haver boa
produo de pigmentos, permitindo a avaliao dos meios de cultivo.
60
Tabela 13 composio dos meios de cultivo e valor de absorbncia especfica

correspondente, em planejamento 72 incompleto YEA x PTS em bagao de mandioca.
Frasco BM YEA (%
(g) sobre o
bagao)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
0
0
0
0
0
1
1
2
2
2
2
2
3
3
4
PTS (%
sobre o
bagao)
0
2
4
6
8
1
3
0
2
4
6
8
1
3
0
ABS SP Frasco BM YEA (%

500
(g) sobre o
(UA/g
bagao)
matria
seca
inicial)
53,3
16
10
4
32,1
17
10
4
17,4
18
10
4
19,8
19
10
4
14,1
20
10
6
33,9
21
10
6
18,0
22
10
6
30,8
23
10
6
12,9
24
10
6
11,1
25
10
8
14,0
26
10
8
13,5
27
10
8
12,6
28
10
8
12,7
29
10
8
12,0
30
10
0
PTS (%
sobre o
bagao)
2
4
6
8
0
2
4
6
8
0
2
4
6
8
0
ABS SP
500
(UA/g
matria
seca
inicial)
10,7
11,6
9,0
11,3
9,0
6,8
7,5
6,1
8,0
7,6
7,5
5,3
3,9
5,1
39,9
Os resultados de absorbncia apresentados na Tabela 13, proporcionais

produo de pigmentos, podem ser melhor apreciados atravs da Figura 17, em que
uma funo polinomial foi ajustada pelo mtodo dos mnimos quadrados aos pontos
experimentais, usando o programa Statistica:
61
Figura 17 (a) Influncia da concentrao (%) em YEA e PTS na absorbncia especfica do

fermentado. A curva plotada a funo obtida por regresso polinomial (mnimos
quadrados) dos valores experimentais. (b) Diagrama de Pareto dos efeitos das variveis
YEA e PTS sobre a produo de pigmentos.
z=42,154-7,53*x-6,068*y+0,39*x*x+0,47*x*y+0,362*y*y
6,696
10,242
13,788
17,333
20,879
24,425
27,971
31,517
35,063
38,609
above
pontos experimentais
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: ABSSP
Diagrama de Pareto dos efeitos padronizados;
2 factors,
1 500
Blocks,
30 Runs;72MS
Residual=20,23094
varivel:
ABS SP
, planejamento
incompleto,
1 bloco, 30 ensaios
DV: ABSSP
p=,05
(1)YEA%(L)
-8,42512
1Lby2L
4,487084
(2)PTS%(L)
-4,30987
YEA%(Q)
3,086318
PTS%(Q)
2,86283
10
Effect Estimate
(Absolute
Value)
Estimativa
do efeito
(valor absoluto)
A inspeo da Figura 17a permite concluir que a adio de leveduras ou de

PTS realmente desfavorece a produo de pigmento. A Figura 7b indica efeitos
lineares negativos, tanto para PTS como para YEA. Note-se que os efeitos positivos
de interao e quadrticos, no independentes, so apenas conseqncia da
62
magnitude dos efeitos lineares (Carvalho, 1999). No se espera que os aditivos YEA
e PTS realmente atrapalhem ambos o desenvolvimento do fungo, pelo menos em
nveis modestos (1 a 2%). Dessa forma, o que pode explicar a produo menor de
pigmentos que a adio desses componentes favoreceu um desvio de
metabolismo, retardando ou diminuindo a produo de pigmentos. Essa hiptese
poderia ser testada pela quantificao da biomassa produzida. Como, no entanto, o
objetivo era produzir pigmentos de Monascus de forma suficientemente eficiente
para permitir estudos de respirometria para futuro escalonamento, decidiu-se mudar
o substrato de trabalho exclusivamente para arroz integral, j que trata-se
efetivamente do melhor substrato testado anteriormente.
4.6 Desenvolvimento do mtodo de anlise de biomassa via ergosterol
Para determinar a equivalncia entre a absorbncia e as concentraes de
ergosterol na anlise cromatogrfica, 10 L de hexano puro e 10 L de trs padres
de ergosterol, com 1000, 5000 e 10000
g/mL foram injetados de acordo com o
mtodo descrito (vide Material e Mtodos). A partir das reas dos picos, obteve-se
por regresso linear a seguinte expresso para a concentrao de ergosterol:
ergosterol ( g/mL) = 5,54.10-5.A, com R2 = 0,999 (A a rea do pico).
A recuperao estimada de 10% foi feita procedendo-se extrao, segundo
o mesmo processo aplicado s amostras, de 0,5 g de arroz dopado com 2000 g de
ergosterol, o que forneceu uma massa de ergosterol de 198 g na anlise. uma
recuperao baixa, devida possivelmente partio pouco seletiva do ergosterol
entre o hexano e a fase alcolico-aquosa. Levando em conta, no entanto, que as
anlises foram feitas da mesma forma, com idnticos volumes de solventes,
podemos supor que os teores de ergosterol nos extratos guardam boa proporo
com o teor na biomassa. Essa hiptese reforada pelo fato de que os dados de
biomassa (via ergosterol) e produo de pigmentos (ABS SP 500) mostram boa
correlao para diversas fases do cultivo (ver item 4.2).
Para estimar a equivalncia entre biomassa e concentrao de ergosterol, foi
analisada uma amostra de 0,4g de biomassa seca temperatura ambiente com
slica. Aps a extrao e injeo, obteve-se um pico de rea A = 18283018 , o que
equivale a 1013
g/mL no extrato. Considerando que o volume de diluio dos
63
extratos 0,200 mL, a massa de ergosterol de 1013 g.mL-1 x 0,2 mL = 202,6 g

nos extratos. Como a recuperao de ergosterol na extrao foi de 10%, a massa de
ergosterol na biomassa de 2026
ergosterol:biomassa seca 2026
g. Temos, portanto, que a proporo
g:0,4g = 5,06 mg/g, resultado prximo da
expectativa, comparando com os resultados de outros autores, discutido em material

e mtodos. Temos ento que: biomassa na amostra(mg) = 5,54.10-5.ABS.0,2 /
506,4. Os valores obtidos so usados na anlise respiromtrica frente.
4.7 Determinao da aerao adequada, em coluna de Raimbault
Para a determinao da aerao tima para fermentao em arroz, foi feito
um ensaio em colunas de Raimbault contendo 60g de arroz com 56% de umidade. O
meio foi inoculado com 5%(v/m) de suspenso de esporos com 106 esporos/mL, e
incubado a 32C em montagem ilustrada na Figura 18, resultando em maior
produo de pigmentos para uma velocidade de aerao de 60NmL./min
Figura 18 Sistema de respirometria (colunas, cromatgrafo e computador). Ao fundo
(esquerda) se v o fermentador piloto de 30kg. No detalhe (direita), uma coluna de FSS
parcialmente preenchida.
64
Os resultados de absorbncia especfica, proporcional produo de

pigmentos, so mostrados na Figura 19, como funo da vazo de ar utilizado:
produo de pigmentos
(UA500/g substrato seco)
Figura 19 Efeito da aerao na produo de pigmentos (como ABS SP) em arroz, a 32C
120
100
80
60
40
20
0
0,00
0,33
0,67
1,00
1,33
1,67
2,00
aerao (NmL/g.min)
A anlise do grfico mostra que a velocidade de aerao mais adequada da

ordem de 1 NmL/g.min (1 mililitro de ar em condies padro, por grama de
substrato mido, por minuto). Nos experimentos subseqentes em coluna, foi feito o
controle da aerao nesse valor, usando-se um rotmetro de fluxo sada das
colunas.
4.8 Anlise respiromtrica em colunas
Para a determinao da cintica de produo de pigmentos e de biomassa
em arroz, foi feito um experimento em colunas, com a montagem da Figura 18, com
colunas de Raimbault com 60g meio inoculado com 5% v/m de suspenso de
esporos com 106 esporos/mL. Os resultados de concentrao de O2 e CO2 (obtidos
por cromatografia gasosa), biomassa (obtidos via ergosterol, por cromatografia
lquida de extratos de amostras dos fermentados) e pigmentos (obtidos por extrao
do pigmento e leitura da absorbncia) foram tabulados em planilha de clculo e
apresentados a seguir (Figura 20):
65
Figura 20 Resultados da anlise respiromtrica em colunas com arroz como substrato

consumo horrio de O2, produo horria de CO2, produo de pigmentos (como ABS
SP500), produo de biomassa e quociente respiratrio Q.
0,25
CO2 produzido
0,2
Q
biomassa, g/coluna
V gs, NL/h
prod. pigmento, 1000UA/coluna
0,15
3
0,1
2
0,05
biomassa (g/coluna), produo de pigmentos

(1000UA/coluna), Q [adimensional]
O2 consumido
0
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
300,00
tempo (h)
Adaptando curvas sigmoidais (Equao de Boltzmann) aos dados de

biomassa e de pigmento produzido, obtm-se as seguintes expresses (Eq. 1 e 2):
Biomassa (g) = [(0,1778 4,7352) / (1 + e(tempo-152,09)/16,83)] + 4,7352
(Eq.1)
com (R2 = 0,950)

ABS SP500 (UA/g) = [(0 5459) / (1 + e(tempo-166,30/18,13)] + 5459
(Eq. 2)
com (R = 0,980)
Essas equaes foram usadas para gerar os grficos a seguir (Figura 21a e
Figura 22), usando o programa MS-EXCEL. O clculo das velocidades especficas
foi feito ponto a ponto, pelas expresses: ~X-1 X/ t, e qp~X-1 P/ t. A Figura 21b
mostra os valores do logaritmo da biomassa por coluna, ao longo da fermentao.
66
Figura 21 a) Biomassa e pigmentos produzidos ao longo da fermentao (modelo

sigmoidal adaptado aos dados experimentais) e b) logaritmo da biomassa real x tempo
5000
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
pigmento
pig. real
4000
Biomassa (g)
pigmento (UA500/coluna)
6000
biomassa
biom real
3000
2000
1000
0
0
50
100
150
200
250
200
250
300
ln biomassa (g)
tempo (h)
1,2
0,7
0,2
-0,3 0
-0,8
50
100
150
-1,3
300
tempo (h)
30
0,045
0,04
25
0,035
0,03
20
0,025
15
10
v pigmentos
0,02
v biomassa
0,015
0,01
0,005
0
0
50
100
150
200
tempo (h)
250
300
350
Velocidade especfica de
crescimento (h-1)
velocidade especfica de formao de

produto (UA500.g2/h)
Figura 22 Velocidade especfica de formao de pigmentos e de biomassa, baseado no

modelo sigmoidal.
67
A anlise da Figura 20, da Figura 21 e da Figura 22 poderia ser discutida para

cada grandeza, mas pode ser vantajosamente dividida por fases, pela anlise da
curva de Q (quociente respiratrio) e de biomassa e pigmentos:
4.8.1 Fases da fermentao:
0 a 60h fase lag: Essa fase representa a adaptao ao meio de cultivo e a
germinao dos esporos, de forma que a quantidade de CO2 produzida (e diluda
pela corrente de aerao) provavelmente baixa demais para ser detectada pelo
cromatgrafo tanto que o quociente respiromtrico Q calculado nulo para tempos
inferiores a 60h. A biomassa e o pigmento detectados tambm apresentam valores
baixos. Note-se que 60h uma fase lag excessivamente grande para fermentaes
industriais, e denota a necessidade de aumentar a concentrao ou a forma de
inoculao, trabalhando em um pr-fermentador.
60 a 90h fermentao: A partir de 60h e at cerca de 85h o valor de Q
aumenta, chegando a um valor mximo prximo de 2, o que indica uma atividade
respiratria grande, com CO2 formado superior ao O2 consumido (em um processo
de respirao ideal, Q = 1). Portanto, deve-se formar outro metablito que no
exclusivamente CO2. De fato, o odor do fermentado no incio da fermentao de
lcool, o que tambm foi observado por outros autores (Pastrana et al., 1995,
Rosenblitt et al., 2000). A aerao, contudo, deveria ser suficiente para o
desenvolvimento aerbico da pouca biomassa presente nessa fase; possivelmente
trata-se de um efeito tipo Crabtree, observado por outros autores (Chen e Johns,
1994; Hamdi et al., 1996) em fermentao submersa.
90h a 140h mudana para respirao: Nessa fase diminui Q, at um valor
prximo a 0,8 e comea a aumentar a produo de biomassa e de pigmentos; o
consumo de O2 e a produo de CO2 atingem um mximo (t = 150 a 160h). Nessa
fase, como pode-se verificar pela grande variao do ln da biomassa na Figura 21b,
o desenvolvimento do miclio bastante grande, chegando ao mximo valor
estimado de
= 0,039 h-1, para t = 130h. A produo especfica de pigmentos
tambm mxima, atingindo 27,50 UA.g-2.h-1 para t = 140h (valores obtidos pela
derivao da curva modelo X=f(t), que podem ser verificados na Figura 22.
68
140h ao fim da fermentao respirao e sntese de pigmentos: Nessa

fase Q permanece constante, na faixa de 0,8. O consumo de O2 e a produo de
CO2 tambm so constantes; h formao de grande quantidade de pigmentos, o
que consistente com a formao de metablitos secundrios (Pandey, 2001). A
velocidade especfica de formao de biomassa e de pigmentos diminui (Figura 21).
Isso denota a desacelerao do crescimento, que deixa de ser exponencial. A partir
de 280h, a produtividade de pigmentos (0,76 UA/g.h) cerca de 10 vezes inferior
produtividade mxima, de cerca de 74 UA/g.h s 170h de fermentao.
4.8.2 Determinao dos parmetros da fermentao usando o programa FERSOL
O programa FERSOL utiliza dados de oxignio consumido e biomassa
produzida para estimar os parmetros de fermentao para o modelo (Eq. 3):
dO2
1 dX
=
+ mX
dt
YX / O dt
(Eq. 3)
onde:
dO2/dt a taxa de consumo de oxignio, em g/h;
Yx/o a relao entre biomassa formada e oxignio consumido [unid biomassa/unid O2]
dX/dt a taxa de produo de biomassa, em g/h
m um coeficiente de manuteno, refletindo a quantidade de O2 usada para outras funes
que no a produo de biomassa, em h-1
X a quantidade de biomassa no sistema, em g
Foram aplicados ao programa os dados constantes na Tabela 14:

Tabela 14 valores de tempo, biomassa e pigmento produzidos, O2 consumido e
converses de substrato e oxignio em biomassa e pigmento, usados para a estimativas de
parmetros cinticos.
tempo de
Biomassa
Pigmento
O2
O2
Yp/s Yx/s
Yp/o
Yx/o
fermentao, produzida, produzido consumido, acum mg/g g/g
g/mol g/mol
h
mg/coluna UA500/coluna
mmol/h
0
30
0
0
59
278
0
0,224
0,01
0
0,0219
0
107
480
109,7
4,804
136 0,109 0,0298 0,0121 3,3100
131
681
313,5
7,227
275 0,268 0,0372 0,0171 2,3687
152
3040
2082,3
9,283
454 1,503 0,1449 0,0688 6,6290
180
3625
3423,3
6,261
683 2,088 0,1463 0,0751 5,2635
297
4816
5458,9
0
915 3,335 0,1950 0,0894 5,2307
69
A partir dos valores de tempo, biomassa e O2 consumido da Tabela 14,

chegou-se aos seguintes valores utilizando o programa FERSOL: Yx/o = 3,703 g
biomassa/mol O2, m = 0,000 h-1 e
max
= 0,038 h-1, na faixa de 59 a 180 h, com
coeficiente de regresso R2 = 0,989 um valor que indica boa correlao entre os

dados e o modelo. O valor de m ~ 0 indica, na verdade, que o valor pequeno
demais para ser estimado pelo programa, o que mostra que a produo de biomassa
deve ser muito superior de pigmentos (ou outros metablitos que exijam o
consumo de oxignio). Essa hiptese reforada pelos pequenos valores de YP/S,
de 0,00335 e YP/O de 0,0894 ao final da fermentao, mostrando que as converses
de substrato e oxignio em pigmentos so bem inferiores s converses em
biomassa. O valor de YX/O obtido atravs do programa prximo do valor obtido pelo
clculo direto dos parmetros cinticos apenas na faixa prxima a 107h de
fermentao. O valor encontrado para
sigmoidal, de
max
max
prximo ao obtido com o modelo
-1
= 0,039 h . Esse valor indica que uma fermentao com
Monascus poderia ter seu tempo reduzido a cerca de 130h, partindo da mesma
concentrao inicial de biomassa, se as condies de inoculao e incubao
fossem tais que a fermentao se desse exclusivamente em fase exponencial.
Ao final da fermentao em coluna, obteve-se 17mg de pigmento/g de
biomassa, um valor prximo ao obtido em fermentao submersa por Hajjaj (2000),
estimado atravs de um grfico em 16,8mg de pigmento/g de biomassa. No entanto,
na FSS esse pigmento est menos disperso, na proporo de cerca de 5g
pigmento/kg de fermentado mido (com cerca de 60% de umidade), contra cerca de
0,1g pigmento/L na fermentao lquida.
4.9 Correlao biomassa-pigmento
Uma anlise de correlao dos dados apresentados na Tabela 14, de
biomassa e pigmento produzidos, apresenta coeficiente R = 0,977, o que sugere
uma razovel proporcionalidade entre ambos os fatores. Usando mais dados de
biomassa x absorbncia (
Tabela 15), chega-se expresso (Eq. 4):
70
Biomassa = -2.10-06.ABSSP2 + 0,0028.ABSSP + 0,0302,
(Eq. 4)
com R2 = 0,9955
onde:
biomassa: biomassa no fermentado seco (g/g)
ABSSP: absorbncia especfica, em UA/g substrato seco
Tabela 15 biomassa e ergosterol em diferentes fases de fermentao de arroz dados
para correlao.
ABS SP 500
biomassa
UA/g
g/g
0
0,01591
1,29
0,04040
3,68
0,03499
12,57
0,06044
112,8
0,35717
315,8
0,71838
269,5
0,58909
232,8
0,59636
291,7
0,68121
499,9
0,93737
Embora essa expresso deva ser usada com ressalvas, pois deve depender
da cepa utilizada e das condies de cultivo, uma forma simples de estimar a
biomassa na fermentao, j que a extrao de pigmentos e leitura de absorbncia
uma anlise mais simples que a extrao do ergosterol e a anlise cromatogrfica.
4.10 Cintica de fermentao em reator do tipo tambor horizontal
Para verificar o comportamento do sistema de fermentao com um aumento
de escala, uma nova fermentao foi feita, utilizando as mesmas condies da
fermentao em coluna (arroz com 56% de umidade, inoculado com suspenso de
esporos, temperatura controlada em 32C). A massa de meio a fermentar foi de
2400g, 40 vezes maior que a utilizada em colunas, de forma que a aerao foi
mantida na mesma proporo (1Nml/g.min), ou seja, 2,4NL/min. Portanto, o critrio
de escalonamento utilizado foi uma razo vazo de ar/massa de meio constante.
Como o reator utilizado no tem camisa de aquecimento, este foi feito atravs do
aquecimento do ar, aps a umidificao, imediatamente antes da entrada no reator.
Um isolamento trmico foi feito no reator, e um sensor de temperatura foi colocado
71
prximo sada de ar do reator, ligado a um termostato e um aquecedor foram

usados para controlar a temperatura do sistema. Ainda assim, houve oscilao de
temperatura, especialmente no 5 dia de fermentao, alm de duas quedas de
energia que causaram flutuaes nas leituras do cromatgrafo. Os resultados
apresentam a mesma tendncia observada na fermentao em coluna (Figura 23).
Figura 23 Resultados da anlise respiromtrica em biorreator tipo tambor utilizando arroz
como substrato consumo horrio de O2, produo horria de CO2, produo de pigmentos
(como ABS SP500), produo de biomassa e quociente respiratrio.
4,5
350
Volume de CO2 produzido
300
Q
V gs, NL/h, Q [adimensional]
3,5
biomassa, mg/g
prod. pigmento, UA/g
250
3
2,5
200
150
1,5
100
1
50
0,5
0
biomassa (g/g fermentado seco), produo de

pigmentos (UA/g fermentado seco)
Volume de O2 consumido
0
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
300,00
350,00
400,00
tempo (h)
A anlise da Figura 23 permite observar o mesmo padro fermentativo

presente nas fermentaes em colunas. Novamente, o quociente respiratrio Q pode
ser usado como referncia para classificar as fases da fermentao: abaixo de 80h
h uma fase de crescimento muito pequeno, de 80 a 150h um metabolismo
predominantemente anaerbio, com Q >1 e pequeno aumento na produo de
biomassa; de 150 a 220h h um declnio no Q, que estabiliza na faixa de 0,8, ainda
com aumento na produo de pigmentos e de biomassa; de 220 a 350h a produo
de pigmentos e de biomassa alta, com Q em uma faixa aproximadamente
constante. O forte declnio na quantidade de oxignio consumido e CO2 produzido,
na vizinhana de 280h, sugere problemas de anlise, pois contrasta com a forte
produo de pigmentos e de biomassa.
72
Adaptando novamente um modelo sigmoidal aos valores de produo

estimada de biomassa x tempo e produo de pigmento x tempo, obtm-se as
seguintes expresses (Eq. 5 e 6):
biomassa (g) = [(46,114 341,55) / (1 + e(tempo-283,8)/35,666)] + 341,55
(Eq. 5)
com (R = 0,953)
ABS SP500 (UA) = [(3038 129000) / (1 + e(tempo-292,9/40,894)] + 129000
(Eq. 6)
com (R2 = 0,957)

Essas equaes foram usadas para gerar os grficos a seguir (Figura 24),
usando o programa MS-EXCEL. O clculo da velocidade especfica de crescimento
foi feito ponto a ponto, pelas expresses: ~X-1 X/ t, e qp~X-1 P/ t
73
Figura 24 (a) Biomassa e pigmentos produzidos ao longo da fermentao (modelo

sigmoidal adaptado aos dados experimentais). (b) logaritmo da biomassa produzida x tempo
(c) Velocidade especfica de formao de pigmentos e de biomassa, baseado nesse mesmo
modelo.
350
biomassa produzida (g)
2,5
biomassa
biomassa real
pigmentos
300
pig. real
250
1,5
200
1
150
100
0,5
50
0
50,0
100,0
150,0
200,0
tempo (h)
250,0
300,0
350,0
0
400,0
5,5
4,5
3,5
velocidade especfica de
formao de biomassa (h-1)
0,0
100,0
200,0
tempo (h)
300,0
400,0
0,014
80
0,012
70
60
0,01
50
0,008
v biomassa
0,006
v pigmento
0,004
40
30
20
0,002
10
0
0,0
100,0
200,0
300,0
400,0
500,0
0
600,0
velocidade especfica de formao

de produto (10-6g/gh)
ln biomassa
0,0
pigmento produzido (g)
400
tempo (h)
A inspeo da Figura 24 permite concluir que o modelo sigmoidal representa

de forma satisfatria a produo estimada de biomassa. A velocidade especfica
mxima de crescimento
max
= 0,013h-1, um valor sensivelmente inferior ao obtido
74
em coluna, possivelmente devido ao controle deficiente de temperatura e

eventualmente formao de caminhos preferenciais no leito do fermentador,
diminuindo
aerao
efetiva
(embora
em
cada
amostragem
diria
se
homogeneizasse o meio, desfazendo grumos). A velocidade especfica de formao

de produto foi de cerca de 70 g pigmento/g biomassa.h, ou 4,7 UA/g.h, e a
produo total de pigmentos foi de 108,7 UA/g de fermentado seco.
4.11
Comparao da produo em frascos, colunas, bandeja e reator tipo
tambor horizontal, com arroz como substrato

Os seguintes valores de produo de pigmentos foram obtidos com diversos
mtodos de fermentao (Tabela 16).
Tabela 16 Comparao da produo de pigmentos em diferentes quantidades de
substrato (arroz) e condies de fermentao em FSS
Mtodo
Massa de
substrato
mido
Aerao
Tempo de
fermentao
Teor de
slidos ao
final da
fermentao
Fermentao
em frascos de
vidro
Bandeja
Fermentao
em coluna
Fermentao
em reator
20g
Difuso
7 dias
86%
Pigmento
produzido
(UA500/g de
fermentado
seco)
89,3
200g
60g
Difuso
Forada
8 dias
12 dias
85,5%
19,9%
117,78
499,9
2400g
Forada
16 dias
22,6%
108,7
Nota-se que a produo de pigmentos em frasco e em bandeja prxima; o

tempo de fermentao para mxima produo de cor semelhante, e ocorre
secagem do meio, mesmo tentando-se incubar o material em estufa com ar saturado
de umidade. A produo de pigmentos em coluna , em mdia, 5 vezes superior
produo em frascos e bandeja, o que pode ser atribudo ao efeito da aerao
forada, e no haver secagem do meio de cultivo. A produo em reator que,
esperava-se, deveria ser semelhante produo em coluna, revelou-se inferior a
todas as outras, levando em conta que a produo se deu em 16 dias, com uma
produtividade mais baixa (15 vezes inferior aos 74UA/g.h obtidos em coluna). A
causa dessa produo relativamente baixa pode ser uma deficincia na aerao, e
75
provavelmente h grande influncia de oscilaes de temperatura. Nota-se tambm

a importncia de controlar a umidade, j que nos sistemas sem aerao forada
(frascos e bandeja) o meio secou ao longo da fermentao, chegando a cerca de
15% de umidade ao final do processo. provvel que, com a umidade mantida em
um valor mais alto, a produo em bandeja fosse maior. Possivelmente, para uma
melhor produo em bandejas, a umidade deve ser controlada pela asperso direta
de gua (j que usar ar saturado com gua no foi eficiente) e para uma melhor
produo em reator, necessrio controlar de forma eficiente a temperatura. Uma
forma de controlar a temperatura do reator controlando rigorosamente a
temperatura de entrada do ar saturado, j que um fluido que deve percolar todo o
meio de cultivo.
4.12 Avaliao da estabilidade dos pigmentos
Com o objetivo de verificar quo estveis os pigmentos de Monascus podem
ser em aplicaes diversas, alguns ensaios foram realizados com a incubao de
solues aquosas e alcolicas de pigmentos em diferentes condies de
temperatura e pH. A estabilidade foi medida atravs da avaliao da absorbncia
dos extratos. A absorbncia das solues aquosas de pigmentos de Monascus
diminui com o tempo, em qualquer das condies testadas. A diminuio na
absorbncia mais significativa em temperaturas mais altas; a Figura 25 mostra
esse efeito para 5 amostras de pigmentos em soluo aquosa a pH 6 (um valor
tpico para alimentos) e diferentes temperaturas:
76
Figura 25 variao da cor (medida como absorbncia relativa) com o tempo (em h) para
solues aquosas de pigmento, a diferentes temperaturas de incubao com pH 6
absorbncia relativa
1,0
0,9
0C
30 C
0,8
40 C
60 C
0,7
100 C
0,6
0,5
0
tempo (h)
O efeito da temperatura similar ao efeito em outras degradaes trmicas,

embora um modelo de Arrhenius (de decaimento exponencial) no represente bem o
sistema. Isso se deve, possivelmente, ao fato de que o extrato uma mistura de
pigmentos, cuja degradao pode se dar a diferentes velocidades e temperaturas.
Fica claro, no entanto, que alteraes de cor devem ser esperadas na formulao de
produtos com Monascus que exijam processamento trmico por exemplo,
autoclavagem, secagem ou defumao.
O efeito do pH igualmente claro: quando vrias amostras de pigmento foram
incubadas mesma temperatura mas com diferentes valores de pH, na faixa de 4,1
a 7,9, observou-se que em pH mais baixos a diminuio da cor mais significativa.
Esse efeito ilustrado na Figura 26:
77
Absorbncia relativa
Figura 26 Variao da cor (medida como absorbncia relativa) com o tempo (em h) para
diferentes pHs, a 100C
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0,00
pH 4,1
pH 4,7
pH 6,0
pH 7,3
pH 7,9
0,50
1,00
1,50
Tempo (h)
2,00
2,50
3,00
A absorbncia diminui mais rapidamente em valores de pH baixos. Esse

efeito pode ser um problema para o uso de Monascus em alimentos cidos, como
iogurte. O efeito do pH pode ser devido acelerao de interaes com as
molculas de pigmentos, como por exemplo o rompimento de uma ligao ster nos
pigmentos rubropunctamina ou monascorubramina; isso fica claro quando se
observa que a estabilidade dos pigmentos muito mais alta em etanol (dados no
mostrados). O efeito do pH e da temperatura sumarizado a seguir (Tabela 17):
Tabela 17 Absorbncia residual relativa de solues de pigmentos, aps 25h de incubao
a diferentes temperaturas e pHs. O valor mximo 1,00;os menores valores indicam a
maior degradao.
pH
4,1
4,7
6,0
7,3
7,9
0
0,799
0,870
0,831
0,827
0,837
Temperatura, C
32
40
60
0,863
0,794
0,493
0,885
0,820
0,460
0,865
0,805
0,572
0,843
0,863
0,724
0,916
0,883
0,789
100
0,132
0,149
0,155
0,266
0,531
78
Em uma tentativa de estabilizar os pigmentos, uma srie de solues a pH 7,0

com diferentes solutos como o antioxidante cido ascrbico, sais oxidantes de Fe3+
e Cu2+, e peptona (para providenciar grupos amino complexos, presentes em
protenas) foram testados; nenhum desses fatores contribuiu apreciavelmente para a
estabilizao dos pigmentos. Ensaios com as solues etanlicas mostraram alta
estabilidade do pigmento, o que indica bom potencial de uso em bebidas alcolicas.
Em resumo, os resultados indicam que h uma diminuio importante na cor
para todos os pHs em temperaturas superiores a 60C, e que em pH mais altos
(prximos neutralidade) o pigmento mais estvel. Esses resultados esto em
concordncia com os encontrados por Fabre et al. (1993) e Lee e Chen (2000).
Estudos futuros devem ser voltados para o mecanismo de degradao, provendo
informao para a estabilizao de pigmentos. A perda de cor por degradao na
indstria de alimentos comum, justamente por se utilizar pigmentos naturais com
freqncia. Por isso, pigmentos de Monascus continuam sendo um aditivo de cor
promissor, mas preciso considerar na formulao do produto que parte da cor
pode degradar, dependendo das condies de processo e do tipo de alimento.
79
5 CONCLUSES E SUGESTES
No presente trabalho comparou-se uma linhagem isolada de Monascus sp
com outras linhagens, avaliou-se substratos potenciais, mtodos de extrao de
pigmento, formas de produo em arroz e estabilidade dos pigmentos produzidos. A
partir dos resultados obtidos, pode-se chegar s seguintes concluses:
5.1.1 LPB 31 uma linhagem adequada para a produo industrial de pigmentos.
Os resultados obtidos mostram que a cepa isolada, LPB 31, uma linhagem
de Monascus sp com capacidade de crescimento equivalente ou superior s outras
linhagens testadas, tanto em arroz como em bagao de mandioca, em frascos. O
teor de citrinina no fermentado produzido por essa linhagem inferior ao obtido com
as outras linhagens testadas, e mesmo inferior ao teor no produto comercial. A
produo de pigmentos e a produtividade, foram superiores s das outras linhagens
testadas, perdendo apenas para o produto comercial (produo 13% menor), donde
pode-se concluir que a linhagem LPB 31 adequada para a produo industrial de
pigmentos de Monascus, sobre arroz.
5.1.2 Etanol o solvente orgnico mais adequado para a extrao de pigmentos.
Para extrair pigmentos de Monascus, sugere-se o uso de etanol at a
concentrao de 60% no meio extrativo, ou outro sistema de solventes de forma que
o ndice de polaridade mdio do meio seja igual a 7. A forma de extrao mais
conveniente industrialmente a agitao por 1h do fermentado com o solvente,
temperatura ambiente,
na proporo de 3 partes de solvente para 1 parte de
fermentado seco. Extraes exaustivas podem aumentar o rendimento da extrao

em 20%. No entanto, o uso de etanol mais concentrado favorece a posterior
evaporao do solvente.
5.1.3 Arroz o substrato bruto mais adequado para a produo de pigmentos.
Embora a produo de pigmentos de Monascus seja possvel em substratos
diversos, que com uma otimizao podem vir a apresentar produo compatvel com
a obtida em arroz, quando se trata de substratos puros (outros cereais e tubrculos),
80
o arroz o que fornece a maior produo de pigmentos. O bagao de mandioca,

substrato-alvo inicial do presente trabalho, apresenta em condies timas uma
produo cerca de 10 vezes menor que a de arroz.
5.1.4 Bagao de mandioca puro um substrato potencial para produo de extratos.
Embora a produo em arroz seja 10 vezes superior obtida em BM, este
substrato um resduo agroindustrial, cujo custo pode justificar o seu uso para a
produo de extratos (o uso de BM fermentado seco como aditivo no seria
possvel, devido ao baixo teor de cor). Outra vantagem do BM a maior porosidade
e menor aglutinao, que o tornam candidato produo com escalas maiores de
fermentao.
5.1.5 Condies para cultivo em meio slido arroz.
Para a produo de pigmentos de Monascus em FSS, as condies mais
adequadas so aerao forada (com ar saturado de umidade) de 1NmL/min.g de
substrato mido, para um leito de 8 cm de altura, durante 8 dias, com inculo
vegetativo, a 32C. Obtm-se nessas condies uma velocidade especfica mxima
de crescimento de 0,039h-1, e uma velocidade especfica de produo de pigmentos
de 27,5 UA/g biomassa.h-1. A produo tambm pode ser feita em bandejas, com
produo de quase igual (embora reconhea-se a necessidade da otimizao de
condies no reator). Nesse caso recomenda-se uma altura de leito de 2 cm.
5.1.6 Estabilidade de pigmentos de Monascus.
Os pigmentos de Monascus so instveis frente a extremos de pH e
temperaturas altas, devendo ser usados em aplicaes a temperaturas inferiores a
60C e pH prximos da neutralidade. O pigmento especialmente adequado para
aplicao em alimentos refrigerados, caso em que a degradao de cor baixa, ou
em bebidas alcolicas caso em que a degradao de cor no pode ser observada
em um intervalo de vrios meses.
81
5.2 Sugestes para trabalhos futuros

Seguem algumas sugestes para futuros trabalhos relacionados a este tema,
no LPB.
5.2.1 Gerao e seleo de linhagens mutantes de Monascus
A maior parte dos pigmentos produzidos por Monascus sp intracelular,
comum a frao pequena de pigmentos hidrossolveis. Como a verificao
qualitativa da produo de pigmentos em placas de Petri simples, por inspeo,
possvel tentar gerar mutantes (usando luz ultravioleta) que produzam mais
pigmentos hidrossolveis. Essa uma forma simples de aumentar o potencial
industrial de linhagens j conhecidas.
5.2.2 Formulaes com substratos mistos
Como a maior produo de pigmentos se d com o arroz, que um substrato
de fcil aglutinao e compactao para escalas de processo, ensaios futuros de
produo de pigmentos deveriam incluir um estudo de formulaes de arroz + BM,
procurando um compromisso entre a produo de pigmentos e a compactao do
meio.
5.2.3 Desenvolvimento de um condicionador de ar para reatores de FSS
Um dos problemas encontrados na fermentao em reator o controle de
temperatura do meio de fermentao. Um condicionador do ar de entrada,
controlado usando como referncia a temperatura mdia no leito do reator
certamente melhorar a qualidade das fermentaes.
82
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1

JLIO CESAR DE CARVALHO

DESENVOLVIMENTO DE BIOPROCESSO PARA A PRODUO DE PIGMENTOS

JLIO CESAR DE CARVALHO

DESENVOLVIMENTO DE BIOPROCESSO PARA A PRODUO DE PIGMENTOS

Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol

2.2 Pigmentos de Monascus .........................................................................12

2.4 Crescimento e produo de metablitos ...............................................18

2.5 Mtodos de fermentao .........................................................................24

2.7 Mtodos de anlise de pigmentos ..........................................................28

2.9 Mtodo de anlise de biomassa .............................................................30

3.3 Comparao de cepas .............................................................................34

3.4 Comparao de mtodos de extrao....................................................35

3.5 Substratos utilizados ...............................................................................35

3.6 Otimizao das condies de cultivo em bagao de mandioca ..........36

3.8 Extrao de pigmentos e anlise da absorbncia.................................38

3.9 Extrao e anlise da citrinina................................................................40

3.10 Anlise de biomassa em FSS................................................................41

3.11 Anlise respiromtrica...........................................................................42

3.11.1 Respirometria em colunas..........................................................................................42

3.12 Clculos - Regresso, ajuste de curvas e parmetros cinticos .......43

4.4 Comparao de diferentes substratos ...................................................53

4.6 Desenvolvimento do mtodo de anlise de biomassa via ergosterol .62

4.9 Correlao biomassa-pigmento..............................................................69

5.1.5 Condies para cultivo em meio slido arroz. ..........................................................80

5.2 Sugestes para trabalhos futuros ..........................................................81

6 Referncias Bibliogrficas ................................................................................82

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

mxima especfica de crescimento microbiano

UA: unidades de absorbncia

Este trabalho apresenta, numa abordagem de desenvolvimento de processo,

usados em pinturas de mais de 30000 anos em cavernas do sul da Frana, norte da

absorve a luz vermelha

absorve a luz verde

absorve a luz azul

As cores primrias subtrativas so o amarelo, o ciano e a magenta. Assim, se

isso que, para a anlise de pigmentos vermelhos, a absoro mxima se d para

A energia requerida por eltrons capazes de excitao depende do orbital que

2.1.5 Pigmentos naturais versus artificiais

A tabela na prxima pgina

(Tabela 1) mostra os corantes permitidos para alimentos segundo a legislao

Tabela 1 Corantes de uso permitido em alimentos e bebidas no Brasil (ANVISA, 2004)

A anlise da Tabela 1 mostra que a legislao brasileira permite o uso de

Uso restrito, permitido

que, presentemente, o uso de pigmentos de Monascus como aditivo intencional de

sinttico, predominantemente cis-, no apresenta. O mercado para pigmentos no

Mercado mundial em 1987: total U$ 320 milhes

Nota-se, analisando a Figura 3, que a participao proporcional dos

perfil econmico deve garantir o aumento no consumo de alimentos processados.

compostos apresentam mximos de absoro em UV a 306 nm, e a sua contribuio

Figura 4 estruturas de pigmentos de Monascus sp.

sintetizados no citosol a partir da acetil coenzima A, pelo complexo multienzimtico

condies e composio do meio de cultivo, com base no metabolismo do fungo. H

hidrossolveis por reao com aminocidos e compostos anlogos in vitro (St.

Figura 6 - Cultura de Monascus observada ao microscpio (aumento de 400 vezes). Note

2.3.4 Cepas utilizadas

universidades ou empresas, as cepas mais referenciadas na literatura de Monascus

Espcie, origem e depositante

Monascus purpureus Went

Sheperd e Carels, 1979

Monascus purpureus Went

Fonte: ATCC, maro de 2004

2.4 Crescimento e produo de metablitos