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Anlise da actividade da catalase de Leveduras em gel nativo

Introduo: A levedura Saccharomyces cerevisiae capaz de crescer em meios de cultura contendo uma fonte de carbono fermentvel (ex. glucose) ou no fermentvel (ex. etanol, glicerol). Em meio de cultura com glucose, as clulas esto sob represso catablica pelo que a expresso de protenas mitocondriais inibida. Nessas condies, a energia produzida na via glicoltica, sendo o piruvato formado convertido em acetaldedo pela piruvato descarboxilase e este em etanol pela lcool desidrogenase 1 (fermentao alcolica). No fim da fase exponencial de crescimento, medida que a concentrao de glucose diminui, as clulas tornam-se gradualmente desreprimidas e induzem a sntese de enzimas mitocondriais (fase de transio diauxica). O etanol ento utilizado para produo de energia por metabolismo respiratrio (fase ps-diauxica): a lcool desidrogenase 2 converte etanol em acetaldedo, e a aldedo desidrogenase converte o acetaldedo em acetato, o qual entra no ciclo de Krebs. Como subprodutos da respirao mitocondrial, formam-se radicais superxido, pelo que as clulas induzem concomitantemente a expresso de defesas antioxidantes, tais como superxido dismutases, que convertem radicais superxido em perxido de hidrognio, e catalase e peroxidases, que reduzem o perxido de hidrognio a gua.

Material equipamento e reagentes Clulas de Saccharomyces cerevisiae BY4741 Meio de cultura YPD: 1% extracto de levedura 2% bactopeptona 2% glucose Tampo 50 mM NaK Fosfato 0.1 mM EDTA pH 7.0 50 mM K2HPO4 0.1 mM EDTA K2HPO4 (174.18 g/mol) 8.709 g EDTA.2H2O (372.24 g/mol) H2O 1000 ml 0.0372 g

50 mM KH2PO4 0.1 mM EDTA KH2PO4 (136.09 g/mol) 6.805 g EDTA.2H2O (372.24 g/mol) H2O 1000 ml 0.0372 g

Tampo fosfato de potssio 50 mM, pH 7,0 cocktail inibidores de proteases 30X prolas de zircnio

Incubadora orbital centrifuga de bancada microcentrfuga tubos eppendorf micropipetas Pontas azuis e amarelas Tanque de electroforese Alimentador de corrente Gel nativo Tampo de electroforese (25 mM Tris-HCl pH 8.3, 192 mM Glicina) Soluo corante-sacarose de aplicao da amostra (50% sacarose, 0,1%azul bromofenol) Peroxidase (HSP) em 50 mM KPi pH 6,7 Diaminobenzidine (DAB) em 50 mM KPi pH 6,7 30 % H2O2

Crecimento das clulas Mtodo 1.Crescer clulas de levedura em meio YPD a 26C at OD600 = 0.5-0.6 (fase exponencial; amostra 1: 30 ml/grupo) ou at OD600 = 8-10 (fase estacionria; amostra 2: 30 ml/grupo). NOTA: manter as amostras a 4C a partir deste ponto. 2.Centrifugar as clulas (5 ml/grupo) a 4000 rpm, 5 min. 3.Ressuspender o pellet em 1 ml tampo fosfato e transferir para tubo eppendorf. 4.Centrifugar a 13000 rpm, 1 min, e rejeitar o sobrenadante. 5.Congelar as clulas a -70C.

Catalase - Lise das clulas 1.Deixar descongelar as clulas lentamente. 2.Ressuspender o pellet em 100 l tampo fosfato + 3.4 l cocktail inibidores de proteases 30X. 3.Adicionar prolas de zircnio (2 colheres peq) e agitar num vortex 5 x 1 min. 4.Centrifugar a 14000 rpm, 15 min. 5.Guardar o sobrenadante num tubo eppendorf.

Anlise da actividade da catalase em gel nativo 1. Preparar um running gel a 7,5 % acrilamida (Mighty-small; 0.75 mm) segundo o seguinte esquema: Acrilamida 30% 2 M Tris-HCl pH 8.85 H2O Persulfato de Amnio 10% TEMED 15 l 3,75 ml 2,81 ml 8,27 ml 150 l

2.Cobrir o gel com H2O e deixar a polimerizar durante 30 minutos. 3. Remover a camada de H2O, colocar o pente e preparar um stacking gel segundo o seguinte esquema: Acrilamida 30% 1 M Tris-HCl pH 6.8 H2O Persulfato de Amnio 10% TEMED 0,534 ml 0,5 ml 2,92 ml 40 l 4 l

4. Aps polimerizao encher o tanque com tampo de electroforese.

5. Prepare a amostra da seguinte forma: a) Pipete para um tubo eppendorf 15 l de sobrenadante obtido aps a lise. Junte 5 l da soluo corante-sacarose.

6. Aplicar 15 l de amostra no gel. 7. Corra o gel numa cmara fria. Proceder electroforese V max = 100 V. 8. Retirar o gel e incuba-lo 30-45 min em HSP (0.9 mg /18 ml de 50 mM KPi pH 6,7) 9. Adicionar 9,2 l de 30 % H2O2 (concentrao final de 5 mM) e agitar continuamente durante 10 min. 10. Lavar o gel rapidamente com dH2O e adicionar a sol. DAB (10 mg / 20 ml de 50 mM KPi pH 6,7). Incubar com agitao suave at aparecimento das bandas.