REAO DE POLIMERIZAO EM CADEIA (PCR)

PCR - consiste em fazer cpias de DNA in vitro, usando os elementos bsicos do processo de replicao natural do DNA ou cDNA.

O processo de PCR foi descrito por Kary Mullis no final da dcada de 1980, tendo-lhe sido posteriormente, em 1993, atribudo o Prmio Nobel de Qumica pelo seu trabalho.

Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patentearam este processo.

Bactria Thermus aquaticus (Taq-polimerase).

PRINCPIOS DA REAO DE PCR

A reao de polimerizao em cadeia (Polimerase chain reaction, PCR) a tcnica que permite a amplificao do DNA ou cDNA in vitro, utilizando-se basicamente de uma reao enzimtica catalizada pela polimerase (enzima termoestvel) cuja atividade depende de ions Mg++ Ocorre em 3 etapas: a) Melting(ou desnaturao que consiste na separao da dupla fita do DNA a ser amplificado), b) annealing( anelamento ou hibridizao- ligao do iniciador ou primer ao DNA a ser amplificado), c) extension (extenso ou seja a polimerizao propriamente dita)

Replicao in vitro do DNA

Depende: Alternncia de temperaturas a cada ciclo: DESNATURAO ANELAMENTO POLIMERIZAO

Alternncia de temperaturas a cada ciclo

1:Denaturaao 94 C -96 C Separa a fita dupla do DNA molde em duas fitas simples 2.Anelamento: 37 C -65 C Primers se ligam aos sitios especficos na fita simples 3. Extenso: 72 DNA polymerase acrescenta os dNTPs fita, de acordo com o pareamneto de bases

a)Desnaturao Inicialmente necessrio que as duas fitas de DNA a ser amplificado sejam separadas. A elevao da temperatura entre 90 a 95 C promove a separao da fita dupla de DNA em duas fitas simples. Muitas vezes a temperatura de desnaturao determinada empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de guanina e citosina (GC) do fragmento DNA alvo ou de interesse.

b) AnelamentoA polimerase para anexar as bases complementares, transformando as fitas simples em fitas duplas, necessita de um fragmento de DNA j ligado na regio previamente escolhida. Para isso adicionam-se, soluo, os primers ou iniciadores que so pequenos fragmentos sintticos de DNA de fita simples, oligonucleotdeos de 20 a 30 bases nitrogenadas de comprimento, que so sintetizados in vitro baseado na sequncia do DNA a ser amplificado sendo eles complementares seqncia do segmento de DNA de interesse. Nas duas fitas surgem, assim, um pequeno fragmento de DNA de dupla fita intacta. A hibridizao dos primers descrito como Annealing (do ingls), deve ser feito a uma tempertura inferior da desnaturao (45 a 70 C).

c) Extenso - Quando os primers encontram e ligamse aos segmentos complementares, a DNA-Polimerase liga os nucleotdeos entre si, completando assim as fitas simples e tornando-as duplas (extenso). A DNAPolimerase no reconhece apenas o bloco de incio como tambm consegue diferenciar as duas extremidades dos primers (3 e 5). Ela inicia a reao sempre pela extremidade 3 do primer, completando a fita simples da em diante, portanto, sempre na direo do fragmento procurado.

Automao da PCR

Um aparelho de PCR, ou um termociclador, repete o correspondente a programa de temperaturas. O operador deve apenas programar e dar incio para que transcorra a amplificao Tcnicamente muitas mudanas tem sido introduzidas melhorando cada vez mais e ampliando a sua utilizao. Para cada situao experimental, novas modificaes tm de ser introduzidas, de tal forma que muito difcil descrever um nico procedimento para um uso generalizado. Por outro lado, fundamental o conhecimento bsico das etapas envolvidas na tcnica, para um desenho experimental com sucesso

Primer: um seguimento de DNA ou RNA de 15 a 40 bases, geralmente baseado na sequncia j conhecida do cido nucleico, sintetizado quimicamente por instrumentos automticos, que podem ser adquiridos no comrcio para fins j definidos ou se escolhe a regio desejada do DNA ou RNA a ser amplificada.

Sonda (probe): um segmento de DNA ou RNA que foi marcado seja com enzimas,, substratos antigenicos, substncias quimioluminescentes ou radioativas, que podem ligar-se com alta especificidade a uma sequncia complementar do cido nucleico alvo (escolhido).

EFICINCIA NA AMPLIFICAO:
Modelo terico eficincia do processo de amplificao corresponde a 100%, o que no observado na prtica. Experimentalmente fragmento amplificado. de 78% a 97%, dependendo do

Os principais problemas para a padronizao:

a) No deteco do produto, b) Baixo rendimento do produto desejado, c) Presena de bandas no especficas devido a misextension dos primers, d) Formao de dmeros dos primers que competem pela amplificao com o produto desejado, mutao ou heterogeneicidade devido a erro de incorporao.

PCR

REAO EM CADEIA

Aps cada ciclo, o nmero de fragmentos se duplica: de um formando-se 2, e ento novamente 4, 8, 16, 32, 64, 128... de tal forma que pode ser definida matematicamente por: N = No 2n N = nmero de molculas amplificadas No = nmero de molculas iniciais n = nmero de ciclos de amplificao

Primeiro Ciclo da PCR

Aps sucessivos ciclos...

A polimerizao feita por uma DNA polimerase termoestvel = sntese exponencial de molculas de DNA. So utilizados dois primers que delimitam o segmento amplificado

Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a partir dos primers serve como molde para a sntese de uma nova fita. Isso garante o aumento exponencial do nmero de novas fitas Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR tem a sequncia dos primers na extremidade 5 e a sequncia complementar aos primers na posio 3.

Polimerizao 5

Todas as DNA-polimerases requerem para seu funcionamento: Molcula de DNA molde Primer de oligonucleotdeos Magnsio dNTPs

Qualquer sequncia alvo de DNA pode ser amplificada por PCR

A localizao da sequencia-alvo feita pelos primers. Oligonucleotdeos com 20-24 pares de bases so seletivos o suficiente para localizar um stio nico em um genoma de alta complexidade.
O pareamento dos primers com a sequencia alvo se faz

pelo estabelecimento de pontes de hidrgnio, segundo Watson e Crick

Componentes da PCR
Tampo:Mantm o pH timo para a atividade da

enzima Sais: fornecem condies timas para a mxima eficincia da enzima. influenciam na cinetica de hibridizaao do DNA ou na Tm dos primers. Magnsio (Mg++): ions de Mg so necessrios para estimular a Taq polimerase Mg++: 1 a 4 mM

Cintica da PCR
Fase de screening- ciclos iniciais Os primers procuram o molde de DNA com as sequencias que lhes so complementares . Encontrar a sequencia complementar no dificil, pois os primers esto em considervel excesso em relao ao molde. Fase intermediria: O processo de amplificao est ocorrendo levando ao acmulo exponencial do fragmento de DNA.O pareamento do primer com a sequencia ja est facilitada, pois ja existem vrias cpias da sequencia-alvo Fase tardia ou fase de plat: A amplificao ja sub-tima devido limitaao dos reagentes e a competio dos produtos gerados com os primers disponveis.

O aumento exponencial do no de cpias ocorre at um determinado no de ciclos, que ser variavel de reao para reao. Causas do plat (Desvio do ideal terico):
Perda de atividade da enzima Todas as enzimas disponveis esto ocupadas com a sntese de DNA Acmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, em detrimento do pareamento com os primers. Aumenta possibilidade de amplificao de produtos inespecficos. Gasto dos reagentes, especialmente de primers, mas tambm de deoxinucleotdeos. Acmulo de pirofosfato, resultante das ligaes fosfodisteres. Competio com outros produtos que vinham sendo amplificados com eficincia menor mas tambm foram se acumulando.

Fidelidade na PCR
Fidelidade: Acuracia na replicao Fidelidade na PCR Alto % dos produtos da PCR tem seqncias idnticas ao alvo Alta fidelidade

Condies que afetam a fidelidade da PCR

Fatores dNTPs Mg++ Temp. anelamento Enzima ou tempo de extenso Ciclos Aumenta Fidelidade Balanceado 40-50M de cada 1:1 com os dNTPs Reduz fidelidade Desbalanceado 1-2mM de cada 6-8 mM Mg++

Otimizao da PCR
Aumenta a eficincia da reao (produo) Aumenta a especificidade Melhora a reprodutibilidade

Parmetros a serem considerados na otimizao Desenho de primers

Contedo de GC, Evitar longas regies ricas em GC ou AT, Temperatura de anelamento (Tm 4oC)

Condies dos ciclos Concentrao dos reagentes Componentes do tampo

Parmetros dos ciclos:

1. Temperatura e Tempo de desnaturao Falta de desnaturao do molde uma causa comum de falha na PCR
Tipicamente 94oC por 30 s Tempo de desnaturao muito longo reduz a meia vida da enzima

Parmetros dos ciclos:

2. Temperatura e Tempo de anelamento
Temperatura de anelamento = 5oC abaixo do Tm real dos primers Tempo de anelamento = 15 a 30 s Tempo de extenso: funo tamanho do AMPLICON
1 minuto suficiente 1,2 kb Longo, reduz a meia vida da enzima

DNA Polimerases Termoestveis

Thermos aquaticus (Taq polymerase)
Taxa de incorporao de bases erradas pode variar entre 10-3 a 10-6, dependendo das concentraes de Mg2+ e dNTPs A incorporao de base errada (mismatch) reduz a estabilidade da interao da enzima com o DNA, favorecendo a interrupo da polimerizao. Baixa temperatura de extenso e elevada concentrao de dNTPs favorecem a extenso de primers com pareamento imperfeito e a extenso aps mismatch.

Inibem a PCR
Contaminantes da amostra de DNA (limitante)

Inibidores da Polimerase
Fenol Proteinase K Agentes quelantes em excesso (EDTA) SDS Elevadas concentraes de sais