Gentica

Citogentica
(Beatriz Porto)
Gentica de Populaes
(Carolina Lemos)
24 de Abril a 23 de Maio 26 de Maio a 13 de Junho
Citogentica
INTRODUO DISCIPLINA

- Programa terico
- Programa prtico
- Avaliao final



Importncia dos estudos cromossmicos na espcie humana

Investigao clnica

Alteraes cromossmicas constitucionais
diagnstico pr-natal
adultos (associadas a infertilidade / esterilidade)

Alteraes cromossmicas no cancro
diagnstico e prognstico

Estudos de instabilidade cromossmica
Alteraes cromossmicas induzidas por genotxicos
Sndromes de instabilidade cromossmica

Importncia dos estudos cromossmicos em espcies aquticas

Investigao bsica
Caracterizao de espcies
Estudos de evoluo

Investigao aplicada
Genotoxicidade ambiental
Programas de conservao de espcies
Melhoramento animal
Programa Terico
- O caritipo como caracterstica de uma espcie
- Morfologia do cromossoma. Eucromatina e heterocromatina.
- Alteraes cromossmicas numricas
- Alteraes cromossmicas estruturais
- Cromossomas sexuais; diferenciao sexual
- Alteraes cromossmicas adquiridas; genotoxicidade e cancro
- Citogentica, estudos de evoluo e especiao
- Citogentica, preservao de espcies e melhoramento
Programa Prtico
- Tcnicas gerais de anlise cromossmica
-Tcnicas especficas de marcao cromossmica
- Caritipo. Regras de nomenclatura cromossmica
-Consequncias meiticas das alteraes equilibradas
- Resoluo de problemas

HORA AULA TERICA AULA PRTICA

24 Abril

13:00 -15:00
Morfologia e estrutura do
cromossoma.
Eucromatina e heterocromatina



28 Abril



16:00 -18:00
Alteraes cromossmicas
numricas
Alteraes cromossmicas
estruturais



2 Maio


13:30 - 16:30 (T1)
16:30 -19:30 (T2)

Tcnicas de anlise cromossmica
Caracterizao do caritipo
Tcnicas especficas de marcao
cromossmica


12 Maio


16:00 -18:00
Cromossomas sexuais e
diferenciao sexual
Instabilidade cromossmica e
genotoxicidade
Culturas celulares a partir de
colheita de sangue de truta

15 Maio

13:00 -15:00
Especiao e conservao de
espcies
Melhoramento de espcies com
interesse comercial


16 Maio

13:30 - 16:30 (T1)
16:30 -19:30 (T2)

Regras de nomenclatura
Leitura e escrita de frmulas
cromossmicas

23 Maio

13:30 - 16:30 (T1)
16:30 -19:30 (T2)


Consequncias meiticas das
alteraes equilibradas
Importncia para a evoluo
Avaliao
Citogentica: 50% do Exame final

Dois tipos de perguntas:
- teste americano, com diferentes tipos de perguntas (escolha
de verdadeiro ou falso, escolha mltipla, perguntas com chave
pr-definida, perguntas com correspondncias)
- perguntas de resposta curta

As respostas erradas no descontam

A nota final a mdia das notas das duas partes; o aluno tem
de obter em cada parte a nota mnima de 9,5.

Bibliografia
Ver no SIGARRA
SUMRIO

- O caritipo de uma espcie

- Morfologia do cromossoma
- Organizao estrutural do cromossoma
- Centrmero, telmero, NOR
- Classificao morfolgica dos cromossomas

- Cromatina
- Eucromatina e heterocromatina
- Regulao da expresso gnica; epigenia
Morfologia e estrutura
do cromossoma
O caritipo de uma espcie: conjunto dos cromossomas de uma
clula somtica, ordenados por tamanho, forma e padro especfico
resultante da colorao efetuada.
O caritipo normal corresponde a um complemento cromossmico diplide,
formado a partir de dois complementos haplides dos gmetas masculino e
feminino
O Caritipo
Fatores determinantes na manuteno do caritipo de uma espcie
interfase profase profase
prometafase metafase anafase
A
anafase B telofase citocinese
Interfase leptteno zigteno paquteno
Profase I
diplteno
diacinese Metafase I Anafase I Telofase I
Metafase II Anafase II Telofase II
Ciclo celular mitose meiose fecundao
(reviso estrutura e funo celular)
O caritipo de uma espcie

Caratersticas genticas de uma espcie
O que varivel: O que constante:
Genes
Recombinao meitica


Mutaes viveis
n de cromossomas
Fecundao

Mitose, Meiose

Reparao do DNA

Exeto para espcies com reproduo que no envolve recombinao
(partenognese, hbridos, reproduo assexuada)
Caritipo de uma espcie:


Mantm-se constante de gerao em gerao

Mantm-se constante, num mesmo organismo, de clula para
clula
Evoluo das espcies: variaes no caritipo
O caritipo de uma espcie
Estabilidade gentica um estado dinmico das clulas
caritipo
Mosca do vinagre 2n = 6
ostra 2n = 20
gato 2n = 38
ratinho 2n = 40
Homem 2n = 46
peixe zebra 2n = 50
co 2n = 70
bovinos 2n = 60
truta arco-ris 2n = 60
truta fario 2n = 80
borboleta 2n = 382
feto 2n = 600
Variao do caritipo entre algumas espcies
Variao do caritipo entre espcies prximas
2n = 46
2n = 48
2n = 48
2n = 48
2n = 16
(Homo sapiens)
(Pan troglodytes)
(Gorilla)
(Pongo pigmaeus)
(Callicebus
lugens)
Variao do caritipo entre espcies aquticas prximas
2n = 60
Salmo do atlntico
Salmo da Esccia 2n = 58
2n = 56
2n = 57
2n = 59
Negobius kessler gorlap
Mar Cspio 2n=46
Mar Negro
Fmeas 2n=29
Machos 2n=30
Generalidade dos telesteos 2n=48
Variao cromossmica entre espcies aquticas
Espcies muito semelhantes morfologicamente,
podem apresentar constituies cromossmicas
(caritipos) muito diferentes
Alguns gneros com espcies com caritipos muito diferentes (muita variabilidade),
e outros com caritipos muito semelhantes (pouca variabilidade)
Relao com adaptao/conservao de espcies?
Variao cromossmica entre espcies
Aplicao da anlise da variao cromossmica entre espcies:
- Anlise de delimitao de reas
- Distribuio de espcies
- Identificao de espcies crpticas
- Medir gene flow interpopulacional
- Determinao de variabilidade gentica
Fatores fsicos que definem fronteiras biogeogrficas para
manuteno de faunas especficas:
- Correntes
- Temperatura
- Salinidade
- Radiao
A radiao durante o perodo tercirio foi uma
das grandes causas para a grande diversidade
das espcies marinhas nos trpicos
98%
Mus musculus
90%
7%
23%
Pan troglodytes
Sacch cerevisiae E coli
O que distingue o Homem de
outros organismos no que se
refere constituio genmica?
Funo e atividade dos genes
O n de genes : ser fator de evoluo de uma espcie ?
O n de cromossomas : no fator de evoluo de uma espcie
O genoma humano possui 20,000 genes que
codificam protenas, e que correspondem a
1,5% de todo o genoma. O restante corresponde
a sequncias de DNA reguladoras, introns,
molculas de RNA no-codificante e sequncias
com funo ainda desconhecida.
Variao cromossmica entre espcies
drosophila melanogaster
50%
O cromossoma metafsico
Fase de maior condensao do cromossoma,
que mantm os 2 cromatdios unidos
interfase profase profase
prometafase metafase anafase A
anafase B telofase citocinese
M
G2
S
G1
Interfase
(G1,S,G2)
Mitose
Organizao estrutural do cromossoma
(reviso estrutura e funo celular)
Morfologia do cromossoma metafsico
- centrmero
- organizador nucleolar
- telmero
- cromatina
brao curto (p)
2 cromatdios
brao longo (q)
centrmero
telmero q
telmero p
cromatina
Organizao estrutural
do centrmero
organizao em feixe, paralelo ao
eixo longitudinal do cromossoma
O centrmero
O centrmero
Centrmero: funo dependente de vrios complexos proteicos, que atuam como
checkpoints na segregao correta dos cromatdios em anafase mittica e dos
cromossomas em anafase meitica
Checkpoint M na mitose

(complexos com Bub1, Bub3, BubR1, Mad1, Mad2)
- Inibio da APC at biorientao de todos os
cromossomas
Checkpoint M na meiose

(importncia da coesina Rec 8
refratria ao da separase )
(reviso estrutura e funo celular)
metacntrico submetacntrico Acrocntrico
ou subtelocntrico
Metacntrico: p = q

Submetacntrico: p < q

Acrocntrico: p << q

Subtelocntrico: p << q

Telocntrico: p= 0
Classificao do cromossoma de acordo com a posio do centrmero
telocntrico
Exemplos de caritipos
Caritipo do rodovalho (2n=44)
caritipo da ostra (2n=20)
Rodeus Ocellatus ocellatus : 2n=48 (8M+20SM e 20 ST)
Rhodeus Fangi : 2n =46 (4 SM + 42 ST)
Exemplos de caritipos
Nomenclatura adicional para determinao do caritipo:
O n fundamental (NF)
Espcie (Mugilidae) 2n NF caritipo
L. macrolepis 48 48 48a
C. labrosus 48 50 46a + 2sm
M. Curema (USA) 28 48 20m + 4a + 4st
M. Curema (Venezuela) 24 48 22m + 2sm
N fundamental: n total de braos
Organizao estrutural do
organizador nucleolar (NOR)
NOR
estrutura no nucleossomal
organizao semelhante ao
centrmero, em feixe
centrmero
Organizador nucleolar
Caracterizao de uma espcie pelo
n e localizao cromossmica dos
NORs
Telmeros
Extremos dos cromossomas, com DNA constituido por
mltiplas sequncias repetitivas (TTAGGG) de 10-15
kilobases e que so essenciais para uma correta estrutura e
funo do cromossoma

DNA polimerase: no consegue replicar os extremos dos cromossomas lineares,
causando um progressivo encurtamento dos telmeros em cada ciclo celular.
Assim:
O comprimento do telmero pode servir de relgio mittico, e um telmero
suficientemente curto pode ser o sinal para uma senescncia nas clulas
normais
O telmero
mltiplas sequncias repetitivas
(TTAGGG)
Shelterinas:
Grupo de, pelo menos 6 protenas que
cobrem as sequncias repetitivas (TTAGGG)

-Protegem as extremidades dos
cromossomas de sofrer quebras

- Permitem ao sistema de
reparao de DNA fazer a distino
entre encurtamento de telmeros e
quebras
Proteo do telmero
Telomerase:
Complexo capaz de alongar os extremos dos
cromossomas com sequncias telomricas
repetitivas, protegendo o cromossoma contra
o rpido encurtamento dos telmeros
Complexo Telomerase:
TERT (transcriptase reversa) junta
TTAGGG repeats ao telmero,
usando TERC como template
TERC (componente RNA)
Protenas associadas: dyskerina,
NOP10, NHP2, GAR ligam-se a
TERC para estabilizar o complexo
clulas germinativas
clulas progenitoras hematopoiticas
clulas basais proliferativas da epiderme
clulas malignas

fibroblastos
linfcitos no ativos
clulas epiteliais
tecidos diferenciados
Telomerase ativa
Telomerase inativa
Atividade da telomerase
Doenas de instabilidade cromossmica
com alteraes na expresso de
shelterinas e/ou telomerase

Formao de cromossomas dicntricos
Medio do comprimento do telmero
Medio do comprimento do telmero em clulas de um indivduo normal (35 anos).
O comprimento do telmero (dependente da idade) encontra-se prximo do percentil 50.
Medio do comprimento do telmero
Medio do comprimento do telmero em clulas de uma criana (1 ano) com
disqueratose congnita (mutao em TERT)
O comprimento do telmero (dependente da idade) encontra-se abaixo do percentil 1.
A cromatina
A cromatina constituda por:
- DNA
- Protenas que remodelam e condensam o DNA
- histonas (H1, H2A, H2B, H3, H4)
- no histonas
-esqueleto proteico (scaffold)
- HMG (high-mobility group)
Gene distantes no cromossoma,
Mas fisicamente prximos
Condensao da cromatina,
da interfase metafase
Cromatina no ncleo em interfase
Os cromossomas individuais ocupam
territrios discretos dentro do ncleo
em interfase

Os territrios dividem-se em domnios:

- domnios dos braos
- domnios das bandas
- domnios dos centrmeros
- domnios dos telmeros
Concluso: a posio dos cromossomas e
respetiva cromatina no ncleo interfsico
no ao acaso. H uma organizao que
fundamental para a regulao da
expresso gnica.
Eucromatina e heterocromatina no ncleo em interfase
Heterocromatina constitutiva

-Composta predominantemente por DNA
satlite altamente repetitivo, rico em bases
A-T, de replicao tardia no perodo S

-Geneticamente inativa

-Fortemente condensada durante toda a
interfase

-Localiza-se na periferia do ncleo
Eucromatina

-Composta predominantemente por DNA
de sequncia nica, rico em bases G-C, e
de replicao precoce no perodo S

-Geneticamente ativa

-No condensada, embora varivel ao
longo do ciclo celular

-Localiza-se no interior do ncleo
Localizao da heterocromatina constitutiva nos cromossomas
A heterocromatina localiza-se preferencialmente:
- na regio justacentromrica (c)
- no brao longo do Y (Y)
- nos telmeros (t)
- nos braos curtos dos acrocntricos e subtelocntricos (p)
(c)
(Y)
(t)
Polimorfismos na heterocromatina constitutiva
Heterocromatina justacentromrica dos
cromossomas 1, 9, 16
Constrio secundria dos cromossomas
acrocntricos 13, 14, 15, 21 e 22
Polimorfismo do Y
Funes e papel biolgico da heterocromatina constitutiva
Estabilidade da cromatina
- nos telmeros e centrmeros
- durante o emparelhamento dos cromossomas
Proteo da eucromatina
- posio relativa no ncleo em interfase
- regulao da formao de pontos de quiasma
Evoluo e variao
- maior frequncia de quebras e rearranjos nestas zonas
- utilizao dos polimorfismos como marcadores genticos
Silenciamento de genes
- regulao da funo gnica (por metilao de DNA e desacetilao
histnica)

A heterocromatina no DNA
lixo
Heterocromatina facultativa
Heterocromatina facultativa = silenciamento de genes = expresso epigentica
Mecanismos de silenciamento:
Alteraes bioqumicas, na estrutura da cromatina,
associadas a regulao da expresso gentica:

- Metilao do DNA
- Desacelilao das histonas

de que modo genes ativos, ao longo do cromossoma, podem ser silenciados?
Metilao do DNA e desacetilao das histonas
Citosina
5-Metilcitosina
O DNA para ser transcrito no deve estar
metilado
A 5 base
Modificao covalente do DNA, pela
adio de um CH3 na posio 5 do anel da
citosina, no contexto de um dinucletotdeo
CpG (5-CG-3)
Metilao e Desmetilao Acetilao e Desacetilao
As caudas das histonas envolvem o DNA que
se enrola em volta do ncleo proteico.

A acetilao das caudas das histonas carregam-
nas negativamente, levando-as a afastarem-se
do DNA permitindo assim a leitura deste pela
polimerase.

A desacetilao pelo contrrio leva ao
envolvimento do DNA pelas caudas das
histonas impedindo assim a sua leitura, ou seja
d-se o silenciamento dos genes.
Resumo: metilao, desacetilao, condensao da cromatina e expresso gentica
heterocromatina
genes inativos
eucromatina
genes ativos
Heterocromatina facultativa
Exemplos de heterocromatina facultativa, com expresso epigentica:

- genes silenciados em tecidos diferenciados

-Imprinting

- inativao do cromossoma X nas clulas somticas femininas

Heterocromatina facultativa = silenciamento de genes = expresso epigentica
Genes silenciados em tecidos especficos
Cdigo gentico sequncia de nucletidos no DNA ou RNA que determina a sequncia
dos aminocidos nas protenas necessrias para a construo dos organismos
Cdigo Epigentico - funciona como acessor do cdigo gentico, permitindo ou inibindo
(silenciando) a atividade gnica (regulador da expresso gnica ao longo da vida).
A existncia de heterocromatina facultativa (genes
temporria e espacialmente silenciados) implica
que o cdigo gentico (DNA) no o nico
responsvel pelas caractersticas de um organismo
em desenvolvimento
heterocromatina facultativa = silenciamento de genes = diferenciao de tecidos
Epigentica e ambiente
O genoma responde dinamicamente ao ambiente. Stress, dieta, comportamento, toxinas
e outros fatores ativam mecanismos que regulam a expresso gnica, por silenciamento.
Herana epigentica herana de padres de expresso ou silenciamento
de genes, que no esto definidos na sequncia de DNA, de clula para
clula pela mitose, ou de organismo para organismo pela meiose.
A compreenso da expresso gentica e das modificaes epigenticas
de genes associados a caractersticas de interesse econmico pode ser
muito til em programas de melhoramento
Aplicao dos conhecimentos sobre os mecanismos epigenticos
Um gene com imprinting manifesta-se de forma diferente
consoante a sua origem paterna ou materna



Imprinting
Nas clulas germinativas o imprinting removido.
Na meiose restabelecido de forma especfica do sexo
Imprinting
Imprinting genmico
1960 (Helen Crause) criou o termo imprinting
marcao de uma regio cromossmica, consoante origem
materna ou paterna
regulao genes envolvidos no crescimento do feto ou placenta, e
comportamento ps-natal
mamferos no toleram partenognese (bimaterna) ou
andrognese (bipaterna) dissomia uniparental de todo o genoma
- teratomas ovricos (partenognese, perda do
complemento paterno)
- molas hidatiformes (andrognese, perda do complemento
materno)
Genoma Materno : Desenvolvimento Fetal
Genoma Paterno : Desenvolvimento Placentrio
Inativao do cromossoma X
Qual dos cromossomas X, de origem materna ou paterna,
sofre inativao (silenciamento)?
genes ativos
genes ativos
X X
X Y
Inativao ao acaso: Hiptese de Lyon
Hiptese de Lyon (1961)

Nas clulas somticas de mamferos do
sexo feminino apenas um cromossoma X
est ativo. O segundo X permanece
condensado e inativo - corpsculo de Barr
ou cromatina sexual

O X inativo tanto pode ser o de origem
paterna como o de origem materna, nas
diferentes clulas do mesmo organismo
(ao acaso)

a inativao uma vez ocorrida mantm-se
constante para cada linha celular
Inativao acaso:
aproximadamente 16 dia do
desenvolvimento
embrionrio
Centro de inativao no cromossoma X: o gene XIST
Localizao do gene XIST
banda Xq13.3
Processo geral de inativao
reconhecimento do n de cromossomas X
iniciao: no centro de inativao
espalhamento da inativao
manuteno da inativao
XIST
O gene XIST no produz uma protena ( no codificante), mas produz um transcrito de
RNA que permanece no ncleo, cobre o X donde transcrito e inativa-o, por alterao da
estrutura da cromatina mediada pelos mecanismos de metilao de DNA e
desacetilao histnica, exceto nalgumas regies que permanecem ativas.
Inativao do cromossoma X
Resumo:
eucromatina e heterocromatina ao longo do cromossoma
DNA de sequncia nica, codificante (60% do total)
- sequncias que codificam genes estruturais (3% do genoma) e
que se encontram espalhadas ao longo do cromossoma
(eucromatina)
- Restantes sequncias: introns e spacer DNA (intra e inter genes)

DNA altamente repetitivo, no ativo (10% do total)
- localizado nas regies de heterocromatina constitutiva:
centrmero e telmeros
- envolvimento na organizao estrutural de cromossoma
(funes no emparelhamento cromossmico)


DNA moderadamente repetitivo, no codificante (30% do total)
- encontra-se espalhado pela eucromatina
- envolvimento na regulao da expresso gnica, atravs da
inibio de genes especficos a nvel ps-transcricional (ex:
microRNAs)

Variao do caritipo entre espcies
De que modo podem os caritipos ter modificado
de modo a originarem todas as variaes
numricas e estruturais que se observam ao
longo da evoluo?