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UFT

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS

Eletroforese

Trabalho Acadêmico apresentado na


disciplina Seminários IV

Professor: Raimundo Wagner de


Souza Aguiar

Mauren C.A. Silveira

Gurupi-Tocantins
maio/2011
ELETROFORESE

A eletroforese é uma técnica desenvolvida para a separação e identificação de


fragmentos que têm propriedades eletromagnéticas distintas.
Vários princípios possibilitaram a formulação desta técnica.
O primeiro deles o foi do eletromagnetismo. Mais tarde, com a elucidação das
propriedades dos colóides verificou-se a possibilidade de dissolver substâncias em
material gelatinoso fazendo com que esse material permitisse o deslocamento de
substratos de forma selecionada. A união dos princípios do eletromagnetismo e de
substâncias colóides resultou na técnica de eletroforese que hoje permite a
separação e identificação de frações pequenas ou grandes de RNA, DNA e
proteínas.

ELETROMAGNETISMO

Conforme registro na Enciclopédia Mirador Internacional, eletromagnetismo é o


ramo da física que estuda quantitativamente e unificadamente, em nível
macroscópico, as interações de cargas e correntes elétricas entre si e com meios
materiais, bem como de suas manifestações magnéticas. O primeiro observador
que acabou com conceitos místicos envolvendo os processos de atração e repulsão
de certas rochas e vários materiais a formular uma crítica científica quanto ao
eletromagnetismo foi o físico inglês William Gilbert (1540-1603) ao considerar o
movimento dos planetas uma reação do eletromagnetismo.
Maxwell formulou, por volta de 1870, em linguagem matemática as relações gerais
dos fenômenos eletromagnéticos e elétricos usadas até hoje.
Esses 273 anos que separam as constatações e observações houve tempo para
experimentos provocados pelo acúmulo de informação. Durante esse período
foram inventados o pára-raios, o motor de indução, os geradores elétricos, o
telégrafo elétrico, as técnicas de eletrólise e galvanoplastia e a bateria elétrica.
Após as publicações de Maxwell vieram o telégrafo sem fio, as técnicas de
telecomunicações em geral, o radar, as microondas, e os raios X.
Segundo Maxwell as manifestações elétricas e magnéticas das cargas elétricas e
ímãs dependem de seu estado de movimento, de acordo com relações quantitativas
corretas, mesmo para velocidades grandes em comparação com a velocidade da luz
no vácuo.
Naquela época já havia o conceito apresentado por Newton de que o campo de
forças era uma região do espaço em cada ponto da qual, e em cada instante recém
passado, se pode experimentar a presença de uma força pelos efeitos mecânicos
causados num corpo de provas. São os corpos, e não o campo de forças que tem
realidade física. Os corpos interagem diretamente sem a necessidade da
intervenção de qualquer outro agente, quer nas dimensões atômicas, quer nas
dimensões interestelares e essas interações se propagam com velocidades infinitas,
isto é, ação e a reação são instantâneas e simultâneas. Por nenhum corpo se
propagar com velocidade superior à da luz no vácuo, e pelo campo de força
formado por essa propagação acompanhar os corpos (e não o contrário) é como se
formasse sempre uma sombra atrasada atrás dos corpos, que foi identificado como
o campo de forças.
Os corpos em geral são eletricamente neutros quando isolados e estáticos. Essa
neutralidade é quebrada dando lugar a cargas elétricas livres quando são
submetidos a atrito (triboeletricidade), pressão de outro corpo (piezoeletricidade),
reações químicas, efeitos térmicos (termoeletriciadade) ou radiações ionizantes. Ao
destruir sua neutralidade elétrica, os corpos passam a produzir efeitos mecânicos.
Em 1785 Coulomb realizou experiências eletrostáticas com pêndulos e bastões
eletrizados no vácuo. A partir dessas experiências desenvolveu o que foi chamada a
fórmula de Coulomb a qual foi modificada após se perceber que as forças
eletrostáticas em meios diferentes não se comportavam como a expressão da
fórmula. Foi introduzido na fórmula um fator de escala, característico de cada
meio material no qual se realiza o fenômeno, para se levar em conta os efeitos das
cargas induzidas por este meio. Este fator se chama “permissividade elétrica” do
meio.
Em 1802 Davy usou a propriedade das baterias elétricas para isolar elementos
alcalinos sódio e potássio por eletrólise de sais em fusão. Ele sabia que na bateria
há dois eletrodos embebidos numa solução condutora (eletrólito) comum e que
desigualdades entre o potencial químico entre eletrodos e eletrólito levam ao
acúmulo de cargas negativas num deles e carência delas no outro, gerando uma
diferença de potencial elétrico. Quando dois eletrodos são ligados por um fio
condutor uma corrente elétrica se estabelece e se fecha no interior da bateria
através do eletrólito. A passagem de corrente elétricas em eletrólitos causa
deposição de matéria neutra (eletrólise). Por meio deste conceito Davy conseguiu
realiza seu experimento.
Faraday relacionou qualitativamente e quantitativamente este processo.
Segundo suas leis propostas, cada 96.500 coulomb de carga transferida para uma
cuba com eletrólito, liberta massa de um átomo-grama de elemento monovalente,
ou seja, cada elétron entrando na cuba pelo terminal negativo neutraliza um íon
positivo do eletrólito, enquanto que a carga positiva deixada livre no outro eletrodo
neutraliza um íon de carga oposta. A eletrólise dentro da bateria provocada pela
corrente elétrica leva à neutralização da própria carga progressivamente e acaba
se extinguindo ao fim de certo tempo.
A lei de Faraday diz que a quantidade da decomposição eletrolítica é proporcional
à quantidade de eletricidade que circula na cuba eletrolítica e que a eletrólise de
várias substâncias diferentes com a mesma carga elétrica depende de seus
equivalentes-gramas.
Um exemplo de como ocorre a eletrólise e como pode ser manipulada dependendo
da quantidade de força aplicada na corrente elétrica:
Se for adicionado HCl a água numa cuba eletrolítica. O H contém íons positivos, o
OH contém íons negativos e o cloreto idem. Ao aplicar-se um campo elétrico à
solução com dois eletrodos imersos na água, os íons hidrogênio migram para o
cátodo e os íons hidroxila e cloreto para o ânodo. No cátodo, os íons hidrogênio
recebem um elétron e reduzem-se, passando à forma atômica. Os hidrogênios
livres se combinam formando moléculas de hidrogênio gasoso. No ânodo, as
hidroxilas oxidam-se, cedendo elétrons e formando oxigênio. Os elétrons que ficam
livres são atraídos pelo ânodo passando pelo condutor metálico e vão compensar os
elétrons faltando no cátodo.

Quando a eficiência da corrente é de 100%, a massa da substância eletrolisada é


proporcional à carga que circula na cuba eletrolítica. Medindo-se a corrente, pode-
se inferir o valor da carga. O aparelho para medir esse valor é o coulômetro ou
voltâmetro.
Para a passagem da substância à forma iônica é necessário que a densidade de
corrente (corrente por unidade de área do eletrodo) proporcione diferença de
potencial entre a solução e o cátodo para ocorrer redução.
A cuba eletrolítica pode ser preenchida por vários tipos de soluções.
O que é de interesse para o funcionamento da eletroforese vem a seguir
especificado.

COLÓIDES

Colóide é um vocábulo de origem inglesa, surgido por volta de 1847 com a acepção
de “natureza de cola”. O químico escocês Thomas Graham, em 1861, usou o termo
para expressar um típico agregado oposto ao cristalóide.
Colóide é um sistema aparentemente homogêneo, polifásico, com uma fase
contínua e outras descontínuas, constituídas por pequeníssimos fragmentos. A fase
contínua é dispersora, as outras fases são as dispersas.
A característica marcante dos colóides é o tamanho das partículas na fase dispersa,
entre 10⁻⁷ e 10⁻⁴ cm. Como base de comparação, partículas menores são em nível
molecular. Em colóides se as partículas forem maiores originará uma suspensão
grosseira.
Alguns exemplos de colóides: leite, manteiga, creme batido, sorvete, gelatina,
mousse, pudins, pomadas, fumaças, névoas.
Proteínas são colóides típicos que sob certas condições cristalizam-se.
Existem vários tipos de colóides que são classificados de acordo com seu estado
físico: Colóide sólido em sólido (certos vidros), colóide sólido em gás (aerosol),
colóide líquido em sólido (minerais silicatados), colóide líquido em gás (aerosol de
névoas, cerração), colóide de gás em sólido (lavas vulcânicas), colóide de gás em
líquido (espumas, mousses, sorvetes) e colóide de sólido em líquido que é chamado
também de solução coloidal ou sol como proteínas, soluções de gelatina, polímeros.
Os colóides sóis não aglutinam a sua fase dispersa e não floculam, mas por quê?
Dois fenômenos impedem a coagulação e mantém a estabilidade do estado coloidal
por certo período.
O primeiro é encontrado nos colóides liófilos: cada partícula da fase dispersa tem
grande afinidade com a fase dispersora e solvata-se, ficando envolvida por uma
camada de solvatação (no caso da água a camada é de hidratação e o colóide é
hidrófilo). No caso da partícula ter carga elétrica forma-se em torno dela uma
atmosfera de íons de sinal oposto ao seu (gegen-íons) e passa a existir uma
diferença de potencial elétrico entre ela e a fase dispersora, o potencial zeta. A
existência da solvatação e do potencial zeta impede que duas partículas se reúnam,
ou dificulta a reunião, e o colóide se mantém estável. O conjunto formado pela
partícula solvatada e seus gegen-íons é a micela coloidal. São liófilos em água a
gelatina, albumina do ovo, gorduras animais e alguns hidróxidos inorgânicos como
o alumínio.
O segundo fenômeno é encontrado em colóides liófobos, em que não há solvatação,
mesmo assim se forma a atmosfera de íons e o potencial zeta dando estabilidade
aos colóides. Um colóide liófobo pode flocular, pois a neutralização da carga
elétrica forma uma dessolvatação. São liófobos os metais e óxidos metálicos.
Pode-se estabilizar um liófobo adicionado-se um liófilo para formar uma micela
solvatada.
Em sóis a mobilidade das partículas por ação de um campo elétrico é menor que a
dos íons, pois o raio das partículas é maior. Essa velocidade é diretamente
proporcional ao potencial zeta.
A eletroforese feita no papel funciona sob o mesmo princípio, já que o papel é
impregnado com uma solução coloidal.

ÁGAR

O ágar é uma substância gelatinosa retirada de algas vermelhas Gelidium,


Gracilaria, Ahnfeltia, Pterocladia e outras. Quimicamente o ágar é um éster
sulfúrico encontrado em estado natural na parede da célula dessas algas,
provavelmente misturados com sais de cálcio e magnésio. A partir de uma
suspensão concentrada de algas, obtêm-se, por simples infusão em água fervente,
seu extrato gelatinoso.
A concentração da agarose determina o grau de separação dos fragmentos
dependendo de seu tamanho. Menores concentrações facilitam as separações de
fragmentos de maior peso molecular

PROTEÍNAS

A primeira denominação de proteína foi por volta de 1838 pelo químico holandês
Johannis Gerardus Mulder que usou o termo por derivar do grego “prõteios” que
quer dizer “primário”, por se pensar, naquela época, que as proteínas eram a
matéria fundamental básica do corpo dos animais e plantas.
São constituídas por aminoácidos que são substâncias orgânicas formadas por um
grupo amino básico e um grupo carboxílico ácido.
As proteínas formam complexos chamados de grupos prostéticos conjugados.
Algumas contem enxofre, iodo e fósforo. Podem se combinar a ácidos nucléicos
situando-se no núcleo das células ou podem ser associadas a hidratos de carbono
ou lipídeos. Podem também se unir a metais, flavinas e ferro.
Algumas características das proteínas permitem identificá-las pela eletroforese:
Diferente comportamento em relação aos ácidos e bases, migração em campo
elétrico funcionando como eletrólitos, solubilidade na água e soluções salinas, peso
molecular e forma das moléculas.
A primeira eletroforese de proteínas foi realizada pelo químico sueco Arne Tiselius
em 1937 que ganhou o prêmio Nobel de química em 1948.
As moléculas de proteína têm uma determinada carga de íons H‾ que lhes confere
um pH.
Os aminoácidos das proteínas podem ficar em um ponto de equilíbrio em que suas
cargas positivas e negativas se anulam no que se dá o nome de ponto isoelétrico
(PI). Um PI baixo indica que a proteína ou o aminoácido tem carga mais negativa.
Dependendo do pH das moléculas, durante a eletroforese as proteínas migram no
campo elétrico para uma determinada direção. As proteínas são substâncias
anfóteras, que variam sua carga (positiva ou negativa) em função do pH. Quando
em meio ácido ficam carregadas positivamente e se comportam como uma base,
quando em meio básico ficam negativamente carregadas e se comportam como um
ácido, no meio neutro se comportam como íons dipolares, ao mesmo tempo
negativas e positivas. Esse pH deve ser meticulosamente testado quando se faz o
tampão que é usado na composição do gel de eletroforese para proteínas. A solução
tampão serve para não haver mudança brusca de pH.
Para realizar a eletroforese precisam ser quebradas suas pontes de dissulfeto para
ligarem-se a uma substância presente num gel de composição específica usado para
separar proteínas e que dá a elas uma carga negativa. Essa substância é o SDS. O
sistema é chamado SDS-Page.
Desde muitos anos estipulou-se que a seqüência de transformações ocorridas desde
o DNA até as proteínas seria o dogma central da biologia: DNA – RNA –
Proteínas.
Conhecendo-se a estrutura das proteínas pode-se mapear como elas foram
montadas e chega-se à estrutura ativa do DNA.
Como as proteínas são o produto dos genes contidos no DNA, para verificar se as
modificações gênicas foram bem sucedidas, basta verificar a formação das
proteínas.
As doenças genéticas se expressam pela produção de proteínas defeituosas ou em
quantidades insuficientes. O diagnóstico de várias doenças pode ser feito pela
verificação direta da estrutura das proteínas.

IMUNOLOGIA

Paul Ehrlich (1854-1915) é o pai da imunoquímica e estudou química por dez anos
antes de investigar a estrutura das proteínas.
A imunodifusão usa a gravidade para evidenciar o deslocamento de antígenos-
anticorpo dispersos em material colóide. O conjugado produz uma zona ou banda
de precipitação que migra no sentido vertical. A distância percorrida é
inversamente proporcional ao quadrado do tempo decorrido, mas cada antígeno
possui sua constante de difusão, o que faz com que migrem com velocidades
diferentes.
Uma técnica mais complexa que usa o mesmo princípio é o da dupla imunodifusão.
Por essa técnica primeiro introduz-se a camada de ágar contendo anticorpo e
espera-se que solidifique. Coloca-se sobre este uma camada de ágar puro e depois
uma camada de ágar contendo o antígeno. Na camada de ágar puro se forma
precipitados em proporção de equivalência aos conjugados. Este tipo de
imunodifusão foi feita por Oakley e Fulthorpe.
Na mesma época Ouchterlony e Elek realizaram uma técnica de imunodifusão em
posição horizontal, deixando migrar livremente antígeno e anticorpo um contra o
outro.
A imunoeletroforese é a combinação da eletroforese com a dupla difusão em gel.
O método foi desenvolvido por Grabar e Williams e realiza-se em gel de ágar com
separação por eletroforese primeiramente para depois os componentes
eletroforéticos separados reagirem com os imuno-soros adequados que serão
adicionados.
Para a imunoeletroforese são utilizados gel de amido, gel de poliacrilamida e
acetato de celulose.
Com esta técnica é possível diferenciar duas substâncias de mesma mobilidade
pelas diferenças de difusão, conhecer a especificidade imunológica que se
relacionam à estrutura química e conhecer as propriedades eletroforéticas da
substância (grau de mobilidade).
O método realizado em lâminas de microscopia, permitindo analisar até 0,001 ml
de soro que corresponde a um total protéico de 70 a 80 μg e permite detecção de
até 1 μg de proteína. Segundo Poulik, a sensibilidade da imunoeletroforese
permite determinar proteína na concentração de 3 μg por mililitro.
DNA

O DNA é um ácido desoxirribonucléico formado pela ligação de 4 bases diferentes.


Suas ligações dependem de pontes de hidrogênio e ligações fosfodiésteres. Quanto
mais pontes de hidrogênio, mais estáveis são as ligações. Como a estrutura dos
açúcares forma um pentagrama e a ligação fosfodiéster liga o carbono 5 (fora do
pentagrama) ao carbono 3 do outro açúcar e a base sempre se liga ao carbono 1 do
mesmo açúcar, a estrutura acaba se torcendo para a direita formando uma hélice.
O DNA é formado por duas fitas, cada uma com uma base complementar à outra
que se ligam ao meio pelo açúcar, logo a estrutura é de dupla hélice.
Usando substâncias que quebram a cadeia nas pontes de hidrogênio é possível
isolar desde uma base com seu açúcar até um gene inteiro. Para se identificar um
gene, basta lembrar que todo gene tem seqüência de terminação e de início e essas
seqüências são conhecidas e geralmente são repetidas várias vezes. Usando-se
enzimas específicas que se ligam somente a essas seqüências, obtém-se o gene
requerido.
Em eletroforese é possível isolar genes que contém cadeias muito grandes, maiores
que as estruturas das proteínas. Para isso o gel no qual o DNA fracionado é
inserido é composto por colóides que formam uma micela mais larga que aquela
formada para a passagem das proteínas.
O DNA migra sempre para o pólo positivo, pois a carga de sua molécula é
negativa.
RNA

O RNA é uma ácido ribonucléico formado pela ligação de 4 bases diferentes. Essas
bases são iguais à do DNA com exceção de uma: ao invés de Timina, encontra-se a
Uracila. A diferença entre a Uracila e a Timina é que na Timina o carbono 1 é
ligado a um metil e na Uracila o carbono 1 é ligado a um –H. A diferença entre o
açúcar desoxirribose e ribose está no radical do carbono 2: em DNA esse carbono
tem um radical –H, em RNA esse carbono tem radical –OH. Apesar de ser capaz
de se ligar a outra fita de RNA, normalmente é composto de fita simples.
Essas mudanças não diferem da carga da molécula de DNA. A molécula de RNA
ainda é negativa.
O RNA é formado a partir do DNA pela transcrição. Esse RNA é chamado RNA
mensageiro, porque é o mensageiro das informações genéticas que serão
posteriormente traduzidas em proteínas. O RNA transportador e o RNA
ribossômico não são traduzidos. Para haver a separação da dupla hélice de DNA e
a inclusão de nucleotídeos (base) que são complementares a fita de DNA é
necessária a ação da RNA polimerase que é uma enzima (proteína) produzida
também a partir do DNA.

GEL PARA ELETROFORESE

A eletroforese é uma técnica que utiliza os princípios do eletromagnetismo,


eletroquímica e as propriedades de substâncias orgânicas para suas separações em
partes estruturais fundamentais para visualização e análise.
Inicialmente a eletroforese era feita em duas cubas contendo solução eletrolítica e
uma fita de papel de filtro mergulhada pelas extremidades a cada uma das cubas.
No meio do papel era colocada a substância a ser analisada, tendo por suporte uma
lâmina de vidro. Em cada cuba mergulhava-se um fio indo a uma bateria. Um fio
no pólo negativo, o outro no positivo. A passagem da corrente fazia com que a
substância fosse separada de acordo com seu peso molecular e direcionada de
acordo com sua carga.
Hoje a eletroforese pode ser realizada em acetato de celulose, gel de agarose, gel de
amido, gel de poliacrilamida, dependendo da substância a ser analisada.
O acetato de celulose tem microporosidade e composição química ligeiramente
pura, o que permite uma separação mais rápida e uma transparentização melhor,
portanto, visualização melhorada das bandas formadas.
O gel de agarose é de baixo custo, fácil de conservar, de fácil manuseio e a
separação das bandas se dão melhor do que no acetato de celulose. A malha do gel
de agarose é mais larga que a do gel de poliacrilamida, assim permite a passagem
de, por exemplo, DNA com dezenas e até centenas quilobases, mas não diferem no
peso de pares de bases específicos.
Para a visualização posterior do DNA a técnica pode ser acrescentada de brometo
de etídeo que é um análogo de base que se intercala na molécula de DNA e emite
fluorescência violeta quando exposto aos raios UV, mas na sua presença ocorre
redução de velocidade de migração, pois seu peso molecular aumenta.
Diferentemente da separação das proteínas, o DNA corre mais ou menos rápido
dependendo da forma de sua estrutura. A forma superenovelada migra mais
rápido que a forma linear, e a forma relaxada é a mais lenta.
O gel de amido é usado para separação de proteínas, enzimas e hemoglobinas.
Quanto mais puro o amido, menor é o poro. É possível a separação de partículas
tão pequenas quanto um par de bases, mas requer um tempo de migração maior,
um tempo maior para preparação do gel e há dificuldade na coloração das frações
separadas.
O gel de poliacrilamida é usado para separar proteínas. Como proteínas são
anfóteras, é comum adicionar ao gel o SDS (dodecil sulfato de sódio) que integram
à proteína a característica de carga negativa sem alterar sua estrutura. Para essa
interação, no entanto, as proteínas devem ser previamente aquecidas com β-
mercaptoetanol que quebra a ligação dissulfeto. Isso também mudará a
conformação da molécula deixando-a linear. A migração do complexo proteína-
SDS não depende da conformação da molécula, mas do seu peso molecular. Na
saturação cerca de 1,4 g de SDS é ligado por cada grama de proteína, o que
corresponde a uma molécula de SDS para cada dois resíduos de aminoácidos.
Para migração do sistema SDS-proteína são usados dois tipos de géis de
poliacrilamida: gel concentrador e gel separador.
O gel concentrador é formado pro uma malha de grande porosidade
(poliacrilamida 5%). Sua função é compactar a amostra em um pequeno volume,
depositando-a sobre a superfície limite do gel separador como uma banda estreita.
O gel separador tem uma malha mais estreita (8-20%) que tem a função de
separar os complexos SDS-proteína em função de suas massas moleculares.
O que permite que a amostra seja compactada para a faixa estreita entre os dois
géis é a diferença de pH entre a constituição do gel e o tampão de corrida utilizado.
O tamanho dos poros diminui com o aumento da relação molar
bisacrilamida/acrilamida.

Para a visualização das bandas de proteínas, mergulha-se o gel, após a migração


em corante comassie-blue ou sais de prata. O comassie-blue não funciona bem com
proteínas básicas e sofre interferência do SDS quando este está em concentração
acima de 0,2%.

SUBSTÂNCIAS USADAS EM TÉCNICAS DE ELETROFORESE EM GEL

Tampão de corrida
A composição e a força iônica do tampão de corrida influenciam na migração e na
qualidade do resultado de uma eletroforese. Em baixa força iônica a migração é
muito lenta e em extrema força iônica provoca uma alta condutividade elétrica que
gera calor e
pode levar à desnaturação das partículas analisadas. Os tampões mais utilizados
são TAE e TBE.
TAE (Tris acetato de EDTA): Tem baixo custo, mas capacidade tamponante
menor que o TBE. Não deve ser utilizado em corridas muito longas nem em altas
voltagens, caso seja necessário seu uso nesses casos deve-se trocar o tampão,
mesmo que seja no meio da corrida. Pode promover uma corrida cerca de 10%
mais rápida quando o DNA em forma linear ou superenovelada.

β-Mercaptoetanol
É um antioxidante que quebra a ligação dissulfeto deixando a estrutura de DNA,
RNA ou proteína linear. A conseqüência disso é que livra o DNA de possível
contaminação por fenóis e no caso de proteínas, deixa livre uma interação para o
SDS.
Brometo de etídeo
É um análogo de base que se intercala na molécula de DNA e emite fluorescência
violeta quando exposto aos raios UV.

SDS 20%
Dodecil sulfato de sódio é usado para alterar a carga elétrica de proteínas sem
influenciar na sua estrutura.
ELETROFORESE PARA DNA OU RNA
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Azevedo, O. M.; Felipe, S. M.; Brígido, M. M.; Maranhão, Q. A.; Souza, T. M.


Técnicas Básicas em Biologia Molecular. Brasília, ed. Brasília, 2003.
Encilcopédia Mirador Internacional – Encyclopaedia Britannica do Brasil (São
Paulo, Rio de janeiro)
Kreuzer, H.; Massey, A. Engenharia Genética e Biotecnologia. Porto Alegre, ed.
Artmed, 2002.