Sistema teste de Allium cepa como bioindicador da citogenotoxicidade de cursos d'gua

Cristina Copstein Cuchiara , Clarissa de Souza Borges , Vera Lucia Bobrowski

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Universidade Federal de Pelotas, Instituto de Biologia, Departamento de Botnica, Laboratrio de Cultura de Tecidos de Plantas, Campus Universitrio s/n, Caixa Postal 354, CEP 96160-000, Capo do Leo, RS, Brasil (cccuchiara@hotmail.com) 2 Universidade Federal de Pelotas, Instituto de Biologia, Departamento de Zoologia e Gentica, Laboratrio de Gentica, Campus Universitrio s/n, Caixa Postal 354, CEP 96160-000, Capo do Leo, RS, Brasil.

Resumo - O objetivo deste trabalho foi avaliar a citogenotoxicidade do Arroio Padre Doutor por meio do sistema teste Allium cepa (cebola comum) como bioindicador. Realizaram-se testes de anlise de crescimento de razes e ndice mittico (IM) em clulas meristemticas radiculares tratadas com guas de 4 pontos do arroio e gua destilada como controle. Na primavera, para crescimento das razes, apenas a amostra do Ponto 3 diferiu do controle. No outono, os resultados para IM e crescimento das razes foram significativos nas diferentes amostras de gua testadas, comprovando o efeito txico e citotxico das mesmas. A estao do ano em estudo foi mais sensvel aos testes realizados e aos efeitos dos mesmos. No inverno, os resultados da anlise do IM foram significativos nos pontos testados, onde o controle no diferiu dos demais pontos enquanto apenas o Ponto 4 diferiu do Ponto 2, onde se observou diminuio no IM. Por meio do bioensaio realizado no foram detectados efeitos genotxicos significativos nos parmetros macroscpicos analisados nas diferentes estaes do ano nem efeitos citotxicos influenciando o ndice mittico as clulas meristemticas de cebola. Palavras-chave: cebola, citotoxicidade, genotoxicidade, biomonitoramento, mutagenicidade, aberraes cromossmicas

Allium cepa test system as a bio indicator of cytogenotoxicity of watercourses

Abstract - The objective of the present study was to evaluate the cytogenotoxicity of the Arroio Padre Doutor stream using the Allium cepa (common onion) system as a bio indicator. For both tests analysis of root growth and the mitotic index (MI) of meristematic root cells, treated with water from four points of the stream, was performed. Distilled water was used as a control. In the spring, only the sample taken from Point 3 of the stream differed from control, for the variable root growth. In the autumn, the statistical results for the variables MI and root growth were highly significant for the different water samples tested, confirming the toxic and cytotoxic effect. This season of study was most sensitive to the tests and the effects thereof. In winter, the results of MI analysis were highly significant for the points tested, as control did not differ from other points, while only Point 4 differed from Point 2, where a decrease in MI was observed. Bioassay performed using the Allium test did not detect significant genotoxic effects in macroscopic study in different seasons, and cytotoxic effects influencing the mitotic index of onion meristematic cells were not observed. Keywords: onion, cytotoxicity, genotoxicity, biomonitoring, mutagenicity, chromosomes aberrations

Introduo Muitos problemas de sade humana, incluindo alguns tipos de cncer, atualmente, so atribudos presena de diversos contaminantes presentes no meio ambiente e na gua (Fatima & Ahmad, 2006; Barbrio et al., 2009). Resduos industriais, urbanos e agrcolas so lanados indiscriminadamente nos cursos d'gua acrescentando vrios contaminantes s guas superficiais e sedimentos (Egito et al., 2007). Para a avaliao, monitoramento e deteco de contaminantes no ambiente, os bioensaios com plantas superiores tm sido recomendados (Grant, 1999). O teste de Allium cepa desenvolvido por Levan (1938) considerado uma ferramenta til para a pesquisa bsica do potencial genotxico e citotxico de produtos qumicos, substncias complexas como extratos de plantas, dejetos industriais e, principalmente, guas contaminadas.

A utilizao de Allium cepa L. (cebola comum) tem sido recomendada para anlises de efluentes devido a sua elevada sensibilidade, baixo custo, rapidez, facilidade de manipulao e da utilizao de amostras sem tratamento prvio, determinando-se a diminuio do ndice mittico e a formao de aberraes cromossmicas (Leme & MarinMorales, 2009). Sendo utilizado rotineiramente em todo o mundo em laboratrios que trabalham com testes de gentica toxicolgica, considerado uma ferramenta valiosa quanto determinao da contaminao ambiental, havendo extenso banco de dados de substncias qumicas j testadas (Fiskesj, 1993). O Allium Teste fornece dois tipos de toxicidade. Parmetros macroscpicos que podem ser observados consistem em formao de tumores, avaliao de crescimento de razes e razes torcidas, entre outros. ndice mittico, para a anlise de taxa de diviso celular, aberraes cromossmicas, como: cromossomos em anel, pontes
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cromossmicas, cromossomos pegajosos, retardos cromossmicos, que ocorrem principalmente nas fases de metfase e anfase e formao de microncleos, como indicadores de anormalidades no DNA, perfazem parmetros microscpicos (Monarca et al., 2000). Este teste tem sido validado internacionalmente como bioindicador de amostras ambientais (Evseeva et al., 2003), sendo utilizado como teste preliminar para avaliar o potencial genotxico e citotxico de substncias cancergenas e como bioindicador de contaminao ambiental (Barbrio et al., 2009). Devido ao crescimento da populao, consequente aumento do consumo e variaes climticas sazonais bem definidas, estudos com cursos d'gua tornam-se necessrios para o monitoramento das condies da gua utilizada pela populao (Cuchiara, 2007). O objetivo desse trabalho foi avaliar a citotoxicidade e a genotoxicidade de cursos d'gua por meio do sistema teste Allium cepa como bioindicador, verificando os danos causados em clulas meristemticas radiculares. Material e Mtodos A Universidade Federal de Pelotas (UFPel), que tem seu campus universitrio situado na cidade do Capo do Leo, Estado do Rio Grande do Sul, Brasil (31 48' 24,85 S e 52 24' 46,16 O) consome gua do Arroio Padre Doutor, que atravessa zonas industriais, urbanas e rurais, considerado de importncia econmica e social para a regio (Cuchiara, 2007). O estudo foi realizado ao longo do Arroio Padre Doutor de forma sazonal nas estaes de primavera, vero, outono e inverno, nos meses de outubro de 2006, fevereiro de 2007, maio de 2007 e junho de 2007, respectivamente, entre 8 e 12h da manh. Foram coletadas amostras de gua de superfcie em diferentes pontos pr-determinados e selecionados de forma a se abordar quatro reas de influncia, de acordo com a Tabela 1. Em cada ponto a gua foi coletada em recipiente de polietileno de 5 L e esses foram mantidos sob refrigerao e transportados ao Laboratrio de Gentica, Departamento de

Tabela 1. Localizao e descrio dos pontos de coleta de gua nas diferentes reas de influncia ao longo do Arroio Padre Doutor nas diferentes estaes do ano. Laboratrio de Gentica, DZG/IB, UFPel, Pelotas, RS, 2006/2007. Coleta de gua Localizao
Ponto 1 Nascente

Descrio

3144'50,20S Localizado na nascente do arroio, na 5229'13,48O Ponte do Arroio Moreira, regio que

corta a BR-293, estrada que liga Pelotas a cidade de Bag (RS)

Ponto 2 3145'25,99S Localizado na Barragem do Arroio Capo do Leo 5229'19,25O Moreira onde ocorre a coleta de gua

para abastecimento da populao da cidade de Capo do Leo (RS)

Ponto 3 3146'56,80S Localizado sob a Ponte sobre o Arroio Ponte Jaguaro 5228'10,66O Teodsio, regio que corta a BR-116,

estrada que liga Pelotas (RS) a cidade de Jaguaro (RS)

Ponto 4 3148'30,18S Localizado prximo ao Campus da Ponte Embrapa 522514,41O Universidade Federal de Pelotas

(UFPel) sob domnio da Embrapa.

Zoologia e Gentica, Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas, onde foram realizadas as anlises. Para o teste foram utilizados 10 bulbos de cebola para cada ponto de coleta, com aproximadamente 20 mm de dimetro e com catfilo externo retirado. Posteriormente foram acondicionados em tubos de ensaio fixos em estantes (Figura 1), na qual permaneceram durante 72h com a rea radicular imersa nas diferentes amostras do arroio (Figura 2) e em gua destilada como controle negativo. A gua testada foi trocada a cada 24h. Ao final das 72h, as razes dos bulbos de cebola foram observadas e medidas, com auxlio de uma rgua milimetrada, para a anlise de morfologia e do comprimento radicular. Para anlise das amostras de gua, razes dos bulbos foram escolhidas aleatoriamente e retiradas aps 48h, identificadas em frascos de 10 mL, fixadas em Carnoy (3:1, lcool etlico:cido actico) por um perodo de 24h temperatura ambiente e, aps, acondicionadas em refrigerao para posterior anlise.

Figura 1. A. cepa com a rea radicular imersa nas diferentes amostras de gua de Arroio Padre Doutor. 34
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mesmo ocorreu no controle crescido na gua destilada. Nesse caso no houve ao txica das amostras testadas. Tabela 2. Mdias das variveis IM (ndice mittico) e crescimento das razes, observadas em bulbos de A. cepa submetidas s diferentes amostras de gua do Arroio Padre Doutor nas diferentes estaes do ano. Laboratrio de Gentica, DZG/IB, UFPel, Pelotas, RS, 2006-2007.
poca do ano Primavera Coletasde gua Controle Ponto 1 Ponto 2 Ponto 3 Ponto 4 Controle Ponto 1 Ponto 2 Ponto 3 Ponto 4 Controle Ponto 1 Ponto 2 Ponto 3 Ponto 4 Controle Ponto 1 Ponto 2 Ponto 3 Ponto 4 IM 3,37 a 4,80 a 3,51 a 3,16 a 3,15 a 37,71 8,12 a 6,20 a 7,04 a 9,19 a 8,95 a 18,99 5,45 b 8,18 ab 6,99 b 11,09 a 7,31 b 15,44 7,37 ab 6,92 ab 4,68 b 5,15 ab 7,60 a 15,91 Crescimento das razes 1,66 b 1,93 ab 2,10 ab 2,73 a 2,29 ab 10,15 0,65 a 0,82 a 0,80 a 1,01 a 0,88 a 18,34 0,77 c 1,82 ab 2,20 a 1,34 bc 1,42 abc 13,37 1,12 a 1,68 a 1,33 a 1,48 a 1,57 a 10,83

Figura 2. Detalhe da raiz de A. cepa submersa na gua testada do Arroio Padre Doutor. Para anlise citogentica foi empregada a tcnica de esmagamento (Guerra & Souza, 2002), hidrolisadas em HCl 5N por quinze minutos em temperatura ambiente, lavadas em gua destilada e coradas com orcena actica 2%. A observao das lminas foi realizada em microscpio ptico a uma magnitude de 400x, atravs da tcnica de varredura, sendo contadas 2000 clulas por ponto de coleta, observando-se o nmero de clulas em cada fase da mitose. Foi tambm analisado a presena de aberraes cromossmicas para deteco de danos ao DNA a nvel qualitativo. Em delineamento inteiramente casualizado, os resultados foram avaliados atravs da anlise de varincia e do teste de Duncan para a comparao de mdias, utilizando-se o programa estatstico Sanest (Zonta & Machado, 1984). Resultados e Discusso O Allium teste utilizado para avaliar a qualidade de guas de fundo, superfcies e efluentes, como uma forma simples de estudo de parmetros macroscpicos, tanto valores de inibio de crescimento de razes e parmetros citolgicos quanto aberraes celulares em metfases ou anfases e inibio de clulas em diviso (Fiskesj, 1988; Vesna et al., 1996; Barbrio et al., 2011). Durante a realizao do Allium teste na primavera, outono e inverno, as cebolas utilizadas nos biotestes com amostras de gua dos diferentes pontos de coleta e do controle em observao macroscpica apresentaram crescimento normal e regular de suas razes, no havendo necrose nem mal formao, no verificando-se toxicidade das amostras de gua. J na coleta de vero, as cebolas apresentaram pouco crescimento radicular, mas no apresentaram nenhuma anormalidade e/ou necrose. O

CV(%) Vero

CV(%) Outono

CV(%) Inverno

CV(%)

Mdias seguidas de letras distintas, nas colunas, diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Duncan ao nvel de 1% de probabilidade. CV = Coeficiente de variao

Quando analisados os resultados do ndice mittico (IM) no Allium teste na coleta de primavera no foram observadas diferenas estatsticas significativas (p>0,01) (Tabela 2). Resultados similares foram descritos por Iganci (2006), onde no foi observada uma variao considervel quanto ao efeito citotxico da gua do Rio So Loureno sobre as clulas meristemticas de cebola, uma vez que o IM no diferiu significativamente entre o grupo controle e os tratamentos analisados. Para a varivel crescimento das razes, apenas a amostra do Ponto 3 diferiu do controle (p<0,01). Os resultados do controle no diferiram significativamente daqueles dos Pontos 1, 2 e 4, mas diferiu do Ponto 3 e as amostras de gua do arroio no diferiram entre si. Pode-se assim observar, que no Ponto 3 houve um maior crescimento das razes em
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relao aos demais. De acordo com estudos de Vesna (1996), a toxicidade de lquidos indicada pela diminuio do crescimento das razes, onde amostras de gua de superfcie e de fundo testadas no apresentaram toxicidade. Estes dados corroboram com os observados nesse trabalho, onde nas amostras de gua testadas no houve a diminuio do crescimento das razes, sendo assim no comprovando a toxicidade das mesmas. Os resultados observados no Allium teste na coleta de vero (Tabela 1) indicam que para as variveis IM e crescimento das razes, no houve diferena estatstica significativa (p>0,01). Comprovando que tanto o controle como as diferentes amostras do Arroio Padre Doutor, no apresentaram efeitos citotxicos e txicos sobre as variveis testadas. Segundo Grant (1982), o Allium teste usado na determinao de efeitos citotxicos e/ou genotxicos de diversas substncias, assim como na determinao de efeitos txicos em guas de diferentes origens, tanto industriais quanto domsticas (Somashekar & Gurudev, 1985; Nielsen & Rank, 1994; Vesna et al., 1996; Rank & Nielsen, 1998). Tais substncias e efluentes industriais e domsticos possivelmente no influenciaram na avaliao desses efeitos na estao do ano estudada. Na coleta de outono, os resultados estatsticos para as variveis IM e crescimento das razes foram altamente significativos nas diferentes amostras de gua testadas do Arroio Padre Doutor, comprovando o efeito txico e citotxico das mesmas (p<0,01). A estao do ano em estudo foi mais sensvel aos testes realizados e aos efeitos dos mesmos. Nos resultados obtidos no IM na coleta de outono, o controle no diferiu das amostras do Ponto 1, 2 e 4, diferindo somente do Ponto 3 que apresentou um maior nmero de clulas em diviso. Esse, por sua vez, nos resultados do ndice mittico no diferiu do Ponto 1 e nos resultados do nmero de metfases no diferiu do Ponto 2 e 4. Os demais tratamento em relao ao Ponto 3 houve um decrscimo do nmero de clulas em diviso, isso pode ser explicado por Vesna (1996). Em seu estudo, a diminuio do ndice mittico de clulas meristemticas de razes de cebola foi avaliado por ser um mecanismo confivel de determinao da presena de substncias citotxicas no ambiente, por monitoramento dos nveis de poluio em ambiente e por valores de poluio na gua. Esses parmetros so sensveis quando usados no monitoramento de nveis de poluio em guas contaminadas. Para a varivel crescimento das razes, o controle diferiu das amostras do Ponto 1 e 2 mas no do 3 e 4. Entre as amostra do arroio apenas os Pontos 2 e 3 diferiram entre si. Podemos avaliar que nessa varivel, o crescimento das razes foi maior no Ponto 2 e menor no controle negativo do experimento. Ou seja, a gua utilizada para o abastecimento do municpio do Capo do Leo apresentou um incremento do crescimento das razes de cebola. Segundo Vesna (1996), o Allium teste pode indicar a presena de substncias citotxicas, genotxicas e mutagnicas no ambiente, no qual 36
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representa direta ou indiretamente os riscos para os organismos que necessitam da gua. Na coleta de inverno os resultados obtidos atravs do Allium teste mostraram que a anlise de crescimento das razes no apresentou diferena estatstica significativa nos diferentes pontos analisados do Arroio Padre Doutor, no comprovando assim o efeito txico das mesmas (p>0,01). Referente a anlise do IM, os resultados obtidos foram altamente significativos nos pontos testados (p<0,01). Os resultados para o controle no diferiram dos demais pontos enquanto apenas o Ponto 4 diferiu estatisticamente do Ponto 2, onde observa-se uma diminuio no IM. Isso mostra que a citotoxicidade induzida por substncias presentes nessas amostras interferiram no ciclo celular (Barbrio et al., 2009). No inverno pode ser observado um efeito inverso do que ocorreu no outono na varivel crescimento das razes, o Ponto 2 apresentou uma diminuio acentuada nas clulas de cebola em diviso testadas com gua da amostra. A inibio da atividade mittica sempre usada para detectar vestgios de substncias citotxicas (Linnainmaa et al.,1978). Segundo Leme & Marin-Morales (2009), as anormalidades cromossmicas em clulas de Allium cepa so parmetros eficientes para a investigao do potencial genotxico guas contaminadas, pois fornecem informaes importantes que devem ser consideradas no biomonitoramento ambiental. Nas clulas meristemticas das cebolas, o aparecimento de aberraes cromossmicas nas estaes de primavera, vero e inverno no foi significativo. J na coleta de outono houve o aparecimento de algumas aberraes nos cromossomos das clulas de cebola do tipo ponte anafsica e quebra de fuso acromtico (Figuras 3A e 3B), mas em nmero no significativos, no comprovando o efeito genotxico das amostras. Como

A
Figura 3 A. Alteraes observadas em clulas meristemticas radiculares de cebola submetidas a diferentes amostras de gua do Arroio Padre Doutor A. Formao de ponte anafsica. Aumento de 1000X.

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B
Figura 3 B. Alteraes observadas em clulas meristemticas radiculares de cebola submetidas a diferentes amostras de gua do Arroio Padre Doutor B. Quebra de fuso acromtico. Aumento de 1000X. mostra a figura, quebras de cromtides ou cromossomos podem ser comprovados pela formao de pontes anafsicas bem como a ocorrncia de perdas de fragmentos cromossmicos (Fiskesj, 1993). Barbrio (2009) detectou efeito genotxico significativo observado no Rio Paraba do Sul, sendo que a presena de microncleos, pontes cromossmicas, c-mitoses, anfase com multipolaridades, outras aberraes cromossmicas e nmero total de clulas anmalas apresentaram aumento significativo. Concluses Os dados observados nesta pesquisa permitem concluir que atravs do bioensaio realizado utilizando o teste Allium no foram detectados efeitos genotxicos significativos nos parmetros macroscpicos analisados nas diferentes estaes do ano; tambm no foram observados efeitos citotxicos influenciando o ndice mittico das clulas meristemticas de cebola. Referncias

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