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Eletroforese
Gurupi-Tocantins
maio/2011
ELETROFORESE
ELETROMAGNETISMO
COLÓIDES
Colóide é um vocábulo de origem inglesa, surgido por volta de 1847 com a acepção
de “natureza de cola”. O químico escocês Thomas Graham, em 1861, usou o termo
para expressar um típico agregado oposto ao cristalóide.
Colóide é um sistema aparentemente homogêneo, polifásico, com uma fase
contínua e outras descontínuas, constituídas por pequeníssimos fragmentos. A fase
contínua é dispersora, as outras fases são as dispersas.
A característica marcante dos colóides é o tamanho das partículas na fase dispersa,
entre 10⁻⁷ e 10⁻⁴ cm. Como base de comparação, partículas menores são em nível
molecular. Em colóides se as partículas forem maiores originará uma suspensão
grosseira.
Alguns exemplos de colóides: leite, manteiga, creme batido, sorvete, gelatina,
mousse, pudins, pomadas, fumaças, névoas.
Proteínas são colóides típicos que sob certas condições cristalizam-se.
Existem vários tipos de colóides que são classificados de acordo com seu estado
físico: Colóide sólido em sólido (certos vidros), colóide sólido em gás (aerosol),
colóide líquido em sólido (minerais silicatados), colóide líquido em gás (aerosol de
névoas, cerração), colóide de gás em sólido (lavas vulcânicas), colóide de gás em
líquido (espumas, mousses, sorvetes) e colóide de sólido em líquido que é chamado
também de solução coloidal ou sol como proteínas, soluções de gelatina, polímeros.
Os colóides sóis não aglutinam a sua fase dispersa e não floculam, mas por quê?
Dois fenômenos impedem a coagulação e mantém a estabilidade do estado coloidal
por certo período.
O primeiro é encontrado nos colóides liófilos: cada partícula da fase dispersa tem
grande afinidade com a fase dispersora e solvata-se, ficando envolvida por uma
camada de solvatação (no caso da água a camada é de hidratação e o colóide é
hidrófilo). No caso da partícula ter carga elétrica forma-se em torno dela uma
atmosfera de íons de sinal oposto ao seu (gegen-íons) e passa a existir uma
diferença de potencial elétrico entre ela e a fase dispersora, o potencial zeta. A
existência da solvatação e do potencial zeta impede que duas partículas se reúnam,
ou dificulta a reunião, e o colóide se mantém estável. O conjunto formado pela
partícula solvatada e seus gegen-íons é a micela coloidal. São liófilos em água a
gelatina, albumina do ovo, gorduras animais e alguns hidróxidos inorgânicos como
o alumínio.
O segundo fenômeno é encontrado em colóides liófobos, em que não há solvatação,
mesmo assim se forma a atmosfera de íons e o potencial zeta dando estabilidade
aos colóides. Um colóide liófobo pode flocular, pois a neutralização da carga
elétrica forma uma dessolvatação. São liófobos os metais e óxidos metálicos.
Pode-se estabilizar um liófobo adicionado-se um liófilo para formar uma micela
solvatada.
Em sóis a mobilidade das partículas por ação de um campo elétrico é menor que a
dos íons, pois o raio das partículas é maior. Essa velocidade é diretamente
proporcional ao potencial zeta.
A eletroforese feita no papel funciona sob o mesmo princípio, já que o papel é
impregnado com uma solução coloidal.
ÁGAR
PROTEÍNAS
A primeira denominação de proteína foi por volta de 1838 pelo químico holandês
Johannis Gerardus Mulder que usou o termo por derivar do grego “prõteios” que
quer dizer “primário”, por se pensar, naquela época, que as proteínas eram a
matéria fundamental básica do corpo dos animais e plantas.
São constituídas por aminoácidos que são substâncias orgânicas formadas por um
grupo amino básico e um grupo carboxílico ácido.
As proteínas formam complexos chamados de grupos prostéticos conjugados.
Algumas contem enxofre, iodo e fósforo. Podem se combinar a ácidos nucléicos
situando-se no núcleo das células ou podem ser associadas a hidratos de carbono
ou lipídeos. Podem também se unir a metais, flavinas e ferro.
Algumas características das proteínas permitem identificá-las pela eletroforese:
Diferente comportamento em relação aos ácidos e bases, migração em campo
elétrico funcionando como eletrólitos, solubilidade na água e soluções salinas, peso
molecular e forma das moléculas.
A primeira eletroforese de proteínas foi realizada pelo químico sueco Arne Tiselius
em 1937 que ganhou o prêmio Nobel de química em 1948.
As moléculas de proteína têm uma determinada carga de íons H‾ que lhes confere
um pH.
Os aminoácidos das proteínas podem ficar em um ponto de equilíbrio em que suas
cargas positivas e negativas se anulam no que se dá o nome de ponto isoelétrico
(PI). Um PI baixo indica que a proteína ou o aminoácido tem carga mais negativa.
Dependendo do pH das moléculas, durante a eletroforese as proteínas migram no
campo elétrico para uma determinada direção. As proteínas são substâncias
anfóteras, que variam sua carga (positiva ou negativa) em função do pH. Quando
em meio ácido ficam carregadas positivamente e se comportam como uma base,
quando em meio básico ficam negativamente carregadas e se comportam como um
ácido, no meio neutro se comportam como íons dipolares, ao mesmo tempo
negativas e positivas. Esse pH deve ser meticulosamente testado quando se faz o
tampão que é usado na composição do gel de eletroforese para proteínas. A solução
tampão serve para não haver mudança brusca de pH.
Para realizar a eletroforese precisam ser quebradas suas pontes de dissulfeto para
ligarem-se a uma substância presente num gel de composição específica usado para
separar proteínas e que dá a elas uma carga negativa. Essa substância é o SDS. O
sistema é chamado SDS-Page.
Desde muitos anos estipulou-se que a seqüência de transformações ocorridas desde
o DNA até as proteínas seria o dogma central da biologia: DNA – RNA –
Proteínas.
Conhecendo-se a estrutura das proteínas pode-se mapear como elas foram
montadas e chega-se à estrutura ativa do DNA.
Como as proteínas são o produto dos genes contidos no DNA, para verificar se as
modificações gênicas foram bem sucedidas, basta verificar a formação das
proteínas.
As doenças genéticas se expressam pela produção de proteínas defeituosas ou em
quantidades insuficientes. O diagnóstico de várias doenças pode ser feito pela
verificação direta da estrutura das proteínas.
IMUNOLOGIA
Paul Ehrlich (1854-1915) é o pai da imunoquímica e estudou química por dez anos
antes de investigar a estrutura das proteínas.
A imunodifusão usa a gravidade para evidenciar o deslocamento de antígenos-
anticorpo dispersos em material colóide. O conjugado produz uma zona ou banda
de precipitação que migra no sentido vertical. A distância percorrida é
inversamente proporcional ao quadrado do tempo decorrido, mas cada antígeno
possui sua constante de difusão, o que faz com que migrem com velocidades
diferentes.
Uma técnica mais complexa que usa o mesmo princípio é o da dupla imunodifusão.
Por essa técnica primeiro introduz-se a camada de ágar contendo anticorpo e
espera-se que solidifique. Coloca-se sobre este uma camada de ágar puro e depois
uma camada de ágar contendo o antígeno. Na camada de ágar puro se forma
precipitados em proporção de equivalência aos conjugados. Este tipo de
imunodifusão foi feita por Oakley e Fulthorpe.
Na mesma época Ouchterlony e Elek realizaram uma técnica de imunodifusão em
posição horizontal, deixando migrar livremente antígeno e anticorpo um contra o
outro.
A imunoeletroforese é a combinação da eletroforese com a dupla difusão em gel.
O método foi desenvolvido por Grabar e Williams e realiza-se em gel de ágar com
separação por eletroforese primeiramente para depois os componentes
eletroforéticos separados reagirem com os imuno-soros adequados que serão
adicionados.
Para a imunoeletroforese são utilizados gel de amido, gel de poliacrilamida e
acetato de celulose.
Com esta técnica é possível diferenciar duas substâncias de mesma mobilidade
pelas diferenças de difusão, conhecer a especificidade imunológica que se
relacionam à estrutura química e conhecer as propriedades eletroforéticas da
substância (grau de mobilidade).
O método realizado em lâminas de microscopia, permitindo analisar até 0,001 ml
de soro que corresponde a um total protéico de 70 a 80 μg e permite detecção de
até 1 μg de proteína. Segundo Poulik, a sensibilidade da imunoeletroforese
permite determinar proteína na concentração de 3 μg por mililitro.
DNA
O RNA é uma ácido ribonucléico formado pela ligação de 4 bases diferentes. Essas
bases são iguais à do DNA com exceção de uma: ao invés de Timina, encontra-se a
Uracila. A diferença entre a Uracila e a Timina é que na Timina o carbono 1 é
ligado a um metil e na Uracila o carbono 1 é ligado a um –H. A diferença entre o
açúcar desoxirribose e ribose está no radical do carbono 2: em DNA esse carbono
tem um radical –H, em RNA esse carbono tem radical –OH. Apesar de ser capaz
de se ligar a outra fita de RNA, normalmente é composto de fita simples.
Essas mudanças não diferem da carga da molécula de DNA. A molécula de RNA
ainda é negativa.
O RNA é formado a partir do DNA pela transcrição. Esse RNA é chamado RNA
mensageiro, porque é o mensageiro das informações genéticas que serão
posteriormente traduzidas em proteínas. O RNA transportador e o RNA
ribossômico não são traduzidos. Para haver a separação da dupla hélice de DNA e
a inclusão de nucleotídeos (base) que são complementares a fita de DNA é
necessária a ação da RNA polimerase que é uma enzima (proteína) produzida
também a partir do DNA.
Tampão de corrida
A composição e a força iônica do tampão de corrida influenciam na migração e na
qualidade do resultado de uma eletroforese. Em baixa força iônica a migração é
muito lenta e em extrema força iônica provoca uma alta condutividade elétrica que
gera calor e
pode levar à desnaturação das partículas analisadas. Os tampões mais utilizados
são TAE e TBE.
TAE (Tris acetato de EDTA): Tem baixo custo, mas capacidade tamponante
menor que o TBE. Não deve ser utilizado em corridas muito longas nem em altas
voltagens, caso seja necessário seu uso nesses casos deve-se trocar o tampão,
mesmo que seja no meio da corrida. Pode promover uma corrida cerca de 10%
mais rápida quando o DNA em forma linear ou superenovelada.
β-Mercaptoetanol
É um antioxidante que quebra a ligação dissulfeto deixando a estrutura de DNA,
RNA ou proteína linear. A conseqüência disso é que livra o DNA de possível
contaminação por fenóis e no caso de proteínas, deixa livre uma interação para o
SDS.
Brometo de etídeo
É um análogo de base que se intercala na molécula de DNA e emite fluorescência
violeta quando exposto aos raios UV.
SDS 20%
Dodecil sulfato de sódio é usado para alterar a carga elétrica de proteínas sem
influenciar na sua estrutura.
ELETROFORESE PARA DNA OU RNA
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS