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1

A GENTICA MOLECULAR DA CLULA NO PATOLGICA. 1.2 1.1 CONCEITOS BSICOS DE GENTICA MOLECULAR....................................1.4 1.1.1 O material gentico............................................................................ 1.4
1.1.1.1 1.1.1.2 1.1.1.3 1.1.1.4 1.1.1.5 cidos Nucleicos (DNA e RNA).......................................................1.4
A estrutura do DNA........................................................................ 1.6 A estrutura do RNA ...................................................................... 1.16 1.1.1.1.1 1.1.1.1.2

A ORGANIZAO DOS GENES NO GENOMA.........................1.18 Estrutura de um Gene.......................................................................1.20 O CDIGO GENTICO..................................................................1.27 Mutaes e Polimorfismos ...............................................................1.29

1.1.2
1.1.2.1 1.1.2.2 1.1.2.3 1.1.2.4

- A FISIOLOGIA DO GENE .........................................................1.31


Transcrio e transcrio reversa .....................................................1.31 Traduo...........................................................................................1.36 Replicao ........................................................................................1.42 Mecanismos de Mutao do DNA...................................................1.47

1.1.2.4.1 Erros na replicao do DNA........................................................... 1.47 1.1.2.4.2 Leses espontneas....................................................................... 1.48 1.1.2.4.3 Recombinao gentica................................................................. 1.50 1.1.2.4.3.1 Recombinao por crossing-over............................................ 1.50 1.1.2.4.3.2 Recombinao somtica........................................................ 1.52 1.1.2.4.4 Mutaes mediadas por elementos de transposio........................... 1.53

1.1.2.5

Mecanismos de reparao do DNA..................................................1.61

1.2 1.2.1 Diviso celular e anomalias genticas.........................................1.66 1.2.2 Ciclinas e CDK .................................................................................1.68 1.2.3 Apoptose.............................................................................................1.76 1.3 A CTIVIDADE CELULAR...............................................................................1.78 1.3.1 Componentes dos sistemas de sinalizao...................................1.78 1.3.2 Regulao da sinalizao por modulao da conformao proteica.............................................................................................1.79 1.3.3 A Superfamilia dos receptores das hormonas esterides..........1.79 1.3.4 Receptores transmembranares; vias de transduo de sinal....1.80

1.1.2.5.1 Mecanismos no excisativos.......................................................... 1.61 1.1.2.5.2 Mecanismos excisativos................................................................ 1.63 1.1.2.5.3 Mecanismos ps-replicativos......................................................... 1.65 O CICLO CELULAR.......................................................................................1.66

1.2

Captulo 1
1 A gentica Molecular da Clula no Patolgica

1.3

1.1 Conceitos bsicos de Gentica Molecular 1.1.1 O material gentico


1.1.1.1 cidos Nucleicos (DNA e RNA)

Foi apenas em 1944 que Griffith demonstrou que a hereditariedade era transmitida pelos cidos nucleicos. A experincia realizada demonstrou que a capacidade de matar um ratinho era conferida a uma estirpe bacteriana no virulenta, pelo DNA de uma outra estirpe bacteriana virulenta (fig.1.1).

Fig. 1.1 Experincia de Griffith demonstrando que a virulncia bacteriana era uma caracterstica gentica transmitida pelos cidos nucleicos. 1.4

Figura 1.2 Experincia de Hershley e Chase demonstrando que a transmisso gentica nos fagos T2 estava associada ao DNA. Em 1952, Hershley e Chase demonstraram que o fago T2 (um vrus que infecta bactrias) transmite os seu cdigo gentico bactria infectada, atravs da injeco do seu DNA na bactria, alargando assim o nmero de organismos que demonstradamente utilizam o DNA como registo gentico (fig.1.2). Sabemos hoje que com a excepo de alguns tipos de vrus, todos os organismos utilizam o DNA como portador da sua informao gentica. Os vrus que fogem a esta regra utilizam o RNA para o mesmo efeito.

1.5

Figura 1.3 - As bases azotadas que entram na composio dos nucletidos.


1.1.1.1.1 A estrutura do DNA

Com a aceitao generalizada por volta dos anos 50 de que a informao gentica residia no DNA, a grande questo passou a ser o mecanismo de armazenamento dessa informao. Com efeito, nesta altura no se compreendia como que um polmero to simples (apenas constitudo por 4 tipos de unidades diferentes) e que se pensava ser homogneo em toda a sua extenso podia codificar a enorme variedade de protenas que compunham os organismos. Para tal, houve necessidade de elucidar de forma precisa a estrutura dos cidos nucleicos. Sabemos hoje que os cidos nucleicos so polmeros de nucletidos. Cada nucletido contm um anel heterocclico de carbono com 5 tomos de azoto (a base nitrogenada), 1 anel de 5 carbonos (uma pentose) e um grupo fosfato. As bases nitrogenadas so de 2 tipos: 1.6

purinas e pirimidinas, sendo o nmero total de bases disponvel de cinco (fig. 1.3). No entanto, cada tipo de cido nucleico utiliza apenas 4 das cinco bases: o DNA contm Adeninas (A), Timidinas (T), Guaninas (G) e Citosinas (C); enquanto o RNA contm Adeninas (A), Uracilos (U), Guaninas (G) e Citosinas (C). As pentoses encontradas nos cidos nucleicos so de 2 tipos: 2-desoxirriboses e riboses (Fig. 1.4) dando origem ao cido Desoxirribonucleico (DNA) e ao cido Ribonucleico (RNA).
Figura 1.4 - As pentoses so o componente dos cidos nucleicos que definem o seu tipo. A desoxirribose entra na composio do DNA, enquanto a ribose compe o RNA

Figura 1.5 - Os nuclesidos so compostos por uma base e uma pentose.

1.7

Figura 1.6 - Os nucletidos unem-se por ligaes fosfodiester para dar origem aos cidos nucleicos.

Os nuclesidos so compostos por uma base nitrogenada e uma pentose (fig. 1.5). Um nuclesido com um grupo fosfato no carbono 5 chama-se nucletido. Os nucletidos so as unidades de construo dos cidos nucleicos, sendo unidas por uma ligao 5-3: o carbono 5 da pentose de um nucletido une-se ao carbono 3 da pentose do 1.8

nucletido seguinte por uma ponte fosfodiester, ficando a base nitrogenada exterior ao esqueleto da ligao (Fig.1.6). Em 1953, uma importante descoberta realizada por Watson & Crick transformou a viso do material gentico. Dados de difraco de raios X mostraram que o DNA tem a forma de uma hlice regular. Das dimenses obtidas para a hlice na difraco de raios X, e da densidade do DNA, inferiu-se ento que a hlice era composta por duas cadeias polinucleotdicas, com as bases de cada cadeia viradas para o interior da hlice. As bases de cada hlice emparelham de tal modo que uma purina se ope sempre a uma pirimidina. Estes dados, conjugados com a observao anterior de Chargaff indicando que independentemente da quantidade de cada base, a proporo G:C e A:T sempre a mesma no DNA, indicam que G emparelha com C e A com T na dupla hlice do DNA. Watson & Crick propuseram que o emparelhamento no se realizava por ligao covalente, mas por pontes de hidrognio entre as bases nitrogenadas (Fig. 1.7). Para tal, as 2 cadeias devem orientar-se de modo antiparalelo (Fig. 1.7). Obteve-se assim para o DNA o modelo ilustrado na figura 1.8.

1.9

Figura 1.7 - O DNA formado por duas cadeias com orientao antiparalela, com as bases de cada uma das cadeias a hibridizarem entre si.

1.10

Figura 1.8 - Estruturas possveis para a dupla hlice do DNA. O modelo da esquerda o da forma A, o do meio o da forma B e do da direita o da forma Z. A estrutura do DNA identificada por Watson & Crick, e ilustrada na figura 1.8B (forma B) a que em situaes fisiolgicas mais frequente. No entanto nem todo o DNA da clula se encontra nesta estrutura, e certamente in vitro possvel manipular as condies do meio, favorecendo outras conformaes. Na tabela 1 encontram-se sumariadas as caractersticas das 4 conformaes teoricamente possveis para a conformao dos cidos nucleicos, podendo na figura 1.8 ver-se comparativamente a conformao prevista.

1.11

Tabela 1.1 - Caractersticas dos tipos de hlice que o DNA pode tomar Tipo de N. Bases Rotao por Hlice por Volta par de Bases A 11 +32.7 B 10 +36 C 9.33 +38.6 Z 12 -30 Elevao por par de bases 2.56 3.38 3.32 3.71 Dimetro da hlice 23 19 19 18

A dimenso do material gentico no Homem coloca o problema de como conseguir compactar 1,8m de DNA num ncleo que pode ser to pequeno como 6m (6x10-6 m). Este empacotamento tem ainda que ser flexvel j que deve mudar ao longo do ciclo celular, aumentando durante as mitoses de tal modo que os cromossomas se tornam individualizados e visveis ao microscpio ptico.

Figura 1.9 Tipos de cromatina observveis em interfase. 1.12

Durante a maior parte do ciclo celular a cromatina pode ser dividida em dois tipos de material gentico (Fig. 1.9): a eucromatina a que ocupa a maior regio do ncleo, sendo composta por material muito menos compactado que os cromossomas; a heterocromatina composta por material muito compactado, formando fibras (encontrase num estado intermdio entre a compactao dos cromossomas e a relativa descompactao da eucromatina). A heterocromatina e a eucromatina no representam fibras de DNA diferentes, j que as mesmas fibras passam pelas duas zonas do ncleo. Constituem assim partes das fibras com diferentes estados de condensao: a heterocromatina constituda por regies do DNA que no so habitualmente expressas na clula em causa, enquanto os genes expressos se localizam na eucromatina (muito embora os genes na eucromatina no estejam todos a ser expressos). Em 1974, foi descoberta a estrutura bsica de organizao da cromatina em todos os eucariotas. Esta subunidade organizativa bsica (nucleosoma) contm cerca de 200 bp de DNA, organizados por um octmero de protenas pequenas e bsicas (histonas) numa estrutura tipo rosrio em que o DNA se localiza no exterior das contas, e as protenas no seu interior (Fig.1.10). Esta organizao explica porque os locais de ligao a protenas se encontram por vezes to espaados na Figura 1.10 - A dupla hlice de DNA d duas voltas ao ncleo central de protenas do nucleosoma

1.13

Figura 1.11 - A organizao do DNA nos nucleosomas coloca prximas sequncias de DNA distantes na sequncia linear sequncia do DNA (Fig. 1.11). O octmero de histonas constitudo por 2 cadeias de cada uma das histonas H1, H2A, H2B e H3, existindo ainda, por vezes, uma 5 histona (H1) a estabilizar as 2 voltas de DNA ao octmero (Fig. 1.12).

Figura 1.12 Vista de cima da organizao das histonas no nucleosoma. Existe ainda um par H2A/H2B por baixo, e por vezes uma histona H1 exterior ao nucleosoma 1.14

Figura 1.13 - A compactao das histonas na fibra de DNA de 10nm A anlise da cromatina ao microscpio electrnico revelou a existncia de 2 tipos de fibras: a fibra de 10nm e a 30nm. A fibra de 10nm essencialmente 1 sequncia continua de nucleosomas (Fig. 1.13). Esta fibra ocorre em condies de baixa fora inica, e na ausncia de histonas H1. Em condies de alta fora inica e na presena da histona H1, forma-se a fibra de 30nm, a qual essencialmente um enrolamento de 6 nucleosomas por volta (Fig. 1.14). A transcrio (cpia dos genes em mRNA), como veremos no captulo 1.1.2.1, envolve a deslocao no DNA de uma complexa maquinaria enzimtica, e inclui a abertura da dupla cadeia do DNA. Este facto, no compatvel com um elevado grau de empacotamento das fibras do DNA, pelo que se compreende que os genes transcripcionalmente activos se localizem na eucromatina. No entanto, os resultados experimentais i ndicam que a estrutura dos genes transcripcionalmente 1.15

activos envolve o empacotamento em nucleosomas, ainda que seja necessrio admitir que durante a transcrio estes sejam temporariamente desmontados pela maquinaria enzimtica.

Figura 1.15 hierarquia de condensao do DNA na cromatina. Figura 1.14 - A organizao dos nucleosomas na fibra de DNA de 30nm.

1.1.1.1.2

A estrutura do RNA

Na clula existem vrias formas de RNA, as quais possuem estruturas e funes diferentes: mRNA - O mRNA ou RNA mensageiro, a espcie de RNA que transporta a informao para a sntese das protenas no ribossoma. O mRNA formado no ncleo na transcrio do DNA, passando ainda por uma fase de processamento antes de atingir o citoplasma na forma madura (mRNA). O processamento efectuado inclui o Splicing, isto a remoo das sequncias no codificantes ou introns. Outras alteraes introduzidas no processamento que ocorre no ncleo consistem na adio de uma cauda poli-adenina extremidade 3, e 1.16

metilao CAP da extremidade 5. A estrutura CAP resulta da ligao de um G purina com que a transcrio habitualmente se inicia, ficando este G na orientao inversa, e ligado pelo trifosfato deixado livre pela purina: Gppp + pppApNpNp GpppApNpNp G sofre ento uma ou mais metilaes. tRNA - o tRNA ou RNA de transporte um tipo de RNA que se encontra covalentemente ligado a um aminocido, tendo como funo o transporte do aminocido para o ribossoma, onde este vai ser posicionado com preciso, sempre que o ribossoma estiver a ler um codo complementar do tripleto que o tRNA possui (anticodo). As 64 espcies de tRNA (correspondentes aos 64 codes), possuem uma estrutura bsica semelhante.

Figura 1.16 Estrutura do tRNA rRNA - trata-se do RNA ribossomal, o qual como o nome indica um dos componentes dos ribossomas. O rRNA constitui a maior parte da massa do ribossoma, e provavelmente todas as protenas do ribossoma se associam ao rRNA. Assim, o rRNA forma como que o esqueleto do ribossoma, determinando a posio das vrias subunidades proteicas. 1.17

1.1.1.2

A ORGANIZAO DOS GENES NO GENOMA

O genoma pode, de uma forma genrica, ser classificado em DNA no repetitivo e DNA repetitivo. A abundncia relativa dos dois tipos de DNA podem ser experimentalmente determinados, tendo por base a diferente cintica de re-hibridao (DNA repetitivo encontra mais rapidamente uma sequncia complementar com quem pode hibridar). O DNA no repetitivo representa sequncias nicas, ou seja genes de cpia nica no genoma. O DNA repetitivo constitudo por DNA moderadamente repetitivo, representando genes com vrias cpias no genoma, e DNA altamente repetitivo. A funo do DNA altamente repetitivo permanece at ao momento uma incgnita. Como j vimos, um exemplo deste tipo de DNA o que existe nos telmeros, onde provavelmente tem a funo de estabilizar o cromossoma. Existem no entanto, repeties de pequenas unidades de sequncias espalhadas pelo genoma (mini e microssatlites), os quais constituem em pequenas sequncias, repetidas um determinado nmero de vezes. O nmero de repeties em muitos casos altamente polimrfico, pelo que estas sequncias tm sido utilizados como marcadores no mapeamento gentico. Sequncias moderadamente repetitivas: Nos genomas eucariticos, os genes que existem em cpia nica so poucos. Na maior parte dos casos, existem sequncias com alguma similaridade, algumas das quais no funcionais (os pseudogenes). A vantagem da existncia de mais que uma cpia dos genes bvia j que assim os organismos podem conservar uma cpia intacta do gene, mutando a outra, numa tentativa de evoluir. Neste processo de evoluo, algumas cpias ficam com a sua funcionalidade comprometida, tornando-se pseudogenes. No entanto, uma vez que uma outra cpia funcional existe, nenhum efeito nefasto da ocorre para o organismo. Um conjunto de genes que descende por duplicao e variao de um gene ancestral chamado de famlia gnica. Os seus membros podem estar arranjados em grupos sequenciais (gene clusters), dispersos no 1.18

genoma (muitas vezes mesmo em cromossomas diferentes), ou numa combinao de ambos os arranjos. Os gene clusters podem conter desde 2 at centenas de genes idnticos, alinhados em sequncia. A disperso dos genes ocorre por translocao de um gene aps a duplicao. Os membros de um gene cluster tm funo similar, mas podem ser expressos em tipos celulares diferentes ou em diferentes condies (Ex. Gene da globina). Em alguns casos, o gene cluster responde grande necessidade de protenas ou de RNA (ex.: rRNA e histonas). Sequncias altamente repetitivas: As sequncias altamente repetitivas tomam a forma de sequncias muito curtas, repetidas muitas vezes em sequncia. Formam-se assim blocos de material genmico, consistindo cada bloco em longas repeties de uma unidade. Em alguns casos as unidades so rigorosamente iguais, noutros so relacionadas. A repetio sequencial de unidades de sequncia forma blocos de DNA com caractersticas fsicas distintas do resto do genoma, o que pode ser utilizado para as isolar. Uma das propriedades fsicas do DNA que depende da sequncia a densidade, a qual depende do contedo GC. A densidade e habitualmente determinada mediante a centrifugao do DNA num gradiente de Cloreto de Csio (CsCl). O DNA forma assim bandas correspondentes a sua prpria densidade. Quando este procedimento realizado para DNA genmico eucariota, forma um pico algo largo, consistindo numa mistura de sequncias com densidades prximas (a banda principal). Por vezes forma-se ainda um ou mais picos adicionais, de menor intensidade. A este material chama-se o DNA satlite. O DNA satlite existe no genoma de varias espcies eucariotas, pode ter uma densidade superior ou inferior banda principal, mas representa habitualmente menos de 5% do genoma total.

1.19

O DNA satlite encontra-se frequentemente localizado na heterocromatina, no sendo habitualmente possvel encontrar as suas sequncias entre o RNA. Nos mamferos, as sequncias que compem cada satlite mostram divergncia aprecivel entre as repeties de cada. Habitualmente existem sequncias curtas predominantes, mas outras relacionadas com estas, mas contendo adies, substituies e deleces formam o restante satlite. Frequentemente, pode observar-se uma hierarquia nas repeties dos satlites, com uma sequncia base a repetir-se, a qual por vezes sofre modificaes, as quais por sua vez se repetem tambm de forma mais ou menos cclica. Este facto originou uma hierarquia de nomenclatura: DNA satlite, minisatelites, microsatelites.
1.1.1.3 Estrutura de um Gene

A comparao directa entre a sequncia do DNA de um gene, e a sequncia da protena respectiva, permite determinar se o gene e a protena so ou no colineares: se a sequncia do gene corresponde exactamente a sequncia de aminocidos da protena. Nas bactrias e vrus, a equivalncia perfeita: cada gene contm uma sequncia continua de nucletidos, cuja sequncia e comprimento est directamente relacionada com a da protena. Quando falamos em correspondncia entre o gene e a protena, estamos no entanto a simplificar o que realmente se passa. Como veremos mais tarde, um gene no codifica directamente uma protena, j que a informao tem que passar por um estado intermdio: o RNA. Assim, mesmo o mais simples dos genes tem que conter sequncias de vrios tipos: sequncias reguladoras ou no codificantes: sequncias que permitem clula controlar que genes esto activos em cada momento, possibilitando assim uma resposta diferenciada dependente das necessidades de cada momento. As sequncias reguladoras podem existir em cada extremidade do gene, e em 1.20

alguns casos estar mesmo bastante distanciadas das sequncias codificantes. sequncias codificantes: sequncias que so directamente transcritas para RNA, e deste codificadas em protenas. Note-se que enquanto o DNA de cadeia dupla, o RNA de cadeia simples, pelo que apenas uma das cadeias do DNA pode ser idntica a do RNA (codificante ou +), sendo a outra cadeia complementar do RNA (-). Como acima foi dito, o gene no no entanto to simples nos eucariotas. Ao contrario das bactrias e vrus, nos organismos eucariotas, os genes e as protenas no so colineares, isto , a regio codificante dos genes (exons) interrompida a espaos irregulares por sequncias no codificantes (introns). Este facto faz com que nos eucariotas, a expresso genica envolva um passo adicional: o splicing do RNA, ou processamento do RNA (com exons e introns) em mRNA. Um promotor uma sequncia de DNA, habitualmente na extremidade 5' de um gene, com a funo de se ligar a protenas, e controlar a iniciao da transcrio. As protenas a que um promotor se deve ligar, so vrias, disso dependendo a sua dinmica funcional. Genericamente pode falar-se de protenas repressoras, protenas activadoras, e da RNA polimerase. As protenas repressoras, ao ligar-se ao promotor impedem a ligao da RNA polimerase, impedindo assim o iniciar da transcrio, enquanto a ligao das protenas activadoras tem o efeito inverso. As propriedades do promotor que lhe conferem afinidade para as diversas protenas dependem da sua sequncia, pelo que esta varia de gene para gene, conferindo aos diversos genes caractersticas de regulao diferentes. No entanto, a ligao a polimerase do RNA universalmente necessria, pelo que deve ser possvel encontrar uma sequncia "consenso" para os promotores. Esta sequncia consenso 1.21

consiste na sequncia mnima comum entre os vrios promotores, e deve incluir a sequncia absolutamente necessria para a ligao a polimerase do RNA. Para os procariotas foi possvel definir a regio 44-50bp "upstream" do ponto de iniciao at 20bp "downstream" com sendo a regio que interactua com a polimerase do RNA, tendo sido definida uma sequncia consenso consistindo de vrios padres: Pribnow box ou sequncia -10- imediatamente upstream do ponto de iniciao (-18 a -12) existe uma regio com a sequncia T80A95T45A60A50T96 (os nmeros representam a frequncia com que as bases ocorrem). A funo desta sequncia parece ser a de permitir que aps a ligao da polimerase do RNA esta possa iniciar a sua evoluo ao longo do gene, possivelmente por permitir a iniciao da abertura da cadeia do DNA (o facto de ter alto contedo AT facilita a abertura da dupla hlice). Sequncia de reconhecimento ou Sequncia -35 - O seu nome deriva do facto de esta ser parte da sequncia que a polimerase tem que reconhecer, mas que no fica fortemente ligada a esta. A sequncia consenso : T82T84G78A65C54A45. A funo desta regio parece ser a de conferir a capacidade de ligao a polimerase do RNA. No caso de organismos eucariotas, o estudo dos promotores bem mais complexo, j que existem no uma RNA polimerase, mas trs. A acrescentar a esta dificuldade, est o facto de no se conhecer com preciso todos os componentes da maquinaria de transcrio eucariota, pelo que os estudos In viro ficam comprometidos. partida 2 particularidades existem nos eucariotas, relativamente ao que se passa nos procariotas: 1) o promotor da polimerase III fica localizado downstream do gene; 2) no possvel conhecer as particularidades do promotor da polimerase I, j que esta transcreve apenas os genes dos rRNA os quais so todos idnticos. 1.22

No entanto o promotor da RNA polimerase II, a responsvel pela transcrio da maioria dos genes nos eucariotas so conhecidos com alguma profundidade. As principais sequncias consenso identificadas nos promotores da RNA polimerase II dos eucariotas so:

A63 A A83 50 Tambm T37 T37 conhecida por Hogness box. Trata-se de uma sequncia quase universalmente presente em mamferos, aves, anfbios e insectos. Posiciona-se a uma distncia do ponto de iniciao entre 19 e 27bp. Como pode ver-se da sequncia consenso, a TATA Box constituda quase exclusivamente por AT, sendo as mutaes que inserem um GC muito raras. Esta sequncia habitualmente rodeada por sequncias ricas em GC, o que pode ser importante para a sua funo.
TATA BOX - sequncia consenso: T82 A97

T CAATCT . Esta sequncia C esta presente em alguns promotores, mas no em todos. A sua distancia ao ponto de iniciao ronda os 70 a 80bp.
CAAT BOX - sequncia consenso GG As anlises In vitro identificaram uma estrutura semelhante ao promotor bacteriano, imediatamente upstream do p onto de iniciao. No entanto, estudos In vivo revelaram a dependncia de zonas ainda mais upstream da TATA box. Este componente pode consistir em duas regies, uma entre -80 e -110 e a outra entre -50 e -70. Esta ltima pode ou no conter a CAAT box. Juntos, estas duas regies tm uma forte influncia na frequncia de iniciao, possivelmente por influnciar a ligao da RNA polimerase II. Junto ao ponto de iniciao, em redor da TATA box existe um componente que parece no ter influncia na f requncia de iniciao, antes de terminando o ponto de iniciao. Na ausncia deste elemento, a transcrio tem uma iniciao errtica. 1.23

Os promotores eucariticos so bem mais complexos que os procariotas. Ao contrrio dos promotores procariticos, e contrariamente ao que at agora assumimos, um promotor eucaritico no funciona s. A sua actividade enormemente aumentada de acordo com a regulao efectuada por outro tipo de sequncias reguladoras: os enhancers. Estas sequncias so distinguveis dos promotores devido a duas caractersticas essenciais: a sua posio relativamente ao promotor muito varivel, podendo ser considervel, e funcionando em qualquer sentido (upstream ou downstream) e orientao. Um enhancer no actua apenas num promotor, podendo interactuar com qualquer promotor colocado na sua rea de influncia. Vrios vrus contm enhancers. Destes, os mais perigosos para a clula que o vrus infecta so os enhancers presentes nos retrovrus. Como estes vrus se integram no genoma da clula infectada, a presena de enhancers pode levar activao de um ou mais genes celulares que de outra forma estariam silenciosos. Desta forma, os retrovrus podem de forma indirecta, originar patologias, mesmo no seu estado dormente, j que mesmo na ausncia de transcrio viral, podem induzir alteraes no programa gentico da clula infectada. O modo de funcionamento dos enhancers permanece desconhecido. Foram no entanto colocadas vrias possibilidades, entre as quais: Formao de estrutura no DNA em cadeia Z (ver figura 5). Os enhancers contm habitualmente uma sequncia alternada de pirimidinas-purinas. Esta sequncia tem elevada probabilidade de formar uma estrutura em z -DNA. Se, por um lado, o modo como esta estrutura poderia afectar a transcrio no est esclarecido, por outro lado, este 1.24

mecanismo poderia explicar porque os enhancers funcionam independentemente da sua orientao. Ligao do DNA a uma estrutura como a matriz nuclear ligao directa polimerase Quando a polimerase do RNA inicia a transcrio, esta prossegue com o complexo enzimtico a percorrer o DNA, at que a enzima encontra um sinal para cessar a actividade. Neste ponto, a enzima pra de adicionar nucletidos, liberta a cadeia de RNA nascente e dissocia-se do DNA. Assim, a terminao envolve a quebra de todas as pontes de hidrognio entre o DNA e o RNA, e a reassociao da dupla hlice do DNA. A sequncia de DNA que d o sinal para que este processo ocorra chama-se terminador (ou abreviadamente t). Em alguns genes procariticos, existem factores denominados anti-terminadores, que permitem polimerase continuar a transcrio passando por um terminador, num processo chamado de read-through). Assim, a terminao no constitui simplesmente uma forma de terminar a transcrio, mas tambm uma forma de controlar esta, j que a existncia dos anti-terminadores pode determinar a transcrio ou no de determinados genes que se encontrem aps o terminador. Pouco se sabe dos terminadores dos genes eucariticos. A principal dificuldade no estudo dos terminadores em eucariticos a incerteza quanto ao local de terminao da transcrio. Ainda que a maior parte das espcies de mRNA eucariticas conhecidas possuam extremidades 3 bem definidas, muito difcil saber se esta extremidade foi produzida por terminao ou por processamento. No caso dos produtos da polimerase II, o problema exacerbado pelo extenso processamento que ocorre com a adio da cauda poli-A. Pelo menos em alguns casos foi possvel determinar que a extremidade 3 observada no RNA de facto originada por corte de uma cadeia de RNA mais longa. 1.25

Estudos efectuados com sequncias de histonas (no poliadeniladas), permitiram verificar que o mRNA termina numa estrutura semicircular (stem-loop). Com efeito, mutaes que impeam a formao desta estrutura, impedem a terminao, enquanto que outras mutaes que revertam a mesma estrutura, embora com uma sequncia diferente, restauram a terminao. Assim, a estrutura parece mais importante que a sequncia que a determina. Os genes eucariticos e procariticos diferem numa caracterstica essencial. Ao contrrio dos genes procariticos, os gene dos organismos eucariticos no so contnuos, mas interrompidos. Significa isto, que no meio das sequncias codificantes, surgem sequncias que tm que ser retiradas do RNA, antes de este poder servir de molde construo das protenas. Este processo de transformao que o RNA sofre nos organismos eucariticos chamado de processamento, ocorre no ncleo, e como veremos envolve no apenas a remoo das sequncias extra (splicing) como outras transformaes qumicas. Os genes eucariticos so assim formados por dois tipos de sequncias transcritas (isto copiveis para RNA) os exons e os introns (tambm chamados de intervening sequences). Os primeiros compem as sequncias que estaro presentes no RNA maduro, sendo os segundos as sequncias que sero removidas durante o splicing. A comparao das sequncias nucleotdicas nas extremidades dos exons permite descrever as suas caractersticas: No existe homologia extensa entre as duas extremidades de um intron, o que exclui a possibilidade da formao de uma estrutura secundria que determine os pontos de corte. As junes possuem uma sequncia consenso conservada mas curta, a qual pode estar envolvida no processo de splicing: 1.26

Exon-----------------------Intron------------------------------------Exon 1.1.1.4 O CDIGO GENTICO

A 64 G73 G100 T100 A 62 A 68 G84 T63 . . . 6Py 74-87 N C65 A 100 G100 N

A descoberta do cdigo gentico pretendeu responder questo j por ns formulada (Cap. 1.1) sobre o mecanismo que permite aos cidos nucleicos, com uma estrutura baseada em apenas quatro tipos de nucletidos, conter a informao que codifica um enorme nmero de protenas, as quais possuem 20 tipos de aminocidos. A elucidao do cdigo gentico pretendeu ainda explicar como que a expresso gnica regulada. No entanto, antes de esta questo poder ser estudada, era necessrio estabelecer definitivamente a veracidade do dogma central da gentica: Um gene - uma cadeia polipptidica. Uma caracterstica essencial do DNA que a sua estrutura bsica independente da sequncia (ao contrrio das protenas cuja conformao directamente dependente da sequncia). Assim, a sequncia do DNA no parece ser importante devido conformao, mas porque codifica uma sequncia bem definida de aminocidos. Note-se que o prprio conceito de que uma protena contm sequncias bem definidas de aminocidos data dos anos 50 (a caracterizao da insulina por Sanger), e portanto estabelecida sensivelmente na mesma altura que se estuda a informao gentica. A esta relao entre a sequncia do DNA e a sequncia proteica correspondente chamou-se cdigo gentico. Como vimos, a sequncia nucleotdica tem que conter informao suficiente para codificar aminocidos diferentes. Como s h quatro tipos de nucletidos no DNA, um clculo simples indica que so necessrios 3 nucletidos (um tripleto ou codo) para codificar um aminocido. As combinaes possveis com trs nucletidos so 43 =64, pelo que o cdigo gentico degenerado, isto , mais do que um tripleto deve codificar o mesmo aminocido (tabela 1.2). 1.27

Tabela 1.2 - Cdigo gentico: significado dos 64 codons SEGUNDA BASE U C A UUU UCU UAU U Phe Tyr
UUC UUA Leu UUG
UCC Ser UCA UCG

G
UGU Cys UGC UGA STOP UGG Trp

UAC

UAA STOP UAG CAU His CAC CAA G ln CAG AAU Asn AAC AAA Lys AAG GAU Asp GAC GAA Glu GAG

CUU CUC Leu CUA CUG


AUU AUC Ile AUA AUG Met

CCU CCC Pr o CCA CCG AAU AAC Thr AAA AAG

CGU CGc Arg CGA CGG

AGU Ser AGC AGA Arg AGG


GGU GGC Gly GGA GGG

GUU GUC Val GUA GUG

GCU GCC Ala GCA GCG

Podem agrupar-se os codes segundo o aminocido que codificam (tabela 1.2). Quando tal realizado, pode observar-se que com frequncia, a base na 3 posio no significante, porque os 4 codes com as mesmas 1 e 2 bases codificam o mesmo aminocido (Tabela 1.2). Por vezes apenas distingue entre uma pirimidina e uma purina a 3 posio. A esta especificidade reduzida na 3 base chama-se degenerncia da 3 base. Esta caracterstica, em conjunto com a tendncia para aminocidos semelhantes (isto polares, hidrofbicos, etc.) serem codificados por codes relacionados minimiza o efeito das mutaes. 1.28

Trs codes no codificam aminocidos. Como se pode observar na tabela 2, estes codes (UUA, UAG e UGA) indicam o fim da sequncia gnica, sendo por isso chamados de codes stop. O cdigo gentico foi inicialmente estudado na bactria E.Coli, pelo que a universalidade deste necessitou de extenso estudo. Sabemos hoje, que genericamente o cdigo gentico similar em todos os organismos vivos estudados. As excepes conhecidas so representadas por pequenas alteraes em algumas espcies de microorganismos, e no cdigo gentico mitocondrial, o qual possui algumas particularidades em alguns organismos (Tabela 1.3). Tabela 1.3 - Exemplos de excepes universalidade do cdigo gentico Organismo Codon Significado Provvel Significado na mitocndria habitual Todos UGA Triptofano Terminao Levedura CUA Treonina Leucina Mosca da fruta AGA Serina Arginina Mamferos AGA Terminao Arginina AUA Metionina Isoleucina
1.1.1.5 Mutaes e Polimorfismos

Uma vez que o cdigo gentico lido em tripletos no sobreponveis, a insero ou remoo de um nucletido causa uma alterao na fase de leitura, alterando os codes subsequentes. Este tipo de mutao denominado em Ingls frameshift. Mutaes deste tipo so susceptveis de reverterem atravs da mutao inversa, isto , se a primeira mutao foi uma insero e a segunda uma deleco, ou viceversa, apenas a zona do gene situada entre as duas mutaes se encontra mutada. A segunda mutao, denominada supressora, j que suprime o efeito da primeira, limitando a zona atingida (fig. 1.17) 1.29

As mutaes pontuais so mutaes que ocorrem devido substituio de um nucletido por outro. A forma mais frequente de mutaes pontuais a transio, a qual ocorre quando uma pirimidina substituda por outra, ou uma purina por outra. A transverso menos frequente, e implica a substituio de uma pirimidina por uma purina, ou vice-versa. As mutaes pontuais podem ser de 3 tipos, de acordo com o efeito que provocam no aminocido codificado. Se no afectam o aminocido codificado so chamadas silenciosas , se mudam o aminocido codificado so chamadas missense, e se transformam o codo num codo stop so chamadas nonsense. As mutaes pontuais foram durante muito tempo consideradas as principais causas de mutaes. Sabe-se no entanto hoje, que as deleces so tambm muito frequentes, representando uma significativa poro das mutaes identificadas. As mutaes podem ser vantajosas, desvantajosas ou neutras, segundo as consequncias funcionais que provocam. As mutaes neutras, apesar de causarem alterao na sequncia no ocasionam mudana funcional. Neste caso, deve falar-se em polimorfismo e no em mutao.
Selvagem GCU GCU GCU GCU GCU GCU GCU GCU GCU Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Insero (+) GCU GCU AGC UGC UGC UGC UGC UGC UGC U Ala Ala Ser Cys Cys Cys Cys Cys Cys Deleco (-) GCU GCU GCU GCU GCU _ CUG CUG CU Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Duplo mutante GCU GCU AGC UGC UGC _ UCU GCU GCU (+ -) Ala Ala Ser Cys Cys Ser Ala Ala triplo mutante GCU GAC UGC AUG CUG CAU GCU GCU GCU (+ + +) Ala Asp Cys Met Leu His Ala Ala Ala triplo mutante GCU _CUG CU_C UGC U_CU GCU GCU (- - -) Ala Leu Leu Cys Ser Ala Ala Figura 1.17 - Mutaes frameshift e seus efeitos. Note-se que as inseres e as deleces podem anular-se mutuamente, fora da zona entre as duas mutaes

1.30

1.1.2 - A FISIOLOGIA DO GENE


1.1.2.1

Transcrio e transcrio reversa

O RNA a espcie de cido nucleico com um papel mais alargado na gentica molecular dos organismos. No s o RNA tem o papel m ais meditico de mensageiro, mas tambm a espcie que assegura a descodificao da informao gentica ( o rRNA e o tRNA). Para alm destes papeis centrais em todos os organismos, existem ainda vrus que utilizam o RNA como material de armazenamento de informao gentica (os retrovrus). A produo do RNA tem habitualmente uma origem comum: a transcrio do DNA. No caso do mRNA, o produto formado um intermedirio cuja funo requer ainda a traduo. No caso do tRNA e do rRNA, o produto formado o efector da funo a que se destina. A transcrio talvez o passo por excelncia para a regulao da expresso gnica. A deciso principal na regulao de um Figura 1.18 Passos da iniciao da transcrio 1.31

gene, habitualmente a deciso de transcrever ou no esse mesmo gene. O que se traduz possivelmente numa necessidade de economia de energia e materiais por parte da clula.

Figura 1.19 Elementos reguladores da iniciao da transcrio eucaritica A transcrio catalisada pela RNA polimerase, e envolve a sntese de uma cadeia de RNA complementar da cadeia molde do DNA (a outra cadeia do DNA a imagem do RNA, isto a sua sequncia equivalente do RNA, excepto no facto de em vez de possuir Uracilos possui Timidinas). A transcrio ocorre pelo processo habitual de emparelhamento de bases num processo altamente regulado e encadeado. Em primeiro lugar, a polimerase deve ligar-se ao DNA de cadeia dupla num processo complexo que envolve co-factores (fig. 1.18). Em seguida, as duas cadeias do DNA devem ser separadas (fig.1.19), para tornar a cadeia complementar acessvel maquinaria de transcrio. A abertura da hlice do DNA um processo localizado, e medida que a transcrio prossegue, novas zonas do DNA vo ficando acessveis, enquanto as zonas j transcritas se vo emparelhando de novo, por forma a preservar a dupla hlice. A fase de iniciao da transcrio envolve assim, o reconhecimento do DNA pela polimerase, a abertura da hlice do DNA, e a incorporao do primeiro nucletido na cadeia do RNA nascente. O local do gene onde se processa todo este processo naturalmente o promotor (fig. 1.19). O 1.32

local da incorporao do primeiro nucletido designado start site ou startpoint (fig.1.19). Depois da fase de iniciao inicia-se a fase de elongao, a qual produz a extenso da cadeia de RNA nascente, originando um hbrido de emparelhamento DNA-RNA. No entanto, medida que a elongao se processa, a polimerase caminha para novas regies do DNA, abrindo a hlice noutras zonas do gene, e fechando nas regies j transcritas, o que implica o desemparelhamento DNA-RNA. A terminao envolve o reconhecimento de um sinal indicando que no devem ser adicionados mais nucletidos. Nesta fase, termina a ligao DNA-RNA da cadeia nascente, com libertao da polimerase e da molcula de RNA. Desta descrio se pode inferir que a polimerase do RNA ( a enzima que catalisa a adio de nucletidos cadeia de RNA nascente) no funciona s, necessitando de um conjunto de outros componentes com funes essencialmente reguladoras e assessrias. Assim, quer a iniciao quer a abertura do DNA, quer a terminao so exemplos de processos em que intervm outros factores para a progresso organizada e controlada da expresso gnica. A maquinaria de transcrio das clulas eucariticas mais complexa e menos bem definida que a dos procariotas. Existem 3 polimerases nucleares, as quais ocupam diferentes locais do ncleo, e so cada qual composta por vrias subunidades. Para complicar ainda mais o problema, existem ainda outras polimerases do RNA em mitocondrias e cloroplastos. A maior parte da actividade de polimerase do RNA realizada, nos eucariotas, pela RNA polimerase I, a qual se encontra no nuclolo, e responsvel pela transcrio dos genes codificando os rRNA (cerca de 50-70% do RNA total sintetizado). A segunda enzima, a RNA polimerase II (20-40% da actividade total de sntese de RNA), e responsvel pela sntese do RNA heterogneo (hnRNA), o percursor 1.33

do mRNA. A RNA Polimerase III responsvel pela restante actividade de produo de RNA (at 10% do total), tem localizao nucleoplasmtica e responsvel pela produo dos tRNA e muitos dos small nuclear RNA (snRNA). Nenhum mecanismo de controlo da transcrio pode ser uma forma eficaz de controlar a expresso gnica, se o produto da transcrio (o mRNA) no tivesse uma vida curta. Se assim no fosse, previsivelmente ocorreria uma acumulao de mensageiro, ou pelo menos o mensageiro formado permaneceria activo tanto tempo que no seria possvel parar de sintetizar a respectiva protena. Na realidade, a instabilidade do mRNA muito acentuada. As duas formas de determinar a instabilidade do DNA baseiam-se ambas no bloquear da sntese de novo do mRNA (transcrio), medindo ento a sua capacidade para servir na sntese proteica (semi-vida funcional), ou a sua capacidade para hibridar com uma sonda (semi-vida qumica). De modo geral, a semi-vida funcional ligeiramente inferior semivida qumica, o que sugere que pequenas degradaes como um simples corte podero ser suficientes para a inactivao biolgica do mRNA. Verifica-se que este primeiro passo inicial seguido da degradao do mRNA nos seus nucletidos componentes, de forma mais ou menos sequencial na direco 53. O dogma central da gentica molecular afirma que os genes so unidades que se perpetuam a si prprios, e que funcionam atravs da sua expresso em protenas, atravs de um intermedirio de RNA. Note-se que o dogma, na sua verso original define um paradigma que considera que a informao gentica transmitida unidirecionalmente: DNARNAProtena. Hoje em dia, sabemos que a restrio do dogma central no absoluta. Efectivamente, a informao gentica pode ser transmitida de forma diferente da acima prevista. Alguns vrus de RNA, utilizam o RNA para a propagao da sua informao gentica. Se esta pode parecer 1.34

uma extenso relativamente pequena do dogma central, j a existncia nos retrovrus (vrus de RNA de cadeia simples que utilizam o DNA de cadeia dupla como intermediria na sua replicao) de transcriptases reversas constitui uma grande mudana no paradigma da gentica molecular. As transcriptases reversas so enzimas que catalisam a sntese de um DNA de cadeia simples a partir de uma cadeia de RNA. Esta cadeia de DNA pode ento ser utilizada para sintetizar DNA de cadeia dupla, utilizando a maquinaria habitual da clula, efectivamente revertendo um dos passos acima indicado: RNADNA. Este facto tem implicaes profundas no s na forma de pensar a gentica, mas tambm na biologia da infeco viral, j que este DNA de cadeia dupla formado, e que uma cpia do RNA viral, vai agora integrar-se no genoma da clula, fazendo com que a infeco se propague de forma mais ou menos inofensiva progenia da clula infectada ( a integrao no genoma celular uma parte normal do ciclo de vida do vrus sendo necessria transcrio dos genes virais). Uma outra implicao deste mecanismo a possibilidade de uma infeco de vrus deste tipo poder mediar a insero de mRNA celular no genoma, como se de RNA viral se tratasse, originando duplicao gnica, e/ou insero de uma cpia do gene sob a aco de um promotor diferente, efectivamente alterando o programa gentico da clula. Uma outra implicao da infeco por este tipo de vrus, foi j por ns abordada aquando da discusso da existncia de enhancers, e constitui na possibilidade de colocar genes celulares sob a aco de enhancers virais, uma vez mais alterando o programa gentico da clula infectada. Os tipos de retrovrus de que existe mais informao disponvel so os que originam as partculas tipo C em aves e mamferos. Estes vrus contm duas cpias de RNA em cada virio. Assim, quando uma clula infectada por dois viries diferentes, podem-se originar viries heterozigticos, o que pode ser importante na aquisio de sequncias celulares por parte do vrus, j que mesmo que em contrapartida perca 1.35

algumas sequncias do seu genoma, a restante cpia do RNA viral permite-lhe continuar a ser capaz de efectuar uma infeco eficaz.
1.1.2.2 Traduo

A sntese proteica efectua-se no citoplasma, envolvendo uma complexa maquinaria gentica centrada no ribossoma (fig. 1.20). Esta maquinaria gentica pode ser vista como migrando ao longo do mRNA, lendo-o e utilizando a informao nele contida para alinhar com preciso cada aminoaciltRNA, promovendo a ligao peptdica entre este e a cadeia peptdica nascente.

Figura 1.20 O ribossoma interactuando com o mRNA, o tRNA e a cadeia polipeptdica nascente.

O ribossoma assim um altamente elaborado e preciso complexo enzimtico com diversificados componentes e vrios centros activos, que requer vrios cofactores para a sua actividade, e que obtm a energia qumica que necessita com a hidrlise de GTP. Um ribossoma composto por duas unidades (60S e 40S nos eucariotas) as quais, apesar de funcionarem em conjunto medeiam reaces diferentes na sntese proteica. O mRNA associa-se subunidade menor, ficando associado a este por cerca de 30-40 nucletidos. Apenas 2 molculas de tRNA se podem associar ao ribossoma em cada momento, pelo que apenas 2 dos cerca de 30 codons associados ao ribossoma se encontram a ser processados em cada momento. Cada tRNA liga-se ao ribossoma num local diferente deste, tendo cada um dos dois locais de ligao propriedades diferentes. Apenas o Local 1.36

A (local de entrada) pode receber um aminoacil-tRNA. Antes da entrada do aminoacil-tRNA, este local expe o codon a ser descodificado. O ltimo dos codons j descodificados encontra-se no local P (local dador), sendo este local ocupado pelo peptidil-tRNA (um tRNA contendo o aminocido j covalentemente ligado por uma ligao peptdica restante cadeia polipeptdica nascente). Quando estes locais (A e P) esto ambos ocupados ocorre a formao da ligao peptdica com transferncia do polipptido nascente para o tRNA do local A. O ribossoma desloca-se ento no mRNA libertando o tRNA do local P e transferindo para este local o peptidil-tRNA do local A, e expondo um novo codon no local A. A sntese proteica pode ser dividida em vrias fases: Iniciao: envolve as reaces que precedem a formao da ligao peptdica. Requer a ligao do ribossoma ao mRNA, a formao de um complexo de iniciao contendo o primeiro aminoacil-tRNA. Trata-se de um processo relativamente lento em comparao com as restantes fases da sntese proteica.

Figura 1.21 Passos da fase de iniciao e respectivos co-factores envolvidos Resumidamente pode dizer-se que nos eucariotas a iniciao comea com a ligao de GTP a um factor de iniciao denominado eIF-2 (eucariotic iniciation factor 2). De seguida efectua-se a ligao de um N-formil-metionil-tRNA a este complexo. o conjunto de factores assim formado que se liga ento subunidade 40S do ribossoma, a 1.37

qual com o auxilio de outros factores de iniciao reconhece ento a extremidade 5 do mRNA (na qual se encontra a estrutura conhecida como CAP) por parte da subunidade 40S do ribossoma. A subunidade 40S migra ento no mRNA at encontrar um codon de iniciao. Neste ponto, liga-se a subunidade 60S, aps a remoo de

Figura 1.22 Passos da fase de elongao da traduo eucaritica eIF-2 do complexo de iniciao. Elongao: inclui todas as reaces desde a sntese da primeira ligao peptdica, at adio do ltimo aminocido da cadeia polipeptdica. 1.38

Os aminocidos so adicionados um a um, naquele que constitui o processo mais rpido da sntese proteica. Assim que a subunidade 60S se liga ao complexo de iniciao, o ribossoma fica pronto a iniciar a elongao. Para tal necessita de aminoaciltRNA, o qual entra o local A, num processo mediado pelo factor eEF-1 (eucariotic elongation factor 1). Assim que o aminoacil-tRNA se encontra correctamente posicionado no local A, a peptidil transferase (uma funo da subunidade 60S) catalisa a formao da ligao peptdica entre os aminocidos dos locais P e A. O ltimo passo na elongao a translocao, processo Figura 1.23 Passos da fase de terminao da traduo eucaritica 1.39

em que o ribossoma avana trs nucletidos de forma concertada( e que requer o factor adicional eEF-2). Este processo envolve a libertao do tRNA do local P, a passagem do peptidil-tRNA do local A para o local P, e a exposio do prximo codon no local A agora vazio. Terminao: inclui todos os passos necessrios para a libertao da cadeia polipeptdica formada, bem como a dissociao do ribossoma do mRNA. Este um processo lento, em comparao com o tempo necessrio para adicionar um aminocido na fase de elongao. Dos 64 tripletos, apenas 61 codificam para aminocidos, sendo os restantes trs codons stop, ou de terminao. Qualquer destes trs codons (UAG, UAA e UGA) suficiente para terminar a sntese proteica. Aos codons de terminao no corresponde nenhum tRNA, sendo estes reconhecidos directamente pelo factor proteico eRF (eucariotic release factor). A reaco de terminao envolve a libertao do polipptido do ltimo tRNA, a expulso do tRNA do ribossoma, e a dissociao deste do mRNA. A clula eucaritica uma estrutura finamente organizada, cujas funes so efectuadas em locais celulares definidos. A sntese proteica no constitui excepo, podendo os polirribossomas ser classificados em 2 tipos (livres e ligados a membranas), aos quais corresponde a sntese de diferentes grupos de protenas . Os polirribossomas livres sintetizam protenas que no interagem com membranas, enquanto os que se encontram associados s membranas sintetizam protenas cuja futura localizao depende da sua capacidade para se ligarem s membranas. Note-se no entanto que a denominao polirribossomas livres no significa que estes se encontrem livres em soluo no citoplasma. Estes polirribossomas encontram-se associados ao citoesqueleto para o que provavelmente dependem do mRNA. 1.40

Os polirribossomas tendem a estar localizados perto de ncleos, nos locais de entrada do mRNA no citoplasma. A maior parte das protenas sintetizadas so solveis, e uma vez libertadas rapidamente difundem para longe do local de sntese. As protenas que iro compor o citoesqueleto, tendem a integrar-se neste num local no muito distante do ponto de sntese. As protenas sintetizadas pelos ribossomas ligados a membranas tm vrios destinos. Algumas so sequestradas em compartimentos celulares , outras so componentes membranares, e outras ainda so protenas que se destinam a ser secretadas. Na maior parte dos casos das protenas de membrana, a sua futura localizao no depende da sequncia da protena madura, mas antes de uma sequncia denominada leader, e que se localiza na zona terminal da cadeia polipeptdica nascente.

Figura 1.24 A replicao semiconservativa, tendo como base o emparelhamento de nucletidos 1.41

Esta sequncia, depois de ter determinado o destino da protena ser excisada do resto da protena, originando a protena madura.
1.1.2.3 Replicao

A descoberta da natureza de dupla hlice do DNA foi o ponto de partida para a compreenso do mecanismo de duplicao deste cido nucleico, o qual designado por replicao. Com efeito, o princpio bsico do emparelhamento dos nucletidos, em que assenta a estrutura do DNA tambm o princpio essencial para a Figura 1.25 A replicao contnua compreenso da replicao numa cadeia (cadeia "leading" ) e do DNA, j que esta assenta descontnua na outra (Cadeia na noo de que cada cadeia "lagging" ). de nucletidos funciona como padro na sntese da uma nova cadeia (fig. 1.24). Assim, a replicao do DNA semiconservativa, isto , aps a duplicao, cada molcula de DNA tem uma cadeia original, e uma cadeia sintetizada de novo (fig. 1.24). Como a sntese se processa sempre no mesmo sentido (53) e as cadeias de DNA tm orientao invertida, numa das cadeias, a sntese contnua, sendo na cadeia complementar descontnua, a partir de vrios pontos de iniciao. Forma-se assim, em cada ponto de replicao uma estrutura em forma de Y (Forks). Como a replicao bidireccional (excepto nos vrus de DNA linear), cada ponto de 1.42

iniciao da replicao d origem a dois Forks invertidos ( ). Para que a mesma polimerase possa sintetizar ambas as cadeias, forma-se uma estrutura local em loop na cadeia de sntese descontnua (fig. 1.26). Em bactrias de DNA habitualmente Figura 1.26 Estrutura em loop que circular, permite que uma polimerase sintetize apenas um ponto de iniciao suficiente para as duas cadeias de DNA. replicar todo o genoma, mas em eucariotas, cada cromossoma possui mltiplos pontos de iniciao, que cooperam para a rpida replicao do DNA. Estes pontos possuem uma sequncia semelhante entre si. Conhecem-se 3 tipos principais destas sequncias: a OriC da E.coli a sequncia do vrus SV40, e a sequncia de replicao autnoma em leveduras. A OriC (bem como a maior parte das sequncias equivalentes em bactrias) composta por repeties de sequncias com 9 e 13 pares de bases (9-mers e 13-mers) ao longo de uma sequncia com cerca de 240bp, sendo estes 9-mers e 13-mers locais de ligao da protena DnaA, a qual inicia a replicao. A origem de replicao do SV40 possui cerca de 65bp. Os 17 cromossomas da levedura S.cerevisiae possuem mais de 400 sequncias de iniciao da replicao. Cada uma destas sequncias (denominadas ARS de autonomously replicating sequence) confere a um plasmdeo a capacidade de se dividir na levedura. Estudos mutagnicos efectuados ao ARS1 (cerca de 180bp) revelaram a existncia de apenas uma regio essencial, com cerca de 15bp, designada elemento A. Trs outros elementos (B1 ,B2 e B3 ) so 1.43

necessrios para o funcionamento efectivo do ARS11. Um complexo de protenas chamado ORC (origin recognition complex) liga-se ao ARS1 de modo dependente do ATP. Adicionalmente a estas sequncias, uma sequncia a elas adjacente, rica em Adenosinas e Timidinas facilita a abertura da dupla hlice. A replicao eucaritica (aqui descrita para o SV40 o modelo mais

Figura 1.27 A sntese descontnua da cadeia "lagging" exige primers de RNA sintetizados pela primase, formando-se temporariamente uma molcula mista RNA/DNA (fragmento de 1.44 okasaki).

bem conhecido) inicia-se com a ligao de uma protena viral chamada T antigen ao DNA. Esta protena multifuncional desenrola o DNA com a sua actividade d e helicase, com a ajuda de ATP e um factor denominado RFA (replicating factor A), o qual uma protena que se liga a DNA de cadeia simples. A replicao inicia-se ento bidirecionalmente a partir de primers de RNA produzidos por uma primase. Duas polimerases distintas ( e ) trabalham no fork eucaritico: a pol produz a cadeia leading, cuja sntese contnua; a sntese da cadeia lagging, realizada de modo descontnuo da responsabilidade da pol , a qual se encontra fortemente associada a uma primase. Na realidade, a sntese da cadeia leading na realidade o trabalho sequencial das polimerases e . O complexo primase-pol sintetiza

Figura 1.28 Representao esquemtica dos vrios componentes que intervm na replicao eucaritica. o primer de RNA, e inicia a extenso do DNA, numa actividade 1.45

estimulada pelo factor de replicao C. A ligao de PCNA (proliferating cell nuclear antigen) liberta a pol . A pol liga-se ento ao PCNA que activa a polimerase a qual sintetiza ento a cadeia leading. Finalmente enzimas chamadas topoisomerases executam o importante trabalho de libertar as tenses de torso introduzidas pelo desenrolar da hlice do DNA padro. No final de cadeias de DNA linear, existe o risco de em cada sntese, a cadeia lagging se tornar progressivamente mais curta, pois a sntese descontnua necessita sempre de um template maior que a sequncia a amplificar. Para obviar a este risco, a clula possui nas extremidades do cromossoma estruturas especiais denominadas telmeros e compostas por repeties de sequncias oligomricas (ex. na levedura : 5-G1-3 T-3). Os telmeros so sintetizados por um processo diferente do acima descrito por enzimas especializadas: as telomerases. Estas enzimas so transcriptases reversas modificadas, produzindo DNA a partir de um template de RNA que a elas se encontra associado, e que determina portanto a sequncia do telmero. Finalmente um outro aspecto da sntese do DNA deve ser alvo da nossa ateno: a reparao de erros. As polimerases, no so enzimas isentas de erros, e a incorporao de nucletidos incorrectos por vezes ocorre. Vrios mecanismos de reparao destes erros existem, e deles depende a transmisso do patrimnio gentico, sem mutaes. O primeiro mecanismo de reparao do DNA est incorporado nas prprias polimerases. Estas enzimas, no s sintetizam DNA (actividade polimerase 53) como exercem uma actividade de verificao (proofreading) das bases recentemente adicionadas, removendo as bases incorrectas (actividade de exonuclease (35).

1.46

1.1.2.4 1.1.2.4.1

Mecanismos de Mutao do DNA Erros na replicao do DNA

Quando, durante a replicao do DNA a polimerase incorpora nucletidos errados, produz-se uma mutao. Na maior parte dos casos, tal no se verifica, apenas porque a maioria das polimerases, possuem no apenas actividade de sntese na direco 53, mas tambm actividade de proofreading na direco 35. Assim, se o nucletido incorporado for o errado, a polimerase usa a sua actividade exonucleolitica, e volta a tentar. Cada base do DNA existe em uma de vrias formas possveis, chamadas tautmeros. Trata-se de ismeros, em que a posio relativa e as ligaes entre os tomos variam. Normalmente apenas a forma ceto aparece no DNA, enquanto as formas enol e imino so raras. No entanto, os tautmeros enol e imino tm a capacidade de emparelhar com bases diferentes das que a forma ceto emparelha, levando a erros na replicao. Assim, por exemplo a forma imino da citosina pode emparelhar com a adenina, a forma enol da timina pode emparelhar com a guanina, a forma imino da adenina pode emparelhar com a citosina e a forma enol da guanina pode emparelhar com a timina. Uma outra forma de incorporao estvel de bases erradas ocorre com a replicao de bases ionizadas, a qual possivelmente mais frequente do que a mediada pelos tautmeros, e justifica os efeitos mutagneos das radiaes ionizantes. Os emparelhamentos de purinas com purinas e pirimidinas com pirimidinas, ocasionam distores na dupla hlice, j que foram alteraes na dimenso exterior da hlice. No entanto, mesmo este tipo de mutaes (transverses) ocorrem, tendo inclusivamente sido observado por difraco de raios X estruturas de DNA albergando este tipo de emparelhamentos. 1.47

Tambm mutaes frameshift podem originar-se por erros de replicao. este tipo de erros ocorre preferencialmente em zonas de repetio de nucletidos (ex: AAAAA AAAA; CTCTCTCTCT), e pensa-se ser o resultado de um deslizar excessivo da polimerase, sem que este provoque uma desestabilizao do emparelhamento imediatamente adjacente ao local de polimerizao. Com o mesmo mecanismo se pode explicar mutaes frameshift causadas por inseres, bastando para tal admitir que a cadeia que desliza a cadeia nascente.
1.1.2.4.2 Leses espontneas

As duas mais frequentes leses espontneas causando mutaes so a despurinao e desaminao. A mais comum a despurinao, a qual envolve a interrupo da ligao glicosidica entre a base e a desoxirribose, com a consequente perda de uma base de guanina ou adenina da molcula de DNA. Uma clula de mamfero perde espontaneamente cerca de 104 purinas do seu DNA num perodo de 20 horas a 37C. Assim se compreende a grande necessidade de mecanismos de reparao do DNA, para a manuteno do cdigo gentico, garantindo a viabilidade celular e a da progenia. Em certas condies, uma base pode ser adicionada ao nucletido apurnico (como um ltimo recurso de reparao), existindo neste processo 3 hipteses em 4 de o resultado se traduzir numa mutao. A desaminao de uma citosina origina um uracilo. Se a base assim alterada no for reparada, numa replicao posterior ela vai emparelhar com uma adenina, originando a substituio de um C por um G. Notese que se o nucletido onde ocorreu a desaminao possuir uma 5metil-citosina, a base desaminada uma 5-metil-uracilo, ou seja timina, a qual no reconhecida pela maquinaria de recombinao, resultando numa mutao no reparvel. Por este motivo as 5-metiluracilo so hot spots de recombinao. 1.48

Figura 1.29 Desaminao de bases nucleotdicas.

Uma forma menos frequente de mutao espontnea so os danos oxidativos. Espcies de oxignio altamente reactivas como os radicais superxido (O 2 ), perxido de hidrognio (H2 O2 ) e o seu derivado radical hidrxilo (OH) so produtos secundrios do metabolismo aerbico, e podem causar danos oxidativos no DNA ou seus percursores. Por exemplo a 7-hydrodeoxiguanosina ou 8-oxodG (GO) frequentemente emparelha com adenina, resultando num elevado nmero de mutaes GT.

Figura 1.30 Formao do 8-oxodG (GO) 1.49

1.1.2.4.3

Recombinao gentica

1.1.2.4.3.1 Recombinao por crossing-over

O crossing-over um mecanismo normal de troca de material gentico entre dois cromossomas homlogos, durante a meiose. Trata-se de um fenmeno complexo em que habitualmente conseguida uma extraordinria preciso, mas de onde podem surgir mutaes quando algo de errado acontece. Existem hoje vrios modelos de recombinao por crossing-over: Recombinao homloga Geral A recombinao homloga geral no envolve nenhuma especificidade em termos de sequncia do DNA, para alm de se verificar apenas entre molculas de DNA homlogo. Esta recombinao envolve a formao de uma estrutura em que uma molcula de DNA (dupla hlice) emparelha parcialmente com outras homloga, formando uma

Figura 1.31 - Modelo de Holiday para a recombinao homloga 1.50

estrutura em quiasma. Note-se que de cada cromossoma, apenas um dos dois cromatdeos (ou uma das duas molculas de DNA de cadeia dupla) toma parte na recombinao. O local de corte e juno ocorre ento no centro do quiasma, resultando dois cromossomas hibridos, mas intactos em termos do seu contedo gentico. O modelo mais plausvel para explicar os passos necessrios para a recombinao foi apresentado por Robin Holliday (fig.1.31) para explicar o fenmeno de converso gnica. Como se pode ver na fig. 1.31, o modelo de Holliday prev que num dos passo iniciais se verifique um corte por uma endonuclease numa das cadeias de cada molcula de DNA, a que se segue a troca de extremidades de uma das cadeias de cada dupla hlice. As cadeias so ento ligadas pela ligase formando-se cadeias hbridas. A este passo segue-se a migrao do ponto de troca, terminando o processo com a resoluo, a qual pode ocorrer por um de dois mecanismos (Fig. 1.31): 1) cortando e ligando mantendo as cadeias originais no resto do DNA ou; 2) cortando e ligando as cadeias novas, efectivamente trocando todo o material cromossmico deste o ponto de cross-over at ao telmero. Este modelo, se bem que explique os resultados obtidos com fungos, no permite explicar todas as observaes efectuadas com leveduras, o que levou Meselson & Radding a propor um mecanismo diferente. Este mecanismo, parte no de um corte de uma cadeia em cada molcula de DNA, mas apenas numa delas, seguindo-se a polimerizao a partir de um dos terminais. Esta polimerizao provoca o desemparelhamento de parte da cadeia em sntese, originando uma molcula de DNA parcialmente de cadeia simples, a qual pode ento substituir a sua homloga no outro cromossoma. Os ltimos passos neste modelo consistem na ligao das cadeias com terminais, seguida da migrao do ponto de juno, e resoluo horizontal ou vertical. Note-se que este modelo explica a formao de produtos no passveis de serem produzidos pelo modelo de Holliday, como o caso de cromossomas irmos que numa diviso possuem 1.51

trocas cromossmicas desiguais entre si. Um outro tipo de implicao deste modelo a possibilidade de ocorrncia de converso de cromatdeos e de converso de meios-cromatdeos. Estes fenmenos ocorrem quando se formam cromatdeos com cadeias de DNA no homlogas, isto quando, por crossing-over, o produto final uma molcula de DNA com cadeias pontualmente no emparelhadas (locais G:T, G:A, C:T, C:A). Quando isto sucede, os mecanismos de correco do DNA podem corrigir o mal-emparelhamento, do que resulta uma molcula de DNA convertida (converso de cromatdeos), ou igual molcula inicial. Pode ainda no ter ocorrido correco, e a molcula de DNA possuir o desemparelhamento local (converso de meio-cromatdeo). Assim se obtm as propores menos frequentes, e no iguais no nmero de cromossomas resultantes de um crossingover.
1.1.2.4.3.2 Recombinao somtica

Trata-se de um processo enzimtico complexo e altamente regulado, que permite a uma clula T ou B adquirir um gene especfico para o TCR ou para uma imunoglobulina respectivamente. O mecanismo de recombinao (ou rearranjo) somtica (descrito em pormenor na seco 2.1) habitualmente restrito s clulas T e B, e apenas aos genes do TCR e Ig. No entanto, a existncia de sequncias de recombinao ditas crpticas (sequncias de recombinao imperfeitas) pode originar a que em casos raros, nestas clulas, os genes do TCR ou Ig sejam refranjamos indevidamente com outros loci genticos, do que resulta uma translocao intra ou intercromossmica com perturbao do programa gentico. O programa gentico da clula em que ocorrem estas anomalias pode ser perturbado de uma de duas formas: 1) a formao de uma protena quimera pode desregular a funo dos genes em questo; 2) a colocao de um gene habitualmente silencioso nos linfcitos debaixo da aco do enhancer do TCR ou das Ig, faz com que este seja expresso de forma 1.52

permanente. Exemplos de anomalias destes tipos, e suas consequncias clnicas sero apresentadas na seco 4.2.
1.1.2.4.4 Mutaes mediadas por elementos de transposio

Os elementos de transposio so elementos genticos com a propriedade de serem capazes de se mobilizarem, e moveremse para outro local do genoma, ou de criarem cpias de si Figura 1.32 Elemento de prprios noutro local do transposio simples ou genoma. Este conceito, criado sequncia de insero (IS do por resultados experimentais ingls insertion sequences). produzidos por Marcus Rhoades e Barbara McClintock em milho, foram inicialmente encarados com grande cepticismo. Sabe-se no entanto hoje que estes elementos so bastante representados em todo o mundo biolgico, dos Procariotas aos Eucariotas superiores. As sequncias de insero (fig.1.32) so os elementos de transposio mais simples, sendo constitudos por sequncias de nucletidos que se podem agrupar em famlias, de acordo com a sua sequncia. Assim, a IS1 foi historicamente a primeira a ser descrita, possuindo cerca de 800bp, mas muitas outras foram entretanto descritas. Uma das caractersticas das IS a presena de uma pequena sequncia que aparece invertida em cada uma das extremidades (IR do ingls inverted repeats). Os inverted repeats possuem entre 16 nucletidos e algumas dezenas, sendo o seu comprimento e sequncia especfico de cada IS.

1.53

Figura 1.33 caractersticas de alguns transposons e consequncias da sua insero Um transposon (Tn1, Tn2, etc.) um elemento de transposio mais complexo, contendo dois IS separados por uma sequncia de DNA que pode conter um ou mais genes. Os dois IS nas extremidades so idnticos, e podem estar na mesma orientao, ou em orientaes invertidas. Se estiverem na mesma orientao os IR presentes so os IR de cada um dos IS. Se estiverem em orientaes invertidas, todo o IS funciona como um IR. Os transposons herdam dos IS que os constituem a capacidade de se deslocarem no genoma, mas com uma habilidade extra que a de transportarem consigo o(s) gene(s) que os constituem. Na verdade, em bactrias, este o mecanismo que muitas vezes se encontra por detrs da aquisio de resistncia a antibiticos num nico plasmdeo. 1.54

Figura 1.34 Os transposons so elementos de transposio mais complexos. So constitudos por uma sequncia central contendo genes ou marcadores, e sequncias laterais que podem ser repeties directas ou invertidas de IS. Os mecanismos de transposio podem ser conservativos ou replicativos. No primeiro ocorre a deslocao do elemento de transposio de um local para outro, sem que o numero de elementos tenha variado. No segundo caso, deixada uma cpia do elemento de transposio no local original, isto o elemento de transposio replicado para um novo local.

Figura 1.35 Mecanismo de transposio conservativa

Figura 1.36 Mecanismo de transposio replicativa

1.55

O mecanismo de transposio replicativa catalizado por uma transposase, e envolve um intermedirio que possui todo o genoma do plasmdeo dador integrado no genoma do plasmdeo receptor, possuindo este intermedirio duas cpias do elemento de transposio (uma em cada extremidade do genoma dador). Em seguida, ocorre como que um cross-over (mediado pela sequncia do elemento de transposio), Figura 1.37 Os transposons que depois resolvida pela podem ser excisados por transposase ( a qual pode ou recombinao homloga entre os no ser codificada nos direct repeats, deixando uma cpia elementos de transposio, dos repeats no local de insero pelo que a sua aco efectuada em trans ou cis respectivamente). Uma outra consequncia da transposio a ocorrncia de uma duplicao do DNA receptor em cada extremidade da insero. Esta duplicao resulta do facto de o corte em cada cadeia do DNA receptor ser efectuado em locais diferentes, e de a sequncia de DNA de cadeia simples ser depois resolvida pela polimerase.

1.56

A presena de elementos de transposio origina uma alta frequncia de deleces na sua vizinhana. Estas deleces ocorrem como eventos de transposio aberrantes e podem incluir ou no parte do elemento de transposio. A prpria mobilidade dos elementos de transposio pode ser causa de mutaes, j que quando um IS se posiciona no meio de um gene, produz uma interrupo deste. Se altera a sequncia codificante, ou a separa do promotor, o resultado pode ser um gene no funcional, com funcionalidade alterada, ou com baixa ou nula expresso. Os elementos de transposio acima descritos, so relativamente simples e pequenos, existindo nos procariotas. Nos Eucariotas foram tambm descritos elementos de transposio como os Ty (levedura), os Copia like elements (drosofila), os FB elements (drosofila), os P elements (drosofila), e os retrovrus. Os Ty elements possuem uma sequncia

Figura 1.38 Elementos de transposio dos eucariotas e suas caractersticas 1.57

altamente varivel, mas terminada por uma sequncia repetida (a sequncia ), a qual tambm varivel de elemento para elemento. Os Ty podem ter vrios Kb de comprimento, e as sequncias cerca de 300bp. Uma particularidade das sequncias que no se constituem em repeties invertidas, mas repeties directas. Cerca de 10% do genoma da drosofila composto por f amlias de elementos de transposio disseminados, e que se movem como elementos discretos no genoma. Na drosofila foram caracterizados 3 tipos de elementos de transposio distintos: (Copia like, Fold Back ou FB e os P elements). Os Copia like so compostos por 7 famlias diferentes, variando em tamanho de 5 a 8.5Kb. Membros de cada famlia so representados com 10-100 elementos no genoma da drosofila. Cada elemento possui uma repetio directa longa, e uma repetio invertida imperfeita e curta, sendo estruturalmente semelhante ao Ty da levedura. Os elementos FB (Fold Back ) variam em tamanho de algumas centenas de pares de bases a alguns Kb. Possuem entre si sequncias semelhantes mas no iguais. Possuem terminais longos em repeties invertidas. Por vezes todo o elemento constitudo pelas repeties invertidas, com excepo de uma pequena sequncia entre estas. O seu nome deriva do facto de em virtude de possurem estas repeties to longas estes elementos poderem hibridizar consigo prprios, como que dobrando-se sobre si mesmos. As propriedades observadas em elementos FB indicam que estes podem excisar-se a si prprios do genoma, provocando rearranjos cromossmicos com elevada frequncia. Os elementos P variam em tamanho de 0.5 a 2.9 Kb (os elementos mais pequenos derivam de deleces parciais num elemento P completo), tendo sempre uma sequncia repetida invertida perfeita com 31 bp nas suas extremidades. Na regio central dos elementos P 1.58

podem existir at 3 open reading frames, sugerindo que os elementos completos codificam para trs protenas. Uma propriedade surpreendente dos elementos P que se uma fmea sem elementos P for cruzada com um macho com P+, a progenia apresenta mutagnese por insero de elementos P (isto os elementos P apresentam-se activos). Em contraponto, se a fmea for P+ e o macho P-, a progenia no apresenta mutagnese por insero os elementos P. O modelo correntemente aceite para explicar as propriedades dos elementos P baseia-se na existncia no interior do elemento de uma transposase e de produtos repressores dos elementos P. Se a fmea possuir elementos P, ento o vulo possui protenas repressoras dos elementos P, pelo que no ocorre transposio. Se no entanto a fmea no possuir estes elementos, os elementos P do macho vo estar activos, inserindo-se no genoma, do que resulta mutagnese por inactivao de genes. Os provrus (DNA de cadeia dupla inserida no genoma do hospedeiro) dos retrovrus podem ser considerados elementos de transposio j que podem efectivamente transportar-se de um lugar para outro no genoma da clula alvo. Com efeito, o genoma dos retrovrus tem algumas semelhanas com os elementos de transposio habituais. Em particular possuem um LTR (long terminal repeat ) em cada extremidade semelhantes aos observados nos elementos Ty1 da drosofila.

1.59

A insero dos retrovrus, tal como a dos elementos de transposio resulta na duplicao da zona de DNA onde se inserem. Uma outra forma de descrever esta similaridade entre os retrovrus e os elementos de transposio como os Ty1 e os copia-like a de dizer que estes apresentam sequncias que indicam serem reminiscncias de retrovrus. Esta forma de ver o problema recebeu suporte experimental de experincias efectuadas por Jef Boeke and Gerald Fink, demonstrando a existncia de um intermedirio de RNA na insero destas sequncias. Os elementos de transposio que utilizam este

Figura 1.39 Os retrotransposons e os retrovrus possuem semelhanas na forma de se integrar no genoma celular. intermedirio de RNA (ex. Ty1 e copia-like) so denominados retrotransposons, e so frequentes entre os eucariotas, sendo geralmente divididos em duas classes: Os retrotransposons virais (como os Ty1 e os copia-like) e os retrotransposons no virais (os mais 1.60

frequentes entre os mamferos). Exemplos de retrotransposons no virais entre os mamferos so os LINES (Long interspersed elements; 1-5Kb) e os SINES (short interspersed elements; ex. as sequncias alu).
1.1.2.5 Mecanismos de reparao do DNA

As clulas eucariticas desenvolveram uma srie de mecanismos integrados de reparao de danos no DNA, os quais podem ser essencialmente de trs tipos: mecanismos excisativos, no excisativos e mecanismos ps replicativos.
1.1.2.5.1 Mecanismos no excisativos

Evitar erros antes de surgirem: alguns sistemas enzimticos neutralizam compostos potencialmente perigosos antes de poderem reagir com o DNA. Um bom exemplo o mecanismo de eliminao de radicais superxido, catalizado pela superxido dismutase e pela catalase (2 HO H2 O2 ; 2 H2 O2 H2 O + O 2 ). Um outro exemplo o do sistema catalizado pela protena do gene muT, o qual previne a incorporao do 8-oxodT no DNA hidrolizando o trifosfato de 8-oxodT em monofosfato. Reverso directa do dano : A forma mais directa de reverter uma leso efectuar o seu processo inverso, restaurando assim a sequncia alterada. No entanto, a reverso directa nem sempre

Figura 1.40 Esquema de aco da fotoliase que por aco da luz reverte a formao dos anis de ciclobutano pirimidinico formados por aco da luz ultravioleta. 1.61

Figura 1.41 dmero de ciclobutano pirimidinico formado por aco da luz ultravioleta. possvel, j que algumas reaces so no essencial irreversveis. Um dos casos em que a reverso possvel o da fotodimerizao por luz UV. O fotodmero de ciclobutano pirimidinico pode ser reparado por uma fotoliase (foi encontrada em eucariotas inferiores e bactrias, mas no em humanos). Esta enzima liga-se ao dmero, catalisando a sua ciso em monmeros, na presena de luz visvel de certos comprimentos de onda. Um outro mecanismo de reverso directa catalisado pelas alquiltransferases. Estas enzimas removem certos grupos alquilo adicionados s guaninas na posio O-6, por certos agentes qumicos. Note-se no entanto que este um processo enzimtico 1.62

em que as alquiltransferases ficam inactivadas, do que pode resultar uma saturao deste mecanismo em situaes de grande alquilao do DNA.
1.1.2.5.2 Mecanismos excisativos

Mecanismo de reparao geral por exciso: Tambm denominado nucleotide excision repair, envolve a quebra da ligao fosfodiester de ambos os lados da leso, mas apenas na cadeia nucleotdica lesada. A sequncia interrompida da resultante reparada por uma polimerase e uma ligase, tendo como padro a cadeia nucleotdica complementar. Este mecanismo no Homem bastante complexo, envolvendo Figura 1.42 Mecanismo geral de pelo menos 17 protenas reparao por exciso. Mecanismo de reparao ligado transcrio: A transcrio e reparao esto tambm ligadas, o que o demonstra o envolvimento de TFIIH (um factor de transcrio) na reparao, bem como o facto de nos eucariotas e nos procariotas, a cadeia transcrita , nos genes activos, preferencialmente reparada, em desfavor da cadeia complementar. 1.63

Mecanismo excisativo especfico: Algumas leses provocam danos geomtricamente mais subtis, pelo que a sua deteco mais difcil (no causam grandes distores no DNA). Para estes casos, as clulas desenvolveram mecanismos especficos de deteco e reparao dos danos: Reparao de DNA Glicosilase (base excision repair): As DNA glicosilase no clivam as pontes fosfodiester, mas antes as ligaes N-glicosilicas (base-pentose), gerando um nucletido apurnico ou apirimidinico (locais AP). Esta leso posteriormente reparada pelo mecanismo de reparao endonucleolitica AP (ver abaixo). Existem numerosas glicosilases, como por exemplo Uracil-DNA glicosilase, a hipoxantina glicosilase (a hipoxantina o resultado de uma desaminao da adenina), 3-metiladenina glicosilase, 3metilguanina glicosilase, a 7 metilguanina glicosilase, etc. Reparao endonucleolitica endonucleases que atacam os locais purnicos e pirimidnicos (AP endonucleases). A aco destas enzimas vital j que como vimos a despurinao espontnea muito elevada. Estas enzimas produzem quebras das ligaes fosfodiester junto ao nucletido apurnico. A este corte endonucleoltico segue-se um corte exonucleoltico, o preenchimento do vazio pela polimerase, e finalmente o de AP: Todas as clulas tm

Figura 1.43 Mecanismo de reparao endonucleolitica de locais apurnicos

1.64

restabelecimento de continuidade pela ligase.

O sistema GO: Para prevenir leses mediadas pela 8-oxodG, duas glicosilases codificadas pelos genes mut M e mut Y trabalham em conjunto com o produto do gene mut T j referido. Quando surge um dano oxidativo produz leses tipo GO, a glicosilase codificada pela mut T remove a leso. No entanto, por vezes as leses passam despercebidas, emparelhando com adenina. Neste caso, o produto do gene mut Y remove a adenina levando sua substituio pela citosina correcta por reparao de sntese, a que se segue a remoo do produto GO pelo produto mut M.
Mecanismos ps-replicativos

1.1.2.5.3

Alguns mecanismos de reparao so capazes de reconhecer os erros no DNA, mesmo aps ou durante a sua replicao: Reparao de Mismatches: Este mecanismo detecta a existncia de bases mal emparelhadas (mismatches) durante a replicao. Este processo envolve trs passos essenciais: 1) a deteco da existncia de um par de bases mal emparelhado; 2) o reconhecimento de que a base mal incorporada tem que ser a que existe na cadeia a ser sintetizada; 3) excisar a base incorrecta e reparar o corte. Assim, o passo critico o reconhecimento da cadeia sintetizada de novo, o que conseguido recorrendo ao atraso na metilao relativamente sntese de DNA. Assim, a cadeia de DNA no metilada reconhecida como sendo a que deve ser processada. Reparao por recombinao: O gene recA envolvido no bypass

Figura 1.44 Reparao por recombinao 1.65

SOS est tambm envolvido na reparao por recombinao. Neste mecanismo, o sistema de replicao pra junto a um dano, continuando depois Figura 1.45 Mecanismo de reparao da leso, deixando SOS. este mecanismo apesar de permitir uma quebra de a continuao da replicao, ao alguns nucletidos introduzir aleatoriamente nucletidos, na cadeia sintetizada pode produzir mutaes. de novo. Neste mecanismo de reparao, o DNA da zona de quebra cortado da outra molcula de DNA homloga, sendo esta depois reparada por sntese normal. Assim, este mecanismo de reparao difere do SOS, j que neste so adicionados nucletidos de forma aleatria na zona de quebra (efectivamente criando mutaes), enquanto na reparao por recombinao no so efectuadas nenhumas alteraes ao programa gentico da clula. 1.2 O ciclo celular 1.2.1 Diviso celular e anomalias genticas De acordo com a sua actividade reprodutora, a clula pode encontra-se em interfase (a fase entre duas divises celulares), ou em fase M (a fase em que se encontra em mitose). A maior parte do ciclo celular passa-se portanto em interfase. Durante perodos especficos da interfase a clula integra estmulos e toma decises centrais para a entrada na fase de mitose. De acordo com a actividade especfica que se efectua, a 1.66

interfase subdivide-se em fases, com actividades e papeis especficos na diviso celular, e que culminam na mitose: Fase G1 (de GAP 1; 6 a 12 horas). No h qualquer sntese de cidos nucleicos, mas uma intensa actividade de sntese proteica prepara a Figura 1.46 Fases do ciclo celular maquinaria necessria s fases subsequentes. A deciso de avanar para a duplicao do DNA ocorre durante a fase G1 (ponto de restrio). Fase S(6 a 8 horas). Inicia-se com a replicao do DNA, e continua at que todo o DNA se encontra duplicado (contedo em DNA 4n). Fase G2 (de GAP 2; 3 a 4 horas). Decorre entre o fim da fase S e o incio da mitose, durante o qual a clula organiza os seus 2 conjuntos completos de cromossomas diplides. No final desta fase ocorre a deciso de avanar para a mitose Durante a mitose (1 hora), um conjunto diplide de cromossomas segregado para cada ncleo. Apenas nesta fase, os cromossomas so observveis como entidades discretas, sendo a organizao celular destruda, e organizado o fuso acromtico entre os dois futuros ncleos. Toda a actividade sinttica pra durante a mitose.

1.67

Fase G0. Uma fase especfica de clulas maduras, que pararam a diviso celular. No entanto alguns tipos de clulas, podem ser estimulados a deixar a fase G0 e entrar em G1.

1.2.2 Ciclinas e CDK Durante todo o ciclo celular, existem pontos de deciso, os quais verificam se a clula se encontra j preparada para proceder para a fase seguinte. Alguns dos mais importantes so: O DNA j se encontra todo duplicado, e apenas duplicado? Existem erros na duplicao do DNA? A massa celular est j duplicada? Estes checkpoints existem sob a forma de factores activadores e inibidores. Destes, alguns encontramse j identificados enquanto que a existncia de outros se encontra apenas deduzida do comportamento observado em fuses de clulas em fases diferentes do ciclo celular. Nomeadamente o factor que determina a deciso de passar o ponto de restrio totalmente desconhecido, enquanto que o factor que determina a entrada na fase S se encontra identificado como sendo uma protena cinase, relacionada com a cinase que inicia a mitose. Esta ltima (MPF M phase promoting Factor ou M phase Kinase), a primeira a ser identificada a mais bem estudada, um dmero composto por duas subunidades: uma a subunidade cataltica (p34) activada no inicio da fase S, a outra (p45) uma ciclina (acumula-se por sntese contnua durante a interfase), sendo destruda durante a mitose, o que responsvel pela inactivao da cinase da fase M, o que sinaliza a sada da mitose. O estudo cristalogrfico do dmero de MPF revelou que a ligao da ciclina provoca uma alterao conformacional na p34, a qual essencial para a formao do centro cataltico. Uma MPF tem apenas um tipo de p34, mas pode conter uma de vrios tipos de ciclinas. Basicamente dois tipos de ciclinas pouco relacionadas(A e B) podem fazer parte da MPF. A similaridade entre estas duas ciclinas centra-se 1.68

numa estrutura com cerca de 150 aminocidos chamada a cyclin box. Em mamferos existem ainda dois tipos de ciclinas B (B1 e B2). A p34 encontra-se em nveis constantes ao longo de todo o ciclo celular, e como a sntese de ciclina constante ao longo de toda a fase G1, a sua presena no constitui o sinal de activao da MPF. Na realidade, o dmero acumula-se numa forma inactiva, sendo a modificao da p34 que constitui o evento activador do dmero. A activao da p34 efectuada por fosforilao/desfosforilao, j que para esta se encontrar activa necessria a presena de grupos fosfatos em alguns resduos e a sua ausncia noutros. Como a actividade cinase da MPF auto-cataltica, basta a activao de uma pequena poro, para que rapidamente toda a MPF disponvel seja activada. Como a MPF no uma fosfatase, e necessrio actividade de cinase e fosfatase para a activao da MPF, esta deve activar directamente a fosfatase que a activa, criando um circulo auto-cataltico completo. O evento inactivador constitudo pela destruio proteoltica da ciclina, a qual ocorre durante a fase M. Na realidade, o controlo da diviso celular constitudo por uma intricada rede de reaces de cinase e fosfatase, que desencadeiam a activao/inactivao de uma srie de factores, permitindo o desencadear temporalmente organizado das vrias fases do ciclo celular. Toda esta srie de reaces culminam na activao da MPF com a concomitante entrada na fase M. Dois modelos gerais podem explicar a actividade da MPF: 1) Pode ser um regulador central que fosforila protenas alvo que por sua vez actuam para regular outras actividades, i.e., pode tratar-se de uma reaco clssica em cascata; 2)pode ser um regulador central, que activa ele prprio uma serie de substractos cruciais indispensveis para realizar trabalhos regulatrios ou reorganizacionais envolvidos no ciclo celular. Os substratos da MPF tm em comum uma estrutura proteica constituda por Ser-Pro flanqueada por resduos bsicos (habitualmente 1.69

na forma Ser-Pro-X-Lys). Substratos potenciais incluem a histona H1 (possivelmente necessria para condensar os cromossomas), lamininas (possivelmente necessrias para desorganizar o envelope nuclear), nucleolina (possivelmente envolvida na paragem da actividade ribossomal), bem como outras protenas estruturais e enzimticas. Dos modelos acima propostos, o mais provvel que a MPF actue directamente em todos (ou na maioria) destes substractos. A protena p34 foi pela primeira vez identificada no Xenopus, que pela dimenso do seu ovo (1mm de dimetro) constitui um bom modelo para purificar protenas envolvidas no ciclo celular. Posteriormente descobriu-se que o homlogo na levedura eram protenas baptizadas como cdc2 (S.Pombe) e CDC28 (S.Cerevisae). Dado o grande paralelo entre as protenas de levedura e de mamferos, o homlogo animal habitualmente designado por cdc2 ( o nome do exemplo mais bem caracterizado em levedura). Em todas as espcies, a protena que emparelha com a cdc2/p34 para formar o dmero activo uma ciclina, muito embora o nvel de homologia entre espcies nas ciclinas seja bem menor que na subunidade cataltica (p34). Na levedura o cdc2 um regulador central quer da deciso de prosseguir de G1 para S quer de prosseguir de G2 para M. Em cada fase, cdc2 tem um par diferente no dmero: na mitose cdc2 emparelha com cdc13 formando uma cinase da fase M semelhante ao p34-ciclina B das clulas animais. Durante a fase G1, a forma activa de cdc2 tem um par diferente chamado cig2, e igualmente semelhante a ciclina-B. Note-se que as 2 formas de dmeros cdc2 podem coexistir na levedura, mas so diferentemente reguladas. Assim, a fase do ciclo celular pode tambm ser definida consoante o tipo de dmero activo em cada momento. O produto de cdc25 necessrio para desfosforilar a cdc2 do dmero cdc2/cdc13. Apesar de no possuir um domnio clssico de fosfatase, a cdc25 efectivamente uma fosfatase, que possivelmente tem como seu 1.70

alvo a tyr-15 da cdc2. Assim provavelmente responsvel pela desfosforilao que constitui o evento chave na activao da M phase cinase. Como mutantes de cdc25 no param a mitose se a duplicao de DNA no tiver sido conseguida, esta fosfatase importante para assegurar que a fase S se completa antes de se iniciar a fase M. Mutantes do gene wee1 permitem que a fase M se inicie sem que o crescimento necessrio tenha ocorrido. Assim, este gene normalmente impede o incio da fase M, se a massa celular crtica no tiver sido atingida. Wee1 codifica para uma cinase pouco usual. Pode fosforilar em serina/treoninas e tirosinas. Inibe cdc2 por fosforilao em tyr-15. Um outro gene mik1 tem efeito semelhante. Este controlo da cdc2 na transio G2/M parece ter sido preservado ao longo da evoluo, j que genes homlogos so encontrados

Figura 1.47 via de activao da MPF por fosforilao da Y15 e T161 de Cdc2 respectivamente mediada pela Wee1 e CAK, e pela aco da Cdc25 1.71

em vrios tipos de leveduras, em anfbios e em mamferos. A activao da transio G1/S requer activao da cdc2/cig2 (em S. Pombe), mas tambm a inactivao da cdc2/cdc13 indispensvel. Com efeito, mutantes de cdc13 no s no entram em fase M, como prosseguem por vrios ciclos da fase S, sugerindo que a cdc2/cdc13 um inibidor da fase S. Assim, activao de cdc2/cd13 durante a fase G2 impede a continuao da fase S, e estimula o incio da fase M. A destruio da cd13 no fim da fase M pra a fase M e permite um novo ciclo de fase S antes de se iniciar nova diviso. O funcionamento deste ciclo depende, provavelmente de cdc18. Esta protena activada aps a passagem do ponto START, sendo necessria para entrar na fase S. Para cdc18 ser activa necessrio que cdc2/cdc13 esteja inactiva. A

Figura 1.48 Interveno das vrias ciclinas em diferentes fases do ciclo celular.

1.72

activao deste dmero na fase M inactiva a cdc18, impedindo novo ciclo de sntese de DNA. A actividade de cdc2/cdc13 dependente do factor rum1. Sem este factor, as clulas entram em mitose prematuramente. Assim, rum1 deve ser um inibidor de cdc2/cdc13 (M phase kinase) expresso entre G1 e G2 mantendo a M phase kinase inactiva ( o que particularmente importante em G1 antes da fosforilao em tyr-15), e reprimindo o nvel de cdc13. Desta imagem, dois conceitos gerais emergem para o controlo da diviso celular: 1) a presena de loops de feedback de controlo e; 2) a presena de duplicidade de efeitos, em que um factor activa a fase seguinte e reprime a anterior. A passagem do ponto START est tambm dependente de cdc2. No entanto, a ciclina que se associa a cdc2 diferente quando a cinase controla o ponto start e a transio G2M. Os mecanismos envolvidos na regulao do ciclo celular em leveduras e em animais so semelhantes, ainda que o nmero de subunidades presentes em animais seja maior, havendo subunidades especificas para o controlo das transies G1/S e G2/M. A comparao das subunidades envolvidas nos diferentes seres estudados esto descritas na tabela 1.4. Como se pode ver, nos animais, a cinase dependente de ciclinas que regula a transio G2/M nica, semelhana do que se passa com as leveduras. No entanto, existem vrias ciclinas que com ela podem interactuar. O mesmo no se passa na transio G1/S, a qual regulada por vrias cinases e vrias ciclinas.

1.73

Tabela 1.4

- comparao das subunidades envolvidas nas vrias transies do


ciclo celular em diferentes organismos Transio G1/S G2/M subunidade subunidade subunidade subunidade cataltica reguladora cataltica reguladora cdc2 cig 1,2 cdc2 cdc13 cdc28 CLN1-3 cdc28 CLB1-4 cdk2(p33), ciclinas A, D1, p34(cdc2) ciclinas A, B1, cdk4 D2, D3, E B2

S.Pombe S.cerevisae Mamferos

Cdk = cyclin dependent kinases

Uma outra diferena tem a ver com as ciclinas C e E, as quais acumulam durante a fase G1 como as restantes, mas no so destrudas na fase M. Assim, como vimos, nos animais existem essencialmente 2 tipos de cinases : a cdk2 e a cdc2, respectivamente responsveis pela transio G1/S e G2/M. Ainda que se trate de componentes diferentes, as estruturas regulatrias conhecidas so similares em ambas, pelo que se deduz que so similarmente regulados. Assim, a sntese de ciclinas na fase G1, vai progressivamente aumentando a sua concentrao, at que se chega a um ponto em que se inicia a formao de dmeros. No entanto estes no so ainda activos, sendo necessrias reaces de fosforilao nos resduos 15 e 161. A primeira fosforilao ocorre por aco da Wee1 cinase, enquanto a segunda catalisada pela CAK (cdc2-activating kinase). O dmero activo promove ento a entrada em mitose, activando concomitantemente por fosforilao a fosfatase cdc25. Esta por sua vez promove a remoo do grupo fosfato na tirosina 15 da cdc2, inactivando-a. A ciclina por sua vez alvo de degradao proteoltica, resultando apenas a cdc2 fosforilada na thr161, terminando assim a mitose. No foram identificadas cinases que 1.74

actuem separadamente em thr-14, em alguns casos a mesma enzima actua na thr-14 e tyr-15. A mitose ocorre como um processo temporal controlado. A mitose, como vimos, iniciada pela activao da MPK. O progresso da mitose requer a degradao de ciclinas e outras protenas. Por exemplo a separao dos cromossomas na anafase requer a actividade proteoltica, mas no directamente de ciclinas. Existem pelo menos 3 alvos proteolticos: o primeiro evento a degradao da ciclina A na metafase, seguindo-se a degradao de 2 alvos na anafase. Uma protena desconhecida tem que ser degradada para a separao das cromatdeas irms e a degradao de ciclina B necessria para a inactivao da MPK. No final da mitose as fosforilaes efectuadas pela MPK tm que ser revertidas. A sntese de ciclinas D activada pela aco de factores de crescimento. Estas ciclinas tm uma semi-vida muito curta, o que permite clula responder a factores externos e sua remoo. Estas ciclinas esto provavelmente envolvidas na reentrada na diviso celular de clulas em G0. O produto do gene de supresso tumoral RB (gene do retinoblastoma) um substracto dos complexos cdk-ciclinas D, e exerce o seu efeito durante a fase G1 que precede o ponto de restrio. O produto deste gene, na ausncia de fosforilao liga-se ao regulador gentico E2F, actuando como supressor de alguns genes, bloqueando a transio G1/S. Quando por aco de cdk4,6-ciclina D1,2,3 fosforilado, liberta a E2F, a qual passa a actuar como um activador gentico, promovendo a entrada na fase S. RB o alvo de vrias vias que inibem o crescimento celular, pelo que pode ser uma forma importante de vrios sinais manterem a clula em G1 ou G0. Alguns destes sinais (incluindo o TGF) actuam atravs de inibidores de cinases cdk (chamadas ckis). Exemplos de ckis so a p15/p16 (ink4), p21(c1p1/wAF1) e p27(kip1). A importncia das ciks realada pelo facto de p16 ser tambm um 1.75

gene de supresso tumural, o que indica que a p16 e possivelmente todas as outras ckis so necessrias para parar o crescimento celular. Na verdade, parece que a via das ciks at RB uma via ventral para o bloqueio do crescimento celular, j que so conhecidos genes de supresso tumoral em todos os seus passos. 1.2.3 Apoptose Durante a vida de um organismo m ulticelular, algumas clulas morrem num processo natural designado por Apoptose ou morte celular programada. Nos vertebrados, os exemplos mais visveis de apoptose ocorrem no sistema imune e no sistema nervoso. O processo de morte caracterstico, envolvendo compactao celular, fragmentao membranar, condensao da cromatina e fragmentao do DNA. Este processo activo, dependendo do RNA e da sntese proteica. So conhecidas vrias formas de activar a apoptose. Estas envolvem insultos moleculares (retirada de factores de crescimento, tratamento com glucocorticoides, irradiao ), bem como estmulos especficos como os produzidos pelas clulas T citotxicas ou activao de p53. Assim, a apoptose importante na embriognese e conteno do crescimento tecidual, bem como na resposta imune e na conteno de cancro. Foram j descritas vrias mutaes recessivas associadas com o estmulo ou o bloqueio da apoptose. Alguns exemplos so: 1) a lpr no ratinho (esta mutao leva a deficincia em faz) que causa a proliferao excessiva levando a autoimunidade; 2) a gld (generalized lymphoproliferative disease) cuja mutao ocorre no gene que codifica para o receptor de fas. A protena faz um receptor membranar relacionado com o receptor para o TNF. Tanto o faz como o TNF so capazes de estimular a apoptose. Ao nvel da poro transmembranar destes receptores existe uma sequncia de 80 aminocidos essencial para o envio do sinal apopttico, pelo que designado por domnio da 1.76

morte. Pouco se sabe sobre o mecanismo de sinalizao do receptor faz ou TNF para o interior da clula. Contudo, foram identificadas algumas protenas que interagem com o domnio da morte, as quais curiosamente tambm os possuem. Pensa-se assim que este domnio seja importante para promover a dimerizao destas protenas. Outros compostos importantes na via da apoptose so a famlia de proteases designada por ICE. O prottipo destas proteases a IL2-converting enzyme: uma protease de cistena que por protelise converte o percursor da IL2 na sua forma activa. O processo de apoptose desencadeado pelas ICE inibido por crmA e pelo bcl-2. Uma outra via appttica desencadeada pelos linfcitos Tc, os quais matam as clulas alvo libertando na sua superfcie grnulos contendo proteases de serina e outras protenas lticas como a perforina, abrindo buracos na superfcie das clulas alvo. As proteases de serina dos grnulos so chamadas granzimas, e na presena de perforina induzem morte por apoptose nas clulas alvo. O bcl-2 inibe a apoptose. Foi originalmente descrito como um protooncogene activado em linfomas por translocao causando a sua hiper-expresso. O bcl-2 tem uma sequncia de ancoragem membranar na zona c-terminal, tendo sido encontrado nas membranas externas de mitocndria, ncleo e retculo-endoplasmtico. Um outro gene semelhante ao bcl-2 nos mamferos o gene Bax. O produto do gene Bax pode dimerizar com bcl-2. O dmero bcl-2, bem como o dmero Bax bloqueiam a apoptose, mas o heterodmero (bcl-2/Bax) no o faz. Assim, a susceptibilidade de uma clula apoptose proporcional proporo bcl-2/Bax.

1.77

1.3 Actividade Celular 1.3.1 Componentes dos sistemas de sinalizao Todos os sistemas de comunicao intercelular tm vrios componentes. Tipicamente, uma molcula denominada ligando libertada pela clula sinalizadora. Alguns ligandos so protenas, enquanto outros so pequenas molculas como pptidos, esterides ou vitamina D. O ligando liga-se ao receptor, habitualmente uma protena, na membrana celular ou no interior da clula alvo. Alguns tipos de complexo ligando-receptor so capazes de alterar a expresso gentica

Figura 1.49 Os sinais podem ser recebidos na membrana celular por um receptor o qual envia o sinal para o interior da clula. Em alguns casos a molcula sinalizadora ela prpria enviada para o citoplasma, enquanto noutros casos o receptor que interage com componentes intracelulares para assegurar a passagem do sinal.

1.78

directamente, enquanto outros necessitam de enviar sinais atravs de uma cadeia de transduo, levando o sinal da membrana celular at ao ncleo (fig.1.49). Alguns ligandos, chamados hormonas viajam a grandes distncias na circulao sangunea, antes de interactuarem com a sua clula alvo. Estas molculas podem actuar como sinais mestres para a actividade de rgos diferentes, os quais podem assim responder de forma coordenada. Outros ligandos no actuam distncia, mas apenas nas clulas vizinhas das que os produziram. 1.3.2 Regulao da sinalizao por modulao da conformao proteica Interaces de pequenas molculas com as protenas receptoras podem provocar intensas alteraes conformacionais nestas. Por exemplo, alteraes conformacionais esto na origem da regulao mediada por algumas protenas cinases. A alterao da conformao coloca ou no amino-cidos em posies favorveis fosforilao. Este mecanismo extremamente eficiente, no s porque permite a rpida activao dos sinais, mas tambm porque permite revert-los rpida e facilmente, reciclando os componentes de sinalizao. 1.3.3 A Superfamilia dos receptores das hormonas esterides Um grupo diverso de ligandos, incluindo vrias hormonas esterides, bem como outras pequenas molculas como a hormona tiride e a vitamina D, devido sua estrutura no polar, so capazes de atravessar a membrana citoplasmtica, actuando directamente no interior da clula alvo. Os receptores para estes ligandos chamam-se globalmente a superfamilia dos receptores esterides, e esto estrutural e funcionalmente relacionados. A ligao destes ligandos ao seu receptor, causa uma alterao conformacional, a qual provoca a sua libertao de uma protena sequestradora. Nestas condies, o 1.79

complexo receptorligando desloca-se para o ncleo, onde em conjunto com outros reguladores da transcrio vo activar ou reprimir directamente a expresso gnica, ao ligar-se a sequncias reguladoras chamadas HRE (hormone response elements).

Figura 1.50 As hormonas esterides no possuem um receptor membranar, mas um receptor citoplasmtico, j que so capazes de atravessar livremente a membrana plasmtica.

1.3.4 Receptores transmembranares; vias de transduo de sinal A maior parte dos ligandos so molculas demasiado volumosas e/ou com carga, para poderem atravessar a membrana citoplasmtica. Assim, os seus receptores so habitualmente protenas de membrana, as quais medeiam a passagem de um sinal para o interior da clula. Os receptores transmembranares so assim compostos por 3 domnios principais: o extracelular, que se liga ao ligando; o transmembranar, que pode atravessar uma ou mais vezes a membrana; e o citoplasmtico, que medeia a transmisso do sinal. Muitos ligandos so dmeros, podendo assim ligar a mais do que um receptor. Desta forma, os ligandos colocam a poro citoplasmtica de dois receptores fisicamente prximos, activando a via de sinalizao destes receptores (Fig. 1.51). Alguns destes receptores so cinases, tendo por isso a habilidade de fosforilar certos resduos em protenas 1.80

Figura 1.51 Muitos receptores so dimerizados pelos seus ligandos, o que activa a zona citoplasmtica, a qual pode a) ligar-se a protenas cinases ou b) autofosforilar-se activando a sua capacidade de fosforilar substractos citoplasmticos alvo, enquanto outros so serinas/treoninas cinases, e outros no tm qualquer actividade enzimtica. Um dos mais bem conhecidos exemplos de receptores deste tipo so os receptores tirosina cinase, nomeadamente os receptores para os factores de crescimento. Estes receptores, aps ligao do ligando 1.81

Figura 1.52 Com frequncia a propagao do sinal no interior da clula envolve a utilizao de mensageiros secundrios como a) cAMP ou b) protenas G dimerizam, originando a sua auto-fosforilao (fig. 1.51). Esta por sua vez activa a actividade de cinase, que vai fosforilar outras protenas, iniciando uma cascata transdutora do sinal em que a fosforilao causa conformao proteica com consequente activao/inactivao proteica. Eventualmente a cascata de activao leva fosforilao de factores de 1.82

transcrio, com consequente alterao do estado de activao de um ou mais genes. Mas a auto-fosforilao no causa apenas a fosforilao de protenas alvo. Tambm a ligao a protenas adaptadoras estimulada pela autofosforilao. Interaces entre o complexo e outras molculas causam a propagao do sinal. (fig. 1.51) Com frequncia a propagao deste sinal envolve protenas G (fig. 1.52). As protenas G so protenas cuja vida um ciclo entre a forma ligada a GDP (o estado inactivo) e a forma ligada a GTP (o estado activo); um exemplo particularmente importante de uma protena G a ras, a qual como veremos est envolvida na carcinognese. A propagao do sinal das RTK leva activao de uma protena que se liga a protenas-G inactivas, alterando a sua conformao, levando-a a ligar-se ao GTP. A protena G assim activada liga-se ento a uma protena cinase citoplasmtica, alterando a sua conformao, activando-a, o que a leva a fosforilar outras protenas, incluindo protenas cinases e factores de transcrio.

1.83

Figura 1.53 Sumrio dos vrios tipos de receptores e vias de transduo de sinal. 1.84

1.85