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BIOLOGIA MOLECULAR

REGULAÇÃO GÊNICA
BACTERIANA

PROFA. MARIANA ESPOSITO

Regulação gênica
 A estrutura e o funcionamento de uma
célula são determinados pelas proteínas que
ela contém.
 Como as proteínas representam a expressão
da atividade gênica, pode-se concluir que as
células se diferenciam no tempo e no espaço
em decorrência da atividade diferencial dos
genes.
 Os estudos visando a compreensão da
expressão e da regulação gênicas foram
feitos inicialmente em bactérias e
bacteriófagos.
Regulação gênica
Procariotos:
 Resposta direta a variações nas condições
nutricionais (genes ativados e reprimidos)
 Transcrição pode ser acoplada com a tradução
(simultânea)

Eucariotos multicelulares:
 Limitação na resposta direta às variações nas
condições nutricionais (células estão organizadas
em tecidos e órgãos)
 Transcrição ocorre em compartimento distinto da
tradução eliminando a possibilidade de
acoplamento
 Regulação gênica

Regulação negativa Regulação negativa

(Repressor ligado inibe a transcrição) (Repressor ligado inibe a transcrição)

Sinal molecular
Sinal molecular
Causa ligação da
Causa dissociação
proteína reguladora
da proteína
com o DNA
reguladora com o
DNA
 Regulação gênica

Regulação positiva Regulação positiva

(Ativador ligado facilita a transcrição) (Ativador ligado facilita a transcrição)

Sinal molecular
Sinal molecular
Causa ligação da
Causa dissociação proteína
da proteína reguladora com o
reguladora com o DNA
DNA
 Sistema Operon
 Mutações em genes estruturais alteram a
atividade enzimática, enquanto que mutações
em genes reguladores alteram a resposta da
célula bacteriana às modificações do ambiente.
 Compreensão de como ocorre a regulação da
expressão gênica.
 Por meio de experimentos de conjugação,
transdução e transformação, foi possível fazer
transferência de genes em E. coli e estudar os
efeitos de mutações em genes estruturais e em
genes reguladores.
 Descoberta de uma nova unidade de
funcionamento genética, a unidade operacional,
ou operon.
 O operon é definido como um conjunto de genes
estruturais organizados em sequência e sob o
controle de um único promotor.
 Sistema Operon
 A polimerase do RNA
transcreve, a partir do
promotor comum, todos os
genes estruturais em uma única
molécula de RNA
policistrônico, a qual é
traduzida nas proteínas
codificadas pelos genes.

 Jacob e Monod em 1961 - o

sistema Lac de E. coli, o qual
envolve três enzimas
indutíveis que atuam no
metabolismo da lactose.
Sistema Operon
 Quando E. coli é
cultivada em meio de
cultura isento de
glicose e contendo um
indutor, ou seja,
lactose ou algum β-
galactosídeo
semelhante, a
concentração
intracelular das três
proteínas aumenta
dramaticamente.
 Sistema Operon
 Essas enzimas são uma β-galactosidase, que
quebra a lactose em glicose e galactose, uma
permease, que aumenta a absorção de lactose
pela célula, e uma transacetilase, cuja função
parece ser a de transferir um grupo acetil,
proveniente da acetil-coenzima A, para os β-
galactosídeos.
 Foi demonstrado que cada uma dessas enzimas é
codificada por um gene específico e que a ordem
desses três genes no cromossomo bacteriano é:
gene Z, gene Y e gene A.
 Repressor do operon Lac
 A constituição das bactérias selvagens é:
Z+Y+A+ e, a partir delas, foram selecionados
mutantes para cada um desses genes.
 Esses mutantes se caracterizavam pelo fato
de não produzir a forma ativa da enzima
codificada por cada um, quando cultivados
em meio com indutor.
 Uma descoberta muito importante foi a de
certos mutantes que eram selvagens quanto
aos três genes estruturais (Z+Y+A+), mas
haviam perdido a capacidade de regulá-los,
ou seja, eles produziam as três enzimas
mesmo na ausência de indutor.
 Esses mutantes foram chamados de
constitutivos, em contraste com as
bactérias selvagens, chamadas de
indutivas.
 Repressor do operon Lac
 Classe de mutantes constitutivos possuía
alterações em um gene não muito distante
dos genes estruturais, o qual foi denominado
gene I, de indutibilidade.
 O genótipo de uma bactéria normal é
representado por I+ e o desses mutantes
constitutivos, por I−.
 gene operador
 A outra classe de mutantes constitutivos
do sistema Lac se caracterizava pelo fato
de terem o alelo selvagem do gene I, ou
seja, eram I+, e produzirem as três
enzimas mesmo na ausência de indutor.
 Esses mutantes foram denominados Oc
(de operador constitutivo), pois o gene
em questão foi denominado gene O (de
operador).
 O comportamento desses mutantes nos
testes de complementação mostraram
que o sítio O é o local onde se liga o
repressor produzido pelo gene I.
 gene operador
 Havia dois tipos de mutação que resultavam na
produção constitutiva das três enzimas do sistema
Lac: as mutações do gene regulador (I) e as
mutações do gene operador (O).
 As mutações do gene O agiam em cis, ou seja,
afetavam apenas os genes localizados na mesma
molécula de DNA, enquanto que as mutações do
gene I agiam em trans, ou seja, afetavam tanto
os genes situados na mesma molécula de DNA
quanto em outra molécula de DNA presente na
mesma célula.
 Mas havia uma entidade genética formada por
O, Z e Y. Esta unidade genética cuja expressão é
coordenada por O pode ser vista como
hierarquicamente superior às unidades de
complementação tomadas individualmente.
 Jacob e Monod deram a ela o nome de unidade
operacional ou operon.
gene operador
 A interpretação de Jacob e Monod foi que uma unidade
funcional, ou cistron, corresponderia à sequência de DNA
traduzida em uma única cadeia polipeptídica, enquanto a
unidade operacional, ou operon, corresponderia à sequência
de DNA transcrita em uma única molécula de uma suposta
molécula intermediária entre o DNA e a proteína.
 Jacob e Monod imaginaram que o hipotético intermediário
seria um RNA e sugeriram chamá-lo de RNAm.
 Cistron seria a unidade de tradução e operon, a
unidade de transcrição.
 Na época em que eles propuseram essa hipótese, o RNAm
ainda não havia sido descoberto.
 Na verdade, tanto a ideia da existência de um produto
intermediário entre o DNA e a proteína, quanto o nome de
mensageiro para essa hipotética entidade foram concebidos
por Jacob e Monod. Por esse trabalho eles ganharam o
prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia.
 Operon lac
 Jacob e Monod propuseram em 1961 que a
molécula repressora codificada pelo gene lacI
regula a transcrição do segmento de DNA que
codifica para as três enzimas envolvidas no
metabolismo da lactose.
 Eles também sugeriram que um intermediário,
uma molécula de RNAm contendo a informação
do DNA determinava a síntese das enzimas pela
maquinaria de síntese de proteínas da célula.
 Eles propuseram ainda que a função do repressor
era regular a síntese desse RNAm.
 Operon lac
 Verificou-se também que O (operador),
na realidade, não é um gene. Ele é um
sítio de ligação da molécula repressora, o
qual é formado por cerca de 25-30 pares
de bases do DNA ao redor do sítio de
iniciação da transcrição do gene da β-
galactosidase (Z).
 A molécula repressora proposta por
Jacob e Monod foi purificada e a
sequência completa de seus 360
aminoácidos foi determinada.
 Os mutantes I− não produzem a proteína
repressora ou sintetizam um
polipeptídeo incapaz de se ligar ao sítio
O.
Operon lac
 O sítio operador O sobrepõe-se parcialmente ao promotor do operon,
de modo que a presença da proteína repressora ligada a O funciona
como barreira à iniciação da síntese do RNAm pela RNA polimerase.
 Existem evidências de que a polimerase do RNA se liga à região
promotora mesmo na presença do repressor, mas ela não consegue
iniciar a síntese do RNAm.
 Assim, o repressor impede a iniciação da transcrição e não a ligação
da polimerase do RNA.
 Essas alterações no DNA no sítio O impedem a ligação da proteína
repressora e levam à síntese constitutiva das enzimas do operon Lac.
 Refinamentos na Regulação Gênica
em bactérias
Repressão Catabólica em E.
coli
 A glicose é o açúcar mais utilizado pela
bactéria E. coli, ela entra no metabolismo
celular sem necessidade de indução de
qualquer nova enzima.
 As enzimas que participam do metabolismo
da glicose são produzidas constitutivamente
e utilizadas também nas vias de degradação
de outros tipos de açúcares.
 As bactérias desenvolveram no curso de sua
evolução um mecanismo de regulação
gênica que lhes permite se beneficiar do fato
de terem de produzir as enzimas do
metabolismo da glicose constitutivamente;
nenhuma outra enzima relacionada com o
metabolismo de açúcares é induzida no caso
de glicose estar presente no meio.
 Refinamentos na Regulação Gênica
em bactérias
Repressão Catabólica em E.
coli
 A glicose, ou produtos de sua degradação
(catabólitos), impede a síntese de RNAm
para enzimas metabolizadoras de outros
açúcares. Esse fenômeno é conhecido
como repressão catabólica.
Refinamentos na Regulação Gênica
em bactérias
O papel do cAMP
 O mecanismo de repressão catabólica começou a ser
desvendado quando se descobriu que bactérias cultivadas
em meio isento de glicose apresentavam um aumento
acentuado na síntese de um nucleotídeo não usual, a
adenosina-3’, 5’-monofosfato, conhecido também
como cAMP ou cAMP.
 O aumento do nível de cAMP na bactéria parece ser um
sinal de “alerta” de um estresse metabólico.
 A adição de cAMP ao meio de cultura das bactérias anula
a repressão catabólica.
 Por exemplo, uma bactéria cultivada em meio contendo
glicose e lactose simultaneamente não produz as enzimas
relacionadas com o metabolismo da lactose em função da
repressão catabólica.
 No entanto, se a esse meio for adicionado cAMP, o operon
Lac entra em atividade. O mesmo acontece em relação às
enzimas indutíveis de diversos açúcares.
 proteína CAP
 Foram encontrados mutantes de E. coli, incapazes de utilizar lactose,
galactose, maltose ou arabinose. Esses mutantes, no entanto,
readquiriam a capacidade de utilizar qualquer desses açúcares com
uma segunda mutação. Esse fato mostrava que a primeira mutação
estava restrita a um único gene responsável pela capacidade do
mutante de utilizar diversos tipos de açúcares.
 Foi verificado que cerca de metade desses mutantes podia utilizar
açúcares diferentes da glicose se cAMP fosse adicionado ao meio de
cultura. O defeito desses mutantes era, portanto, decorrente de uma
incapacidade de produzir cAMP. Eles apresentam erros no gene que
codifica uma enzima chamada adenilciclase, a qual catalisa a reação
de conversão de ATP em cAMP.
 A outra metade dos mutantes não conseguia metabolizar açúcares
diferentes da glicose mesmo na presença de cAMP; na verdade, esses
mutantes tinham o gene da adenilciclase intacto e conseguiam produzir
cAMP normalmente. Essa observação sugeria que esse segundo grupo
de mutantes apresentava defeito em uma proteína mediadora do
efeito do cAMP.
 Essa proteína foi denominada CAP (do inglês, catabolite activator
protein).
 proteína CAP
 O operon Lac, assim como outros operons
relacionados com o metabolismo de açúcares, está
sujeito, portanto, a um controle duplo: a
proteína repressora atua negativamente
sobre a transcrição do operon, enquanto o
complexo CAP-cAMP atua positivamente,
fornecendo as condições básicas para a
transcrição.
 O complexo CAP-cAMP liga-se ao promotor Lac e
dobra o DNA dessa região, o que permite que ele
seja reconhecido pela polimerase do RNA.
 Na ausência de cAMP ou da proteína CAP, a
transcrição não ocorre porque a polimerase do RNA
não reconhece o promotor Lac.
 Quando o complexo CAP-cAMP está presente, o
promotor é reconhecido pela polimerase do RNA,
que se liga a ele, mas a transcrição só ocorrerá se
não houver proteína repressora ligada ao sítio
operador, pois ela impede o deslocamento da
polimerase.
 A proteína CAP é, portanto, um ativador e o
cAMP um efetor.
 proteína CAP
 A proteína CAP é necessária para a transcrição de outros operons relacionados com o
metabolismo de açúcares, ou seja, os promotores desses operons só são reconhecidos pela
polimerase do RNA quando ligados ao complexo CAP-cAMP.
 Assim, na presença de glicose, esses operons não são transcritos, mesmo quando seus
indutores estão presentes, pois a polimerase do RNA não reconhece seus promotores.
 Já na ausência de glicose, todos eles se tornam acessíveis à polimerase de RNA e a
transcrição só dependerá da presença do indutor específico no meio.
 Controle da Expressão do Operon
gal
 Quando a bactéria E. coli é colocada em um meio apenas com o
açúcar galactose, ocorre aumento da síntese das três enzimas
relacionadas com o metabolismo da galactose: uma epimerase (E),
uma transferase (T) e uma quinase (K).
 As três enzimas são produzidas constitutivamente pela célula, mas na
condição induzida sua síntese é 10 a 15 vezes maior.
 Na presença de glicose, ou seja, sob repressão catabólica, a síntese das
três enzimas relacionadas ao metabolismo da galactose volta a seu
nível basal, ou seja, ela é 10 a 15 vezes menor do que no estado
induzido.
 Assim, existe um nível basal de síntese dessas enzimas que é
independente da fonte de carbono que está sendo utilizada pela
célula. Isso poderia ser considerado um desperdício, pois, em princípio,
as enzimas não teriam função em uma bactéria vivendo em um
meio onde a fonte de carbono não fosse a galactose.
 Benefícios fisiológicos - a epimerase, é responsável pela produção de
um precursor direto da biossíntese da parede bacteriana; assim, essa
enzima é necessária à célula independentemente da fonte de
carbono que está sendo utilizada.
 Controle da Expressão do Operon
gal
 O mecanismo de regulação do operon Gal é um paradigma
para outros sistemas complexos de regulação da atividade
gênica.
 O operon Gal possui dois promotores parcialmente
sobrepostos (PG1 e PG2) e dois sítios separados para
iniciação da transcrição.
 O promotor PG2 se liga à polimerase do RNA, permitindo a
transcrição dos genes gal, mesmo quando glicose está
presente e galactose ausente; ele é responsável pela síntese
constitutiva das três enzimas.
 O promotor PG1 só se liga à polimerase do RNA na presença
do complexo CAP-cAMP; assim, esse promotor só tem
capacidade de iniciar transcrição quando não existe glicose
no meio.
 O complexo CAP-cAMP inibe a ligação da polimerase do
RNA ao promotor PG2. Já o promotor PG1 complexado com
CAP-cAMP tem afinidade pela polimerase do RNA.
 A síntese de mRNA gal é maior quando PG1 é usado (ou
seja, na condição induzida) do que quando PG2 é usado.
 Atenuação e Controle do Operon
trp
 Utilizado para se adaptar às condições ambientais
e poupar ao máximo o desperdício de energia.
 O operon Trp codifica as proteínas necessárias à
síntese do aminoácido triptofano.
 Regulação negativa e a proteína repressora só é
ativa em associação com um correpressor que é o
próprio triptofano.
 Quando existe triptofano disponível, a transcrição
do operon é interrompida; na ausência de
triptofano, a proteína repressora é incapaz de se
ligar ao operador e a transcrição ocorre.
 A regulação do operon Trp é suplementada e
refinada por um segundo mecanismo
independente, que determina se a transcrição do
operon, uma vez iniciada, deve ser interrompida
ou deve ser continuada. Esse mecanismo é
chamado atenuação.
 Atenuação e
Controle do
Operon trp
 Entre o promotor e o primeiro gene
estrutural (trpE) do operon Trp, existe uma
sequência de 162 pares de nucleotídeos
denominada região líder.
 Nessa sequência existe um conjunto de 45
pares de nucleotídeos que codificam um
peptídeo de 14 aminoácidos, denominado
peptídeo líder.
 O RNAm transcrito a partir da região líder
contém, próximo do final da região de
codificação do peptídeo líder, dois códons
consecutivos que especificam o aminoácido
triptofano. Além disso, a região líder contém
quatro segmentos ricos em GC.
 Os códons que especificam triptofano e essas
quatro sequências ricas em GC participam
do processo de atenuação.
 O mecanismo
de atenuação
 As quatro sequências ricas em GC da região líder
do RNAm podem se emparelhar e formar uma ou
duas estruturas secundárias alternativas.
 A primeira configuração secundária possível
envolve a formação de duas alças no RNAm; uma
pelo emparelhamento das sequências 1 e 2, e
outra pelo emparelhamento das sequências 3 e 4.
 A alça 1-2 é uma estrutura típica de pausa de
transcrição.
 A alça 3-4 é seguida de uma série de Us sendo,
portanto, um sinal de término de transcrição
independente de fator rho. Esse sinal de término
de transcrição é incomum, pois está localizado
antes do primeiro gene do operon Trp.
 A segunda configuração secundária possível
envolve a formação de uma única alça no RNAm,
pelo emparelhamento das sequências 2 e 3. Essa
alça só se forma no caso da sequência 1 não estar
disponível para se emparelhar com a 2.
 O mecanismo
de atenuação
 Durante a transcrição da região líder, a polimerase do
RNA sofre uma pausa quando a alça 1-2 é formada.
 Enquanto a polimerase está parada, um ribossomo
inicia a tradução do RNAm codificador do peptídeo
líder. Essa região de codificação começa pouco antes
da alça 1-2.
 Na presença de triptofanil-RNAt,o ribossomo e a
polimerase do RNA se movem praticamente na
mesma velocidade.
 À medida que o ribossomo traduz a sequência 1, ele
desfaz a alça 1-2 e permite que a polimerase continue
e transcreva a sequência 3.
 Quando o ribossomo encontra o códon de terminação
(pare) do peptídeo líder, presente dentro da porção 1,
ele se desacopla do RNAm e a alça 1-2 se refaz.
 A polimerase do RNA continua a transcrever a
sequência 4, que forma então uma alça com a
sequência 3.
 A formação dessa alça é um sinal de parada de
transcrição e faz com que a polimerase se dissocie do
DNA molde antes que os genes estruturais do operon
Trp sejam transcritos.
 O mecanismo
de atenuação
 Quando existe pouco triptofano na célula, o ribossomo e a
polimerase do RNA não se movem em sincronia. O
ribossomo para quando atinge os dois códons que
especificam triptofano na sequência 1 do RNAm, pois há
relativamente pouco triptofanil-RNAt na célula. Nessa
circunstância, a polimerase do RNA, que havia sido
liberada do sítio de pausa pela ruptura da alça 1-2 pelo
ribossomo, transcreve as sequências 3 e 4.
 Enquanto o ribossomo está parado, esperando pela
chegada de um triptofanil-RNAt, e a sequência 1 está
recoberta por ele, parte da sequência 2 forma uma alça
com a sequência 3.
 Uma vez que a alça 2-3 é mais estável do que a alça 3-4, a
sequência 3 não se emparelhará com a 4 para formar a
alça de término de transcrição.
 Assim, a polimerase do RNA passa pelo sítio potencial de
término de transcrição e o restante do operon Trp é
transcrito.
 O mecanismo de atenuação
 A atenuação parece ser um mecanismo de
regulação recente na história evolutiva e é
encontrado apenas em bactérias entéricas como a
E. coli (atenuação não ocorre em eucariontes pois
nesses organismos os processos de transcrição e
tradução são separados pela existência da
membrana nuclear).
 O mecanismo de atenuação regula diversos
operons em E. coli, como os operons Phe,Thr, His,
Leu e Ile. Alguns operons, como o Trp, combinam
atenuação com repressão, enquanto que outros,
como o His, são regulados apenas por atenuação.
 Material de apoio
 Texto 8: REGULAÇÃO GÊNICA EM BACTÉRIA
 Apostila organizada pelos docentes do Instituto de Biociências da USP que ministraram e ministram
as disciplinas “Biologia Molecular e de Microrganismos”,“Biologia Molecular” e “Fundamentos de
Biologia Molecular” para os cursos de Bacharelado e Licenciatura em Ciências Biológicas.
 CAP 19, 20, 21 e 22
Biologia Molecular: Princípios e Técnicas / Molecular Biology: Principles and Techniques. /Cox, Michael
M; Doudna, Jennifer A; O'Donnell, Michael. - Porto Alegre; Artmed; 2012. 914 p.
 Cap 7
Biologia molecular da célula [recurso eletrônico] / Bruce Alberts ... [et al.] ; tradução: [Ardala Elisa
Breda Andrade ... et al.] ; revisão técnica: Ardala Elisa Breda Andrade, Cristiano Valim Bizarro, Gaby
Renard. – 6. ed. – Porto Alegre : Artmed, 2017.

Animações:
http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/lacoperon/intro.html

Imagens:
Biologia Molecular: Princípios e Técnicas.
Apostila Biologia Molecular-USP
Google imagens.