Universidade Federal de So Carlos Centro de Cincias Exatas e de Tecnologia Departamento de Qumica Programa de Ps-Graduao em Qumica

Busca de produtos naturais bioativos em plantas das famlias Myrtaceae (Siphoneugena densiflora Berg) e Verbenaceae (Vitex polygama Cham.)

Margareth Borges Coutinho Gallo *

Tese apresentada ao Departamento de Qumica da Universidade Federal de So Carlos como requisito parcial obteno do ttulo de DOUTOR EM CINCIAS, rea de concentrao QUMICA ORGNICA. Orientador: Prof. Dr. Paulo Cezar Vieira *Bolsista CAPES/CNPQ So Carlos SP 2004

Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitria/UFSCar

Gallo, Margareth Borges Coutinho. Busca de produtos naturais bioativos em plantas das famlias Myrtaceae (Siphoneugena densiflora Berg) e Verbenaceae (Vitex polygama Cham.) / Margareth Borges Coutinho Gallo. -- So Carlos : UFSCar, 2005. 419 p. Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de So Carlos, 2004. 1. Produtos naturais. 2. Atta sexdens rubropilosa. 3. Trypanosoma cruzi. 4. GAPDH. 5. APRT. I. Ttulo. CDD: 547.3 (20 )
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G172bp

ii

iii

Ao meu amado Senhor, Salvador e Criador de todas as coisas.

Ao meu querido esposinho Jorge, aos meus filhos Iuri e Ir, a minha mezinha Terezinha e a todos os meus familiares.

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Ainda que eu fale as lnguas dos homens e dos anjos, se no tiver amor, serei como o bronze que soa ou como o cmbalo que retine. Ainda que eu tenha o dom de profetizar e conhea todos os mistrios e toda a cincia; ainda que eu tenha tamanha f, a ponto de transportar montes, se no tiver amor, nada serei. E ainda que eu distribua todos os meus bens entre os pobres e ainda que entregue o meu prprio corpo para ser queimado, se no tiver amor, nada disso me aproveitar. O amor paciente, benigno; o amor no arde em cimes, no se ufana, no se ensoberbece, no se conduz inconvenientemente, no procura seus interesses, no se exaspera, no se ressente do mal; no se alegra com a injustia, mas regozija-se com a verdade; tudo sofre, tudo cr, tudo espera, tudo suporta. O amor jamais acaba; mas, havendo profecias, desaparecero; havendo lnguas, cessaro; havendo cincia, passar... Agora, pois, permanecem a f, a esperana e o amor, estes trs; porm o maior destes o amor. Extrado da Bblia, livro de I Corntios, captulo 13, versculos de 1-13.

Viver, como talvez morrer, recriar-se: a vida no est a apenas para ser suportada nem vivida, mas elaborada. Eventualmente reprogramada. Conscientemente executada. Muitas vezes, ousada. Para viver de verdade, pensando e repensando a existncia, para que ela valha a pena, preciso ser amado; e amar; e amar-se. Ter esperana; qualquer esperana. Questionar o que nos imposto, sem rebeldias insensatas mas sem demasiada sensatez. Saborear o bom, mas aqui e ali enfrentar o ruim. Suportar sem submeter-se, aceitar sem se humilhar, entregar-se sem renunciar a si mesmo e possvel dignidade. Sonhar, porque se desistimos disso, apaga-se a ltima claridade e nada mais valer a pena. Escapar, na liberdade do pensamento, desse esprito de manada que trabalha obstinadamente para nos enquadrar, seja l no que for. E que o mnimo que a gente faa seja, a cada momento, o melhor que afinal se conseguiu fazer . Extrado do livro Pensar Transgredir, da autora gacha Lya Luft.

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Agradecimentos
Ao meu orientador, Paulo Cezar Vieira, que acreditou em mim e disse sim, quando oito professores anteriores haviam me dito no. Aos professores Arlene Gonalves Corra, Joo Batista Fernandes, Antnio Gilberto Ferreira, Maria Ftima das Graas F. da Silva, rsula Brocksom Edson Rodrigues Filho, Quezia B. Cass e demais professores pelas inmeras horas concedidas ao esclarecimento de dvidas e ao grande carinho dedicado a mim. amiga ngela Valente pela companhia e troca de idias durante todos estes anos. Aos amigos Clverson Garcia, Patrcia Baraldi, Tatiana Gamboa, Waldirene Rocha, Waldir Tavares, Fernando Cotinguiba e Flvio Beltrame pelas vrias contribuies sem as quais este trabalho no seria o mesmo. Aos colegas do PN, RMN, Inorgnica, Sntese e demais laboratrios do DQ pela prestatividade, companherismo, pelos piqueniques e cafs da manh, pelas festas juninas e de aniversrios, churrascos, congressos e tantas outras confraternizaes que nos uniram como uma grande famlia. s secretrias da ps-graduao Ariane, Cristina e Luciana pela alegria e disponibilidade na prestao de servios. Aos tcnicos Dora, Luciana e Paulo pela ateno, apoio e servios prestados. Eurides Alves Matheus, minha senhoria e segunda me em So Carlos.

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s colegas de penso Fernanda, Luciana, Flvia, Poliana, Karina, Rafaela, Mari, Ftima, Viviane e Samira pela amizade e to profundas e enriquecedoras conversas. Aos professores, colegas e tcnicos do Laboratrio de Bioensaios do DQ/UFSCar; do Laboratrio de Cristalografia do Instituto de Fsica da USP/So Carlos; do Laboratrio de Plantas Inseticidas do Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrcola da ESALQ/USP Piracicaba; do Departamento de Cincias da Sade da Faculdade de Cincias Farmacuticas da USP/Ribeiro Preto e do Centro de Estudos de Insetos Sociais da UNESP/Rio Claro por possibilitarem a realizao de todos os bioensaios. Aos professores Marcos Sobral (UFRGS/UFMG) e Ftima Regina Salimena-Pires (UFJF) pela identificao taxonmica das espcies vegetais. A ALCOA, na pessoa de seus funcionrios Reinaldo dos Santos, Benedito Joaquim da Silva e Charles G. Ferreira, por facilitar o acesso coleta das plantas.

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Abreviaturas e Smbolos
AcOEt Ace APTR CCDA CCDP CCV CGCC CG-EM CLAE CLV - Acetato de etila - Acetona - Enzima adenina fosforribosiltransferase - Cromatografia em camada delgada analtica - Cromatografia em camada delgada preparativa - Cromatografia em coluna de vidro - Cromatografia de gotas em contra-corrente - Cromatgrafo a gs acoplado ao espectrmetro de massas - Cromatografia lquida de alta eficincia - Cromatografia lquida a vcuo

CRLCC - Cromatografia de rotao locular em contra-corrente COSY-45- Correlation Spectroscopy d dd Dic DMSO DOSY dt ED50 EM/IE EM/ESI F.E. F.M. GAPDH H HAc HMBC HSCCC HSQC - Dubleto - Dubleto duplo - Diclorometano - Dimetilsulfxido - Diffusion Ordered Spectroscopy - Dubleto triplo - Concentrao que produz 50 % da dose efetiva - Espectroscopia de massas com ionizao por impacto eletrnico - Espectroscopia de massas com ionizao por eletrospray - Fase estacionria - Fase mvel inicial - Enzima gliceraldedo-3-fosfato-desidrogenase - Altura da slica ou outra fase estacionria usada no interior da coluna - cido actico - Heteronuclear Multiple Bonding Correlation - Cromatografia de alta velocidade centrfuga em contra-corrente - Heteronuclear Single Quantum Correlation
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DEPT135- Distortionless Enhancement by Polarization Transfer, com pulso de 135o

Hx CI50 IV IR J LD50 m m/z MeOH n-BuOH

- Hexano - Concentrao correspondente a 50 % de inibio - Infra-vermelho - ndice de refrao - Constante de acoplamento (dada em Hertz) - Concentrao correspondente a 50 % do efeito de letalidade - Multipleto - Relao massa/carga - Metanol - n-butanol

NOEDIFF - Nuclear Overhauser Difference Spectroscopy PENDANT- Polarization Enhancement During Attached Nucleus Testing ppm PRPP QSAR RDA
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- Partes por milho - Fosforribosilpirofosfato - Anlise quantitativa da relao estrutura-atividade - Reao Retro-Diels/Alder

RMN H - Ressonncia magntica nuclear de hidrognio RMN 13C - Ressonncia magntica nuclear de carbono-13 RMN 2D - Ressonncia magntica nuclear de duas dimenses RPM s t T.C. tl U.R. UV - Rotao por minuto - Singleto - Tripleto - Tamanho da coluna - Tripleto largo - Umidade Relativa - Ultravioleta - Dimetro da coluna - Deslocamento qumico em partes por milho - Comprimento de ondas

TSPA-d4 - Sal de sdio do cido trimetilsililpropinico deuterado

Lista de Tabelas
Tabela 1-1- Substncias isoladas anteriormente de V. polygama..................................................................... 12 Tabela 4-1- Extratos brutos de V. polygama ...................................................................................................... 52 Tabela 4-2- Resultados da partio lquido/lquido do extrato hidrometanlico de frutos ................................. 54 Tabela 4-3- Resultados da partio lquido/lquido do extrato hexnico de folhas ........................................... 54 Tabela 4-4- Resultados da partio lquido/lquido do extrato hidrometanlico de folhas ................................ 55 Tabela 4-5- Resultados da partio lquido-lquido do extrato metanlico de galhos ....................................... 56 Tabela 4-6- Resultados da partio lquido-lquido do extrato metanlico de folhas ....................................... 56 Tabela 5-1- Dados dos espectros de absoro ultra-violeta das Substncias VI e IX ...................................... 71 Tabela 5-2- Dados dos espectros de massas, ESI modo negativo, das Substncias I a IX ............................. 71 Tabela 5-3- Dados dos espectros de RMN H das Substncias I a IX ............................................................ 72 Tabela 5-4- Dados do espectro de RMN de C (400 MHz, acetona-d6) da Substncia III e da 3-O-metil luteolina ....................................................................................................................................................... 76 Tabela 5-5- Dados dos espectros de RMN H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia IX e da 3-Ometilquercetina ............................................................................................................................................ 83 Tabela 5-6- Dados do espectro de RMN de H (J em Hz, 400 MHz, acetona-d6) das Substncias XI e XII ... 86 Tabela 5-7- Dados dos espectros de RMN C (100 MHz, CD3OD) das Substncias XIII e XIV, schaftosdeo e isoschaftosdeo ........................................................................................................................................... 90
13 1 1 13 1 a

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Tabela 5-8- Dados das projees dos C dos espectros de RMN Hx C HMBC e HSQC (400 MHz, CD3OD) das Substncias XV + XVI e carlinosdeo e isocarlinosdeo ...................................................................... 98 Tabela 5-9- Dados do espectro de RMN H da mistura das Substncias III e VIII e das Substncias XVII e a XVIII em vrios solventes deuterados .................................................................................................... 110 Tabela 5-10- Dados do espectro de RMN de C (100 MHz, DMSO-d6) da mistura das Substncias III e VIII e das Substncias XVII e XVIII, da 3'-O-metil luteolina (1), 3-O--D-glucopiranosilquercetina (2) e 4'-O--Dglucopiranosilquercetina (3) ...................................................................................................................... 111 Tabela 5-11- Dados do espectro de RMN H /HMBC da mistura das Substncias III e VIII e das Substncias XVII e XVIII................................................................................................................................................ 112 Tabela 5-12- Dados do espectro de RMN de C (100 MHz, acetona-d6) da mistura das Substncias XIX, XX e XXI e do cido vanlico........................................................................................................................... 119 Tabela 5-13- Dados dos espectros de RMN de H, de RMN C, Correlaes homonuclear ( H - H) e 1 13 heteronuclear ( H- C) da mistura das Substncias XXIV e XXV ............................................................ 127 Tabela 5-14- Dados do espectro de RMN de C das Substncias XXVII (50 MHz, C5D5N) e XLVIII (50 MHz, CDCl3); do 3-O--D-glucopiranosilsitosterol (TANDOM et al., 1990) e do sitosterol ( FURUYA et al., 1987) .................................................................................................................................................................. 136 Tabela 5-15- Dados do espectro de RMN de C/PENDANT da Substncia XXVIII (50 MHz, CDCl3) e do ster metlico do cido 2,3diidroxiolean-12-en-28-ico ............................................................................... 140 Tabela 5-16- Dados do espectro de RMN de C/PENDANT (50 MHz, C5D5N) da mistura das Substncias XXX e XXXI e do 2,3-diidroxi-urs-12-en-28-ato de metila e maslinato de metila................................. 145 Tabela 5-17- Dados do espectro de RMN de C/PENDANT (50 MHz, C5D5N) da mistura das Substncias XXVIII e XXIX e do 2,3diidroxiurs-12-en-28-ato de metila ................................................................. 150 Tabela 5-18- Dados do espectro de RMN de C/DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXII e do 2,3,19-triidroxiurs-12-enato de -D-glucopiranosila ........................................................................... 154 Tabela 5-19- Dados do espectro de RMN de C/PENDANT (50 MHz, C5D5N) da mistura das Substncias 13 XXXIII e XXXIV e do RMN de C dos cidos urslico e oleanlico......................................................... 160 Tabela 5-20- Dados do espectro de RMN de C e DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXV e da 20hidroxiecdisona ......................................................................................................................................... 166 Tabela 5-21- Dados do espectro de RMN de H (200 MHz, C5D5N, J em Hz) da Substncia XXXV e da 20hidroxiecdisona ......................................................................................................................................... 167 Tabela 5-22- Dados do espectro de RMN de C e DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVI e da polipodina B .............................................................................................................................................. 173 Tabela 5-23- Dados do espectro de RMN de H (200 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVII e da stachysterona B ................................................................................................................................................................ 177 Tabela 5-24- Dados do espectro de C e DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVII e da 20hidroxiecdisona ......................................................................................................................................... 178 Tabela 5-25- Dados do espectro de RMN de C e DEPT135 (50 MHz, C5D5N) e de RMN H (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVIII e da shidasterona ................................................................................... 183 Tabela 6-1- Extratos brutos de S. densiflora .................................................................................................... 190 xii
13 1 13 1 13 1 13 13 13 13 13 13 13 1 13 1 1 13 1 13 1

13

Tabela 6-2- Resultados da partio lquido/lquido do extrato metanlico do caule ....................................... 191 Tabela 6-3- Resultados da partio lquido/lquido do extrato metanlico da casca da raiz........................... 194 Tabela 6-4- Resultado da partio lquido/lquido do extrato metanlico de folhas ........................................ 198 Tabela 7-1- Dados do espectro de RMN de C (50 MHz, CD3OD) da Substncia XL e da 3-O--Lramnopiranosilquercetina.......................................................................................................................... 205 Tabela 7-2- Dados do espectro de RMN de H (400 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias XLI e XLII e de 1 13 RMN de H (600 MHz, CD3OD) e C (150 MHz, CD3OD) dos grupos -L-arabinopiranosila e -Da xilopiranosila ........................................................................................................................................... 211 Tabela 7-3- Dados do espectro de RMN de C (50 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias XLI e XLII e da 3-O--D-xilopiranosilquercetina e 3-O--D-arabinopiranosilquercetina ................................................... 212 Tabela 7-4- Dados dos espectros de RMN de H, C, DEPT135 (400 e 50 MHz, C5D5N) da Substncia XLIII (P), do cido 2,3,6-triidroxiolean-12-en-28-ico (Q) e 2,3,19-triidroxiolean-12-en-24-ico-28-oato de -D-glucopiranosila (R) ........................................................................................................................ 217 Tabela 7-5- Dados dos espectros de RMN de C e DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia XLIV e do cido arjunlico ......................................................................................................................................... 224 Tabela 7-6- Dados do espectro de RMN C (50 MHz, CDCl3) da mistura das Substncias XLV, XLVI e XLVII; do lupeol, -amirina e -amirina .............................................................................................................. 230 Tabela 7-7- Dados de deslocamentos de RMN C, H e J para o pirrol, furano e respectivos 2-carboxaldedos a ................................................................................................................................................................. 244 13 1 1 13 Tabela 7-8- Dados dos espectros de RMN de C (50 MHz, CDCl3), H (400 MHz, acetona-d6) e Hx C HMBC (400 MHz, acetona-d6) da Substncia LV ..................................................................................... 247 Tabela 7-9- Dados dos espectros de RMN C e DEPT135 (50 MHz) das Substncias LVI e LVII e da casuarinina e stachyurina ......................................................................................................................... 252 Tabela 7-10- Dados dos espectros de RMN H (400 MHz, em ppm e J em Hertz) das Substncias LVI e LVII e da casuarinina e stachyurina.......................................................................................................... 253 Tabela 7-11- Dados dos espectros de RMN Hx C HMBC (400 MHz, CD3OD) e HSQC (400 MHz, acetonad6/D2O) da mistura das Substncias LVI e LVII........................................................................................ 258 Tabela 7-12- Dados dos espectros de RMN H e RMN Hx C HMBC (400 MHz, CD3OD) das Substncias LVIII e LXVIII e da castalagina e vescalagina........................................................................................... 269 Tabela 7-13- Dados dos espectros de RMN
13 1 1 13 1 13 1 13 13 1 13 13 1 13 13 1 13

C e H (50 e 400 MHz) da Substncia LVIII ........................... 270

1

Tabela 7-14- Dados do espectro de RMN de H (400 MHz, CD3OD, J em Hz) da Substncia LX, do eschweilenol C e do 3-O--L-ramnopiranosdeo do cido elgico ......................................................... 276 Tabela 7-15- Dados do espectro de RMN de C (100 MHz, D2O) da Substncia LX, do eschweilenol C e do 3-O--L-ramnopiranosdeo do cido 3-O-metilelgico............................................................................. 277 Tabela 7-16- Dados do espectro de RMN de Hx C HMBC (400 MHz, CD3OD, J em Hz) da Substncia LX, do eschweilenol C e do 3-O--L-ramnopiranosdeo do cido elgico .................................................... 278
1 13 13

xiii

Tabela 7-17- Dados dos espectros de RMN de H (400 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias LX, LXI, LXII e LXIII, da Substncia LX pura e dos 3-O--L-2; 3 e 4-O-acetilramnopiranosdeos do cido 3-Ometilelgico ............................................................................................................................................... 283 Tabela 7-18- Dados dos espectros de RMN de C (100 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias LX, LXI, LXII e LXIII e dos 3-O--L-2; 3 e 4-O-acetilramnopiranosdeos do cido 3-O-metilelgico ............... 284 Tabela 7-19- Dados dos espectros de RMN H e C (400 e 100 MHz, acetona-d6) da Substncia LXIV; do eschweilenol B (M; 400 e 100 MHz, DMSO-d6) e penta-O-metil-eschweilenol B (Q; CD3COD).............. 291 Tabela 7-20- Dados do espectro de RMN Hx C HMBC (400 MHz, acetona-d6) da Substncia LXIV.......... 292 Tabela 7-21- Dados dos espectros de RMN C e H (50 e 200 MHz, acetona-d6) da Substncia LXV e da a pedunculagina ......................................................................................................................................... 300 Tabela 7-22- Dados dos espectros de RMN C, DEPT135, H, NOEDIFF, Hx C HSQC e HMBC (50 e 400 MHz, piridina-d5) da mistura das Substncias LXVI e LXVII .................................................................... 306 Tabela 7-23- Dados dos espectros de RMN C da Substncia LXVII (50 MHz, piridina-d5), do cido -Dglucopiranurnico e da -lactona do cido -D-glucofuranurnico .......................................................... 307 Tabela 8-1- Condies empregadas na CLAE para anlise qualitativa dos padres benzamida, acetofenona e benzofenona na coluna analtica recm empacotada .............................................................................. 323 Tabela 8-2- Condies empregadas na CLAE para anlise quantitativa da 20E presente no extrato metanlico de galhos de V. polygama ...................................................................................................... 324 Tabela 8-3- Condies empregadas na CLAE para anlise qualitativa da 20E presente na soluo metanlica originada do pr-tratamento do extrato metanlico de galhos de V. polygama em cartucho C-18 ......... 325 Tabela 8-4- Dados da preciso e exatido da quantificao da 20-hidroxiecdisona, inter-dia (n = 5)............ 333 Tabela 9-1- Atividade inibitria enzimtica de substncias originadas da frao DMF de V. polygama sobre a GAPDH (controle positivo, chalepina CI50 = 64 M) e APRT ................................................................... 361 Tabela 9-2- Atividade inibitria enzimtica de substncias originadas da frao DMF e do extrato MVG de V. polygama sobre a GAPDH (controle positivo, chalepina CI50 = 64 M) e APRT ..................................... 362 Tabela 9-3- Atividade inibitria enzimtica de substncias originadas da frao BHMVF de V. polygama sobre a GAPDH (controle positivo, chalepina CI50 = 64 M) e APRT ................................................................ 365 Tabela 9-4- Atividade inibitria enzimtica de substncias isoladas de S. densiflora sobre a GAPDH (controle positivo, chalepina CI50 = 64 M) e APRT ................................................................................................ 369 Tabela 9-5- Atividade dos extratos (4 mg/mL) de V. polygama sobre o T. cruzi ............................................. 380 Tabela 9-6- Atividade das fraes (4 mg/mL) de V. polygama sobre o T. cruzi .............................................. 381 Tabela 9-7- Atividade de substncias isoladas de V. polygama sobre T. cruzi (controle positivo violeta genciana, CI50 = 31 g/mL ou 76 M)....................................................................................................... 382 Tabela 9-8- Atividade de substncias isoladas de S. densiflora sobre T. cruzi (controle positivo violeta genciana, IC50 = 31 g/mL ou 76 M)....................................................................................................... 383 Tabela 9-9- Atividade de extratos (4 mg/mL) de S. densiflora sobre T. cruzi .................................................. 384 Tabela 9-10- Atividade de substncias de S. densiflora e V. polygama sobre o crescimento do fungo L. gongylophorus ........................................................................................................................................... 385 xiv
13 13 1 1 13 13 1 1 13 1 13 13

Tabela 9-11- Dimetro dos halos (mm) de inibio dos microrganismos em presena dos extratos hidrometanlicos de S. densiflora ............................................................................................................. 387 Tabela 9-12- Determinao da MIC (g/mL) dos extratos hidrometanlicos de S. densiflora sobre alguns microrganismos......................................................................................................................................... 388 Tabela 9-13- Atividade de extratos e substncias de S. densiflora e V. polygama sobre a enzima pectinase .................................................................................................................................................................. 391 Tabela 9-14- Atividade dos taninos sobre as enzimas GAPDH (controle positivo, chalepina CI50 = 64 M) e APRT......................................................................................................................................................... 392

Lista de Figuras
Figura 1-1- Todas as novas entidades qumicas organizadas por fonte/ano desde 1981 a 2002 (NEWMAN et al., 2003) ......................................................................................................................... 3 Figura 1-2 - Vitex polygama Cham. ........................................................................................................... 10 Figura 1-3- Desenho de Vitex polygama Cham. (desenho de Suzana G. Leito) ..................................... 11 Figura 1-4- Siphoneugena densiflora var. densiflora. ................................................................................. 14 Figura 1-5- Estruturas qumicas de compostos utilizados no tratamento qumico e profilaxia da Doena de Chagas............................................................................................................................................ 18 Figura 1-6- Produtos naturais com atividade tripanocida ........................................................................... 21 Figura1-7- Estrutura tridimensional da enzima gGAPDH (SOUZA et al., 1998) ........................................ 24 Figura 1-8- Estruturas qumicas dos compostos empregados no tratamento de Leishmanases ............. 30 Figura 1-9- Produtos naturais com atividade leishmanicida ....................................................................... 34 Figura 1-10- Produtos naturais com atividade inseticida............................................................................ 40 Figura 4-1- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias VI e VIII .................. 61 xv

Figura 5-1- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia I.................................................... 73 Figura 5-2- Espectro de RMN de H (200 MHz, acetona-d6), da Substncia I........................................... 73 Figura 5-3- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia II e VI em mistura ........................ 74 Figura 5-4- Espectro de RMN de H (200 MHz, acetona-d6) da Substncia II........................................... 74 Figura 5-5- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia III.................................................. 75 Figura 5-6- Espectro de RMN de NOEDIFF (400 MHz, acetona-d6, irradiao OMe em 4,00) da Substncia III ....................................................................................................................................... 75 Figura 5-7- Espectro de RMN de
13 1 1 1

C (100 MHz, acetona-d6) da Substncia III ........................................ 77

Figura 5-8- Espectro de RMN de H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia III.......................................... 78 Figura 5-9- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia V .................................................. 79 Figura 5-10- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia VI ............................................... 79 Figura 5-11- Espectro de RMN de H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia VI ....................................... 80 Figura 5-12- Espectro de RMN de NOEDIFF (400 MHz, acetona-d6, irradiao da OMe em 4,00) da Substncia VI....................................................................................................................................... 80 Figura 5-13- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia VII .............................................. 81 Figura 5-14- Espectro de RMN de H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia VII ...................................... 81 Figura 5-15- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia VIII ............................................. 82 Figura 5-16- Espectro de RMN de H (200 MHz, acetona-d6) da Substncia VIII ..................................... 82 Figura 5-17- Espectro de RMN de H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia IX ....................................... 83 Figura 5-19- Espectro de massas (ESI, modo negativo) das Substncias XI e XII ................................... 86 Figura 5-20- Espectro de RMN de H (400 MHz, acetona-d6) das Substncias XI e XII ........................... 87 Figura 5-21- Espectro de massas (ESI, modo negativo) das Substncias XIII e XIV ................................ 91 Figura 5-22- Espectro de massas (ESI, modo positivo) das Substncias XIII e XIV ................................. 91 Figura 5-23- Espectro de RMN de H (400 MHz, CD3OD) das Substncias XIII e XIV ............................. 92 Figura 5-24- Espectro de RMN
1 1 13 1 1 1 1 1 1

C (100 MHz, CD3OD) das Substncias XIII e XIV ................................. 93

Figura 5-25- Espectro de H- H COSY (400 MHz, CD3OD) Substncias XIII e XIV .................................. 93 Figura 5-26- CCDA das Flavonas Glicosiladas .......................................................................................... 94 Figura 5-27- Espectro de Hx C HSQC (400 MHz, CD3OD) das Substncias XIII e XIV ......................... 94 Figura 5-28- Espectros de massas das Substncias XV e XVI.................................................................. 99
1 13

xvi

Figura 5-29- Espectro de RMN de H (400 MHz, CD3OD) das Substncias XV e XVI ............................ 100 Figura 5-30- Espectro de RMN de H (400 MHz, D2O/acetona-d6) das Substncias XV e XVI............... 101 Figura 5-31- Espectro de H- H COSY (400 MHz, CD3OD) das Substncias XV e XVI.......................... 102 Figura 5-32- Espectro de Hx C HMBC (400 MHz, CD3OD) das Substncias XV e XVI ....................... 102 Figura 5-33- Espectro de Hx C HSQC (400 MHz, CD3OD) das Substncias XV e XVI........................ 103 Figura 5-34- Espectro de massas (ESI, modo negativo, pr-coluna G-ODS) da mistura das Substncias XVII e XVIII e Substncias III e VIII ................................................................................................... 107 Figura 5-35- Espectro de massas (ESI, modo negativo, 9,7 eV) da mistura das Substncias XVII e XVIII ........................................................................................................................................................... 107 Figura 5-36- Espectro de massas (ESI, modo negativo, 30,0 eV) da mistura das Substncias XVII e XVIII ........................................................................................................................................................... 108 Figura 5-37- Espectro de massas da mistura das Substncias XVII e XVIII............................................ 108 Figura 5-38- Espectro de massas (ESI, modo negativo, 25 eV) da mistura das Substncias XVII e XVIII ........................................................................................................................................................... 109 Figura 5-39- Espectro de RMN de C (100 MHz, DMSO-d6) da mistura das Substncias III e VIII e das Substncias XVII e XVIII.................................................................................................................... 113 Figura 5-40- Espectro de RMN de H (400 MHz, DMSO-d6) da mistura de Substncias III e VIII e das Substncias XVII e XVIII.................................................................................................................... 113 Figura 5-41- Espectro de RMN de H (400 MHz, acetona-d6) da mistura das Substncias III e VIII e das Substncias XVII e XVIII.................................................................................................................... 114 Figura 5-42- Espectro de Hx C HMBC (400 MHz, DMSO-d6) da mistura das Substncias III e VIII e das Substncias XVII e XVIII.................................................................................................................... 114 Figura 5-43- Espectro de RMN H (400 MHz, A: C5D5N; B: CD3OD) da mistura das Substncias III e VIII e das Substncias XVII e XVIII............................................................................................................. 115 Figura 5-44- Espectro de Hx C HSQC (400 MHz, DMSO-d6) da mistura das Substncias III e VIII e das Substncias XVII e XVIII.................................................................................................................... 116 Figura 5-45- Espectro de RMN de C (100 MHz, acetona-d6) da mistura das Substncias XIX, XX e XXI ........................................................................................................................................................... 119 Figura 5-46- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia XIX ........................................... 120 Figura 5-47- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias XIX, XX e XXI..... 120 Figura 5-48- Espectro de RMN de H (400 MHz, acetona-d6) da mistura das Substncias XIX, XX e XXI ........................................................................................................................................................... 121 Figura 5-49- Espectro de RMN de H (200 MHz, acetona-d6) da Substncia XX .................................... 121 Figura 5-50- Espectro de RMN de H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia XIX ................................... 122 Figura 5-51- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias XXII e XXIII......... 124 xvii
1 1 1 13 1 13 1 1 13 1 1 13 1 13 1 13 1 1 1

Figura 5-52- Espectro de RMN de H (200 MHz, acetona-d6) da mistura das Substncias XXII e XXIII 124 Figura 5-53- Espectro de RMN de H (400 MHz, acetona-d6) da mistura das Substncias XXIV e XXV 128 Figura 5-54- Espectro de RMN de C (100 MHz, acetona-d6) da mistura das Substncias XXIV e XXV ........................................................................................................................................................... 129 Figura 5-55- Espectro de Hx C HSQC (400 MHz, acetona-d6) da mistura das Substncias XXIV e XXV ........................................................................................................................................................... 129 Figura 5-56- Espectro de H- H COSY (400 MHz, acetona-d6) da mistura das Substncias XXIV e XXV ........................................................................................................................................................... 130 Figura 5-57- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias XXIV e XXV........ 130 Figura 5-58- Espectro de RMN de H (200 MHz, D2O) da Substncia XXVI ........................................... 133 Figura 5-59- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia XXVI......................................... 133 Figura 5-60- Espectro de RMN de
13 1 1 1 1 1 13 13 1

C e DEPT135 (50 MHz, D2O) da Substncia XXVI ........................ 134

Figura 5-61- Espectro de RMN de H (200 MHz, C5D5N) da Substncia XXVII ..................................... 137 Figura 5-62- Espectro de RMN de
13

C (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXVII ....................................... 137

Figura 5-64- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia XXVIII....................................... 141 Figura 5-65- Espectro de H- H COSY (200 MHz, CDCl3) da Substncia XXVIII .................................... 141 Figura 5-66- Espectro de RMN de H (400 MHz, CDCl3) da Substncia XXVIII ...................................... 142 Figura 5-67- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias XXX e XXXI........ 146 Figura 5-68- Espectro de RMN de H (400 MHz, C5D5N) da mistura das Substncias XXX e XXXI...... 146 Figura 5-69- Espectro de Hx C HSQC (400 MHz, C5D5N) da mistura das Substncias XXX e XXXI .. 147 Figura 5-70- Espectro de RMN de C/PENDANT (50 MHz, C5D5N) da mistura das Substncias XXX e XXXI................................................................................................................................................... 147 Figura 5-71- Espectro de RMN de C/PENDANT (50 MHz, C5D5N) da mistura das Substncias XXVIII e XXIX ................................................................................................................................................... 151 Figura 5-72- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias XXVIII e XXIX..... 151 Figura 5-73- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias XXX e XXXII....... 153 Figura 5-74- Espectro de RMN de H (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXII ...................................... 155 Figura 5-75- Espectro de RMN de Figura 5-76- Espectro de RMN de Figura 5-77- Espectro de RMN de
1 13 13 13 13 1 13 13 1 13 1 1 1 1

C (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXII ....................................... 156 C/DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXII ...................... 156 C/PENDANT (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXII..................... 157

Figura 5-78- Espectro de Hx C HMBC (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXII .................................. 157 xviii

Figura 5-79- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias XXXIII e XXXIV . 161 Figura 5-80- Espectro de RMN de C/PENDANT (50 MHz, C5D5N) da mistura das Substncias XXXIII e XXXIV ................................................................................................................................................ 161 Figura 5-81- Espectro ampliado de RMN de C/PENDANT (50 MHz, C5D5N) da mistura das Substncias XXXIII e XXXIV .................................................................................................................................. 162 Figura 5-82- Espectro de RMN de H (200 MHz, CDCl3) da mistura das Substncias XXXIII e XXXIV.. 163 Figura 5-83- Espectro de massas (ESI, modo positivo) da Substncia XXXV......................................... 167 Figura 5-84- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia XXXV ....................................... 168 Figura 5-85- Espectro de RMN de Figura 5-86- Espectro de RMN de
1 1 13 13 1 13 13

C (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXV....................................... 168 C/DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXV ...................... 169

Figura 5-87- Espectro de H- H COSY (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXV .................................... 169 Figura 5-88- Espectro RMN H (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXV ................................................ 170 Figura 5-89- Espectro de RMN de Figura 5-90- Espectro de RMN de
1 13 13 1

C (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVI...................................... 174 C/DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVI ..................... 174

Figura 5-91- Espectro de RMN H (200 MHz, C5D5N, com supresso do sinal da gua em 4,9 ppm) da Substncia XXXVI.............................................................................................................................. 175 Figura 5-92- Espectro de RMN de H (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVII .................................... 179 Figura 5-93- Espectro de RMN de Figura 5-94- Espectro de RMN de
1 13 13 1

C (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVII..................................... 180 C/DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVII .................... 180

Figura 5-95- Espectro de RMN H (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVIII ........................................ 184 Figura 5-96- Espectro de RMN de Figura 5-97- Espectro de RMN de
1 1 1 13 13

C/DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVIII ................... 185 C (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVIII.................................... 185

Figura 5-98- Espectro de H- H COSY (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVIII ................................. 186 Figura 5-99- Espectro de Hx C HSQC (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVIII............................... 187 Figura 5-100- Espectro de Hx C HMBC (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVIII............................. 188 Figura 7-1- Espectro de RMN de H (200 MHz, acetona-d6) da Substncia XXXIX ................................ 203 Figura 7-2- Espectro de RMN de Figura 7-3- Espectro de RMN de
1 13 13 13 1 1 13 13

C (50 MHz, CD3OD) da Substncia XL............................................. 206 C/DEPT135 (50 MHz, CD3OD) da Substncia XL............................ 206

Figura 7-4- Espectro de H C HMBC (400 MHz, CD3OD) da Substncia XL ......................................... 207 Figura 7-5- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia XL .............................................. 207 xix

Figura 7-6- Espectro de RMN H (400 MHz, CD3OD) da Substncia XL ................................................. 208 Figura 7-7- Espectro de H C HMBC (400 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias XLI e XLII ........ 210 Figura 7-8- Espectro de RMN de
13 1 13

C (50 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias XLI e XLII ........... 213

Figura 7-9- Espectro de RMN de C/DEPT135 (50 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias XLI e XLII ........................................................................................................................................................... 213 Figura 7-10- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias XLI e XLII ........... 214 Figura 7-11- Espectro de RMN de H (400 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias XLI e XLII......... 214 Figura 7-12- Espectro de RMN de H (400 MHz, C5D5N) da Substncia XLIII ........................................ 218 Figura 7-13- Espectro de H- H COSY (400 MHz, C5D5N) da Substncia XLIII ...................................... 219 Figura 7-14- Espectro de Hx C HMBC (400 MHz, C5D5N) da Substncia XLIII .................................... 219 Figura 7-15- Espectro de Hx C HSQC (400 MHz, C5D5N) da Substncia XLIII ................................. 220 Figura 7-16- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia XLIII ......................................... 220 Figura 7-17- Espectro de RMN de Figura 7-18- Espectro de RMN de Figura 7-19- Espectro de RMN de
13 13 13 1 13 1 13 1 1 1 1

13

C (50 MHz, C5D5N) da Substncia XLIII ......................................... 221 C/DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia XLIII ........................ 221 C (50 MHz, C5D5N) da Substncia XLIV......................................... 223

Figura 7-20- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia XLIV ......................................... 225 Figura 7-21- Espectro de H- H COSY (400 MHz, C5D5N) da Substncia XLIV...................................... 225 Figura 7-22- Espectro de Hx C HSQC (400 MHz, C5D5N) da Substncia XLIV.................................... 226 Figura 7-23- Espectro de
13 1 13 1 1

C/DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia XLIV ..................................... 226

1

Figura 7-24- Espectro de RMN de H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia XLIV ................................. 227 Figura 7-25- Espectro de RMN
13

C (50 MHz, CDCl3) da mistura das Substncias XLV, XLVI e XLVII... 229

Figura 7-26- Cromatograma da mistura das Substncias XLV, XLVI e XLVII ......................................... 231 Figura 7-27- Espectro de massas, CG/EM-IE, da Substncia XLVII........................................................ 231 Figura 7-28- Espectro de RMN H (400 MHz, CDCl3) da mistura das Substncias XLV, XLVI e XLVII .. 232 Figura 7-29- Espectro de RMN de H (200 MHz, CDCl3) da Substncia XLVIII ...................................... 233 Figura 7-30- Espectro de RMN de H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia XIX ................................... 234 Figura 7-31- Espectro de massas, ESI modo negativo, da Substncia XLIX .......................................... 235 Figura 7-32- Espectro de massas, ESI modo negativo, da Substncia L ................................................ 236 Figura 7-33- Espectro de massas, ESI modo negativo, da Substncia LI ............................................... 237 xx
1 1 1

Figura 7-34- Espectro de RMN de H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia LII..................................... 239 Figura 7-35- Espectro de RMN de
13 1

C (100 MHz, acetona-d6) da Substncia LII ................................... 239

Figura 7-36- Espectro de RMN de H (400 MHz, acetona-d6) da mistura das Substncias LIII e LIV..... 241 Figura 7-37- Reao de degradao cida de pentoses (MORRISON & BOYD, 1972) ......................... 243 Figura 7-38- Espectro de RMN de H (400 MHz, CDCl3) da Substncia LV............................................ 245 Figura 7-39- Espectro de Hx C HMBC (400 MHz, acetona-d6) da Substncia LV ................................ 245 Figura 7-40- Espectro de RMN H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia LV ......................................... 246 Figura 7-41- Espectro de massas, EM/CG-IE, da Substncia LV ............................................................ 247 Figura 7-42- Espectro de RMN Figura 7-43- Espectro de H
1 13 13 1 1 13 1

C (50 MHz, CDCl3) da Substncia LV.................................................. 248

C HSQC (400 MHz, acetona-d6) da Substncia LV ................................. 248

13 13 1

Figura 7-44- Espectro de RMN de Figura 7-45- Espectro de RMN de

C/DEPT135 (50 MHz, CD3OD) da Substncia LVII........................ 254 C (50 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias LVI e LVII ......... 254

Figura 7-46- Espectro de RMN de H (400 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias LVI e LVII......... 255 Figura 7-47- Espectro de RMN de H (400 MHz, acetona-d6/D2O) da mistura das Substncias LVI e LVII ........................................................................................................................................................... 256 Figura 7-48- Espectro de RMN de H (400 MHz, acetona-d6/D2O) da Substncia LVI............................ 257 Figura 7-49- Espectro de Hx C HMBC (400 MHz, CD3OD) da Substncia LVII ................................... 258 Figura 7-50- Espectro de massas, ESI modo negativo, da mistura das Substncias LVI e LVII............. 259 Figura 7-51- Espectro de RMN de
1 13 13 1 13 1 1

C/DEPT135 (50 MHz, acetona-d6) da Substncia LVI ................... 259

Figura 7-52- Espectro de Hx C HSQC (400 MHz, acetona-d6/D2O) da mistura das Substncias LVI e LVII..................................................................................................................................................... 260 Figura 7-53- Espectro de RMN de H (400 MHz, (CD3)2CO/D2O) da Substncia LVIII ........................... 265 Figura 7-54- Espectro de RMN de H (400 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias LVIII e LXVIII ... 266 Figura 7-55- Espectro de RMN de C/DEPT135 (50 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias LVIII e LXVIII ................................................................................................................................................. 267 Figura 7-56- Espectro de RMN de
1 13 13 13 1 1

C (50 MHz, acetona-d6) da Substncia LVIII .................................. 267

Figura 7-57- Espectro RMN Hx C HMBC (400 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias LVIII e LXVIII ........................................................................................................................................................... 268 Figura 7-58- Espectro RMN Hx C HSQC (400 MHz, (CD3)2CO/D2O) da Substncia LVIII ................... 268 Figura 7-59- Espectro de RMN
13 1 13

C/DEPT135 (50 MHz, (CD3)2CO) da Substncia LVIII ........................ 269

xxi

Figura 7-60- Espectro de massas, ESI modo negativo, da Substncia LVIIII (A) e da Substncia LVI (B) ........................................................................................................................................................... 271 Figura 7-61- Espectro de massas, ESI modo positivo, da mistura das Substncias LVIII e LIX ............. 272 Figura 7-62- Espectro de massas, ESI modo negativo, da mistura das Substncias LVIII, LXVIII e LIX 272 Figura 7-63- Espectro de massas, ESI modo negativo, da mistura das Substncias LVIII e LIX............ 273 Figura 7-64- Espectro de massas, ESI modo negativo, da Substncia LX.............................................. 278 Figura 7-65- Espectro de RMN de H (400 MHz, CD3OD) da Substncia LX.......................................... 279 Figura 7-66- Espectro de RMN de
13 1 1

C (100 MHz, D2O, TSPA-d4 padro interno) da Substncia LX...... 280

13

Figura 7-67- Espectro de RMN de Hx C HMBC (400 MHz, CD3OD) da Substncia LX ....................... 280 Figura 7-68- Espectro de massas, ESI modo negativo, da mistura das Substncias LX, LXI, LXII e LXIII ........................................................................................................................................................... 285 Figura 7-69- Espectro de RMN de C (100 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias LX, LXI, LXII e LXIII.................................................................................................................................................... 285 Figura 7-70- Espectro de RMN de H (400 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias LX, LXI, LXII e LXIII ........................................................................................................................................................... 286 Figura 7-71- Espectro de RMN Hx C HMBC (400 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias LX, LXI, LXII e LXIII ......................................................................................................................................... 287 Figura 7-72- Espectro de RMN Hx C HSQC (400 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias LX, LXI, LXII e LXIII ......................................................................................................................................... 287 Figura 7-73- syzyginina B; Substncia LXIV; eschweilenol B e seu derivado metilado ........................... 290 Figura 7-74- Espectro de massas, ESI modo negativo, da Substncia LXIV .......................................... 292 Figura 7-75- Espectro de RMN
13 1 1 1 1 13 1 13 1 13

C (100 MHz, acetona-d6) da Substncia LXIV..................................... 293

Figura 7-77- Espectro de RMN H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia LXIV ...................................... 294 Figura 7-78- Espectro de RMN Hx C HSQC (400 MHz, acetona-d6) da Substncia LXIV ................... 295 Figura 7-79- Espectro de RMN Hx C HMBC (400 MHz, acetona-d6) da Substncia LXIV ................... 296 Figura 7-80- Espectro de RMN
13 1 1 13 13

C (50 MHz, acetona-d6) da Substncia LXV........................................ 299

Figura 7-81- Espectro de RMN H (200 MHz, acetona-d6) da Substncia LXV ....................................... 299 Figura 7-82- Espectro de RMN H (200 MHz, piridina-d5) da Substncia LXVI ....................................... 302 Figura 7-83- Espectro de RMN
13

C (50 MHz, CD3OD) da Substncia LXVI ............................................ 302

Figura 7-84- Espectros de massas, ESI modo negativo (A) e positivo (B), da Substncia LXVI............. 303 Figura 7-85- Modelos usados para a identificao da Substncia LXVII ................................................. 307 Figura 7-86- Espectro de massas, ESI modo positivo, da mistura das Substncias LXVI e LXVII ......... 308 xxii

Figura 7-87- Espectro de RMN

13

C (50 MHz, piridina-d5) da mistura das Substncias LXVI e LXVII ..... 308

Figura 7-88- Espectro de RMN C/DEPT 135 (50 MHz, piridina-d5) da mistura das Substncias LXVI e LXVII .................................................................................................................................................. 309 Figura 7-89- Espectro de RMN Hx C HMBC (400 MHz, piridina-d5) da mistura das Substncias LXVI e LXVII .................................................................................................................................................. 309 Figura 7-90- Espectro de RMN H (400 MHz, piridina-d5) da mistura das Substncias LXVI e LXVII..... 310 Figura 7-91- Espectro de RMN Hx C HSQC (400 MHz, piridina-d5) da mistura das Substncias LXVI e LXVII .................................................................................................................................................. 311 Figura 7-92- Espectro de NOEDIFF (400MHz, piridina-d5), irradiao em 5,02, da mistura das Substncias LXVI e LXVII.................................................................................................................. 311 Figura 7-93- Espectro de NOEDIFF (400MHz, piridina-d5) da mistura das Substncias LXVI e LXVII ... 312 Figura 7-94- Espectro de NOE (400MHz, piridina-d5) da mistura das Substncias LXVI e LXVII ........... 313 Figura 8-1- Estrutura geral dos ecdisterides........................................................................................... 316 Figura 8-2- Cromatograma da mistura de padres .................................................................................. 329 Figura 8-3- Cromatograma do extrato metanlico de galhos de V. polygama ......................................... 330 Figura 8-4- Cromatograma da anlise da 20-hidroxiecdisona no extrato metanlico de galhos de V. polygama: (azul) extrato; (verde) extrato pr-tratado em cartucho C-18; (rosa) padro .................. 331 Figura 9-1- Lagartas de S. frugiperda dentro do tubo de vidro contendo dieta artificial (A); recm eclodidas na placa de Petri (B) e na forma adulta, mariposa (C)..................................................... 344 Figura 9-2- Teste preliminar dos extratos com lagartas de S. frugiperda (foto menor/autora) nos tubos de vidro, mantidas sob condies controladas (foto maior/ Waldir T. de Lima)..................................... 346 Figura 9-3- Aplicao da dieta em placa ELISA (foto maior) e inoculao das lagartas (1 instar; foto menor) de S. frugiperda para o ensaio com substncias puras ........................................................ 346 Figura 9-4- Material para o ensaio bioqumico com as pectinases .......................................................... 351 Figura 9-5- Placa contendo resultado da determinao da MIC pelo mtodo do TTC ............................ 357 Figura 9-6- Atividade inibitria enzimtica de extratos e fraes de V. polygama sobre a GAPDH ........ 359 Figura 9-7- Grfico da curva dose resposta para a determinao da CI50 da 3-O-metil quercetina sobre a GAPDH .............................................................................................................................................. 363 Figura 9-8- Atividade inibitria enzimtica de extratos de V. polygama sobre a APRT ........................... 364 Figura 9-9- Atividade inibitria enzimtica de extratos de S. densiflora sobre a GAPDH ........................ 366 Figura 9-10- Grfico da curva dose-resposta para a determinao da CI50 da quercetina sobre a GAPDH ........................................................................................................................................................... 368 Figura 9-11- Grfico da curva dose-resposta para a determinao da CI50 do cido elgico sobre a GAPDH .............................................................................................................................................. 368 xxiii
1 13 1 1 13

13

Figura 9-12- Atividade inibitria enzimtica de extratos de S. densiflora sobre a APRT ......................... 370 Figura 9-13- Atividade dos extratos (adio dieta) de S. densiflora sobre S. frugiperda ...................... 371 Figura 9-14- % de mortalidade, ao 10 dia, de lagartas (1 instar) de S. frugiperda alimentadas em dieta contaminada superficialmente com taninos....................................................................................... 372 Figura 9-15- % de mortalidade, ao 10 dia, das lagartas (2 instar) de S. frugiperda alimentadas em dieta contaminada superficialmente com extratos hidrometanlicos de S. densiflora a 5 % (equivalente a 1000 ppm no ensaio do tubo) ............................................................................................................ 374 Figura 9-16- Mdia das massas (mg), ao 10 dia, das lagartas (2 instar) de S. frugiperda alimentadas em dieta contaminada superficialmente com extratos de S. densiflora a 5 % (equivalente a 1000 ppm no ensaio do tubo) .................................................................................................................................. 375 Figura 9-17- Atividade dos extratos (adio dieta) e parties de V. polygama sobre S. frugiperda ... 377 Figura 9-18- Mtodo de difuso em gar com discos de papel de filtro contaminados com extratos de S. densiflora para determinao de atividade antimicrobiana sobre S. aureus e M. roseus ................. 388 Figura 9-19- Mtodo de difuso em gar com discos de papel de filtro contaminados com extratos de S. densiflora para determinao de atividade antimicrobiana sobre E. coli e P. aeruginosa ................ 389 Figura 9-20- Mtodo de difuso em gar com discos de papel de filtro contaminados com extratos de S. densiflora para determinao de atividade antimicrobiana sobre T. cutaneum e B. cereus ............. 389 Figura 9-21- Espectro de absoro do NADH, castalagina, casuarinina e 4-O--L-raminopiranosdeo do cido elgico ....................................................................................................................................................393

Lista de Esquemas
Esquema 1-1- Esquema da gliclise ocorrida no glicossomo do T. cruzi .................................................. 25 Esquema 1-2- Vias metablicas para a sntese de purino-nucleotdeos ................................................... 32 Esquema 5-1- Proposta de fragmentao da Substncia XVIII ............................................................... 106 Esquema 5-2- Reaes de formao do cido metacrlico (KITAGAWA, 1984) ..................................... 132 Esquema 7-1- Proposta de reao ocorrida com a Substncia LVI para troca de configurao do centro anomrico .......................................................................................................................................... 260 Esquema 7-2- Proposta de formao dos adutos de massa 964 e 996 a partir da Substncia LVIII...... 264 Esquema 7-3- Proposta de formao da Substncia LIX, artefato, a partir da Substncia LVIII ...............274 Esquema 7-4- Proposta de formao biossinttica da Substncia LXIV .................................................297 Esquema 7-5- Reao de equilbrio da -lactona e do seu cido correspondente, o cido 3,4,5,6tetraidroxihexanico........................................................................................................................... 305 Esquema 9-1- Reao de oxirreduo (HOSTETTLER et al., 1951) ocorrida no ensaio bioqumico de determinao da inibio de atividade das pectinases fngicas....................................................... 350

xxiv

Lista de Substncias Identificadas de Vitex polygama Cham.

R1
2'

R4

R2
4'

R3 R2
7

2'

4'

R5

HO
7

O
2 4 5

O
4 5

R1

OMe O

OH

O
R1 R2 OH OMe OH

OH

R1 Substncia I Substncia II Substncia V (4-metoxipenduletina)

R2

R3 H H H H H

R4 H H H

R5 OMe OMe OH

Substncia III (crisoeriol) Substncia IV (acacetina) Substncia VII (luteolina)

OMe H OH

OMe OMe H H OMe OH

(5-hidroxi-3,7,4-trimetoxiflavona) (3-metoxikaempferol) xxv Substncia VI OMe OMe (casticina) Substncia VIII H OH OH OMe OMe OH

OH 3'' OH HO
1'' 6''

OH
3' 5'

OH O O
2

OH
OH
3'

HO
7 5

OH
5'

OH

O
6''

HO OH O

O
2 5 4

Substncia XI orientina

HO HO
3''

1''

OH

OH

Substncia XII isoorientina

OH O
1'' 5'' 3'' 2'

3'''

OH OH
6'''

OH
4'

HO HO OH
6''' 1''' OH 3'''

OH

HO 1''' O OH HO 3''
5''

OH
2'

O
7 3 5 6'

4'

OH

O
7 3 1'' 5 6'

OH
O

HO

HO HO

HO O
Substncia XIII schaftosdeo

HO

Substncia XIV isoschaftosdeo

OH

O
1''

5 '' 3'' 6'

OH
4'

OH OH
OH OH

HO HO OH
6''' 1 ''' OH

O
7 3 5 2'

HO 1''' O
xxvi

6'''

OH
2'

OH
4' 6'

OH

OH

HO

OH

OH 3'' 5''

HO

O
3 5

Substncia XV carlinosdeo Substncia XVI isocarlinosdeo

OH
3' 6''

OH OH
3''

O O
5' 1''

HO
7

O
4 5

OH

OH
3'

OH

OH
5' 6''

OH O

HO
7 5

O
4

OH

OH OH OH

O O
1 ''

O OH
3''

Substncia XVII 4-O--D-glucopiranosilquercetina

OH

Substncia XVIII 3-O--D-glucopiranosilquercetina

COOH

HO HO

COOH

R3 R2
R1 Substncia XIX (cido vanlico) Substncia XX Substncia XXI Substncia XXIII (cido protocatquico) H

R1

Substncia XXII cido cafeico R2 OH OH OH R3 H H OH

OMe

O HO
1 4 7 8

O O
1'

(cido p-hidroxibenzico) OMe

HO

(cido 5-hidroxivanlico) OH OH H

HO HO

OH

OH

Substncia XXIV e XXV 6-O-cafeoil- e -D-glucopiranosdeo

COOH

xxvii

21 25 18 23

Substncia XXVI cido metacrlico

R3 R4 HO HO

R2 R1

COOH

Substncia XXVII 3-O--D-glucopiranosilsitosterol ou daucosterol

R1 Substncia XXVIII Substncia XXIX Me H

R2 Me Me

R3 H H

R4 H Me

(cido 2,3-diidroxiolean-12-en-28-ico) (cido 2,3-diidroxiurs-12-en-28-ico)

R3 R4
25 11 26

R2 R1
20 18 16

OH O

R5
3

COOH
28

HO OH HO H O

10 6 27

HO

R1 Substncia XXX Substncia XXXI Substncia XXXII Substncia XXXIII (cido urslico) Substncia XXXIV (cido oleanlico) Me Me H H H

R2 Me Me Me Me Me

R3 H H

R4 H Me

R5 OH OH OH H

Substncia XXXVIII shidasterona

(cido 2,3-diidroxiolean-12-en-28-ico) (cido 2,3-diidroxiurs-12-en-28-ico) OH Me H H Me H (cido 2,3,19-triidroxiurs-12-en-28-ico)

xxviii H

OH OH

OH HO HO O OH OH
Substncia XXXVII stachysterona B

OH HO OH HO R O
R Substncia XXXV (20-hidroxiecdisona ou polipodina A) Substncia XXXVI OH H

(polipodina B) Lista de Substncias Identificadas de Siphoneugena densiflora Berg

OH OH HO O OR OH O
R Substncia XXXIX (quercetina) Substncia XL (quercitrina) Substncia XLI (3-O--D-xilopiranosilquercetina) Substncia XLII -D-xilopiranosila -L-ramnopiranosila H

OMe CHO MeO OMe

Substncia LIV trans-2,4,6-trimetoxifenilpropenaldedo

OH
5' 3' 1' 1 3

OH O
7

7'

O
5

xxix (3-O--L-arabinopiranosilquercetina) -L-arabinopiranosila

HO OH

Substncia LI cido elgico

20 18 25 11 26 16 10 6 27

OH
3

HOH2C

OH

HO
3

COOR
28

HO R1

O
Substncia LXVII -lactona do cido 3,4,5,6-tetraidroxihexanico

R2
R1 Substncia XLIV (cido arjunlico) Substncia XLIII H OH OH R2 H R H

-D-glucopiranosila

(6-hidroximaslinato de -D-glucopiranosila) indita

OH
5'

OH
1'

7'

O
7

1 5

RO
R Substncia XLVIII (sitosterol) Substncia XXVII -D-glucopiranosila H

HO O O R2O OR1 OR

(3-O--D-glucopiranosilsitosterol)

Substncia LX R =R1 =R2 =OH 4-O--L-ramnopiranosdeo do cido elgico Substncia LXI R= OAC; R1 =R2 = OH 4-O--L-2-O-acetilramnopiranosdeo do cido elgico- indita

xxx Substncia LXII R =R2 = OH; R1 =OAC 4-O--L-3-O-acetilramnopiranosdeo do cido elgico- indita
Substncia LXIII

R1 Substncia XLIX (cido glico) H H OMe OMe H

R2 OH OMe H H OMe

R3 OH OH OMe OMe OH

R4 OH OMe H H H

R5 H H

R6 OH OH

COR6 R5 R4 R3 R1 R2

Substncia L (cido sirngico) Substncia LII Substncia LIII Substncia XIX (cido vanlico)

OMe OH OMe H H OH

(cido 2,4,6-trimetoxibenzico) (2,4,6-trimetoxibenzaldedo)

29 30 20 21 12 25 1 9 27 18 25 15 28 1 9 27 15 28 1 12 18 25 9 27 21 21 12 18 26 15

HO
23

HO
23

HO
23

Substncia XLV -amirina

Substncia XLVI -amirina

Substncia XLVII lupeol

HO HO

OH

HO

OH OH

HO HO

OH

HO

OH OH

CO O
5

OC O
1

CO O

OC O
5 1 R1

O HO CO

O OC CO

R1 R2 OH OH
xxxi
HO HO

O CO

O OC CO

R2 OH OH

Substncia LVI R1 = H e R2 = OH casuarinina Substncia LVII R1 = OH e R2 = H estaquiurina

Substncia LVIII R1 = H e R2 = OH castalagina Substncia LXVIII R1 = OH e R2 = H vescalagina

OH HO HO HO HO OH CO CO O O
3 6

OH
OH HO O
1

1 3

OH OH OH

O OH

HO

HO

HO

OH

HOOC HOOC HOOC

OH OH OH OH

Substncia LXVI ramnose

Substncia LIX 1-C-flavogalonil-4,6-O-(S)-hexaidroxidifenoil--Dglucopiranosdeo

OH HO O HO HO CO CO O O OH
3 1 6

O OH

OMe HO
4''

OH O
4 1

HO

O
1''

O MeO

4' 1'

OC OC HO HO OH HO OH OH

HO HO

OH

O OH

COOH xxxii

Substncia LXIV cido 4-O --D-glucopiranosil, 3,5-dimetoxifenil-[1, 4]-dioxinil-2-hidroxiglico ou siphoneugenina - indita

Substncia LXV -pedunculagina

HOH2C

CHO

Substncia LV 5-hidroximetil-2-furfuraldedo

Resumo
BUSCA DE PRODUTOS NATURAIS BIOATIVOS EM PLANTAS DAS FAMLIAS MYRTACEAE (Siphoneugena densiflora Berg) E VERBENACEAE (Vitex polygama Cham.) Neste trabalho esto sendo descritas trinta e sete substncias identificadas de V. polygama Cham. e trinta e duas de S. densiflora Berg, provenientes do estudo fitoqumico de seus respectivos extratos. Destas, quatro substncias isoladas de S. densiflora so destacadas por serem inditas na literatura, a saber: 6hidroximaslinato de -D-glucopiranosila; 4-O--L-2-O-acetilramnopiranosdeo do cido elgico e seu regioismero com o grupo acetila na posio 3 e a siphoneugenina. So relatadas as atividades inibitrias enzimticas de vrias das substncias identificadas, e de seus extratos de origem, sobre as enzimas gliceraldedo 3-fosfatodesidrogenase glicossomal (gGAPDH), de Trypanosoma cruzi; adenina fosforribosiltransferase (APRT), de Leishmania tarentolae; e pectinase, do fungo Leucoagaricus gongylophorus, simbionte da formiga cortadeira Atta sexdens rubropilosa. Dentre todas as substncias

xxxiii

testadas, os taninos castalagina e casuarinina se revelaram os mais promissores inibidores com valores de CI50 de 7,5 e 1,8 M sobre a gGAPDH e 3,3 e 1,8 M sobre a APRT, respectivamente. Como os taninos podem precipitar protenas e causar uma ao inibitria no especfica, foram realizados estudos sobre a interao deles com os reagentes dos ensaios enzimticos. So relatadas as atuaes biolgicas in vitro de algumas substncias sobre as formas tripomastigotas de T. cruzi; sobre as lagartas de 1 e 2 instar da mariposa, praga do milho, Spodoptera frugiperda; sobre as bactrias Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Micrococcus roseus e sobre os fungos Leucoagaricus gongylophorus, Candida albicans, Cryptococcus laurentii, Sacharomyces cerevisae e Trichosporon cutaneum. A mistura dos flavonis glicosilados 3-O + 4-O--D-glucopiranosil quercetina apresentou a maior atividade tripanocida (1,1 mM; 97 % lise contra 0,6 mM; 100 % lise da violeta genciana), ressaltando-se que sua CI50 sobre a gGAPDH foi de 20 M. Os extratos metanlicos e hidrometanlicos dos galhos, caule, folhas e cascas da raiz de S. densiflora causaram 100 % de morte das lagartas de S. frugiperda, a uma concentrao de 1000 ppm. Do extrato metanlico de folhas de S. densiflora foram isolados dois flavonides: quercetina e quercitrina que, a uma concentrao de 100 ppm, provocaram 78 e 85 % de morte das lagartas. Os taninos casuarinina e 4-O--L-raminopiranosdeo do cido elgico, na mesma concentrao, atuaram principalmente como fagoinibidores. O extrato hidrometanlico de folhas de V. polygama teve uma atividade inseticida de 60 % sobre S. frugiperda a uma concentrao de 1000 ppm. Dele foram isoladas as misturas das flavonas di-C-glicosiladas carlinosdeo, schaftosdeo e seus respectivos ismeros, os quais apresentaram atividade inseticida relatada na literatura (SIMMONDS, 2001). O extrato hidrometanlico de folhas de S. densiflora apresentou uma atividade bactericida (halo de inibio de 11 mm) to intensa quanto a do antibitico tetraciclina (10 e 12 mm) para as bactrias P. aeruginosa e M. roseus. Das substncias ensaiadas, apenas a mistura do cafeoil-6-O- + -D-glicopiranosdeo foi relativamente ativa sobre o fungo L. gongylophorus causando 60 % de inibio de seu crescimento, a uma concentrao de 50 g/mL. Tambm est sendo narrado o desenvolvimento de um mtodo, usando-se CLAE, para a anlise e quantificao da 20-hidroxiecdisona presente no extrato metanlico de galhos de V. polygama, em virtude de suas inmeras atividades biolgicas e grande uso e importncia na indstria farmacutica.
xxxiv

Abstract
SEARCH FOR BIOACTIVE NATURAL PRODUCTS IN SPECIES OF MYRTACEAES (Siphoneugena densiflora BERG) AND VERBENACEAES (Vitex polygama CHAM.) FAMILIES - The present work describes the results of phytochemical investigations of the species S. densiflora and V. polygama, culminating in 32 and 37 identified natural substances respectively. Among them, the structural elucidation of four new ones, from S. densiflora, deserves to be stood out: 28--Dglucopyranosyl-6-hydroxymaslinate; ellagic acid 4-O--L-2-O-acetylrhamnopyranoside and its regioisomer in the 3-O-acetyl position; and siphoneugenin. The extracts and substances inhibitory enzymatic activities on glucossomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gGAPDH) of Trypanosoma cruzi, adenine phosphoribosyltransferase (APRT) of Leishmania tarentolae, and pectinase of Leucoagaricus gongylophorus (a symbiont fungus of leaf-cutting ant Atta sexdens rubropilosa) enzymes are reported. Taking into account all the assayed compounds, the
xxxv

tannins Castalagin and Casuarinin have been assigned as the most promising inhibitors with IC50 of 7.5 and 1.8 M on gGAPDH and 3.3 and 1.8 M on APRT enzymes, respectively. As tannins can conjugate with protein and hence non-specifically inhibit enzyme action, researches were performed in order to assess their influences upon the biochemical assays reagents. The in vitro biological effects of some compounds on trypomastigote form of T. cruzi; on 1st and 2nd instar larvals of fall armyworm, Spodoptera frugiperda; on the bacteria Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, and Micrococcus roseus; and on the fungi Leucoagaricus gongylophorus, Candida albicans, Cryptococcus laurentii, Sacharomyces cerevisae and Trichosporon cutaneum are related. The mixture of

glycosylated flavonols quercetin 3-O + 4-O--D-glucopyranosides has presented the highest trypanocidal activity (1.1 mM, 97 % lysis versus gentian violet 0.6 mM, total lysis) and an IC50 of 20 M on gGAPDH enzyme. The methanol and hydroalcoholic extracts from twigs, stem, leaves and roots bark of S. densiflora incorporated into an artificial diet of 1st instar S. frugiperda larvae at a concentration of 1000 ppm induced 100 % of mortality. The methanol extract from leaves of S. densiflora yielded two flavonoids: quercetin and quercitrin. The 1st instar larvae reared on a diet containing 100 ppm of those flavonoids an overall mortality of 78 and 85 % was observed. The tannins casuarinin and ellagic acid 4-O--L-rhamnopyranoside have been shown to possess, at the same concentration, antifeedant activity. The inclusion of 1000 ppm hydroalcoholic extract from leaves of V. polygama in the diet of the 1st instar Spodoptera larvae caused 60 % of mortality. This extract yielded two mixtures of di-C-glycosylflavones carlinoside and schaftoside along with their isomers, whose insecticidal effects are reported in the literature (SIMMONDS, 2001). The antimicrobial activity observed with the hydroalcoholic extract from leaves of S. densiflora (inhibition halo of 11 mm) was as intense as that of the antibiotic tetracycline (10 and 12 mm, respectively) on the bacteria P. aeruginosa and M. roseus. Among the tested substances, only the mixture containing cafeoyl-6-O- + -D-glucopyranoside played a significant action against the fungus L. gongylophorus, causing 60 % of growth inhibition at a concentration of 50 g/mL. An analytical method which is present for the quantitative HPLC determination of 20-hydroxyecdysone, in the methanol extract from twigs of V. polygama, has been

xxxvi

developed since this compound exhibits several biological activities and has found widespread applications into the pharmaceutical industries.

Sumrio
1. INTRODUO....................................................................................................................................... 1

1.1. HISTRICO ....................................................................................................................................... 2 1.2. ASPECTOS GEOGRFICOS DO LOCAL DE COLETA DAS ESPCIES VEGETAIS ........................................... 4 1.3. VITEX POLYGAMA CHAMISSO ............................................................................................................. 6 1.3.1. Perfil Qumico de V. polygama Cham. .................................................................................... 9 1.4. SIPHONEUGENA DENSIFLORA BERG ................................................................................................. 13 1.4.1. Perfil Qumico de S. densiflora Berg ..................................................................................... 15 1.5. DOENA DE CHAGAS....................................................................................................................... 16 1.5.1. Quimioterapia ........................................................................................................................ 17 1.5.2. Quimioprofilaxia..................................................................................................................... 19 1.5.3. Produtos naturais tripanocidas.............................................................................................. 20 1.6. TRYPANOSOMA CRUZI ..................................................................................................................... 22 1.6.1. A enzima gGAPDH de T. cruzi.............................................................................................. 23 1.7. LEISHMANASES .............................................................................................................................. 25 1.7.1. Leishmanase Cutnea ......................................................................................................... 26 1.7.2. Leishmanase Mucocutnea ................................................................................................. 27 1.7.3. Leishmanase Visceral .......................................................................................................... 28 1.7.4. Fosforribosiltransferases (PRTases) de Leishmania ............................................................ 31 1.7.5. Produtos naturais leishmanicidas.......................................................................................... 33 1.8. INSETOS ......................................................................................................................................... 34 1.8.1. Inseticidas.............................................................................................................................. 35 1.8.2. Inseticidas de origem natural ................................................................................................ 37

xxxvii

2. 3.

OBJETIVOS ........................................................................................................................................ 41 MATERIAIS E MTODOS .................................................................................................................. 43

3.1. REAGENTES E MATERIAIS UTILIZADOS............................................................................................... 44 3.2. EQUIPAMENTOS .............................................................................................................................. 44 3.2.1. Separao de substncias em geral ..................................................................................... 44 3.2.2. Anlise das substncias ........................................................................................................ 45 3.2.3. Quantificao da 20-hidroecdisona....................................................................................... 46 3.2.4. Ensaio com enzima pectinase............................................................................................... 46 3.3. MTODOS ....................................................................................................................................... 47 3.3.1. Colunas cromatogrficas....................................................................................................... 47 3.3.2. Cromatografia de CCDA e CCDP ......................................................................................... 47 3.3.3. Cromatografia de Spins ...................................................................................................... 48 3.4. ESPECTROMETRIA DE ABSORO NO UV.......................................................................................... 48 3.5. ESPECTROMETRIA DE MASSAS, IV E RMN........................................................................................ 48 3.6. COLETA DO MATERIAL ..................................................................................................................... 48
4. ESTUDO FITOQUMICO DE VITEX POLYGAMA CHAM.- EXPERIMENTAL .................................. 51

4.1. PREPARAO DOS EXTRATOS BRUTOS ............................................................................................. 52 4.2. FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS BRUTOS ........................................................................................ 53 4.2.1. Extrato hexnico dos frutos................................................................................................... 53 4.2.2. Extrato hidrometanlico dos frutos........................................................................................ 54 4.2.3. Extrato hexnico das folhas .................................................................................................. 54 4.2.4. Frao metanlica do extrato hexnico de folhas................................................................. 55 4.2.5. Extrato hidrometanlico das folhas ....................................................................................... 55 4.2.6. Partio lquido-lquido dos extratos metanlicos de galhos e folhas .................................. 56 4.2.7. Frao em diclorometano do extrato metanlico de folhas .................................................. 57
4.2.7.1. 4.2.7.2. 4.2.7.3. 4.2.7.4. 4.2.7.5. 4.2.7.6. 4.2.7.7. 4.2.7.8. 4.2.7.9. 4.2.7.10. 4.2.7.11. 4.2.7.12. Obteno Substncia XXVII .............................................................................................................57 Obteno da Substncia XXXII e das Substncias XXXIII e XXXIV em mistura..............................58 Obteno da Substncia III ..............................................................................................................58 Obteno da Substncia IV e das Substncias XVII e XVIII em mistura .........................................59 Obteno das Substncias V e XXVIII .............................................................................................59 Obteno da Substncia VI..............................................................................................................60 Obteno das Substncias VII e IX..................................................................................................60 Obteno da Substncia VIII............................................................................................................60 Obteno das Substncias XXX e XXXI em mistura........................................................................61 Obteno das Substncias XXVIII e XXIX em mistura.................................................................62 Obteno das Substncias XIX, XX e XXI em mistura.................................................................62 Obteno das Substncias XXII e XXIII em mistura e XXIV e XXV em mistura...........................62

4.2.8. Frao em diclorometano do extrato metanlico de galhos ................................................. 63 4.2.9. Frao em acetato de etila do extrato metanlico de galhos ............................................... 64 4.2.10. Frao em n-butanol do extrato hidrometanlico de folhas .................................................. 65 5. ESTUDO FITOQUMICO DE VITEX POLYGAMA CHAM.- RESULTADOS E DISCUSSES ......... 67

5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.6. 5.7. 5.8. 5.9. 5.10. 5.11. 5.12. 5.13. 5.14.

IDENTIFICAO DAS SUBSTNCIAS I A IX .......................................................................................... 68 IDENTIFICAO DAS SUBSTNCIAS XI E XII....................................................................................... 85 IDENTIFICAO DAS SUBSTNCIAS XIII E XIV ................................................................................... 88 IDENTIFICAO DAS SUBSTNCIAS XV E XVI.................................................................................... 95 IDENTIFICAO SUBSTNCIAS XVII E XVIII..................................................................................... 104 IDENTIFICAO DAS SUBSTNCIAS XIX, XX E XXI EM MISTURA ....................................................... 117 IDENTIFICAO DAS SUBSTNCIAS XXII E XXIII EM MISTURA ........................................................... 123 IDENTIFICAO DAS SUBSTNCIAS XXIV E XXV EM MISTURA .......................................................... 125 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA XXVI............................................................................................ 131 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA XXVII ....................................................................................... 135 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA XXVIII ...................................................................................... 138 IDENTIFICAO DAS SUBSTNCIAS XXX E XXXI EM MISTURA ...................................................... 143 IDENTIFICAO DAS SUBSTNCIAS XXVIII E XXIX EM MISTURA ................................................... 148 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA XXXII ....................................................................................... 152

xxxviii

5.15. 5.16. 5.17. 5.18. 5.19.

6.

IDENTIFICAO DAS SUBSTNCIAS XXXIII E XXXIV EM MISTURA ................................................. 158 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA XXXV....................................................................................... 164 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA XXXVI...................................................................................... 171 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA XXXVII..................................................................................... 176 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA XXXVIII.................................................................................... 181

ESTUDO FITOQUMICO DE S. DENSIFLORA BERG - EXPERIMENTAL..................................... 189

6.1. PREPARAO DOS EXTRATOS BRUTOS ........................................................................................... 190 6.2. FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS BRUTOS E FRAES ................................................................... 191 6.2.1. Partio lquido/lquido do extrato metanlico do caule...................................................... 191 6.2.2. Frao em n-butanol do extrato metanlico de caule e obteno das Substncias LVIII e LXV 191 6.2.3. Frao em acetato de etila do extrato metanlico de caule .............................................. 192 6.2.4. Frao em diclorometano do extrato metanlico de caule ................................................. 192
6.2.4.1. 6.2.4.2. 6.2.4.3. Obteno das Substncias LIII e LIV em mistura e da Substncia LII ...........................................193 Obteno das Substncias XIX e LV .............................................................................................193 Obteno da Substncia XLIV e XLIX............................................................................................194

6.2.5. 6.2.6.

Partio lquido/lquido do extrato metanlico da casca da raiz ......................................... 194 Frao em acetato de etila do extrato metanlico da casca da raiz................................... 195
Obteno das Substncias L e XLIX..............................................................................................195 Obteno da Substncia LVI..........................................................................................................195 Obteno das Substncias LXVI, LXVII e LXIV .............................................................................196 Obteno da Substncia LX...........................................................................................................196 Obteno da Substncia LI ............................................................................................................196 Obteno das Substncias LVIII e LIX em mistura e LVI e LVII em mistura..................................196 Obteno das Substncias LX, LXI, LXII e LXIII em mistura .........................................................197

6.2.7. Extrato hidrometanlico do caule ....................................................................................... 198 6.2.8. Partio lquido/lquido do extrato metanlico de folhas..................................................... 198 6.2.9. Frao em acetato de etila do extrato metanlico de folhas .............................................. 199 6.2.10. Frao em diclorometano do extrato metanlico de folhas e obteno das Substncias XLV, XLVI e XLVII em mistura........................................................................................................... 199 7. ESTUDO FITOQUMICO DE S. DENSIFLORA BERG RESULTADOS E DISCUSSES ........... 201

6.2.6.1. 6.2.6.2. 6.2.6.3. 6.2.6.4. 6.2.6.5. 6.2.6.6. 6.2.6.7.

7.1. 7.2. 7.3. 7.4. 7.5. 7.6. 7.7. 7.8. 7.9. 7.10. 7.11. 7.12. 7.13. 7.14. 7.15. 7.16. 7.17. 7.18. 7.19. 7.20. 7.21. 7.22.

IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA XXXIX ......................................................................................... 202 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA XL................................................................................................ 204 IDENTIFICAO DAS SUBSTNCIAS XLI E XLII EM MISTURA.............................................................. 209 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA XLIII ............................................................................................ 215 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA XLIV ............................................................................................ 222 IDENTIFICAO DAS SUBSTNCIAS XLV, XLVI E XLVII EM MISTURA ................................................ 228 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA XLVIII .......................................................................................... 233 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA XIX .............................................................................................. 234 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA XLIX ............................................................................................ 235 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA L .............................................................................................. 236 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA LI ............................................................................................. 237 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA LII ............................................................................................ 238 IDENTIFICAO DAS SUBSTNCIAS LIII E LIV EM MISTURA ........................................................... 240 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA LV............................................................................................ 242 IDENTIFICAO DAS SUBSTNCIAS LVI E LVII EM MISTURA .......................................................... 249 IDENTIFICAO DAS SUBSTNCIAS LVIII, LXVIII E LIX EM MISTURA ............................................. 261 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA LX............................................................................................ 275 IDENTIFICAO DAS SUBSTNCIAS LX, LXI, LXII E LXIII EM MISTURA .......................................... 281 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA LXIV ........................................................................................ 288 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA LXV ......................................................................................... 298 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA LXVI ........................................................................................ 301 IDENTIFICAO DA SUBSTNCIA LVII.......................................................................................... 304

8. DESENVOLVIMENTO DE UM MTODO PARA A ANLISE E QUANTIFICAO DA 20HIDROXIECDISONA ................................................................................................................................ 315

xxxix

8.1. INTRODUO ................................................................................................................................ 316 8.1.1. Ecdisterides: Estrutura qumica......................................................................................... 316 8.1.2. Ocorrncia na natureza....................................................................................................... 317 8.1.3. Atividade biolgica .............................................................................................................. 317 8.1.4. Separao cromatogrfica de ecdisterides para fins analticos........................................ 319 8.2. METODOLOGIA .............................................................................................................................. 321 8.2.1. Anlise quantitativa da 20-hidroxiecdisona......................................................................... 321 8.2.2. Preparao do extrato......................................................................................................... 322 8.2.3. Preparao da coluna analtica........................................................................................... 322 8.2.4. Gradiente exploratrio......................................................................................................... 323 8.2.5. Pr-tratamento do extrato ................................................................................................... 324 8.2.6. Purificao e determinao da pureza do padro 20E ....................................................... 325 8.2.7. Soluo estoque do padro externo e preparao das amostras para a construo da curva de calibrao externa......................................................................................................................... 326 8.2.8. Soluo estoque do extrato e preparao das amostras para a construo da curva de calibrao por adio de padro ....................................................................................................... 326 8.2.9. Recuperao ....................................................................................................................... 327 8.2.10. Preciso............................................................................................................................... 327 8.2.11. Exatido............................................................................................................................... 327 8.2.12. Seletividade ......................................................................................................................... 328 8.2.13. Limites de deteco (LD) e quantificao (LQ)................................................................... 328 8.3. RESULTADOS E DISCUSSES ......................................................................................................... 328 8.3.1. Preparao do extrato......................................................................................................... 328 8.3.2. Preparao da coluna analtica........................................................................................... 328 8.3.3. Gradiente exploratrio......................................................................................................... 329 8.3.4. Pr-tratamento do extrato ................................................................................................... 330 8.3.5. Determinao da pureza do padro 20E e seletividade ..................................................... 331 8.3.6. Validao do mtodo........................................................................................................... 332
8.3.6.1. 8.3.6.2. 8.3.6.3. 8.3.6.4. Linearidade.....................................................................................................................................332 Preciso e exatido........................................................................................................................332 Limite de quantificao e limite de deteco..................................................................................334 Recuperao ..................................................................................................................................334

9.

ENSAIOS BIOQUMICOS E BIOLGICOS...................................................................................... 335

9.1.

VERIFICAO DE INIBIO DAS ENZIMAS GLICERALDEDO 3-FOSFATODESIDROGENASE (GAPDH) E ADENINA FOSFORRIBOSILTRANSFERASE (APRT) ....................................................................................... 336
9.1.1. 9.1.2. 9.1.3. 9.1.4. 9.1.5. 9.1.6. 9.1.7. 9.1.8. Local de realizao ............................................................................................................. 336 Mtodo para avaliao de inibio enzimtica da gGAPDH .............................................. 336 Mtodo para avaliao de inibio enzimtica da APRT.................................................... 337 Metodologia para o ensaio de inibio da atividade da enzima GAPDH em placa ELISA. 337 Metodologia para o ensaio de inibio da atividade da enzima APRT em placa ELISA.... 337 Clculo dos resultados ........................................................................................................ 338 Determinao da CI50 .......................................................................................................... 339 Teste de interao qumica entre os taninos e a APRT ..................................................... 339
Preparo das solues.....................................................................................................................340 Teste com a enzima .......................................................................................................................341 Teste com o PRPP.........................................................................................................................341 Teste com a Adenina .....................................................................................................................341

9.1.9.

9.1.8.1. 9.1.8.2. 9.1.8.3. 9.1.8.4.

Teste de interao qumica entre os taninos e a enzima GAPDH...................................... 341

Preparo das solues.....................................................................................................................341 + Teste com NAD .............................................................................................................................342 Teste com G3P ..............................................................................................................................342 Teste com a enzima .......................................................................................................................342 Teste com tampo TEA em pH 7,5 ................................................................................................342

9.2. VERIFICAO DE ATIVIDADE INSETICIDA SOBRE SPODOPTERA FRUGIPERDA...................................... 343 9.2.1. Introduo............................................................................................................................ 343 9.2.2. Local de realizao ............................................................................................................. 343 9.2.3. Criao artificial da S. frugiperda ........................................................................................ 343 9.2.4. Metodologia ......................................................................................................................... 344

9.1.9.1. 9.1.9.2. 9.1.9.3. 9.1.9.4. 9.1.9.5.

xl

9.3. VERIFICAO DE ATIVIDADE INSETICIDA SOBRE A FORMIGA ATTA SEXDENS RUBROPILOSA................. 347 9.3.1. Introduo............................................................................................................................ 347 9.3.2. Local de realizao ............................................................................................................. 348 9.3.3. Metodologia do ensaio enzimtico com as pectinases fngicas ........................................ 349
9.3.3.1. 9.3.3.2. 9.3.3.3. 9.3.3.4. 9.3.3.5. Teste de interao dos taninos com a pectinase ...........................................................................350 Teste com a pectinase ...................................................................................................................351 Teste com a pectina .......................................................................................................................351 Teste com o tampo.......................................................................................................................352 Teste com o ADNS.........................................................................................................................352 Preparo dos tubos contendo o meio de cultura..............................................................................352 Preparo do inculo .........................................................................................................................353 Determinao da massa seca ........................................................................................................353 Avaliao do crescimento do fungo simbionte ...............................................................................353

9.3.4.

Metodologia para o ensaio com o fungo simbionte............................................................. 352

9.3.5.

9.3.4.1. 9.3.4.2. 9.3.4.3. 9.3.4.4.

Ensaio antimicrobiano ......................................................................................................... 354

9.4. VERIFICAO DE ATIVIDADE SOBRE O T. CRUZI ............................................................................... 357 9.4.1. Introduo............................................................................................................................ 357 9.4.2. Local de realizao ............................................................................................................. 357 9.4.3. Metodologia ......................................................................................................................... 358 9.5. RESULTADOS E DISCUSSES ......................................................................................................... 359 9.5.1. Atividade inibitria enzimtica de V. polygama sobre a GAPDH........................................ 359 9.5.2. Atividade inibitria enzimtica de V. polygama sobre a APRT ........................................... 364 9.5.3. Atividade inibitria enzimtica de S. densiflora sobre a GAPDH........................................ 366 9.5.4. Atividade inibitria enzimtica de S. densiflora sobre a APRT ........................................... 370 9.5.5. Atividade de S. densiflora sobre S. frugiperda.................................................................... 371 9.5.6. Atividade de V. polygama sobre S. frugiperda.................................................................... 375 9.5.7. Atividade de V. polygama sobre o T. cruzi.......................................................................... 379 9.5.8. Atividade de S. densiflora sobre o T. cruzi.......................................................................... 383 9.5.9. Atividade de S. densiflora e V. polygama sobre o fungo Leucoagaricus gongylophorus simbionte de Atta sexdens rubropilosa.............................................................................................. 385 9.5.10. Atividade de S. densiflora e V. polygama sobre microrganismos....................................... 386 9.5.11. Atividade de S. densiflora e V. polygama sobre a enzima pectinase ................................. 390 9.5.12. Atividade dos taninos sobre as enzimas GAPDH e APRT ................................................. 392
10. 11. 12. CONCLUSES .............................................................................................................................. 395 PERSPECTIVAS............................................................................................................................ 399 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................................. 401

9.3.5.1. Mtodo de difuso em gar utilizando-se discos de papel de filtro (BAUER et al., 1966)..............354 9.3.5.2. Determinao da concentrao inibitria mnima (MIC) pelo mtodo da microdiluio com Alamar Blue (MABA) ..................................................................................................................................................355 9.3.5.3. Determinao da concentrao inibitria mnima (MIC) pelo mtodo do TTC ...............................356

xli

xlii

1.Introduo

1.1. Histrico
O homem vem utilizando vrios produtos de origem natural para o tratamento de doenas e a manuteno da sade h sculos (KOROLKOVAS & BURCKHALTER, 1988). Dentre estes produtos naturais, as plantas originaram as primeiras substncias desenvolvidas como frmacos. So conhecidas 250 mil espcies de plantas florferas, mas apenas 10 % foram estudadas quimicamente. Um enorme arsenal de substncias qumicas, com um grande potencial farmacolgico, se coloca a nossa frente (ROUHJ, 2003), pois o Brasil o pas que possui o maior nmero de espcies de angiospermas no planeta (MITTERMEIER et al., 1992). Porm, devido automao, robtica, descobertas da biologia molecular em identificar alvos biolgicos e afirmao de que os produtos naturais eram irrelevantes para a maioria das doenas humanas, eles foram deixados de lado na dcada de 90, havendo um crescente desinteresse da indstria por este tipo de pesquisa (ROUHJ, 2003). No entanto, nos ltimos anos, ressurgiu o interesse pela investigao de produtos naturais na busca de novas substncias ativas como compostos de partida para o desenvolvimento de frmacos, j que o nmero de novas entidades qumicas caiu de uma mdia de 30 para 17 na ltima dcada, como pode ser visualizado no grfico da Figura 1-1 (NEWMAN et al., 2003). Aliados aos grandes avanos tecnolgicos e cientficos em cultura de clulas, as tcnicas de extrao e de identificao estrutural, os processos de triagem (onde um grande nmero de substncias pode ser testado de maneira automatizada), a gentica, a bioqumica de protenas, a biologia estrutural e a qumica sinttica tm convergido para criar um futuro promissor entre as cincias de produtos naturais e o desenvolvimento de novos frmacos (ROUHJ, 2003).

Nmero

Ano

Figura 1-1- Todas as novas entidades qumicas organizadas por fonte/ano desde
1981 a 2002 (NEWMAN et al., 2003)
Legenda da figura: V: vacina; S*/NM: sinttico com farmacforo e mimetizador de produto natural; S*: sinttico com farmacforo de produto natural; S/NM: sinttico mimetizador de produto natural; S: totalmente sinttico; ND: derivado de produto natural com modificao semissinttica; N: produto natural; B: biolgico

A descoberta de novos agentes teraputicos inicia-se sempre pela busca de uma molcula que cause uma resposta biolgica especfica: um prottipo (ROUHJ, 2003). Vrios tipos de bioensaios tm sido usados para monitorar o fracionamento de extratos brutos vegetais, usando principalmente organismos alvo, como parasitas, microrganismos, linhagens de clulas cancergenas etc. Na maioria dos casos o receptor especfico da substncia no conhecido, o que pode dificultar o desenvolvimento de um medicamento. O uso de receptores especficos, como enzimas alvo, atravs de ensaios bioqumicos, representa uma tima estratgia na busca de substncias bioativas e, recentemente, vem sendo empregada na busca de compostos de partida anti HIV (MAHATO & SEM, 1997), para a terapia anticncer (FANG et al.,
3

1993); inseticidas (YU & ABO-ELGHAR, 2000) e tripanocidas (LEITO et al., 2004). Nesta rea, vrias classes de produtos naturais apresentaram atividade de inibio enzimtica, entre elas: flavonides, cumarinas, antraquinonas, steres de cido glico, triterpenos cidos, taninos condensados e hidrolisveis e alcalides. Segundo NEWMAN et al. (2003), entre 1981 e 2002, 61 % das 877 molculas novas introduzidas como frmacos no mundo foram provenientes de ou inspiradas em produtos naturais: 6 % incluiam produtos naturais; 27 % eram derivadas de produtos naturais; 5 % eram sintticos com farmacforos derivados de produtos naturais e 23 % sintticos mimetizadores de produtos naturais. Entre as 137 novas entidades qumicas, molculas de baixo peso molecular, na fase II ou III das triagens clnicas em junho de 2003, 59 % eram produtos naturais, derivadas ou inspiradas em produtos naturais (NEWMAN et al., 2003). Faz muito sentido usarem-se produtos naturais como lderes para o desenvolvimento de novos frmacos, pois eles integram os elementos de conservadorismo e diversidade simultaneamente expressados pelos alvos biolgicos (NEWMAN et al., 2003).

1.2. Aspectos geogrficos do local de coleta das espcies vegetais

Segundo VICENZI et al. (1992), o Planalto de Poos de Caldas, Estado de Minas Gerais, tambm chamado Macio de Poos de Caldas, est situado entre a parte oeste da Serra da Mantiqueira e o bordo leste da bacia sedimentar do Rio Paran. uma regio que abrange aproximadamente 800 km2 de superfcie, dentro das coordenadas geogrficas de longitude 46 a 47 W de Greenwich e latitude 21 e 22 S, a sudoeste de Belo Horizonte, da qual dista de 460 Km. O clima desta regio sofre interferncia da sua topografia e do seu relevo movimentado, onde ocorrem altitudes mdias de 1200 a 1400 m acima do nvel do mar, com pontos que superam os 1600 m. Nessas condies, a circulao atmosfrica, de origem tropical, influenciada por correntes de ar do quadrante sul e por sistemas localizados de vale-montanha. Sendo assim, as condies mdias do clima permitem caracteriz-lo como do tipo Tropical Mesotrmico Brando Sub-mido, com veres
4

quentes, algumas geadas, concentrao de chuvas no vero e estao seca nos meses de inverno. A temperatura mdia anual de 18C, ocorrendo uma grande amplitude trmica, sendo registradas as temperaturas mxima absoluta de 34C e mnima absoluta de -4C. A mdia anual das precipitaes pluviomtricas est entre 1500 mm a 1750 mm, sendo que de meados de maio a meados de outubro ocorre o perodo de seca. O ms mais seco tem at 30 mm de chuva em mdia, podendo ser zero em certos anos. A umidade relativa do ar varia ao longo do dia e tambm da estao, podendo chegar a nveis baixos na poca do inverno. O macio de Poos uma intruso de rochas alcalinas em rochas prexistentes de granitos e gnaisses do escudo cristalino e arenitos, apresentando uma predominncia de rochas nefelnicas, tinguatos, foatos e fonolitos. Nefelnica a rocha rica em silicatos de alumnio e sdio, cujos principais minerais so feldspatos sdico e nefelina. Submetida a intensos processos de meteorizao e eroso, a poro central do macio foi dissecada, destacando-se as bordas perifricas que oferecem maior resistncia decomposio, que justamente so as rochas alcalinas nas quais ocorre a bauxita. Essas bordas alcanam altitudes de 300 a 600 m acima das reas circunvizinhas. As bordas apresentam-se segundo um formato anelar, dando a impresso, quando observadas atravs de fotografias areas, de se tratarem de bordas erodidas de um antigo e enorme vulco que jamais existiu. A rede de drenagem que banha o Planalto de Poos integra a bacia do rio Paran. no macio que nascem alguns dos rios que formaro o rio Grande que, juntamente com o Paraba, formam o rio Paran. So todos rios de planalto e, como tal, apresentam trechos curtos de navegabilidade, porm, em contrapartida, elevado potencial de aproveitamento hidreltrico. O rio que se destaca o das Antas, que um tributrio do rio Pardo. Na regio de Poos predominam solos classificados como latossolos, de colorao avermelhada e com espessura variando de 150 a 200 cm. Em geral, so porosos e bem drenados, com textura argilosa. So, normalmente, cidos e, para as prticas agrcolas, necessitam de correo (calagem) e adubao.

So trs os tipos de vegetao predominantes na regio: a floresta subtropical subcaducifolia, os campos de altitude e formaes com espcies de cerrado, sendo uma rea de transio entre diferentes formaes. As famlias das espcies arbreas predominantes na regio so Laurceas, Voquisiceas, Mirtceas e Euforbiceas (VICENZI et al., 1992).

1.3. Vitex polygama Chamisso

Esta espcie pertence ordem Lamiales, famlia Verbenaceae

(MOLDENKE, 1957; CRONQUIST, 1981), subfamlia Viticoideae (BRIQUET, 1895). O nome Vitex de raiz latina, viere, que siginifica juntar, tecer, em aluso aos ramos flexveis com os quais podem ser tecidos cestos. O nome polygamo, tambm com raiz latina, significa aquela planta que conduz, sobre o mesmo indivduo, flores hermafroditas e unissexuais (RIZZINI & RIZZINI, 1983). largamente aceito que a famlia Lamiaceae evoluiu da Verbenaceae, e que o limite entre as duas famlias arbitrrio. Tradicionalmente, a famlia Lamiaceae se distingue da Verbenaceae de acordo com a estrutura do gineceu (reunio de carpelos ou rgos femininos da flor). A classificao de subfamlia a proposta por BRIQUET (1895) que, baseada nos tipos de inflorescncia e posio dos vulos, origina 7 subfamlias: Verbenoideae, Chloanthoideae, Viticoideae, Caryopteridoideae, Symphoremoideae, Stilboideae e Avicennioideae. As trs ltimas subfamlias so, algumas vezes, segregadas como famlias (VON POSER et al., 1995 e 1997). Baseando-se em estudos morfolgicos do gineceu (JUNELL, 1934), a famlia Verbenaceae ficou restrita subfamlia Verbenoideae, consistindo de 6 tribos: Verbeneae, Lantaneae, Privaceae, Petreeae, Citharexyleae e Casselieae (TRONCOSO, 1974). CANTINO et al. (1992) introduziram o gnero Vitex na famlia Lamiaceae (ou Labiateae) e subdividiram-na em oito subfamlias: Ajugoideae (ou Teucrioideae); Scutellarioideae; Lamioideae; Nepetoideae; Chloanthoideae; Viticoideae e Pogostemonoideae. O estudo fitoqumico das espcies destas famlias tende a contribuir para a resoluo dos impasses acima discutidos. O gnero Vitex possui cerca de 250 espcies registradas na sia, Amricas do Sul e Central, Caribe, frica e Europa. bem representado no Brasil,
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ocorrendo desde a Regio Amaznica at o Estado do Rio Grande do Sul (MOLDENKE, 1957). A espcie aqui apresentada (Figura 1-2; Figura 1-3) tem a casca do caule e frutos tradicionalmente usados como emenagogo e as folhas como diurtico (CORREA, 1926). No Brasil, pode ser encontrada nos estados do Esprito Santo, Distrito Federal, Par, Paran, Minas Gerais, Rio de Janeiro e So Paulo. conhecida popularmente como Azeitona do Campo, Maria-Preta, Tarum e Velame do Campo (MOLDENKE, 1957). Segundo MOLDENKE (1957), seu tamanho varia de arbustivo a arbreo, podendo chegar a 20 m de altura e o tronco com 15 cm de dimetro. Apresenta galhos grossos, marrom-acizentados, subcilndricos ou visivelmente achatados de modo tetragonal; flexveis e densamente tomentosos ou vilosos, menos pubescentes medida que envelhecem, principalmente nos ndulos. Os plos so amarelados ou ferruginosos e aveludados; os ndulos medem de 1,0-9,5 cm de comprimento. As folhas so opostas cruzadas, 5-folioladas (raramente 3), totalmente desenvolvidas quando na poca da florao (antese); pecolos grossos, de 3,5-17,0 cm de comprimento, densamente tomentosos ou vilosos, como os galhos. Convexos na base, achatados no pice. Os fololos so semelhantes s folhas ou consideravelmente reduzidos, todos geralmente com pecolos curtos de 1,0-14,0 mm de comprimento, sendo que os centrais so freqentemente mais longos do que os laterais, todos mais ou menos marginados (bordos espaados) e tambm densamente tomentosos. A lmina foliolar submembranosa ou muito fina quando jovem; subcoricea quando totalmente desenvolvida; verde escura na face superior (freqentemente pardacenta quando seca); amarelo-amarronzada ou ferruginosa na face inferior; elptica (oval) ou oblonga, variando levemente de suboval a oboval, 5,5-22,0 cm comprimento; 1,7-10,0 cm de largura, aguda ou acuminada no pice, com as margens inteiras ou levemente onduladas (raramente serreadas nos brotos); aguda ou acuminada na base, densamente pubescente ou velutinosa na face inferior, com plos amareloamarronzados ou ferruginosos. As lminas laterais so semelhantes central, com exceo do tamanho e que, algumas vezes, so assimtricas. As nervuras so reticuladas e abundantes, indiscernveis ou obscuras na face superior (nas folhas
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jovens) ou subimpressas (nas folhas velhas), sendo que somente as partes mais largas so proeminentes, geralmente escondidas pelo tomento denso. encontrada habitando campos, especialmente cerrados, florestas primitivas, capoeiras e clareiras arenosas at 1500 m acima do nvel do mar, em Minas Gerais. A madeira usada nas construes civis. Floresce de setembro a janeiro e frutifica de dezembro a junho. A inflorescncia axilar, cimosa, abundante, 3,5-7,5 cm de comprimento, 2,0-4,5 cm de largura, geralmente pouco florida, mas densa, uma ou duas vezes furcada, notavelmente bracteolada, densamente tomentosa, subvilosa ou totalmente pubescente, plos amarelo-amarronzados ou ferruginosos (aveludados quando jovens); pednculos delgados ou ligeiramente grossos, 5,0 cm comprimento ou muito reduzidos, achatados, tomentosos ou vilosos; pedicelos grossos com 1,0 mm comprimento ou obsoletos; numerosas bractolas, oblongas ou lanceoladas, 2,0 mm comprimento, 3,0 mm largura, ssseis, escuras na face superior, claras na face inferior, densamente pubescentes; flores ssseis ou subssseis; clice herbceo, campanulado ou obcnico, densamente viloso-velutneo com plos amarelos ou ferruginosos, tubo com 6,0-8,0 mm de comprimento; 4,0-6,0 mm largura; margem profundamente 5lobada, lobos lanceolados, 2,0-4,8 mm comprimento, acuminados. Corola hipocrateriforme, variando de azul, violeta plida ou rosada, branca ou amarela na base, com tubo largamente cilndrico, cerca de 1,5 cm de comprimento, 3,5-5,0 mm largura, levemente alargado no pice, densamente amarelo-tomentoso na face externa acima do clice, ptalas com 1,0-1,5 cm largura, bilabiadas, os quatro lobos menores oblongo-lanceolados, cerca de 5,0 mm comprimento e 6,0-7,0 mm largura, onduladocrispados ao longo das margens, barbados em direo base, pubrulos em ambas as faces; estames e estiletes livres cerca de 5,0 mm para fora do tubo da corola; ovrio densamente pubescente, pardo. As flores, que aparecem principalmente entre novembro e dezembro, so mui procuradas por mamamgabas e abelhas silvestres. Fruto tipo drupa, preto ou preto-avermelhado, elptico ou esfrico, suculento, cerca de 1,5 cm comprimento e largura, comestvel, embora com sabor pouco convidativo, com caroo grande e ptreo. Na poca do amadurecimento dos frutos, entre maro-maio, essas rvores so muito freqentadas por diversos pssaros frugvoros como os sabis e sanhaos. Foram encontrados caroos inteiros do fruto em dejees de Jacus. HOEHNE, citado por MOLDENKE (1957), escreveu: ainda nos recordamos como,
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quando meninos, ficvamos escondidos sob os ramos de rvores do pomar de casa, para esperarmos os periquitos que vinham comer essas preciosas negras drupas da Maria-Preta, que no pomar havia sido poupada para, entre as fruteiras exticas, apresentar a fartura para os ditos psitacdeos. To entretidas ficavam as aves no banquete, que podamos passar-lhes o lao de cerdas de rabo de cavalo por sobre a cabea, sem que notassem o movimento da ponta de bambu ou ainda sentissem o instrumento, antes de serem puxadas para baixo. Essas drupas, um pouco maiores do que cerejas, aparecem em tal profuso nesta planta, que ela toda se mostra negra entre o verde da folhagem.

1.3.1.

Perfil Qumico de V. polygama Cham.

Segundo BRITO (1986), os compostos predominantes da ordem Lamiales

so originados da via do mevalonato, sendo o perfil qumico da famlia Verbenaceae caracterizado por metablitos secundrios tipo neolignanas, lignanas, naftoquinonas preniladas, iridides carbocclicos, terpenides e aromticos. De acordo com JUDD et al. (2001), a qumica de Verbenaceae e Lamiaceae semelhante. O gnero Vitex tem sido amplamente estudado, apresentando diversas substncias identificadas como ecdisterides, iridides glicosilados, diterpenos do tipo labdano, flavonides C-glicosilados, triterpenos, lignanas entre outras (TAVARES et al., 1999; ONO et al., 1998; DUTTA et al., 1983; SEHGAL et al., 1982; CHAWLA et al., 1992a.; SUKSAMRARN & SOMMECHAI, 1993; BARBOSA et al., 1995; WERAWATTANAMETIN et al., 1986; SANTOS et al., 2000; LEITO et al., 1997; LEITO & DELLE MONACHE, 1998; CHAWLA et al., 1992b; HERNNDEZ et al., 1999; SEIKEL et al., 1966). Algumas espcies apresentam atividade inseticida (HERNNDEZ et al., 1999), antivirtica (LEITO et al., 1997), antiinflamatria (CHAWLA et al., 1992a), citotxica (HIROBE et al., 1997) etc. A espcie V. polygama no indita do ponto de vista fitoqumico. A deciso de se estud-la novamente residiu no fato da espcie possuir uma grande quantidade de metablitos secundrios, principalmente flavonides, que poderiam ser testados nos ensaios propostos para este trabalho. Variadas substncias foram identificadas anteriormente e podem ser conferidas na Tabela 1-1.
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Figura 1-2 - Vitex polygama Cham.

Foto maior: coleta de frutos em maio de 2002 Foto menor: frutos de vrios tamanhos e estgios de maturao (fotos da autora).

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Figura 1-3- Desenho de Vitex polygama Cham. (desenho de Suzana G. Leito)

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Tabela 1-1- Substncias isoladas anteriormente de V. polygama

ORIGEM Folha Folha Folha Folha Folha Folha Folha Folha Folha Galho Galho Galho Galho Galho Folha Folha Folha Folha Folha SUBSTNCIA 2-O-cafeoil-orientina orientina * vitexina * luteolina

CLASSE Flavona C-glicosilada acilada Flavona C-glicosilada Flavona C-glicosilada Flavona C-glicosilada Flavona C-glicosilada Flavona Flavonol

isoorientina * isovitexina *

quercetina

3-metoxiquercetina

Flavonol cido Fenlico Ecdisteride Ecdisteride Ecdisteride Ecdisteride Esterol ster de fenilpropanide ster de fenilpropanide de de ster de fenilpropanide Hidrocarboneto Sesquiterpeno

cido p-hidroxibenzico 20-hidroxiecdisona * ajugasterona C *

monoacetonido de ajugasterona C * turkesterona * 3-O--D-glucopiranosilsitosterol * 3,4-dicafeoilquinato de metila * 3,5-dicafeoilquinato de metila * 3-(3,4-diidroxifenil)-2-propenoato etila (cafeato de etila) hentriacontano, espatulenol
-pineno, -pineno, limoneno, trans-

hexacosanoato

tetracosanoila, nonacosano

pinocarveol, terpin-4-ol, -cadineno, leo essencial de folhas cariofileno, -elemeno, -cubebeno, copaeno, curcameno

elemeno, Z--farneseno,

Monoterpeno e Sesquiterpeno

humuleno, allo-aromadendreno, ar-

*SANTOS, 2000; LEITO & DELLE MONACHE, 1998; BARBOSA et al., 1995;

LEITO et al., 1999.

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1.4. Siphoneugena densiflora Berg

Esta espcie pertence ordem Myrtales; famlia Myrtaceae; subfamlia Myrtoideae; tribo Myrteae (PROENA, 1990; JUDD et al., 2001). O nome Siphoneugena tem raiz latina, siphone, sifo; raiz grega, eugneia, propcia reproduo; raiz latina, densiflora, que tem flores numerosas e prximas (RIZZINI & RIZZINI, 1983). O gnero Siphoneugena pequeno, sendo composto por oito espcies. Ocorre desde Porto Rico at ao norte da Argentina, com centro de diversidade no sudeste do Brasil. Pertence subtribo Eugeniinae e um dos gneros especializados segregados do gnero Eugenia por Berg (PROENA, 1990). Segundo PROENA (1990), a espcie arbrea (Figura 1-4), podendo atingir at 12 m de altura. Habita campos rupestres, cerrades e florestas de galerias no Sul de Gois, Distrito Federal, Minas Gerais e So Paulo. conhecida vulgarmente como Maria-Preta, Murta (Distrito Federal) e Uvatinga (So Paulo). Os galhos jovens so lisos, glabros ou pubrulos, tornando-se levemente estriados com a idade, no cascudos. Folhas com glndulas translcidas; nervura mdia surgindo mais ou menos do mesmo ponto em ambas as superfcies; nervuras laterais idem; nervura marginal quase reta. Pecolo 3,0-14,5 x 1,0-2,0 mm, glabro ou pubrulo. Lmina foliar 4,0-13,7 x 1,4-5,0 cm, ovada a elptica, glabra ou com poucos plos delgadamente esparsos e prximos base; pice abrupto ou longo-cnico acuminado; base aguda; face superior contendo glndulas subepidermais rentes superfcie ou ligeiramente afundadas. Racemos com (1-)2-7(-14) flores, 0,8-2,7 cm, pubrulos a glabros, raque (eixo da inflorescncia) de 1,0-1,7 cm; brcteas e bractolas glabras a pubrulas, cerca de 1,0 mm, largamente triangulares a lanceoladas; geralmente persistentes no fruto. Pedicelo (haste que sustenta cada flor) 0-15,0 mm, mas as flores terminais so ssseis algumas vezes. Botes com 3,5 x 2,0-3,0 mm, glabros ou pubrulos. Antese pela abertura dos lbulos do clice, raramente com rasgo entre os lbulos; lbulos do clice depois da antese 1,0 x 1,0-1,5 mm. Estilete 4,5-7,0 mm; vulos 3-7 por lculo. Hipanto geralmente constrito (apertado) entre o clice e o ovrio; clice hipantial cerca de 2,0 x 3,0 mm. Ptalas 1,5-2,5 x 1,5-2,0 mm, irregularmente ovais a orbiculares (o dimetro
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longitudinal igual ao transversal). Estames 1,5-5,0 mm, de 65-110 unidades. Ovrio bilocular ou raramente trilocular, cerca de 1,0 x 1,0-2,0 mm, redondo ou em formato de fuso. Fruto tipo baga indeiscente, 9,0-12,0 mm de dimetro; epicarpo brilhante de cor vinho; mesocarpo carnudo com sabor doce adstringente. Sementes 1-4. Embrio 6,07,0 x 4,0-6,0 mm, esferide a elipside; cotildones com glndulas afundadas na superfcie intercotiledonria (PROENA, 1990).

Figura 1-4- Siphoneugena densiflora var. densiflora.

A: habitat; B: boto da flor; C: embrio; D: pice da inflorescncia (desenho de Carolyn Proena em PROENA, 1990)

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1.4.1.

Perfil Qumico de S. densiflora Berg

Segundo BRITO (1986), os compostos predominantes da ordem Myrtales

so originados das trs vias metablicas: chiquimato, mevalonato e acetato/malonato. A via acetato/malonato leva formao de substncias de natureza policetdica. A via mevalonato forma substncias terpenodicas e a via do chiquimato forma compostos lignides. Assim sendo, taninos glicos, elgicos, flavonides, aromticos, terpenos, estilbenos, floroglucinis, acetofenonas e cumarinas so exemplos de classes de substncias que podem ser encontradas nesta ordem. Vale ressaltar que os taninos glicos e elgicos so derivados de metablitos iniciais da via do chiquimato e constituem marcadores sistemticos das angiospermas, pois nunca foram encontrados em monocotiledneas (BRITO, 1986). Derivados do cido elgico so largamente encontrados na ordem Myrtales, sendo que alguns deles s ocorrem em famlias pertencentes a esta ordem (GIBBS, 1974). Apesar do seu grande valor econmico, devido ao seu espcime mais importante na indstria do papel, o eucalipto, a famlia Myrtaceae tem sido pouco explorada quanto ao seu potencial qumico, sendo uma das famlias botnicas menos investigadas. Algumas razes se revelam para tal desinteresse, figurando como principal a dificuldade de classificao taxonmica em decorrncia das grandes semelhanas morfolgicas entre seus representantes. constituda por 144 gneros, incluindo cerca de 3100 espcies (KAWASAKI, 1984; JUDD et al., 2001). A espcie S. densiflora indita quanto ao estudo fitoqumico e no apresenta uso popular registrado. No entanto, o gnero Eugenia, do qual Siphoneugena foi segregado, comportando 400 espcies, tem sido amplamente estudado, sendo usado na medicina popular para inmeros fins, como, por exemplo, antiinflamatrio, analgsico, antipirtico, antifngico, no tratamento de lcera pptica, antidiabtico (MAHMOUD et al., 2001), digestivo, eupptico, carminativo (LEE et al., 1997), anti hipertensivo (PAINULY & TANDOM, 1983) e com propriedades tripanocidas sobre T. congolense e T. brucei com LD50 de 12,5 e 66,7 g/mL (ADEWUNMI, et al., 2001). Os taninos, comuns neste gnero, tm largo emprego na indstria de curtume como tanantes (EL-SHERBEINY & SALEH, 1974). Alm destes, vrios outros metablitos secundrios tm sido relatados: derivados polifenlicos do cido glico e
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elgico, flavonis glicosilados (MAHMOUD et al., 2001), C-metil-flavonas glicosiladas (PAINULY & TANDOM, 1983) e muitos triterpenos com esqueletos do tipo lupano, ursano e oleanano (JUNGES, 1994).

1.5. Doena de Chagas

A Doena de Chagas, ou tripanossomase americana, causada pelo protozorio Trypanosoma cruzi e afeta aproximadamente 18 milhes de pessoas principalmente nas Amricas do Sul e Central, e tambm se manifesta em reas metropolitanas dos Estados Unidos, com cerca de 50 a 100 mil pessoas infectadas, principalmente imigrantes da Amrica Central (WENDEL et al., 1992; Doena de Chagas, 2003). No Brasil, cerca de 5 milhes de pessoas esto infectadas, sendo que 300 mil delas se situam no estado de So Paulo (VERONESI, 1991). Por sua grande difuso e gravidade das manifestaes que pode acarretar, alm da grande perda econmica (US$ 8,156 milhes, o equivalente a 2,5 % da dvida externa do continente americano inteiro em 1995) devido mortalidade e inatividade de indivduos jovens no auge de sua produtividade, a doena ainda representa um srio problema de sade pblica (Doena de Chagas, 2003). O vetor de transmisso um inseto conhecido popularmente como barbeiro (Triatoma infestans, ordem Hemiptera, famlia Reduvidae, subfamlia Triatominae). noite ou durante o dia em ambiente escuro, esses insetos saem de seus esconderijos, normalmente frestas de parede, colches, tetos de palha ou barro, para sugar o sangue das partes descobertas do mamfero hospedeiro. Uma vez infectado, o indivduo passa por duas fases: aguda e crnica. A fase aguda caracterizase normalmente pela manifestao de sintomas 8 a 10 dias aps a contaminao. Alm de inflamao local, que depende do mecanismo de entrada, ocorrem sintomas gerais como febre, mal estar e cefalia. Alguns rgos como, por exemplo, o corao, fgado e bao, apresentam aumento de volume. Com a regresso das manifestaes da fase aguda, o paciente entra em um estado de cura aparente, podendo permanecer assintomtico durante um longo perodo de tempo, o que caracteriza a chamada fase crnica da doena. Durante esta fase os sintomas associados ao corao podem
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permanecer: arritmias, insuficincia cardaca e tromboembolismo, levando o paciente a ter dores e palpitaes associadas a esforos fsicos. No estgio final da doena, a deficincia cardaca e as inflamaes gastrointestinais resultam em 10 % de casos fatais (MARKELL et al., 2003).

1.5.1.

Quimioterapia
Desde a descoberta da doena pelo mdico sanitarista Carlos Chagas

(1909) at os dias atuais, tm sido realizadas inmeras tentativas de tratamento, sem se obter, entretanto, um medicamento que fosse totalmente eficaz. Em 1961, iniciou-se um perodo de tentativas que resultou, e o principalmente, em dois medicamentos nitroderivados muito utilizados: o nifurtimox (3metil-4(5-nitrofurfurilidenamino)-tetraidro(1,4)-tiazina-1,1-dixido; LAMPIT) benzonidazol (N-benzil-2-nitro-1-imidazolacetamida; ROCHAGAN, Figura 1-5). O nifurtimox, que inibe o desenvolvimento das formas sangunea e intracelular do T. cruzi a uma concentrao de 1 M in vitro (GILMAN et al., 1983), saiu do mercado desde 1997, devido a suspeitas de ser cancergeno e mutagnico. Alm disso, causava vrios efeitos gastrintestinais adversos, tornando-o pouco tolerado, principalmente por adultos. Poucos pacientes completavam o total de 120 dias de tratamento, que era o perodo recomendado para a cura de casos crnicos. Quanto ao benzonidazol, usado principalmente na Argentina, Brasil e Chile desde 1978, as reaes so principalmente na pele (similar urticria), neurite e diminuio dos glbulos brancos no sangue. Em alguns pacientes tais reaes so to intensas que obrigam a suspenso do tratamento (MARTINDALE). Este medicamento 80 % eficiente na cura da doena na fase aguda. Seu mecanismo de ao se d atravs da inibio da sntese de cido nuclico. Um estudo recente mostrou os resultados do acompanhamento de 91 pacientes, portadores da Doena de Chagas, sendo tratados com nitroderivados por 10 anos. A concluso foi de que a terapia base de nitroderivados (Figura 1-5) insatisfatria e no pode ser recomendada, pois falha na erradicao do parasita e pode mudar a progresso da doena cardaca nos pacientes crnicos (LAURIA-PIRES et al., 2000).
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N(CH3)2 .Cl

N NO2

NH O

(CH3)2N

N(CH3)2
Violeta Genciana

Benzonidazol

OH N N N H O2N
Alopurinol

O
Nifurtimox

N N

SO2

Figura 1-5- Estruturas qumicas de compostos utilizados no tratamento qumico e

profilaxia da Doena de Chagas

alopurinol

(4-hidroxipirazol[3,4-d]pirimidina)

parece

ser

um

medicamento to eficaz no tratamento da infeco por T. cruzi, bem como no das leishmanases, tanto quanto o benzonidazol. Os sistemas enzimticos destes organismos, diferentemente dos do homem, transformam o alopurinol em anlogos txicos da adenina. Reaes adversas, tais como dermatite pruriginosa generalizada, dor epigstrica, diarria e polineurite transitrias, ocorrem em 11 % dos pacientes, contra 30 % daqueles em tratamento com benzonidazol (MARKELL et al., 2003). Alguns esforos tambm tm sido feitos para buscar tratamentos alternativos, j que as perspectivas, a um curto prazo, para novos medicamentos eficazes no tratamento da doena so inexistentes, principalmente devido ao descaso da indstria farmacutica em produzir e comercializar medicamentos que seriam dirigidos basicamente para populaes muito pobres de pases subdesenvolvidos (Pesquisa FAPESP, 2000). Por exemplo, a combinao do benzonidazol com o antifngico cetoconazol produziu um efeito sinrgico na quimioterapia com o nitroderivado em ratos infectados com a cepa Y do T. cruzi (ARAUJO et al., 2000).

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1.5.2.

Quimioprofilaxia
Os movimentos de migrao rural/urbano que ocorreram na Amrica

Latina entre os anos de 1970-1980 transformaram o modelo epidemiolgico da doena, caracterizando-o como uma infeco urbana. Com o controle da populao de barbeiros, tambm a partir da dcada de 70, a utilizao de sangue contaminado em bancos de sangue passou a ser a principal forma de transmisso da doena nas Amricas do Sul e Central. As estatsticas demonstram nmeros que variam entre 3 e 53 %, mostrando que a prevalncia de sangue infectado por T. cruzi maior do que a infeco por HIV, hepatite B e C (Doena de Chagas, 2003). Esse fato passou a ter um efeito mais acentuado principalmente com as crescentes migraes. No Brasil, estima-se que existam aproximadamente 2 milhes de indivduos infectados vivendo em centros urbanos, cuja grande maioria so migrantes de reas rurais endmicas (Doena de Chagas, 2003). De acordo com dados obtidos entre 1988-1989 de 850 municpios do pas, apenas 56,9 % dos bancos de sangue realizavam testes sorolgicos para doena de Chagas. Ainda que um grande nmero de substncias qumicas tenha sido testado como quimioprofilticos na doena de Chagas, somente a violeta de genciana (cloreto de hexametilrosanilina; CI50 31 g/mL, Figura 1-5) recomendada pela OMS (Doena de Chagas, 2003). O fato de induzir danos hemostticos em plaquetas e alterar a colorao do sangue e urina, explica o uso cada vez menor da violeta de genciana na esterilizao de sangue (RIBEIRO & PIL-VELOSO, 1997). Os parasitas tripanossomatdeos so conhecidos por serem muito sensveis a alteraes no seu balano redox. A primeira linha de defesa contra peroxidantes, como nos hospedeiros mamferos, consiste na glutationa reduzida (GSH). Eles no tm a enzima glutationa redutase (GR) e mantm seu nvel de GSH atravs de reaes no enzimticas com a tripanotiona (T[SH]2, 18,-bis-glutationilespermidina) e a 1-glutationilespermidina, sendo estes compostos mantidos na sua forma reduzida pela ao da tripanotiona redutase (TR), enzima especfica dos tripanossomatdeos. A violeta genciana inibe a TR do T. cruzi atravs de mecanismo de competio com um Ki = 5,3 M (SEPLVEDA-BOZA & CASSELS, 1996).

19

Algumas sugestes tm sido feitas para se ter substitutos mais convenientes, como o caso, por exemplo, de antioxidantes usados na indstria alimentcia como o BHT (2,6-di-terc-butil-4-hidroxitolueno) e o BHA (2-mono- e 2,6-diterc-butilato de 4-hidroxianisol). Alguns produtos naturais que apresentem baixa toxicidade e qualidades antioxidantes potentes, como flavonides e taninos, tambm podem vir a ser mais apropriados do que os antioxidantes sintticos, se a atividade tripanocida deles contra a forma infectante do T. cruzi provar ser adequada (SEPLVEDA-BOZA & CASSELS, 1996).

1.5.3.

Produtos naturais tripanocidas

Na Bolvia, algumas plantas so indicadas para o tratamento da doena

de Chagas, porm no atuam sobre o parasita, sendo efetivas sobre alguns sintomas, como o caso do Sangre de Drago (Croton roborensis), ch de flores de Retama (Spartum juncum) com Lippia triphylla e Melissa officinalis para tranqilizar ataques do corao (BOURDY et al., 2000). Com o objetivo de se identificar novos agentes quimioprofilticos para bancos de sangue e quimioteraputicos, muitos produtos naturais tm sido testados contra culturas de T. cruzi ou mamferos infectados. O triterpeno tingenona (Figura 1-6) mostrou ser to efetivo contra as formas epimastigotas de T. cruzi in vitro quanto o nifurtimox e mais do que o benzonidazol (CI50 = 12 e 40 M, respectivamente), inibindo completamente o crescimento do parasita a 30 M (12 g/mL). O flavonide quinnico 3R-claussequinona (Figura 1-6) produziu 100 % de lise de formas tripomastigotas de T. cruzi in vitro a uma concentrao de 100 M (SEPLVEDA-BOZA & CASSELS, 1996). Os flavonides sacuranetina e penduletina (Figura 1-6) apresentaram 100 e 86 % de atividade tripanocida em formas epimastigotas de T. cruzi in vitro com concentraes de 500 g/mL (CI50 violeta genciana = 31 g/mL, 100 % lise= 250 g/mL) (RIBEIRO & PIL-VELOSO, 1997). As lignanas caerofilina e cubebina produziram 100 % de lise em formas tripomastigotas, cepa Boliviana, de T. cruzi in vitro na concentrao de 25 e 50 g/mL (BASTOS et al., 1999), mas no reproduziram to boa atividade contra a cepa Y. J as lignanas grandisina e veraguensina, a uma concentrao de 5 g/mL, causaram 100 % lise na cepa Y (LOPES et al., 1998). A naftoquinona metoxilapachol
20

apresentou um ED50/24h de 164,8 mol/L sobre as formas tripomastigotas, cepa Y, de T. cruzi in vitro contra um ED50/24h de 536,0 mol/L da violeta genciana (MOURA et al., 2001). O monoterpeno terpinen-4-ol apresentou um ED50 de 0,02 g/mL em formas sanguneas de T. brucei contra 0,5 g/mL do Suramin (MIKUS et al., 2000).
COOCH3 MEO O OH

O HO HO Tingenona OH MeO MeO HO O Penduletina O OMe O O Caerofilina MeO O MeO O H H O O O O Sakuranetina O

O O Cubebina

MeO O MeO OMe Grandisina O OMe O 3R-Claussequinona Metoxilapachol HO O O OMe OMe MeO OMe OMe Veraguensina O

OMe OMe

OMe

Figura 1-6- Produtos naturais com atividade tripanocida

21

1.6. Trypanosoma cruzi

O T. cruzi um protozorio flagelado da classe Mastigophora, ordem Kinetoplastida, famlia Trypanosomatidae. Este parasita tem um ciclo de vida complexo que inclui sua passagem tanto no inseto (hospedeiro intermedirio) quanto no mamfero (hospedeiro definitivo, incluindo o homem) e apresenta a caracterstica nica de se dividir no interior das clulas do hospedeiro definitivo e no no sangue perifrico. Durante seu ciclo de vida, apresenta-se sob trs formas: tripomastigota, epimastigota e amastigota (MARKELL et al., 2003). Tripomastigota a forma flagelada ingerida pelo inseto, no momento da picada, pois est presente no sangue do mamfero contaminado. Depende exclusivamente da via glicoltica para obteno de energia, pois no munida de citocromo e possui mitocndria inativa e, portanto, sem ciclo de Krebs funcional. dotada de uma organela especializada, o glicossomo, que contm nove enzimas envolvidas na reao da gliclise e do metabolismo do glicerol (OPPERDOES & BORST, 1977; OPPERDOES, 1987). Devido a esta organela, a velocidade da gliclise 50 vezes maior do que aquela ocorrida no eritrcito humano. Aps ingerida pelo inseto, a forma tripomastigota se diferencia na forma epimastigota (forma intermediria e flagelada). Esta, ao chegar no intestino posterior do inseto, se diferencia na forma tripomastigota novamente, a qual, posteriormente, invadir a corrente sangunea do mamfero picado pelo inseto e, quando penetrar no interior das clulas dos tecidos, se diferenciar na forma amastigota. A forma amastigota aflagelada, arredondada ou oval, encontrando-se agrupada formando os chamados ninhos parasitrios no interior dos tecidos (MOURA et al., 2001). Ela tem como principal fonte de obteno de energia os depsitos de lipdeos. Em mdia, um Trypanosoma, na forma sangunea do hospedeiro, contm 240 glicossomos, o que representa entre 4,3 a 8 % de seu volume total. Nas formas amastigota e epimastigota o nmero de glicossomos cai a menos de 50. Alm do Trypanosoma, outros gneros da famlia Trypanosomatidae como Leishmania e Crithidia tambm apresentam glicossomos (OPPERDOES & BORST, 1977).

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O metabolismo de carboidratos de Trypanosoma no inseto vetor completo, isto , apresenta gliclise, ciclo de Krebs, cadeia transportadora de eltrons e fosforilao oxidativa (CLARKSON & BROHN, 1976).

1.6.1.

A enzima gGAPDH de T. cruzi

Um dos caminhos para o desenvolvimento de novos frmacos contra a

doena de Chagas explorar o fato de que a forma infectante do T. cruzi depende exclusivamente da via glicoltica como fonte de energia. Portanto, compostos que bloqueiem a gliclise podem ser utilizados como medicamentos para tratar e combater a doena. Com o objetivo de se descobrir novas substncias candidatas a combater doenas causadas por parasitas dos gneros Trypanosoma e Leishmania (vrias espcies responsveis pelas Leishmanases), foram determinadas as estruturas tridimensionais de algumas de suas enzimas glicolticas: triosefosfatoisomerase de T. brucei (WIERENGA et al., 1991) e gliceraldedo-3-fosfatodesidrogenase (GAPDH) de T. brucei (VELLIEUX et al., 1993) e de Leishmania mexicana (KIM et al., 1995). A investigao detalhada das estruturas de GAPDH humana e de T. brucei levou identificao dos stios de ligao do NAD+ (Nicotinamida Adenina Dinucleotdeo, cofator da GAPDH) e deteco de importantes diferenas nas duas enzimas (VERLINDE et al., 1994) quanto afinidade pelo cofator, implicando em diferenas na estrutura tridimensional do stio de ligao ao cofator e, portanto, a um possvel stio de seletividade. Esta descoberta forneceu subsdios para se acreditar que a GAPDH de T. cruzi, por apresentar alta homologia com a enzima de T. brucei, pode ser utilizada como uma molcula alvo interessante para o desenho de frmacos contra a Doena de Chagas (Figura 1-7, SOUZA et al., 1998). A gGAPDH (GAPDH glicossomal) participa da via glicoltica, tanto do hospedeiro humano quanto do tripanossomo, catalisando a converso do gliceraldedo3-fosfato em 1,3-difosfoglicerato, na presena do cofator NAD+ e fosfato inorgnico (Esquema 1-1). O Laboratrio de Cristalografia de Protenas do Instituto de Fsica da Universidade de So Paulo campus So Carlos (IFSC/USP) mantm uma linha de
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pesquisa dedicada ao estudo estrutural de protenas do T. cruzi e modelagem de inibidores especficos que possam ser potenciais medicamentos na terapia antichagsica. Dentre os resultados j alcanados por este grupo, destacam-se a expresso, purificao, cristalizao, determinao da estrutura (a 2.8 de resoluo) e padronizao de ensaios de atividade seletiva da enzima glicoltica gliceraldedo-3fosfatodesidrogenase de T. cruzi. Em paralelo, iniciou-se a modelagem de potenciais inibidores, pelas tcnicas de simulao computacional em bases de estruturas micromoleculares com atividade farmacolgica (PAVO, 1996; PAVO, 2001), alm da sntese e bioensaios enzimticos com produtos naturais de vrias procedncias, inclusive dos laboratrios de Sntese e de Produtos Naturais da UFSCar , destacando-se a cumarina chalepina com CI50 de 64 M e os flavonides 5,6,7,3,4-pentametoxiflavona, 5,7,3,4,5-pentametoxiflavona, 5,6,7,8,4-pentametoxiflavona e 3,5,6,7,3,4,5heptametoxiflavonol cuja inibio enzimtica foi de 100 % a uma concentrao de 100 g/mL (LEITO et al., 2004; VIEIRA et al. 2001; PAVO et al., 2002; GARCIA et al., 2000; MORAES et al., 2003).

Figura1-7- Estrutura tridimensional da enzima gGAPDH (SOUZA et al., 1998)

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Esquema 1-1- Esquema da gliclise ocorrida no glicossomo do T. cruzi

As enzimas de 1 a 9 so as glicossomais do parasita: (1) hexoquinase; (2) glicose-6-fosfatoisomerase; (3) fosfofrutoquinase; (4) frutose-difosfatoaldolase; (5) triose-fosfatoisomerase; (6) glicerol-3-fosfato desidrogenase; (7) gliceraldedo-3-fosfatodesidrogenase (GAPDH); (8) glicerolquinase; (9) fosfoglicerato quinase; (10) fosfogliceratomutase.

1.7. Leishmanases
So doenas causadas por um grande nmero de espcies do gnero Leishmania e esto classificadas de acordo com sintomas clnicos e espcies causadoras em trs principais tipos: Leishmanase Cutnea, Mucocutnea e Visceral. Todas so transmitidas por flebotomneos pertencentes ao gnero Phlebotomus. Quando a picada de um destes insetos infectado introduz promastigotas na pele, os parasitas se proliferam como amastigotas nos macrfagos e no endotlio dos capilares e outros pequenos vasos das regies contguas. A lise dos amastigotas ocorre logo aps a ativao dos macrfagos por linfcitos sensibilizados. Uma reao granulomatosa resulta na formao de um ndulo localizado, o qual se transforma em lcera quando o suprimento de sangue para o local fica prejudicado devido ao dano induzido pelo parasita. Uma infeco piognica, geralmente de pouca importncia, desenvolve-se na base da lcera aberta e, medida que a imunidade do hospedeiro aumenta, a lcera cicatriza. Observa-se o aumento no volume dos nodos linfticos regionais (MARKELL et al., 2003). O parasita, cujos alvos so macrfagos e clulas dendrticas, tem seu nome em homenagem ao pesquisador W. B. Leishman que, juntamente com Donovan,
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primeiramente descreveu o protozorio responsvel pelo Calazar indiano. No continente americano, foi Gaspar Viana, em 1909, no Instituto Oswaldo Cruz, que correlacionou as leses conhecidas como lcera de Bauru ou ferida brava ao mesmo gnero de protozorio, o qual recebeu o nome de L. braziliensis (MARKELL et al., 2003). Estas doenas esto espalhadas em 22 pases do Novo Mundo e 66 pases do Velho Mundo, no sendo encontradas apenas no Sudeste da sia. Produzem 1,98 milhes de indivduos desabilitados, 57 mil mortes anuais; 1,5 milhes de novos casos por ano, sendo que 350 milhes de pessoas vivem nas reas de risco. S o tipo visceral tem 500 mil casos anuais registrados (Leishmanases, 2002).

1.7.1.

Leishmanase Cutnea
endmica em 88 pases de 4 continentes, mas 90 % dos casos se

concentram no Ir, Nepal, Sria, Arbia Saudita, Brasil, Peru, Armnia, Azerbaijo, Turcomenisto, Uzbequisto, Afeganisto, ndia e Qunia (Leishmanases, 2002). A Leishmanase Cutnea conhecida no Velho Mundo como Boto do Oriente e produzida por leishmnias que pertencem ao complexo L. tropica. Caracteriza-se pela produo de leso seca que ulcera somente depois de vrios meses, sendo geralmente unitria, mas podendo chegar ao nmero de 200, e ocorrendo principalmente na face, deixando cicatrizes horrveis. O co pode ser um hospedeiro natural (MARKELL et al., 2003). No Novo Mundo, esta doena causada por espcies do complexo L. mexicana. encontrada em Belize, Pennsula de Yucatn, Guatemala, Mato Grosso, Venezuela e Bacia Amaznica. Pode se transformar na forma cutnea difusa, com ppulas de formato irregular que se assemelham s leses da lepra lepromatosa e no se curam espontaneamente (MARKELL et al., 2003). O tratamento se d atravs do Estilbogluconato Sdico (gluconato sdico de antimnio, Pentostam), menos txico que os antimoniais pentavalentes mais antigos. o mais eficaz composto atualmente disponvel para o tratamento de todas as leishmanases cutneas. Seu mecanismo de ao se baseia na oxidao dos cidos graxos das formas amastigotas da leishmnia e na inibio das enzimas glicolticas. Uma dessas enzimas a fosfofrutoquinase (PFK), a qual catalisa a fosforilao da frutose-626

fosfato (F-6-P) pela adenosina trifosfato (ATP). Essa atividade inibitria sobre a enzima exercida por mecanismo competitivo junto ao substrato F-6-P, resultando no acmulo deste, ao mesmo tempo em que ocorre a reduo da concentrao do metablito frutose-1,6-difosfato (FDP) e adenosina difosfato. Assim, como os parasitas consomem grande quantidade de glicose como fonte de energia para exercer suas funes vitais, a depleo do teor de FDP acarreta inibio da gliclise. Portanto, os parasitas morrem em conseqncia do baixo consumo de carboidratos. A PFK do hospedeiro tambm afetada, mas sua sensibilidade a antimoniais aproximadamente 80 vezes menor do que a do parasita (ZANINI & OGA, 1982). Tosse, cefalia e vmitos so os efeitos colaterais mais freqentes da quimioterapia com antimoniais. Na Amrica Latina este medicamento substitudo pelo Antimoniato de Meglumina (Glucantime, Figura 1-8). A Anfotericina B tem sido utilizada em pacientes que no respondem aos antimoniais pentavalentes, porm uma alternativa menos txica o uso do Cetoconazol (inibidor da biossntese de esteris). Uma vacina combinada (L. amazonensis morta pelo calor mais bacilo de Calmette-Guerin [BCG] vivel) foi avaliada quanto a sua eficcia na imunoterapia para a leishmanase cutnea americana num estudo clnico no qual participaram 217 pacientes. A cura clnica foi de mais de 90 % dos que receberam a vacina, sendo o tempo mdio para a cura de 16 a 18 semanas, o qual comparvel ao do Glucantime. Porm a eficcia da vacina na profilaxia ainda no foi experimentada (MARKELL et al., 2003)

1.7.2.

Leishmanase Mucocutnea
Esta infeco causada pela L. braziliensis e encontrada no Brasil, leste

do Peru, Bolvia, Paraguai, Equador, Colmbia e Venezuela. O aspecto que sobressai nesta doena, conhecida no Brasil como espndia, o desenvolvimento, em porcentagem varivel de pacientes, de lceras na mucosa oral ou nasal. As leses cutneas so mltiplas e podem se tornar muito grandes. Caso se desenvolvam ulceraes na mucosa, o avano da infeco, embora lento, constante. A no ser que um tratamento eficaz seja feito, toda a mucosa do nariz e a dos palatos duro e mole eventualmente afetada. O septo nasal destrudo, mas diferentemente de leses sifilticas, o processo no envolve os ossos. A ulcerao pode resultar em perda de todas
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as partes moles do nariz, lbios, palato mole, e assim por diante. A morte ocorre, em geral, devido a infeces secundrias (MARKELL et al., 2003). Vrios roedores e ces do mato so os reservatrios naturais. Flebotomneos pertencentes aos gneros Lutzomia e Psychodopygus so os vetores. O tratamento tambm atravs do Pentostam (Figura 1-8) com doses iniciais de 50 mg/Kg de peso corpreo, intramuscular. O pamoato de cicloguanila (Camolar), um inibidor do cido flico, eficaz quando administrado intramuscularmente nas quantidades de 300 mg para adultos e 280 mg para crianas de 1 a 5 anos de idade. A anfotericina B (Fungizona, Figura 1-8) tambm apresenta bons resultados quando administrada intravenosamente. Porm, freqente ocorrer dano renal e depresso da medula ssea quando este medicamento aplicado por perodos prolongados (MARKELL et al., 2003).

1.7.3.

Leishmanase Visceral
Amplamente conhecida por seu nome indiano calazar, causada por

parasitas do complexo L. donovani. Ao contrrio daqueles que foram discutidos anteriormente, os parasitas que causam o calazar no esto confinados s clulas reticuloendoteliais dos tecidos subcutneos e membranas mucosas, mas podem ser encontrados em todo o corpo (MARKELL et al., 2003). Ocorre na ndia, Burma, Leste do Paquisto, Sumatra e Tailndia, bem como Repblica Centro-Africana, Chad, Etipia, Somlia, Djibuti, Qunia entre outros (Leishmanases, 2002). Ces so os principais reservatrios e o vetor o mosquito Phlebotomus. Nas Amricas Central e do Sul - Argentina, Bolvia, Brasil, Suriname, Venezuela, Colmbia, Equador, El Salvador, Honduras e Guatemala - bem como no Mxico e Guadalupe das Antilhas, a leishmanase visceral quase sempre causada pela L. chagasi e L. amazonensis. Afeta principalmente crianas. Os ces, raposas e gatos domsticos so os reservatrios naturais. O vetor o mosquito Lutzomyia (MARKELL et al., 2003). As formas promastigotas do parasita se multiplicam no intestino do vetor e migram para a poro anterior deste, escapando pela probscida quando o inseto se
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alimenta. O perodo de incubao pode variar de 2 semanas a 18 meses. freqente o paciente se queixar de aumento do volume abdominal, sendo observadas, no exame, hepatomegalia e esplenomegalia (aumento do fgado e do bao). Algumas vezes o incio agudo e pode simular um ataque de malria. Outras vezes o paciente pode apresentar diarria, sendo o incio semelhante ao da febre tifide. Ocorre anemia e perda progressiva de peso (MARKELL et al., 2003). Se a infeco no tratada, pode causar de 75 a 95 % de mortes. O tratamento se d principalmente com o Pentostam, causando reaes adversas severas, alm de durar, no mnimo, 28 dias (20 mg/Kg/dia) e ser administrado parenteralmente, o que requer estrita superviso mdica. Somando-se a isto, o custo alto, a resistncia a antimoniais chega a 50 % e a eficcia limitada (MARKELL et al., 2003). A ndia, que um dos beros da leishmanase visceral, tem empregado um novo medicamento, a Miltefosina (1-O-hexadecilfosfocolina, da classe dos alquillisofosfolipdeos, Figura 1-8), que j vinha sendo usado na terapia da metstase cutnea de carcinomas mamrios, porm com uso restrito, pois, na dosagem requerida, provoca uma srie de efeitos colaterais graves como toxicidade renal, teratogenicidade e infertilidade, evidenciando ser citotxica com pouca seletividade. No entanto, as doses necessrias para o tratamento da leishmanase so muito menores e, como conseqncia, as reaes adversas tambm, sendo em geral de ordem gastrointestinal (KAMINSKY, 2002). o primeiro medicamento oral efetivo no tratamento da doena, inclusive de formas resistentes aos antimoniais, revolucionando o tratamento e controle do Calazar (Leishmanases, 2002). Seu mecanismo de ao ainda no est esclarecido, mas, por se tratar de um falso fosfolipdeo, pouco sensvel ao hidroltica das fosfolipases. O motivo qumico para tal que os fosfolipdeos so formados por steres de cidos graxos (saturados ou insaturados) ligados a dois dos trs grupos hidroxila do glicerol, estando o grupo hidroxila restante ligado a uma molcula de fosfato de colina (ou de etanolamina, de inositol, de serina etc). Assim sendo, este falso fosfolipdeo capaz de competir com os fosfolipdeos verdadeiros enganando as enzimas. Em decorrncia deste fato, diversas hipteses j foram levantadas quanto ao seu modo de ao no parasita: interferncia na transduo de sinais atravs da membrana citoplasmtica, na
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biossntese do glicosilfosfatidilinositol, no metabolismo da alquilglicero-fosfocolina e na sntese de novo da fosfatidilcolina atravs da via Greenberg. Alm disso, o tratamento com Miltefosina promove a ativao dos macrfagos, com conseqente aumento na produo de NO e anticorpos monoclonais, resultando numa maior toxicidade para os parasitas (SARAIVA et al., 2002). Tambm considerada como um inibidor seletivo na biossntese de esteris e fosfolipdeos dos Kinetoplastdeos (KAMINSKY, 2002).

CH2NHCH3+ HCOH HOCH HCOH HCOH CH2OH Glucantime (Antimoniato de meglumina) OH O HO O OH OH OH OH (OH)2Sb2O-

CH2OH CHOH HCO HCO HCO COOPentostam

-

CH2OH CHOH OH Sb O OSb OCH OCH OCH OOC Na3. 9H2O

OH O

OH COOH HO O OH NH2 OH

Anfotericina B

O H3C (CH2)14 CH2 O P O O(CH2)2

N(CH3)3

Miltefosina (Hexadecilfosofocolina)

Figura 1-8- Estruturas qumicas dos compostos empregados no tratamento de

Leishmanases

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1.7.4.

Fosforribosiltransferases (PRTases) de Leishmania

O metabolismo de purino-nucleotdeos, imprescindveis na formao do

DNA e RNA, de uma grande variedade de espcies de parasitas difere significativamente daquele do hospedeiro humano. Neste, os purino-nucleotdeos podem ser sintetizados por duas vias metablicas. A primeira delas envolve um conjunto de dez reaes seqenciais catalisadas por enzimas, levando sntese de novo dos purino-nucleotdeos a partir do precursor PRPP (fosforribosilpirofosfato), resultando na sntese do anel purnico e na formao do monofosfato de inosina (IMP), o qual , por sua vez, convertido ao monofosfato de adenosina (AMP) e monofosfato de guanosina (GMP). A segunda via, reao de poupana ou de recuperao, consiste na formao dos nucleotdeos purnicos a partir das bases purnicas livres (adenina, guanina e hipoxantina) provenientes da degradao hidroltica de cidos nuclicos e nucleotdeos. Nesta reao, a poro ribose fosfato do PRPP (pirofosfato de fosforribosila) transferida a uma base purnica para formar o ribonucleotdeo correspondente, sendo catalisada por enzimas da famlia das fosforribosiltransferases. A adenina fosforribosiltransferase (APRT) especfica para a formao do AMP, enquanto a hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (HGPRT) catalisa a formao do IMP e GMP (Esquema 1-2; NELSON & COX, 2000). Os protozorios do gnero Leishmania e Trypanosoma so auxotrficos para purino-nucleotdeos, ou seja, no so capazes de sintetiz-los pela via de novo, dependendo do hospedeiro mamfero para obt-los a partir da via de recuperao, sendo inteiramente dependentes das enzimas desta via durante seu ciclo de vida. Tal fato despertou o interesse de muitos pesquisadores para o estudo destas enzimas como alvos potenciais para a descoberta de novas substncias que combatam as leishmanases.

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Sntese "de novo"

PRPP
1

NH2 N O HN
2 10

N N N RiboseP

NH2 RiboseP Fosforribosilamina

N N N RiboseP Inosinato (IMP)

Adenilato (AMP) O HN H2N N N N RiboseP

Via de recuperao
O
-O

Guanilato (GMP)

O H O H O O OH P OO O P OOPurina

POCH2 H OH OH

PPi

POCH2 H OH OH

Purina O H H OH

PRPP

Ribonucleotdeo purnico

Adenina Hipoxantina Guanina

PRPP PRPP PRPP

APRT

adenilato inosinato guanilato

PPi PPi PPi

HGPRT

HGPRT

Esquema 1-2- Vias metablicas para a sntese de purino-nucleotdeos

O Laboratrio de Cristalografia de Protenas do Instituto de Fsica da Universidade de So Paulo campus So Carlos (IFSC/USP) mantm uma linha de pesquisa dedicada ao estudo estrutural de enzimas e protenas da L tarentolae, espcie isolada em lagartos e de toxicidade nula aos seres humanos. O Dr. Otvio Thiemann realizou a clonagem e caracterizao da enzima APRT desta espcie (THIEMANN, 1998). Alm disso, a mesma enzima teve sua estrutura cristalogrfica recentemente determinada (SILVA, 2001). Analisando-se cuidadosamente o

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sequenciamento dos aminocidos da APRT de L. tarentolae, juntamente com os seus stios ativos, pode-se notar grande semelhana com a protena homloga de L. donovani, revelando diferenas em apenas 35 resduos. Com identidade de 85 % nas seqncias de aminocidos, alm de se tratarem de protenas homlogas, deduziu-se que suas estruturas tridimensionais so similares e que as informaes obtidas nas pesquisas com a APRT de L. tarentolae podero ser utilizadas na triagem de novos agentes contra as leishmanases humanas.

1.7.5.

Produtos naturais leishmanicidas

Na Bolvia, algumas plantas so empregadas popularmente para o

tratamento das leishmanases, como, por exemplo, a Tesseria integrifolia (Arecaceae), Jacaranda laevilimbum glabra, Tanaecium nocturnum (Bignoniaceae), (Rutaceae), Bowdichia Brugmansia virgiliodes arborea (Fabaceae), Irbalchia alata (Gentianaceae), Swietenia macrophylla (Meliaceae), Piper (Piperaceae), Galipea longiflora (Solanaceae), de uso externo somente, com as partes das plantas sendo reduzidas a p ou maceradas e aplicadas sobre as feridas em forma de compressas ou sendo administradas na forma de banhos (BOURDY et al., 2000). Muitos produtos naturais tm sido testados contra formas promastigotas de L. major. A dilactona germacreno 16,17-diidrobraquicalixoldeo (Figura 1-9) mostrou CI50 de 17 g/mL contra 67 g/mL do Pentostam, porm foi altamente txica aos linfcitos humanos na mesma concentrao (OKETCH-RABAH et al., 1998). Algumas saponinas tambm foram testadas, como a -hederina, sendo altamente efetivas em concentraes similares pentamidina, no entanto foram txicas aos macrfagos no mesmo nvel que o Glucantime. O uso de saponinas como frmacos limitado pela baixa biodisponibilidade, reduzida absoro no trato gastrointestinal e toxicidade hemoltica quando administradas por via parenteral (KAYSER et al., 2002). Um grande nmero de chalconas foi testado e submetido anlise QSAR quanto ao seu efeito contra formas promastigotas de L. donovani e atividade supressora de linfcitos, tendo a licochalcona (Figura 1-9) apresentado CI50 de 13 e 48 M respectivamente (NIELSEN et al., 1998). O iridide arbortristosdeo A (Figura 1-9) foi 57 % ativo contra L. donovani

33

quando adminstrado oralmente na dose de 100 mg/Kg/dia x 5, sendo que o Pentostam 75 % ativo numa dose 10 vezes menor (TANDON et al., 1991).

HO COOH O RO HO
-hederina R= ram (12) ara (1)
3'

OH

OMe Licochalcona

HO OH O O O
1 ''

COOMe

CH2 O
16

O O
1 7 3 5 14 9 1'

RO O HO

4' 13 11 12

O O HO OH OH

H3CH2C

HO

O
16 ,17- diidrobraquicalixoldeo

R= p-metoxi cinamoil

15

Arbortristosdeo A

Figura 1-9- Produtos naturais com atividade leishmanicida 1.8. Insetos

A maioria dos insetos fitfaga, isto , alimenta-se de plantas, e sua atividade exerce forte influncia sobre o equilbrio ecolgico. Apesar de existir aproximadamente um milho de espcies de insetos j classificadas, apenas alguns milhares so considerados pragas e, destes, somente cerca de 500 causam grandes danos s plantas. Acredita-se que todos os insetos foram inicialmente herbvoros polifgicos, isto , alimentavam-se de plantas de diversos tipos. A especializao deles em determinados tipos de plantas s teria ocorrido em fases posteriores do processo evolutivo (CRAVEIRO & MACHADO, 1986). Neste processo existem vrios tipos de substncias que desempenham o papel de mensageiros qumicos no mecanismo coevolucionrio e esto classificadas dentro de dois grupos: os FEROMNIOS, que agem
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entre indivduos da mesma espcie (intraespecficos) como atraentes sexuais, marcadores de trilhas, propiciadores de comportamentos de agregao, alarme, disperso, entre outros; os ALELOQUMICOS, que agem entre espcies (interespecficos) e se diferenciam de acordo com o organismo que est sendo beneficiado na comunicao. Os aleloqumicos esto classificados de acordo com sua atuao: os alomnios so benficos aos organismos que os produzem; os cairomnios beneficiam os organismos a que se destinam; os sinomnios favorecem tanto o agente emissor quanto o receptor do sinal qumico e os apneumnios so liberados por material em decomposio e atraem principalmente insetos coprfagos e saprfagos. Uma mesma substncia aleloqumica pode apresentar diversas funes de acordo com a variedade de indivduos envolvida na interao, como o caso de uma interao tri-trfica (planta-herbvoro-inimigo natural), onde a substncia liberada atua como cairomnio, se atrai um determinado herbvoro ou fagoestimulante para este; como alomnio, se repele insetos fitfagos, reduz os processos digestivos ou txica para os mesmos; como sinomnio, se atrai inimigos naturais do herbvoro o qual est atacando-a (FERREIRA et al., 2001). Para que um inseto possa usar uma planta como hospedeira, necessrio que ocorra a sequncia de cinco etapas complementares: localizao da planta, reconhecimento da mesma, aceitao do inseto e adequao inseto/hospedeira. Tudo indica que, nessas cinco etapas, no s os produtos de valor nutricional, mas tambm os metablitos secundrios, desempenham papel destacado. Alguns podem ser repelentes (agem distncia), supressantes (inibem o ato de provar o alimento), deterrentes (inibem a alimentao ou oviposio), intoxicantes (causam intoxicaes crnicas ou agudas) e redutores da digesto (inibim a utilizao dos alimentos). Todos os componentes devem estar presentes no tempo apropriado e na quantidade exata. A resistncia de uma planta ao ataque de insetos decorre do rompimento de qualquer um dos elos da seqncia normal de eventos (CRAVEIRO & MACHADO, 1986).

1.8.1.

Inseticidas
Os insetos tm sua funo no equilbrio ecolgico, mas tambm, desde

tempos remotos, vm causando prejuzos ao homem, sejam como transmissores de

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doenas ou como destruidores de lavouras ou gros estocados e no por acaso que os insetos figuram, no livro de xodo da Bblia, como uma das pragas do Egito. Na prtica milenar da agricultura, o homem sempre teve de se haver com esse flagelo e, h muito, se empenha em evitar que ele destrua alimentos e outros vegetais. O cultivo de uma nica ou de algumas espcies em grandes extenses de terra fornecendo aos insetos biomassa abundante e contnua facilitou ainda mais sua ao nefasta (VILELA et al., 1989). Os inseticidas, os quais esto arrolados dentro dos termos agrotxico ou defensivo agrcola, so substncias qumicas, naturais ou sintticas, destinadas a matar, controlar ou combater de algum modo os insetos que atacam, lesam ou transmitem enfermidades s plantas, aos animais e ao homem (ZAMBRONE, 1986). O uso mundial destas substncias foi introduzido a partir da dcada de 1940. Seus benefcios em especial no controle de insetos que transmitem doenas ao homem so inegveis. Em contrapartida, ao longo de 60 anos de uso, muitas desvantagens tambm se evidenciaram, entre elas a de representarem riscos para o ser humano e o meio ambiente. Vrios produtos chegaram a ter seu uso abolido, tal a sua periculosidade, como o ALDRIN (organoclorado), LINDANE (organofosforado), PARATION (organofosforado), entre outros, devido longa persistncia no solo, na gua e nos organismos vivos, comprometendo toda a cadeia alimentar, alm de serem altamente cancergenos (SANTIAGO, 1986). Nos primrdios de seu uso, os inseticidas tinham amplo espectro de atividade e exterminavam indiscriminadamente tanto as pragas como os insetos benficos ao homem. Devido a este fato, os insetos foram adquirindo resistncia a essas substncias, significando a aplicao de maiores quantidades e maiores danos ecolgicos e poluio ao meio ambiente. Verificou-se que a simples introduo de substncias mais txicas no garantia o controle total das pragas a mdio ou curto prazo, mas s piorava as condies de poluio ambiental e da sade dos agricultores (FERREIRA et al., 2001). O conhecimento adquirido com o passar dos anos, levou descoberta dos mecanismos naturais de adaptao inseto-planta. O respeito a estes mecanismos exigiu o desenvolvimento de substncias menos txicas e tem favorecido a busca de inseticidas de origem natural, devido crena pblica de que os produtos naturais so mais seguros que os sintticos. Apesar desta crena no ser sempre cientificamente comprovada, o
36

mercado permite preos especiais para produtos naturalmente produzidos, o que vem estimulando a pesquisa e desenvolvimento de inseticidas naturais nos laboratrios de pesquisa de Universidades e Indstrias em todo o mundo. Para um inseticida natural ser comercialmente vivel, ele no pode ser apenas eficaz, mas deve preencher uma srie de requisitos como: seletividade contra inimigos naturais (baixa toxicidade ambiental), baixa toxicidade em mamferos, biodegradabilidade e ausncia de fitotoxicidade. Entre os critrios prticos que devem ser preenchidos, tm-se: fonte de matria-prima abundante (se for planta, por exemplo, que seja de fcil cultivo e o princpio ativo esteja nos frutos, proporcionando uma explorao extrativa, mas no destrutiva); baixo custo e potencial para patentear a tecnologia de obteno dos compostos inseticidas (FERREIRA et al., 2001).

1.8.2.

Inseticidas de origem natural

Os inseticidas derivados de produtos naturais foram muito utilizados at

1940, sendo principalmente usado o alcalide nicotina (Figura 1-10) extrado das folhas de Nicotiana tabacum e N. rstica (Solanaceae) e precursor da imidacloprida associado nornicotina e anabasina (Anabasis aphylla, Chenopodiaceae; Figura 1-10). O surgimento dos inseticidas sintticos que foram desenvolvidos a partir da II Guerra Mundial acabou substituindo por completo os agentes naturais por serem muito mais potentes. A retomada dos inseticidas naturais nos ltimos anos surgiu por vrios motivos, entre eles a preocupao com o impacto ao meio ambiente e sade humana, sendo vrias as fontes pesquisadas. No passado, alm da nicotina, figuravam entre as substncias naturais inseticidas muito usadas as piretrinas, as rotenonas, a rianodina (Ryania, Flacourticaceae; Figura 1-10), a sabadina (Schoenocaulon officinale, Liliaceae), entre outras (FERREIRA et al., 2001). As piretrinas, ainda em uso, so steres extrados das flores de crisntemos, vrias espcies do gnero Chrysantemum (Asteraceae). O que impulsionou a utilizao e pesquisa das piretrinas e piretrides, substncias sintticas modeladas a partir das piretrinas naturais, foi sua baixa toxicidade aos mamferos e alta eficincia no
37

combate aos insetos. Porm, as piretrinas tm baixa estabilidade fotoqumica e trmica (fato que impede de serem usadas na agricultura) e, como os piretrides, podem desencadear reaes alergizantes como asma e bronquite em crianas, j que so os inseticidas mais usados em ambientes domsticos, na forma de sprays ou em aparelhos, ligados tomada, no quarto de dormir, onde a substncia gradativamente liberada. Isto promove a inalao contnua do inseticida, costume que tem originado vrios problemas relacionados ao aparelho respiratrio, como asma e bronquite (ZAMBRONE, 1986). Os rotenides, apresentando a rotenona (Figura 1-10) como principal substncia inseticida, so homoflavonides, compostos polioxigenados com um grupamento cetnico no seu esqueleto bsico e que podem ser encontrados em vrios gneros de Leguminosas, como Derris, Lonchocarpus, Tephrosia e Mundulea. A rotenona, em condies de campo, tambm degradada pela luz, calor e pelo contato com o ar, de forma consideravelmente rpida (FERREIRA et al., 2001). Atualmente, muito se tem pesquisado para se descobrir substncias naturais com atividade inseticida com modos alternativos de ao. Uma substncia pode matar diretamente o inseto (ao inseticida propriamente dita); pode inibir o seu apetite (ao fagoinibidora) e mat-lo indiretamente de fome; pode atrasar seu ciclo evolutivo, impedindo o acasalamento e, conseqentemente, a propagao da espcie; pode gerar insetos deformados, entre outras formas (RODRIGUEZ, 1990). No h uma classe especfica, ou com um perfil estrutural, de substncias para que a atividade se manifeste. Num estudo feito com 140 espcies de plantas chilenas (LABB et al., 2000), foram isolados compostos da classe dos cromenos (benzopiranos e benzofuranos), sesquiterpenos lactonas, furanoclerodanos e flavonas substitudas que apresentaram atividade fagoinibidora. Alguns leos essenciais de espcies de Vitex (Verbenaceae) tm apresentado atividade inseticida (LEITO et al., 1999). O isolamento de duas naftoquinonas (Figura 1-10) da Calceolaria andina L. (Scrophulariaceae) com alta atividade inseticida e baixa toxidez oral e drmica aos mamferos resultou numa patente dos referidos compostos como praguicidas (KHAMBAY et al., 1999a). A piranociclohexenodiona ericifoliona (Figura 1-10), isolada da espcie Kunzea ericifolia (Myrtaceae), apresentou atividade inseticida (KHAMBAY et al., 1999b). Uma mistura de sete diterpenos do grupo labdano (SERRANO et al., 1999), inibidores do crescimento larval de uma lepdptera, foram isolados da planta Hyptis spicigera
38

(Lamiaceae). Os limonides, como a azadiractina (Figura 1-10), so conhecidos pelo fato de apresentarem atividade em insetos tanto interferindo no crescimento quanto atravs da inibio alimentar e so substncias presentes nas famlias Rutaceae e Meliaceae (FERREIRA et al., 2001). Do estudo qumico da espcie Dimorphandra mollis (Caesalpinaceae), txica s abelhas na poca da florao, isolou-se o flavonide astilbina, o qual provocou 100 % de letalidade no bioensaio com abelhas aps 12 dias (CINTRA et al., 2002; Figura 1-10). sabido que o conceito de um inseticida ideal ainda constitui uma utopia e, dentro de uma determinada lgica, este tipo de produto, por si s, nunca conseguiria a completa soluo das infestaes de insetos na agricultura. Mesmo um produto natural, com todas as qualidades possveis e desejveis, pode repetir o desastre que ocorreu h cerca de 40 anos com o DDT e outros. A natureza e seus prprios mecanismos acabam se adaptando e advm a resistncia. Por isso, importante a constante pesquisa nesta rea, mantendo-se uma conscincia e respeito a todos os requisitos exigidos e ainda aos que surgiro, medida que o conhecimento cresce.

39

H N Me N N

H N H N

H N H

Nicotina

Nornicotina

Anabasina
OH O

H O O H O

CO2Me O OH O H

H OMe OMe AcO MeO2C H OH O

Rotenona

Azadiractina
O OR

O O

Piretrina I

21 19 18 1

R= H 2- (1,1-dimetilprop-2-enil)-3-hidroxi1,4-naftoquinona R= COCH3 acetato correspondente

O
24 7

O
10

27

OH OH OH

O
17 16

O HO

O
30

Ericifoliona
OH O

O O Me OH

OH OH

Astilbina

Figura 1-10- Produtos naturais com atividade inseticida

40

2.Objetivos

Este projeto visou colaborar com o conhecimento fitoqumico e das atividades biolgicas das plantas brasileiras, coletadas em Poos de Caldas - MG, Vitex polygama Cham. (Verbenaceae) e Siphoneugena densiflora Berg (Myrtaceae) atravs da busca de princpios bioativos. Para tanto, foram propostos os seguintes passos: 1- Preparao dos extratos hexnicos, metanlicos e hidrometanlicos das diversas partes dos vegetais a serem estudados. 2- Fracionamento e isolamento das substncias constituintes dos extratos, atravs de mtodos convencionais como cromotografia em coluna de vidro, camada delgada preparativa, de gotas em contra-corrente de alta velocidade, CLAE e partio. 3- Identificao e elucidao das estruturas destes constituintes qumicos por mtodos fsicos instrumentais (UV, IV, EM, RMN estrutural). 4- Realizao dos ensaios biolgicos e bioqumicos para verificao das possveis atividades: a) Tripanocida, verificada in vitro b) Inibidora enzimtica, frente enzima gGAPDH de T. cruzi c) Inibidora enzimtica, frente enzima APRT de L. tarentolae d) Inseticida, verificada in vitro, sobre Spodoptera frugiperda e) Inseticida, verificada in vitro, sobre Atta sexdens rubropilosa f) Inibidora enzimtica, frente enzima pectinase de Leucoagaricus gongilophorus, fungo simbionte de A. sexdens rubropilosa g) Fungicida sobre Leucoagaricus gongilophorus, Candida albicans, Cryptococcus laurentii, Sacharomyces cerevisae e Trichosporon cutaneum h) Bactericida sobre Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Micrococcus roseus
13

C, RMN 1H, COSY homo e

heteronuclear, NOESY e outros) e qumicos (obteno de derivados ou modificao

42

3.Materiais e Mtodos

3.1. Reagentes e materiais utilizados

**Solventes utilizados na preparao dos extratos e em cromatografia CCD e CCV: solventes comerciais destilados no DQ-UFSCar como n-butanol; metanol, acetonitrila, tetrahidrofurano (THF) e cido trifluoractico (TFA) para CLAE da Mallincrodt AR

**Fases estacionrias para cromatografia: Slica gel 60, comum, (63-230 m), Merck; Slica gel 60 silanizada (23-70 mesh), Merck; Slica gel flash (230-400 mesh / 0,04-0,06 mm); FLORISIL (0,15-0,25 m); SEPHADEX LH-20 (dextrana hidroxipropilada) (Amersham Pharmacia Biotech); celulose microcristalina-VETEC qumica fina; XAD 7 (Aldrich Chemical Company, Inc.) **Placas para CCDA e CCDP: Placas de vidro 4,5 x 10,0 cm, 0,25 mm de espessura, com Aluminium oxide-G, Merck, preparadas no DQ-UFSCar; Cromatofolhas Al/TLC 20,0 x 20,0 cm, com slica gel 60 F254 Merck; Placas de vidro 24,0 x 20,0 cm, cobertas com slica comum / gesso, preparadas no DQ-UFSCar **Solventes para RMN: Deuterados da Merck e Aldrich

3.2. Equipamentos 3.2.1. Separao de substncias em geral

** Cromatgrafo de contra-corrente de alta velocidade centrfuga HSCCC, P. C. Inc ser. # 403, coluna preparativa de 80 ml, injetor de 1 ml. Bomba LC -10AD (SHIMADZU LIQUID CHROMATOGRAPHY) **Evaporador rotativo Buchi-rotavapor R-114 **Ultra Sonic Cleaner UNIQUE USC 1400
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**Coluna Lobar GROBE (310-25)- Lichroprep Si 60 (40-83 m) com bomba Delivery pump LP-1100 / Eyela-Tokyo Rikakikai Co., LTDA ou LAB PUMP Jr / MODEL RHSY (Fluid Metering Inc.) **SHIMADSU LC-8A, Preparative Liquid Chromatography acoplado ao detector espectrofotomtrico SHIMADSU SPD-GAV UV-VIS **Coluna polimrica preparativa SHODEX Asahipak GS-310 (lcool polivinil octadecanolico/ ODPVA), 2,5 cm DI x 50,0 cm **Coluna fase reversa preparativa C18 (octadecilslica) Hypersil ODS, 30,0 cm x 2,5 cm DI **Coluna fase reversa analtica C18 spherical 5/Waters, 150,0 mm x 4,6 mm DI **Coluna Hibar NH2 (5 m) analtica, 150,0 mm x 4,6 mm DI

3.2.2.

Anlise das substncias

**Luz UV Spectroline-Longlife TM filter, com Cmara cromato-UV, Ultra -

Violet Products, INC. **Espectrmetro de RMN Bruker ARX-200 e Avance DRX-400 **Espectrmetro Micromass Quattro LC triple quadrupole (ESI/APCI) Micromass CE Instruments; equipado com Bomba PHOENIX 40). As anlises foram feitas no modo de ionizao por eletrospray, com amostras diludas em MeOH grau analtico, inseridas via injetor (10 L), utilizando-se como solvente de ionizao MeOH, bombeado por uma seringa Carlo Erba Phoenix. O gs de nebulizao e dissolvatao foi o N2 (White Martins). Valores de voltagem do capilar de 3,9 ou 2,9 KV, cone 26-28 v, extrator 4v, RF da lente 0,23 v, temperatura da fonte 130oC, temperatura de dissolvatao 300oC. O programa para operao do equipamento, coleta e tratamento dos dados foi Masslynx 3,3 (Micromass). **CG-EM QP 500, SHIMADSU, com ionizao qumica (voltagem de ionizao de 70e-volts), coluna DB-5 da J. & W. Scientific e coluna HP-5MS da Agilent Technologies (30,0 m, 0,25 mm de dimetro, espessura da fase estacionria de 0,25 m)
45

**Analisador elementar Fision Instruments, modelo EA 1108 (CHNS-O) **Aparelho Fusatom Brasil-430 srie 389736 **Espectrmetro de IR Bomem M-102 srie SZM040012 **Espectrmetro VARIAN CARY 500 SCAN/ UV-VIS-NIR

3.2.3.

Quantificao da 20-hidroecdisona
**SHIMADSU LC-10AD, Preparative Liquid Chromatography acoplado ao

detector espectrofotomtrico SHIMADSU SPD-10AD UV-VIS, detector UV com arranjo de diodo, autoinjetor SHIMADSU SIL-10AF, 2 bombas SHIMADSU LC-10AD utilizando-se o programa CLASS LC10. **Coluna 5/Luna hexil/fenil 250,0 mm x 4,6 mm DI **Coluna 10/Luna hexil/fenil 150,0 mm x 4,6 mm DI **Cartucho Supelclean LC-18 1 mL para extrao em fase slida ** Filtro PHENOMENEX-AFO-0415. 2NY ** Empacotadora de coluna SHANDON Southern Products, LTD. ** Cmara de filtrao a vcuo para cartucho spe (extrao fase slida) de micro extrao VARIAN ** Bomba de vcuo TE-058 Tecnal e controladora CBM -10A . O sistema foi operado e as anlises adquiridas e processadas

3.2.4.

Ensaio com enzima pectinase

**Agitador de tubos Phoenix AP 56 **Eppendorf Centrifuge 5417 R **Espectrofotmetro Beckman DU 640 **Espectrofotmetro UV-1650 PC/SHIMADZU **Controlador de temperatura das reaes enzimticas CPS-Controler/

SHIMADZU

46

3.3. Mtodos 3.3.1. Colunas cromatogrficas

Para o fracionamento dos extratos estudados, foram utilizados diversos mtodos cromatogrficos (MARSTON & HOSTETTMAN, 1994; MOHRIG et al., 1998; HOSTETTMAN et al., 1986; TOUCHSTONE, 1992) tais como cromatografia de adsoro em slica gel comum para as substncias de baixa e mdia polaridade (CCV, CLV); cromatografia de excluso com SEPHADEX LH-20 (HENKE, 1995; CARDELLINA, 1983); cromatografia de contra-corrente (FOUCAULT, 1991) e cromatografia de adsoro em slica silanizada para as substncias mais polares (CCV), usando CLAE (BIDLINGMEYER, 1992; HARBORNE, 1988; CASS & DEGANI, 2001) para purificao de fraes, etc. Foram usadas colunas de vidro com tamanhos e dimetros variados, dependendo das quantidades de extratos a serem fracionadas. Nos fracionamentos em geral, optou-se geralmente pela tcnica de eluio gradiente e a isocrtica foi usada conforme convenincia. Nos fracionamentos de extratos hidroalcolicos, usou-se o mtodo de partio lquido-lquido ou a cromatografia de adsoro usando-se a resina polimrica no inica Amberlite XAD-7 e tambm SEPHADEX LH-20.

3.3.2.

Cromatografia de CCDA e CCDP

Estas tcnicas (MATOS, 1997) foram utilizadas para monitoramento das

fraes e subfraes obtidas das separaes por colunas cromatogrficas. Para anlise em CCDA foram utilizados os seguintes reveladores: Radiao UV (254 e 360 nm) Vapor de iodo Borrifao com soluo de vanilina em H2SO4/MeOH e aquecimento Borrifao com soluo de Na2CO3 20% e reagente de FOLIN (eluio com n-BuOH/HAc/H2O (4:1:5 ou 5:1:4) para fraes provenientes de HSCCC e CLAE dos extratos e fraes mais polares Soluo cida de FeCl3.
47

3.3.3.

Cromatografia de Spins
Em 1992, Morris e Johnson desenvolveram uma tcnica analtica no

invasiva, baseada na metodologia dos ecos de spin com gradientes de campo magntico pulsado (PFGSE), que permite discriminar e caracterizar os diversos componentes de uma mistura. Esta tcnica foi denominada DOSY (Diffusion Ordered Spectroscopy) e se baseia nos diferentes coeficientes de difuso das substncias (SOUZA & LAVERDE, 2002). Foi usada em nosso trabalho para identificar flavonides em mistura.

3.4. Espectrometria de absoro no UV

A adio de reagentes de deslocamento a uma soluo metanlica de compostos aromticos, um flavonide, por exemplo, provoca deslocamentos nos mximos de absoro () do espectro de ultra-violeta que so considerados diagnstico para a atribuio de certos grupos hidroxilas livres (ROITMAN & JAMES, 1985; VOIRIN, 1983; WOLFENDER, 1993).

3.5. Espectrometria de massas, IV e RMN

Estes mtodos foram usados na determinao estrutural das substncias (KEMP, 1986; BREITMEYER & VOELTER, 1987; BREITMEYER, 1993; SILVERSTEIN, 1991; AGRAWAL, 1989).

3.6. Coleta do Material

As plantas foram primeiramente coletadas em julho de 2000, numa mata prxima rea de minerao de bauxita da ALCOA, Retiro Branco, Poos de CaldasMG a 46o30 de longitude e 21o46 de latitude. Posteriormente, frutos da V. polygama foram coletados no Bairro do Teixeira, Poos de Caldas, em maio de 2002 e galhos em abril de 2004. Todas as coletas foram realizadas pela autora.

48

A V. polygama teve sua identificao taxonmica confirmada pela professora Ftima Regina Salimena-Pires, da Universidade Federal de Juiz de Fora - MG, em cujo herbrio est depositada uma exsicata. A S. densiflora teve sua identificao taxonmica confirmada pelo professor Marcos Sobral, da Universidade Federal do Rio Grande do Sul - RS. Uma exsicata de nmero 1 est depositada no herbrio do Departamento de Botnica da Universidade de So Paulo-SP.

49

50

4.Estudo fitoqumico de Vitex polygama Cham.Experimental

4.1. Preparao dos extratos brutos

As respectivas partes vegetais foram coletadas e submetidas secagem em estufa de circulao de ar entre 45-55oC e pulverizadas em moinho eltrico tipo Willey. Os pulverizados foram extrados com hexano, metanol e soluo MeOH/H2O destilada 1:1. A extrao com hexano foi realizada durante 12 dias (trocando o solvente de 6 em 6 dias) temperatura ambiente e em repouso. A extrao com MeOH foi realizada da mesma forma, sendo os extratos filtrados e concentrados em rotaevaporador. Na extrao hidroalcolica, o resduo a ser extrado foi dividido em 3 partes e, a cada parte, foram adicionados 200 mL da soluo MeOH/H2O 1:1. Essa mistura foi levada ao ultra som para agitao por 10 minutos e depois filtrada e concentrada em rotaevaporador, sendo essa operao repetida por 6 vezes. Aps esse procedimento, o extrato aquoso obtido foi liofilizado. Os resultados podem ser observados na Tabela 4-1.

Tabela 4-1- Extratos brutos de V. polygama

Material vegetal seco (g) Folhas (423) Solvente hexano metanol MeOH/H2O 1:1 hexano metanol MeOH/H2O 1:1 hexano metanol MeOH/H2O 1:1 Massa de extrato obtida (g) 5,1 40,4 31,0 1,1 2,0 0,9 0,85 19,3 2,3 Cdigo HVF MVF HMVF HVFr MVFr HMVFr HVG MVG HMVG

Frutos (171) Galhos (415)

Foi realizada uma segunda coleta de frutos para se obter maior quantidade de extrato. Os frutos foram colocados frescos dentro de um recipiente e deixados em macerao com MeOH por uma semana para retirada do excesso de acar e gua (operao repetida 3 vezes; o extrato obtido foi denominado extrato
52

hidrometanlico). Logo aps, foram submetidos secagem e moagem e macerados com hexano e metanol, respectivamente. O extrato hidrometanlico desta segunda extrao foi adsorvido em XAD-7 e eludo com gua (1L), MeOH/H2O 4:1 (1,5 L) e AcOEt (1,5 L). Ver fluxograma abaixo.

Fracionamento dos extratos brutos de V. polygama 4.2. Fracionamento dos extratos brutos de V. polygama 4.2.1. Extrato hexnico dos frutos
1,1 g foi submetido a CCV ( x h = 3,0 x 15,0 cm) sendo que a F.E. foi slica comum e a F.M. hexano, quantidades crescentes de AcOEt at MeOH, obtendose 25 fraes. A frao HFr1 foi identificada, atravs de CG-IE (biblioteca eletrnica de compostos) como uma mistura de hidrocarbonetos: eicosano; hexatriacontano e tetratetracontano. As outras fraes foram analisadas por CCDA, sendo constitudas de outras misturas de hidrocarbonetos no identificados.

53

4.2.2.

Extrato hidrometanlico dos frutos

900 mg foram dissolvidos em 300 mL de gua destilada e submetidos a

partio lquido-lquido com AcOEt e n-BuOH (3 x 300 mL cada) e as fraes obtidas foram concentradas no rotaevaporador e depois secas na capela de exausto, temperatura ambiente. O resduo aquoso foi liofilizado. Os resultados podem ser vistos na Tabela 4-2.

Tabela 4-2- Resultados da partio lquido/lquido do extrato hidrometanlico de

frutos Extrato (mg) 900 Solvente AcOET n-BuOH resduo aquoso Massa obtida (mg) 120 184 522 Cdigo AHMVFr BHMVFr RHMVFr

4.2.3.

Extrato hexnico das folhas

5,1 g foram submetidos a CLV em funil de placa sinterizada ( x h= 6,5 x

30,0 cm), utilizando-se hexano, diclorometano, AcOET e MeOH como eluentes (1,5 L de cada) e slica comum como fase estacionria. Os resultados podem ser vistos na Tabela 4-3.

Tabela 4-3- Resultados da partio lquido/lquido do extrato hexnico de folhas

Extrato (g) 5,1 Solvente hexano diclorometano AcOET MeOH Massa obtida (g) 1,08 1,84 1,94 0,19 Cdigo HHVF DHVF AHVF MHVF

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4.2.4.

Frao metanlica do extrato hexnico de folhas

MHVF 171 mg CCV F.E.: slica comum F.M. Hx/Dic 1:1 T.C: 4,5 x 18,0 cm, 7 fraes MHF5 26,6 mg CCV Sephadex-LH-20 Metanol T.C.:3,0 x 52 cm, 7

Obs: na primeira coluna, 50 % do material ficou retido na slica, mesmo aps passado MeOH

fraes
MHF85 4,2 mg Substncia I MHF88 1,2 mg Substncia

II

4.2.5.

Extrato hidrometanlico das folhas

31 g foram dissolvidos em 500 mL de gua destilada e submetidos

partio lquido-lquido com AcOET e n-BuOH (5 x 300 mL cada) e as fraes obtidas foram concentradas no rotaevaporador e depois secas na capela de exausto, temperatura ambiente. O resduo aquoso foi liofilizado. Os resultados podem ser vistos na Tabela 4-4.

folhas

Tabela 4-4- Resultados da partio lquido/lquido do extrato hidrometanlico de

Extrato (g) 31 Solvente AcOET n-BuOH resduo aquoso Massa obtida (g) 2,2 10,7 22,6 Cdigo AHMF BHMF RHMF

55

4.2.6.

Partio lquido-lquido dos extratos metanlicos de

galhos e folhas
Cada extrato, MVG e MVF, foi misturado a uma soluo de MeOH/H2O 1:3 e deixado no ultra-som at se dissolver completamente. Depois foi submetido partio lquido-lquido usando-se os solventes diclorometano e acetato de etila (3 x 250 mL cada) e as fraes obtidas foram concentradas no rotaevaporador. Aps isto, foram deixadas na capela de exausto para completar a secagem. O resduo aquoso foi liofilizado. Os resultados podem ser vistos na Tabela 4-5 e Tabela 4-6.

Tabela 4-5- Resultados da partio lquido-lquido do extrato metanlico de galhos

MVG (g) 17,6 Solvente diclorometano AcOEt resduo aquoso Massa obtida (g) 2,6 3,9 8,4 Cdigo da frao DMG AMG RMG

Tabela 4-6- Resultados da partio lquido-lquido do extrato metanlico de folhas

MVF (g) 38,1 Solvente diclorometano AcOEt resduo aquoso Massa obtida (g) 15,1 8,0 15,4 Cdigo da frao DMF AMF RMF

56

4.2.7. folhas

Frao em diclorometano do extrato metanlico de

A frao DMF, 15,1 g, foi submetida a CCV (T.C. 5,5 x 20,0 cm) usandose como F.E. slica comum e F.M. inicial Dic/ MeOH 95:5 at MeOH. Aps reunidas as fraes semelhantes, foram obtidas 8 subfraes. Destas, duas subfraes, DMF4 e DMF5, foram escolhidas para sofrerem sucessivos refracionamentos, conforme fluxograma abaixo.

4.2.7.1. Obteno Substncia XXVII

A frao MF5c (Vide fluxograma sesso 4.2.7), 406,1 mg, foi submetida a CCV (T.C. 4,0 x 24,0 cm) usando-se como F.E. slica comum e F.M. inicial CH2Cl2/AcOEt 1:1 at MeOH. Aps reunidas as fraes semelhantes, foram obtidas 7 fraes. A frao MF5c3, 8,4 mg, foi identificada como o 3-O--D-glucopiranosil sitosterol.
57

4.2.7.2. Obteno da Substncia XXXII e das Substncias XXXIII e XXXIV em mistura

A frao MF4df (Vide fluxograma sesso 4.2.7), 350,4 mg, sofreu refracionamento conforme fluxograma abaixo.

4.2.7.3. Obteno da Substncia III

A frao df446 (Vide fluxograma sesso 4.2.7.2), 75,5 mg, foi submetida a CCV (T.C. 2,0 x 52,0 cm) usando-se como F.E. Sephadex LH20 e F.M. MeOH. Foram obtidas 5 fraes. A frao df446T, 11,7 mg, foi submetida a CCV (T.C. 1,0 x 24,0 cm) usando-se como F.E. slica flash e F.M. inicial Dic/AcOEt 8:2. Foram obtidas 3 fraes. A frao df446Ta, 4,0 mg, foi identificada como a 3-O-metiluteolina.

58

4.2.7.4. Obteno da Substncia IV e das Substncias XVII e XVIII em mistura

A frao MF4dg (Vide fluxograma sesso 4.2.7) sofreu vrios

refracionamentos, como indicado no fluxograma abaixo.

4.2.7.5. Obteno das Substncias V e XXVIII

A frao df4433 (Vide fluxograma sesso 4.2.7.2), 25,0 mg, foi submetida a CCV (T.C. 3,0 x 55,0 cm) usando-se como F.E. Sephadex LH20 e F.M. MeOH. Foram obtidas 10 fraes. A frao df4433P, 0,6 mg, foi identificada como a 5,7,4triidroxi-3-metoxiflavona (Substncia V). A frao df4433K, 5,1 mg, foi identificada como o cido 2,3-diidroxiolean-12-en-28-ico (Substncia XXVIII).

59

4.2.7.6. Obteno da Substncia VI

A frao 4c5 (Vide fluxograma sesso 4.2.7), 241,5 mg, foi submetida a CCV (T.C. 3,0 x 52,0 cm) usando-se como F.E. Sephadex LH20 e F.M. MeOH. Foram obtidas 7 fraes. A frao 4c5I, 11,0 mg, foi submetida a CCV (T.C. 2,0 x 56,0 cm) usando-se como F.E. Sephadex LH20 e F.M. MeOH. frao 4c5Iac, 0,8 mg, foi identificada como a casticina. Foram obtidas 4 fraes. A

4.2.7.7. Obteno das Substncias VII e IX

A frao 5btg (Vide fluxograma sesso 4.2.7), 11,2 mg, foi submetida a CCV (T.C. 3,0 x 52,0 cm) usando-se como F.E. Sephadex LH20 e F.M. MeOH. Foram obtidas 13 fraes. A frao 5btg20, 4,0 mg, foi identificada como a luteolina (Substncia VII). A frao 5btg17, 1,0 mg, foi identificada como a 5,7,3,4-tetraidroxi-3metoxiflavona (Substncia IX).

4.2.7.8. Obteno da Substncia VIII

A frao 4c5 (Vide fluxograma sesso 4.2.7), 241,5 mg, foi submetida a CCV (T.C. 3,0 x 52,0 cm) usando-se como F.E. Sephadex LH20 e F.M. MeOH. Foram obtidas 7 fraes. A frao 4c5J, 11,3 mg, foi submetida a CCV (T.C. 3,0 x 52,0 cm) usando-se como F.E. Sephadex LH20 e F.M. MeOH. Foram obtidas 5 fraes, porm no houve a separao desejada, fato este observado no espectro de massas. No entanto, usando-se uma pr-coluna com fase G-ODS (4/8246) no momento da injeo da amostra, houve a separao (Figura 4-1). Logo, pensamos que poderamos obter a mesma separao em escala preparativa, e as fraes foram novamente reunidas e submetidas CLAE reciclante, usando-se uma coluna preparativa com fase RP-ODS (30,0 x 2,5cm), 254 e 365 nm, fluxo de 3mL/min, eluio isocrtica com MeOH/H2O 1:1 e volume de injeo de 1mL. A amostra precipitou dentro da coluna e MeOH foi passado para retir-la, coletando-se fraes conforme picos observados no cromatograma da tela do monitor do cromatgrafo. As fraes c5JK3 e c5JK5 eram mistura das Substncias VI e VIII e a frao c5JK4, 1,5 mg, foi identificada como a 5,7,4-triidroxi-3,3-dimetoxiflavona (Substncia VIII).
60

Figura 4-1- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias VI
e VIII
Legenda da figura: A: espectro da mistura sem uso da pr-coluna G-ODS; B: espectro obtido aps injeo da amostra usando-se a pr-coluna, a Substncia VIII saiu separada; C: espectro obtido aps lavagem da pr-coluna com MeOH, a Substncia VI, que havia ficado retida na pr-coluna, saiu separada.

4.2.7.9. Obteno das Substncias XXX e XXXI em mistura

A frao MF4dh (Vide fluxograma sesso 4.2.7), 833,3 mg, foi submetida a CCV (T.C. 4,5 x 18,0 cm) usando-se como F.E. slica comum e F.M. inicial Dic/Ace 95:5. Foram obtidas 7 fraes. A frao MF4dh5, 172,4 mg, foi submetida a CCV (T.C. 3,0 x 25,0 cm) usando-se como F.E. slica flash e F.M. inicial CH2Cl2/Ace 9:1. Foram obtidas 7 fraes. A frao 4dh5e, 49,8 mg, foi submetida a CCV, usando-se sephadex LH-20 (54,0 x 3,0 cm) como F. E. e MeOH como eluente. Foram coletadas 15 fraes de 15 mL cada. Aps reunidas as fraes semelhantes, a frao dh5eX, 11,4 mg, foi

61

identificada como uma mistura dos cidos 2,3-diidroxiolean-12-en-28-ico e 2,3diidroxiurs-12-en-28-ico.

4.2.7.10.Obteno das Substncias XXVIII e XXIX em mistura

A frao df444 (Vide fluxograma sesso 4.2.7.2), 16,1 mg, foi submetida A CCV (T.C. 3,0 x 10,0 cm) usando-se como F.E. slica flash e F.M. Dic/AcOEt 8:2 a MeOH. Foram obtidas 6 fraes. No houve uma boa separao, por isto a frao, agora denominada df4442, foi submetida a CCV (T.C. 2,5 x 32,0 cm) usando-se como F.E. Sephadex LH20 e F.M. MeOH. Foram obtidas 6 fraes. A frao df4442c, 9,7 mg, foi identificada como uma mistura dos cidos 2,3-diidroxiolean-12-en-28-ico e 2,3-diidroxiurs-12-en-28-ico (Substncias XXVIII e XXIX). A frao df4442e, 0,4 mg, foi identificada como a Substncia V.

4.2.7.11.Obteno das Substncias XIX, XX e XXI em mistura

A frao 4c6 (Vide fluxograma sesso 4.2.7), 137,1 mg, foi submetida a CCV (T.C. 2,5 x 32,0 cm) usando-se como F.E. Sephadex LH20 e F.M. MeOH. Foram obtidas 4 fraes. A frao 4c6I, 64,7 mg, foi identificada como uma mistura dos cidos vanlico, p-hidroxibenzico e 5-hidroxivanlico (Substncias XIX, XX e XXI). Desta frao, 6,4 mg foram submetidos a CCDP, 20,0 x 20,0 cm, usando-se CH2Cl2/MeOH 9:1 como eluente. Foram obtidas as fraes c6Iab2 e c6Iab3, 4,4 e 1,2 mg respectivamente, dos cidos vanlico e p-hidroxibenzico respectivamente (Substncias XIX, XX).

4.2.7.12.Obteno das Substncias XXII e XXIII em mistura e XXIV e XXV em mistura

A frao 5bth (Vide fluxograma sesso 4.2.7), 31,1 mg, foi submetida a CCV, usando-se sephadex LH-20 (3,0 x 52,0 cm) como F.E. e MeOH como eluente. A frao 5bth2, 3,0 mg, foi identificada como uma mistura dos cidos cafeico e protocatquico (Substncias XXII e XXIII). A frao 5bth3, 3,0 mg, como uma mistura

62

dos 6-O-cafeoil- e -D-glicopiranosdeo (Substncias XXIV e XXV) e a frao 5bth8, 1,9 mg, identificada como a Substncia VII.

4.2.8. galhos

Frao em diclorometano do extrato metanlico de

2,6 g da partio DMVG foram submetidos a CCV. A frao DMG5, 390,6 mg, foi submetida a CCV, usando-se slica flash como fase estacionria (TC= 34,0 cm x 4,0 cm) e uma eluio gradiente, partindo-se de Dic/Hex/Ace 9:0,5:0,5; Dic/Ace 3:7 e MeOH. Aps reunio das alquotas semelhantes foram obtidas 19 fraes. A frao DMG5L, 58,4 mg, foi identificada como o cido 2,3,19-triidroxiurs-12-en-28-ico (Substncia XXXII).

63

4.2.9. galhos

Frao em acetato de etila do extrato metanlico de

CCV Slica flash AcOEt/Dic 9:1 grad. TC: 2,5 x 16,0 cm

64

4.2.10. folhas

Frao em n-butanol do extrato hidrometanlico de

65

66

5.Estudo fitoqumico de Vitex polygama Cham.Resultados e Discusses

67

5.1. Identificao das Substncias I a IX

R1
2' 4'

R4 R2 R2
7

R3 O
4 5 2

2'

4'

R5

HO
7

O
2 4 5

R1

OMe O

OH

O
R1 R2 OH OMe OH
Substncia I Substncia II Substncia V

OH

R1

R2

R3 H H H

R4 H H H

R5 OMe OMe OH

Substncia III

OMe H OH

OMe OMe H H OMe OH

(crisoeriol)
Substncia IV

(4-metoxipenduletina) (5-hidroxi-3,7,4-trimetoxiflavona) (3-metoxikaempferol)

Substncia VI OMe OMe H

(acacetina)
Substncia VII

(luteolina)

OH OMe OMe OH OH OH

(casticina)
Substncia VIII Substncia IX

H H

OH OH

H H

(5,7,4-triidroxi-3,3-dimetoxiflavona) (3-metoxiquercetina)

O extrato hexnico, partio metanlica de folhas de V. polygama, aps sofrer vrias etapas cromatogrficas em slica e sephadex LH-20, forneceu a frao MHF85, 4,2 mg (Substncia I), e a frao MHF88 (Substncia II), 1,2 mg. O extrato metanlico de folhas, partio diclorometnica, forneceu as fraes df446Ta, 4,0 mg (Substncia III); dgf4d, 0,6 mg (Substncia IV); df4442e, 0,8 mg (Substncia V); c5Iac, 0,8 mg (Substncia VI); F5bt20 4,0 mg (Substncia VII); c5JK4, 1,5 mg (Substncia VIII) e 5btG17, 1,0 mg (Substncia IX). Todas as fraes se apresentaram como um p amarelo amorfo.

68

A anlise dos espectros de RMN 1H (Tabela 5-3) das substncias I, II, V, VI, VIII e IX indicou serem de flavonas 3-metoxiladas, enquanto os espectros das substncias III, IV e VII mostraram pertencerem classe das flavonas, por apresentarem o sinal caracterstico referente ao H-3. Os espectros de RMN 1H de sete das substncias (II, III, IV, V, VII, VIII e IX) apresentaram sinais caractersticos de um sistema de acoplamento AB no anel A, correspondentes a dois hidrognios que mantm uma relao meta ente si (H-6 e H-8; J cerca de 2 Hz). Os espectros de RMN 1H das substncias I, II, IV e V (Figuras 5-2, 5-4, respectivamente) revelaram, cada um, um par de sinais do tipo dubleto (J cerca de 9,5 Hz), tpico de hidrognios acoplados pertencentes a um anel B para-substitudo (H-2 e 6; H-3 e 5). J os espectros das substncias III, VI, VII, VIII e IX (Figuras 5-8, 5-11, 514, 5-16 e 5-17) mostraram um modelo de multiplicidade entre trs hidrognios onde um deles acoplava com os outros dois, enquanto estes dois no acoplavam entre si. O valor mdio das constantes de acoplamento (2 e 8,5 Hz) foi caracterstico de acoplamento meta e orto de flavonides com o anel B 3,4-dissubstitudo. A presena do grupo hidroxila fortemente quelado no C-5 originou um sinal muito desblindado em todos os espectros de RMN 1H (Tabela 5-3), com exceo da substncia IV. A soluo metanlica da Substncia IX apresentou efeito batocrmico adio tanto de acetato de sdio junto com cido brico, reagente de deslocamento especfico para grupos orto-diidroxi, quanto de AlCl3 (Tabela 5-1), o qual caracterstico para grupos hidroxilas quelados ou orto-diidroxi do anel B e instvel na presena de HCl (VOIRIN, 1983), confirmando o padro de substituio proposto. Alm dos modelos de substituio, os espectros de RMN 1H forneceram o nmero de grupos metoxila em cada flavonide. Segundo HARBORNE et al. (1975), o sinal de H-2 (da Substncia VI) em 7,66, estando mais blindado que o sinal de H-6, em 7,72, um indicativo de que um dos gupos metoxila se liga ao C-4. Outra tcnica utilizada para se caracterizar o grupo OH-4 livre foi a adio de metxido de sdio a uma soluo metanlica da Substncia VI. A no observao, no espectro de UV (Tabela 5-1), de efeito hipsocrmico, de 38-70 nm, na banda I do flavonide indicou que no havia hidroxila livre nesta posio (ROITMAN & JAMES, 1985).

69

Os espectros de massas de todas as substncias, ESI modo negativo (Figuras 5-1, 5-3, 5-5, 5-9, 5-13, 5-15; Tabela 5-2), mostraram picos intensos relativos aos ons pseudo moleculares [M-H]- e tambm picos referentes a fragmentos originados da perda de grupos metoxila [M-H-30]-, de gua [M-H-18]-, monxido de carbono [M-H-28]- e da reao RDA. No caso das Substncias I e VI, os fragmentos de RDA em m/z 151 e 221, juntamente com a perda de molcula de gua, foram essenciais para a confirmao do nmero e posio de gupos metoxila no anel A (proposta de fragmentao da Substncia VI na Figura 5-18, baseada nos fragmentos revelados no espectro Figura 5-10). Somente a Substncia III foi analisada atravs do espectro de RMN
13

(Figura 5-7, Tabela 5-4). A substncia foi confirmada como flavona devido deslocamentos caractersticos de C-2 ( 164,9) e C-3 ( 104,4), alm do deslocamento em 183,1 (C-4), o qual reiterou a presena de carbonila quelada (ARRUDA, 1990). As flavonas 3-metoxiladas poderiam ter esta posio do grupo metoxila confirmada atravs do espectro de RMN
13

C, pois conhecido (ROITMAN & JAMES, 1985) que

grupos metoxila ligados a carbonos di-orto substitudos apresentam valores de deslocamento mais desblindados (~ 60) em relao aos grupos metoxila atados a carbonos que suportam um ou nenhum substituinte na posio orto (~ 55). Porm a quantidade destas flavonas foi muito pequena, o que impossibilitou a anlise por esta tcnica. A Substncia VI teve a posio de um dos seus grupos metoxila corroborada a partir do experimento de RMN NOEDIFF. Pode-se observar no espectro diferena (Figura 5-12) que a irradiao no sinal em 4,00 afetou significativamente o sinal em 6,86, sendo este ento atribudo ao H-8. A irradiao dos outros sinais referentes aos outros gupos metoxila no provocou aumento observvel nos espectros diferena. Porm, esperava-se que houvesse NOE dos sinais relativos aos H-2 e H-6 quando se irradiasse o sinal pertencente ao grupo metoxila ligado no C-3. O efeito NOE tambm no foi observado ao se realizar o mesmo experimento com as outras flavonas 3-metoxiladas. A Substncia III tambm foi submetida ao experimento de RMN NOEDIFF com irradiao do sinal referente ao grupo metoxila. Foi observado um aumento de

70

intensidade no sinal relativo ao H-2 ( 7,64) no espectro diferena (Figura 5-6), confirmando a posio da metoxila em C-3. Baseando-se nos dados espectrais obtidos e nos dados relatados na literatura (referncias na Tabela 5-2), foram propostas as estruturas das Substncias I a IX (Tabela 5-1 a 5-5) conforme esquematizado acima. Com exceo das Substncias VII e IX, todas so inditas para a espcie.

Tabela 5-1- Dados dos espectros de absoro ultra-violeta das Substncias VI e IX

Substncia VI IX UV mx () nm
MeOH 249; 263; 336 251; 263 *; 346 NaOMe 263 AlCl3 259; 293 *; 361 267; 298 *; 346 *; 424 NaOAc + H3BO3 255; 366

*ombro; -: experimento no realizado

IX

Tabela 5-2- Dados dos espectros de massas, ESI modo negativo, das Substncias I a
Fragmentos Substncia Referncia Southwick et al., 1972 Mndez & Rosquete, 1988 Brieskorn & Riedel, 1977 Giner et al., 1982 Agrawal, 1989 Dayrit et al., 1987 Dayrit et al., 1987 Chiapini et al., 1982 Roitman & James, 1985 [M-H] on
-

neutros perdidos

on fragmento RDA 151 151; 221 -

Frmula molecular C19H18O7 C18H16O6 C16H12O6 C16H12O5 C16H12O6 C19H18O8 C15H10O6 C17H14O7 C16H12O7

I II III IV V VI VII VIII IX

357 327 299 283 299 373 285 329 315

18; 28; 30; 32 28; 30 30 30 30 28; 30; 60 18; 28; 30 30

71

Tabela 5-3- Dados dos espectros de RMN 1H das Substncias I a IX a

Substncia H-3 H-6 H-8 H-2 8,07 (d; 9,0 ) H-3 7,02 (d; 9,0 ) H-5 7,02 (d; 9,0 ) H-6 8,07 (d; 9,0 ) OH-5 12,66 (s) OMe 3,96;
I

6,50 (s)

3,92; 3,90; 3,86 3,93; 3,92; 3,89 4,00

II

6,33 (d; 2,0) 6,26 (d; 2,1) 6,20 (d; 2,1) 6,26 (d; 2,1)

6,68 (d; 2,0) 6,56 (d; 2,1) 6,50 (d; 2,1) 6,50 (d; 2,1)

8,13 (d; 9,1) 7,64 (d; 2,1) 8,00 (d; 9,0 ) 8,03 (dl; 9,1) 7,66 (d; 2,2)

7,13 (d; 9,1)

7,13 (d; 9,1) 7,01 (d; 8,3) 7,00 (d; 9,0 ) 7,02 (d; 9,1) 7,14 (d; 8,6)

8,13 (d; 9,1) 7,61 (dd; 8,3 e 2,1) 8,00 (d; 9,0 ) 8,03 (dl; 9,1) 7,72 (dd; 8,6 e 2,2)) 7,36 (dd; 8,3 e 2,2) 7,59 (d; 8,5 e 2,2) 7,57 (d; 8,5 e 2,2)

12,74 (s) 13,10 (s) * 12,90 (s)

III

6,71 (s)

7,00 (d; 9,0 ) 7,02 (d; 9,1)

IV V

6,70 (s) -

3,90 3,87 3,99;

VI

6,86 (s)

12,70 (s)

3,96; 3,89; 3,80

VII

6,56 (s)

6,14 (d; 2,1) 6,30 (d; 2,1) 6,24 (d; 2,1)

6,42 (d; 2,1) 6,65 (d; 2,1) 6,48 (d; 2,1)

7,39 (d; 2,2) 7,71 (d; 2,1) 7,68 (d; 2,2)

6,89 (d; 8,3) 6,99 (d; 8,5) 6,97 (d; 8,5)

12,90 (s) 12,76 (s) 12,83 (s)

3,92; 3,86 3,86

VIII

IX
a

Substncias II, IV, V, VI e VIII (200 MHz, acetona-d6); Substncias III, VII e IX (400 MHz, acetona-d6) *sinal no observado; -, sinal inexistente; multiplicidade e J (Hz) entre parnteses

72

magMHF85 261 (3.071) Cm (228:311-(95:215+346:464)) 100

255.3

Scan ES1.20e6

2'

4'

OMe

MeO

O
4 5

MeO
150.9

OMe

OH
%

325.3 311.3 241.2 227.4 171.2 144.9 113.4 143.0 297.3 157.1 181.2 199.3 267.3 213.5 279.3 253.2 283.4 269.3 281.3 301.2 339.4

115.2

357.3

0 100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

320

330

340

350

360

370

380

390

m/z 400

Figura 5-1- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia I

2'

4'

OMe

MeO

O
4 5

MeO

OMe

OH

Figura 5-2- Espectro de RMN de 1H (200 MHz, acetona-d6), da Substncia I

73

margAVF7K4a 152 (1.799) Cm (134:192-(10:118+251:335)) 100

2'

4'

OCH3

327.2

Scan ES1.08e6

H3CO
7

O
4

OCH3

OH

%
301.2 325.3 343.3

255.3 313.1

339.3

113.1

150.9 115.2 126.9 156.9

171.0 199.3

227.3

241.2

283.2 269.3 281.2

373.3 297.2 357.4 371.6 381.4

235.1

0 100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

320

330

340

350

360

370

380

390

m/z 400

Figura 5-3- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia II e VI em

mistura

2'

4'

OCH3

H3CO
7

O
4

OCH3

OH

Figura 5-4- Espectro de RMN de 1H (200 MHz, acetona-d6) da Substncia II

74

margDF446TA 109 (1.297) Cm (99:135-(31:78+145:197)) 100

299.1

Scan ES4.99e6

OCH3
2' 4'

OH

HO

O
4 5

OH

173.9

269.1

0 100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

320

330

340

350

360

370

380

390

m/z 400

Figura 5-5- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia III

Figura 5-6- Espectro de RMN de NOEDIFF (400 MHz, acetona-d6, irradiao OMe em
4,00) da Substncia III

75

Tabela 5-4- Dados do espectro de RMN de 13C (400 MHz, acetona-d6) da Substncia
III e da 3-O-metil luteolina Posio 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6
a

C da Substncia III 164,9 104,4 183,1 163,4 99,7 164,9 94,8 158,8 * 123,6 110,5 151,5 148,9 116,8 121,3

3-O-metil luteolina a 163,7 103,8 181,8 161,6 98,8 164,2 94,0 157,4 103,3 120,4 110,2 150,8 148,0 115,8 120,4

(AGRAWAL, 1989); * Sinal no observado

76

OCH3
2' 4'

OH

HO

O
4 5

OH

Figura 5-7- Espectro de RMN de 13C (100 MHz, acetona-d6) da Substncia III

77

Figura 5-8- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia III

78

margc5jk7 75 (1.401) Cm (62:101-(6:51+105:185)) 100

299.1

Scan ES4.94e6

2'

OH
4'

HO

O
4 5

OMe O

OH
%

269.0 599.3

569.3

0 100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

m/z 600

Figura 5-9- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia V

margc5iac 102 (2.237) Cm (99:129-(45:90+152:184)) 100

373.4

Scan ES3.00e5

OH
113.1 112.7 59.1 69.1

2'

OCH3
5'

H3CO

O
4

H3CO
88.9

OCH3

OH

255.4

283.5

281.4

74.4

136.8 144.0 114.1 150.6

179.1

221.4

241.4

269.1

301.7

343.3 341.1 385.2 405.3

463.6

535.5

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

600

620

640

m/z

Figura 5-10- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia VI

79

OH
2'

OCH3
5'

H3CO

O
4

H3CO

OCH3

OH

Figura 5-11- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia VI

OH
2'

OCH3
5'

H3CO

O
4

H3CO

OCH3

OH

Figura 5-12- Espectro de RMN de NOEDIFF (400 MHz, acetona-d6, irradiao da

OMe em 4,00) da Substncia VI
80

mag5bt20 173 (2.045) Cm (156:208-(46:132+239:331)) 100

285.2

Scan ES3.14e6

OH
2'

OH
4'

HO
7

O
4 5

OH
%

142.1

255.1

0 100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

320

330

340

350

360

370

380

390

m/z 400

Figura 5-13- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia VII

Figura 5-14- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia VII

81

MARGc5JK4(ES-)
MARGc5JK4 60 (0.925) Sm (Mn, 4x1.20); Cm (43:62-(6:39+90:143)) 100
329.4

Scan ES1.14e6

OCH3
2'

OH
4'

HO
7

O
4 5

OCH3

62.1

OH

89.1 325.4

97.0 103.1 255.3 283.4 299.3 311.4 339.5 343.4 445.5

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

m/z

Figura 5-15- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia VIII

Acetone-d6 12.7628 7.7191 7.7085 7.6217 7.6107 7.5793 7.5682 7.0072 6.9648 6.6571 6.6457 6.3107 6.2999 3.9166 3.8617 2.0400 3 2

OCH3
2'

OH
4'

HO
7

O
4 5

OCH3

OH

13

12

11

10

Figura 5-16- Espectro de RMN de 1H (200 MHz, acetona-d6) da Substncia VIII

82

OH
2'

OH
4'

HO
7

O
2 4 5

OCH3

OH

Figura 5-17- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia IX Tabela 5-5- Dados dos espectros de RMN 1H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia
IX e da 3-O-metilquercetina H / Posio OH-5 2 5 6 6 8 OMe-3
a

Substncia IX* 12,83 (s) 7,68 (d; 2,2) 6,97 (d; 8,5) 7,57 (dd; 2,2 e 8,5) 6,24 (d; 2,1) 6,48 (d; 2,1) 3,86 (s)

3-O-metilquercetina* a 12,81(s) 7,72 (d; 2) 7,00 (d; 8,5) 7,59 (dd; 2 e 8,5) 6,25 (d; 2) 6,48 (d; 2) 3,87 (s)

* em ppm, J em Hz; (100 MHz, acetona-d6; ROITMAN & JAMES, 1985)

83

OH OMe MeO O MeO O

OH OMe

MeO OH O

C H

H H m/z 373

MeO OH O

OMe m/z 373

H m/z 343
2 H

O H

RDA

O H MeO O O

O OMe

OH

MeO

m/z 151

C O

OMe m/z 221

MeO OH O

H m/z 283

CO OH

MeO OH

m/z 255

Figura 5-18- Proposta de fragmentao da Substncia VI

84

5.2. Identificao das Substncias XI e XII

OH 3'' OH
OH
5'

OH
3'

HO OH
6''

O
2 5 4

HO
1''

6''

OH
3' 5'

OH O O
2

O
1''

OH

HO
O
7

HO HO
3''

OH

OH

4 5

isoorientina

OH

orientina O extrato hidrometanlico, partio n-butanlica, de folhas de V. polygama depois de sofrer fracionamento em XAD-7, originou a poro metanlica, a qual foi submetida a vrias etapas cromatogrficas em sephadex LH-20 e CLAE, que forneceu a frao HM5d, 20,5 mg, de aspecto oleoso e amarelo limo. A anlise do espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6, Figura 5-20, Tabela 5-6) revelou dois sinais em 13,58 e 13,18 (ambos s, com intensidades diferentes) referentes aos grupos hidroxilas quelados ligados ao C-5, indicando tratarse de uma mistura de flavonides; dois conjuntos de sinais caractersticos do anel B 3,4-dissubstitudo em intensidades diferentes e sinais em 6,61 (s); 6,59 (s, de menor intensidade) e 6,51, referentes aos H-3, 8 e 6 respectivamente reforou a idia de uma mistura. Um sinal centrado em 4,98 (d, J = 9,7 Hz, integrando para 2H) relativo a H anomricos, indicando a presena de duas molculas de acar em configurao ligada aglicona, e vrios sinais na regio entre 3,87 a 3,47, pertencentes a H carbinlicos dos carboidratos, corroboraram com a hiptese de ser uma mistura de flavonides glicosilados, provavelmente de ismeros. Em soluo, um ismero pode se transformar no outro e vice-versa. A frmula molecular C21H20O11 foi deduzida com base nos dados obtidos pelo espectro de massas, ESI, modo negativo (Figura 5-19), medida no pico do on pseudo molecular a m/z 447 [M-H]-.
85

Baseados nos dados espectrais acima expostos e dados da literatura (SANTOS, 2000; DAYRIT et al., 1987), foram propostas as estruturas 8-C--Dglucopiranosil luteolina (orientina) e a 6-C--D-glucopiranosil luteolina (isoorientina) para as Substncias XI e XII.

Tabela 5-6- Dados do espectro de RMN de 1H (J em Hz, 400 MHz, acetona-d6) das
Substncias XI e XII H 3 6 8 2 5 6 1 OH 13,59 (s) 7,01 (d, 8,3) 7,49 (dd, 2,2 e 8,3) 4,98 (d, 9,7) 13,18 (s) 6,51 (s) 7,51 (d, 2,1) 6,99 (d, 8,3) 7,54 (d, 2,1 e 8,3) XI mistura 6,61 (s) 6,59 (s) XII

margHM5de 135 (2.952) Cm (99:183) 100

447.2

Scan ES5.44e6

OH
3'

OH
5'

3''

OH OH
6''

HO OH
6''
68.9

O
2 5 4

O
1''

HO
1''

OH
3' 5'

OH O O
2

OH

HO HO
3''

OH

OH

HO
7

4 5

68.6

OH

89.2 97.1

113.1

255.2

463.2

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

600

620

640

m/z

Figura 5-19- Espectro de massas (ESI, modo negativo) das Substncias XI e XII
86

Figura 5-20- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6) das Substncias XI e XII

87

5.3. Identificao das Substncias XIII e XIV

OH OH OH HO 1''' O OH 3''
5'' 6'''

O
1''

5'' 3'' 6'

OH
4'

HO HO
2' 4' 6'

OH

OH O
3

O
7 3 5 2'

OH

OH
6'''

O
1''' OH

HO

OH

OH

HO O

1''

HO HO
3'''

OH

isoschaftosdeo

schaftosdeo

O extrato hidrometanlico, partio n-butanlica, de folhas de V. polygama depois de sofrer fracionamento em XAD-7, originou a poro metanlica, a qual foi submetida a vrias etapas cromatogrficas em sephadex LH-20 e CLAE, que forneceu a frao 4Vx1, 4,0 mg, sob a forma de slido amarelo. A anlise do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, Figura 5-23) revelou ser uma mistura de flavonas glicosiladas com o anel B p-substitudo, devido apresentar os seguintes sinais em intensidades diferentes: um em 7,98 (d, 8,7 Hz, H2 e 6); um em 6,93 (d, 8,7 Hz, H-3 e 5); um em 6,92 (d, 8,7 Hz, H-3 e 5); um em 6,63 (s, H-3); os sinais em 5,05 (d, 9,9 Hz), em 5,02 (d, 9,8 Hz) e outro em 4,86 (d, 9,8 Hz) referentes a H anomricos, juntamente com os sinais entre 4,08 a 3,45 relativos aos H carbinlicos, corroboraram com a hiptese de flavonas glicosiladas, as quais pensamos ser a vitexina e seu ismero. Porm, ao se fazer a anlise da amostra por espectrometria de massas, usando-se a ionizao por eletrospray no modo negativo (Figura 5-21), o espectro revelou um pico relativo ao on pseudo molecular a m/z 563 [M-H]- e um pico a m/z 431 [M-H-132]-, indicando a presena de uma pentose ligada possvel molcula de vitexina. Para confirmao da massa molecular, foi adicionada uma nfima quantidade de NaCl amostra, para se realizar a anlise da mesma no espectrmetro de massas, usando-se a ionizao por eletrospray no modo positivo, j que sem a adio do sal no foi possvel a realizao desta anlise. Assim, foi observado o pico (Figura 5-22) referente ao aduto de sdio a m/z 587 [M+Na]+
88

confirmando a massa molecular de 564 g/mol relativa frmula molecular C26H28O14 pertencente a uma flavona diglicosilada. A hiptese acima foi reiterada com os resultados obtidos atravs das anlises dos espectros de RMN 13C, HSQC e COSY. O espectro de RMN
13

C (100 MHz, CD3OD, Figura ; Tabela ) revelou dois

sinais em 184,5 e 184,3 referentes s carbonilas queladas localizadas no C-4, alm de vrios outros sinais duplicados, entre eles doze sinais referentes a C carbinlicos. O espectro de HSQC (400 MHz, CD3OD, Figura 5-27) foi decisivo para a elucidao da mistura como sendo de di-C-glicosdeos, j que mostrou a correlao dos H anomricos em 5,02 e 4,86 com os carbonos em 75,2 e 76,7, pois os C anomricos mais blindados so caractersticos de flavonas C-glicosiladas. O espectro de COSY (400 MHz, CD3OD, Figura 5-25) contribuiu para a atribuio dos H-2 dos acares devido revelar os acoplamentos entre estes H, sinais em 4,08 (d, 9,6 Hz) e 4,00, e o H anomrico em 5,02 (d, 9,8 Hz). No espectro de HSQC estes mesmos sinais estavam correlacionados com os C em 73,3 e 70,6 respectivamente. Os acares foram identificados como a glicose e arabinose, devido dados dos espectros de massas e por seus deslocamentos no espectro de RMN estarem em concordncia com os dados da literatura (BESSON et al., 1985). Baseados nos dados espectrais obtidos e nos dados da literatura (BESSON et al., 1985), foram propostas as estruturas das flavonas di-C-glicosiladas 5, 7,4,-triidroxi,6-C--D-glucopiranosil, 8-C--L-arabinopiranosil apigenina (schaftosdeo) e a 5,7,4,-triidroxi,8-C--D-glucopiranosil,6-C--L-arabinopiranosil apigenina (isoschaftosdeo), sendo estas inditas para o gnero Vitex.
13

89

Tabela 5-7- Dados dos espectros de RMN 13C (100 MHz, CD3OD) das Substncias
XIII e XIV, schaftosdeo e isoschaftosdeo C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 Acar 1 2 3 4 5 6
a

schaftosdeo a 164,1 102,4 182,4 159,5 108,4 161,2 104,3 154,3 103,5 121,3 129,2 116,1 161,5 116,1 129,2 Glic 73,6 70,7 78,7 69,8 81,2 61,5 Ara 74,7 68,8 75,1 68,8 70,7

isoschaftosdeo a 164,2 102,6 182,4 161,1 108,1 158,3 105,1 155,2 103,7 121,5 129,0 116,0 161,3 116,0 128,5 Glic 72,9 70,8 79,0 69,8 81,6 61,6 Ara 71,4 63,1 72,3 69,9 67,1

Substncias XIII + XIV 166,9 103,9 184,5; 184,3 157,6 108,5 163,0; 162,9 105,9 * 104,1 123,5 130,3; 129,9 117,2; 117,1 160,5 117,2; 117,1 130,3; 129,9 Glic 72,1; 73,3 70,6 80,4; 75,4 71,4 83,1; 82,8 63,2 Ara 75,2;72,5 * 76,7 70,6 70,6

(DMSO-d6; BESSON et al., 1985); * Sinal no observado

90

marg4vx1 44 (1.125) Cm (24:55-(64:94+5:21)) 100

563.3

Scan ES4.71e5

OH O OH OH HO O O
7 3 5
62.0 193.3

OH
6' 4'

OH

2'

HO HO

OH HO

89.2

307.3 86.9 97.1 177.0 353.1 387.5

431.3 447.3 463.3

579.2

631.3

635.3 665.3 649.3

0 50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

325

350

375

400

425

450

475

500

525

550

575

600

625

650

675

700

725

m/z 750

Figura 5-21- Espectro de massas (ESI, modo negativo) das Substncias XIII e XIV
margareth(071003)
marg4Vx1pos 71 (1.539) Cm (68:79) 100
288.25

Scan ES+ 1.62e7

288.60

122.20 122.38

587.37

143.94

182.98

223.17 235.05

463.48

507.55

551.55 565.46

595.49

0 100

120

140

160

180

200

220

240

260 280

300

320

340 360

380

400

420

440 460

480

500

520 540

560

580

m/z 600

Figura 5-22- Espectro de massas (ESI, modo positivo) das Substncias XIII e XIV

91

Figura 5-23- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) das Substncias XIII e XIV

92

OH O OH OH HO O O
7 3 5 2' 6'

OH
4'

OH

HO HO

OH HO

Figura 5-24- Espectro de RMN 13C (100 MHz, CD3OD) das Substncias XIII e XIV

Figura 5-25- Espectro de 1H-1H COSY (400 MHz, CD3OD) Substncias XIII e XIV
93

Figura 5-26- CCDA das Flavonas Glicosiladas

Legenda da figura: 5e: Substncias XV e XVI; 5de: Substncias XI e XII; 4Vx1: Substncias XIII e XIV (eluente: BAW 5:1:4; revelador: vanilina sulfrica e aquecimento; manchas amarelas intensas)

OH O OH OH HO O O
7 3 5 2' 6'

OH
4'

OH

HO HO

OH HO

Figura 5-27- Espectro de 1Hx13C HSQC (400 MHz, CD3OD) das Substncias XIII e
XIV

94

5.4. Identificao das Substncias XV e XVI

OH O
1'' 5'' 3'' 6'

OH OH HO 1''' O
2'

OH
4'

6'''

HO HO OH
6'''

OH OH
OH HO

OH
2'

OH
4' 6'

OH

O
7 3 5

O
1'''

OH 3''
5''

O
3

HO HO
3'''

OH

OH

HO O

1''

OH

carlinosdeo

isocarlinosdeo

O extrato hidrometanlico, partio n-butanlica, de folhas de V. polygama depois de sofrer fracionamento em XAD-7, originou a poro metanlica, a qual foi submetida a vrias etapas cromatogrficas em CLAE, que forneceu a frao HM5ep, 3,0 mg, sob a forma de slido amarelo. A anlise do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD; Figura 5-29) revelou uma mistura de flavonas glicosiladas com o anel B 3,4-dissubstitudo, devido apresentar os seguintes sinais: um em 7,55 (d, 2,0 Hz, H-2); um em 7,51 (dd, 8,3 e 2,0 Hz, H-6); um em 7,39 (m); um em 7,36 (sl); um em 6,90 (d, 8,4 Hz, H-5); um em 6,89 (d, 8,4 Hz, H-5); um em 6,56, que a princpio foi interpretado como um sinal de multiplicidade dubleto com constante de acoplamento 3,8 Hz, mas depois foi considerado como dois sinais em 6,57 e 6,56 (ambos s) respectivamente. Os sinais em 5,08 (d, 9,7 Hz), em 5,02 (d, 10,0 Hz) e outro em 4,86 (d, 10,0 Hz) referentes a H anomricos, juntamente com os sinais entre 4,17 a 3,42 relativos aos H carbinlicos, corroboraram com a hiptese de flavonas glicosiladas, as quais pensamos ser a orientina e seu ismero, devido a frao anterior conter esta mistura, com um outro possvel flavonide monoglicosilado, j que a intensidade do sinal em 5,02 era o dobro dos sinais em 5,08 e 4,86 . Porm, ao se fazer comparao em CCDA (Figura 5-26) entre as flavonas glicosiladas, foi observada grande diferena no fator de reteno (Rf) das mesmas, logo as substncias eram diferentes. Alm disso, a amostra era pouco solvel em acetona deuterada, enquanto a mistura contendo as Substncias
95

XI e XII era perfeitamente solvel. Somando-se a estes fatos, o espectro de RMN de 1H (200 MHz) mostrou tratar-se de uma mistura de duas flavonas, por apresentar dois sinais em 13,84 e 13,71, referentes a dois grupos de hidroxila quelada ligada ao C-5, e vrios outros sinais de intensidade diferentes. Logo, foi realizado um espectro de RMN de 1H em acetona-d6/D2O (400 MHz, Figura 5-30), o qual exibiu os seguintes sinais: um em 7,66 (sl); um em 7,62 (dl, 8,3 e 9,9 Hz); um em 7,57 (s); um em 7,50 (dl, 7,6 Hz); um em 7,03 (dl, 8,4 Hz); um em 7,00 (d, 8,5 Hz); dois em 6,66 e 6,65, sobrepostos na linha de base, assemelhando-se a um sinal tipo singleto largo. Esses sinais pertencentes aglicona perderam resoluo, quando comparados com os sinais apontados no espectro realizado em metanol deuterado. Porm, os sinais referentes aos H anomricos ficaram bem diferenciados evidenciando-se dois sinais em 5,15 (d, 9,6 Hz) e 4,83 (d, 10,7 Hz), de menor intensidade, e outros dois em 5,02 e 4,88 (ambos d, 9,7 Hz) de maior intensidade, levando-se hiptese de uma mistura contendo duas flavonas diglicosiladas. A anlise da amostra por espectrometria de massas, usando-se a ionizao por eletrospray no modo negativo, produziu um espectro (Figura 5-28) que revelou um pico relativo ao on pseudo molecular a m/z 579 [M-H]-. Para confirmao da massa molecular, foi adicionada uma pequena quantidade de NaCl amostra, para se realizar a anlise da mesma por espectrometria de massas, usando-se a ionizao por eletrospray no modo positivo, j que sem a adio do sal no foi possvel a realizao desta anlise. Assim, foi observado o pico referente ao aduto de sdio a m/z 603 [M+Na]+ confirmando a massa molecular de 580 g/mol relativa frmula molecular C26H28O15 pertencente a uma flavona diglicosilada e seu ismero. A hiptese acima foi reiterada com os resultados obtidos atravs das anlises dos espectros de RMN de HSQC, HMBC e COSY. O espectro de HSQC (400 MHz, CD3OD, Figura 5-33) foi decisivo para a elucidao da mistura como sendo de di-C-glicosdeos, j que mostrou a correlao dos H anomricos em 5,02 e 4,86 com os carbonos em 76,0 e 78,0, pois os C anomricos mais blindados so caractersticos de flavonas C-glicosiladas. O espectro de COSY (400 MHz, CD3OD, Figura 5-31) contribuiu para a atribuio dos H-2 dos acares devido revelar os acoplamentos entre estes H, sinais em 4,07, 3,53 e 3,99, e os H anomricos em 5,02 e 4,86. No espectro de HSQC estes mesmos sinais
96

estavam correlacionados com os C em 73,0 e 70,0 respectivamente. O espectro de HMBC (400 MHz, CD3OD, Figura 5-32) revelou as correlaes entre os H anomricos com os C-6/8 ( 106,0) e C-9 ( 158,0) comprovando os locais de ligao dos acares, os quais tambm foram identificados da mesma forma que as Substncias XIII e XIV. Baseados nos dados espectrais obtidos e nos dados da literatura (BESSON et al., 1985; Tabela 5-8), foram propostas as estruturas das flavonas di-Cglicosiladas luteolina 5,7,3,4,-tetraidroxi,6-C--D-glucopiranosil,8-C--L-arabinopiranosil e a 5,7,3,4,-tetraidroxi,8-C--D-glucopiranosil,6-C--L(carlinosdeo)

arabinopiranosil luteolina (isocarlinosdeo). Sendo estas substncias inditas para o gnero Vitex. Anteriormente, em s um artigo de 1966 (SEIKEL et al., 1966) havia sido relatada a presena de flavonides di-C-glucosilados derivados da luteolina e apigenina, as luceninas e viceninas, respectivamente, do caule de Vitex lucens. Sabese que os flavonides di-C-glicosilados tambm ocorrem em plantas da famlia Lamiaceae (DOU et al., 2002), o que refora mais a semelhana qumica destas famlias.

97

Tabela 5-8- Dados das projees dos C dos espectros de RMN 1Hx13C HMBC e
HSQC (400 MHz, CD3OD) das Substncias XV + XVI e carlinosdeo e isocarlinosdeo C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 Acar 1 2 3 4 5 6 Glic 73,5 70,8 78,9 70,4 81,7 61,2
a

carlinosdeo a 164,0 102,5 182,3 159,8 108,8 162,0 104,2 154,0 103,3 121,6 113,8 145,8 150,0 116,2 119,9 Ara 74,4 68,9 75,3 69,3 70,8

isocarlinosdeo a 163,2 102,5 182,2 160,1 109,3 163,2 102,5 153,0 103,1 121,6 113,7 146,0 150,1 116,1 119,2 Glic 73,2 71,0 79,2 70,0 81,8 61,9 Ara 71,5 63,3 72,6 70,2 67,2 Glic 75,0 73,0 80,0 72,0 83,0 63,0

Mistura 166,0 104,0 184,0 * * * 106,0 158,0 105,0 124,0 114,0; 115,0 147,0 151,0 117,0 121,0; 122,0 Ara 76,5 70,0 76,0 71,5 72,5

* Sinal no observado; (20 MHz, DMSO-d6; BESSON et al., 1985)

98

MARG030902
MARGHM5eB 87 (1.878) Sm (Mn, 4x1.20); Cm (72:124-(20:60+141:184)) 100
603.7

Scan ES+ 3.45e5

OH O
1'' 5'' 3'' 6'

A
OH
4'

HO HO OH
6'''
%

OH OH

O
7 3 5 2'

O
1'''

HO HO
3'''

OH

OH

604.8

625.7 210.5 214.5 216.4 246.5 257.3 301.7 307.8 429.8 441.9 471.7 487.7 551.3

523.2

683.7

0 200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

600

620

640

660

680

m/z 700

MARG030902
MARGHM5eA 94 (2.026) Sm (Mn, 4x1.20); Cm (70:115) 100
579.6

Scan ES8.12e5

447.4

249.3

269.1 271.1

463.4

615.6

637.5

693.5

0 200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

600

620

640

660

680

m/z 700

Figura 5-28- Espectros de massas das Substncias XV e XVI

(EM/ESI, A: modo positivo; B: negativo)

99

Figura 5-29- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) das Substncias XV e XVI
100

Figura 5-30- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, D2O/acetona-d6) das Substncias XV

e XVI
101

Figura 5-31- Espectro de 1H-1H COSY (400 MHz, CD3OD) das Substncias XV e XVI

Figura 5-32- Espectro de 1Hx13C HMBC (400 MHz, CD3OD) das Substncias XV e
XVI

102

OH O
1'' 5'' 3'' 6'

OH
4'

HO HO OH
6'''

OH OH

O
7 3 5 2'

O
1'''

HO HO
3'''

OH

OH

Figura 5-33- Espectro de 1Hx13C HSQC (400 MHz, CD3OD) das Substncias XV e
XVI

103

5.5. Identificao Substncias XVII e XVIII

OH
3'

OH

OH
5' 6''

3'

6''

OH OH
3''

O O
5' 1''

HO
7 5

O
4

OH OH OH

HO
7

O
4 5

OH

OH

O O
1''

O OH
3''

OH O

OH

OH

3-O--D-glucopiranosil quercetina ou isoquercitrina

4-O--D-glucopiranosil quercetina

O extrato metanlico de folha de V. polygama, partio diclorometnica, aps sofrer vrias etapas cromatogrficas em slica e sephadex LH-20, forneceu as fraes dh5dR5, 4dgf4f, dgf6d e dgf8d, que reunidas renderam 8,0 mg, sob a forma de p amarelo brilhante amorfo. A anlise do espectro de RMN de 1H (DMSO-d6, 400 MHz, Figura 5-40) revelou que a amostra, inicialmente, era uma mistura de flavonides (Substncias III, VIII, XVII e XVIII) com sinais caractersticos para flavona (Sub. III) como o conjunto em 6,92 (sl; H-3), 6,35 (sl; H-6) e 6,04 (sl; H-8); sinais referentes a mais de um anel B orto-dissubstitudo e sinais que indicavam presena de acar em 4,90 (d; J = 7,7 Hz; H-1) e em 3,27 (dd; J = 12,3 e 4,5 Hz; H-6). Aps vrias etapas cromatogrficas em HPLC, somente a graxa foi retirada. Vrios espectros de RMN de 1H (Tabela) foram realizados em diferentes solventes deuterados, sendo evidenciada a presena de dois sinais adicionais referentes a hidrognios de metoxilas em 3,89 e 3,88, referentes Substncia VIII (CD3OD, 400 MHz, Figura 5-43), e o restante dos sinais permaneceu semelhante mistura inicial. O experimento de RMN de 1H de duas dimenses, HMBC, foi realizado para se detectar o carbono de conexo do acar aglicona e tambm permitiu a atribuio de alguns outros sinais (Figura 5-42, Tabela 5-11). O experimento de NOEDIFF (400MHz, CD3OD) foi realizado com o intuito de se atribuir a localizao das metoxilas. Foi realizada a irradiao dos sinais em 3,88-3,89, causando aumento de intensidade no sinal em 7,1, no muito conclusivo por se tratar de uma rea com muita sobreposio de sinais.
104

A tcnica denominada DOSY (SOUZA & LAVERDE, 2002) foi usada na tentativa de se identificar os flavonides da mistura, porm no houve sucesso, pois apesar de esperarmos coeficientes de difuso bem diferentes para os constituintes da mesma, a sobreposio dos sinais referentes a mais de um anel B orto-dissubstitudo impediu a distino dos sinais. A anlise do espectro de RMN de
13

C (100 MHz, DMSO-d6, Figura 5-39)

revelou um sinal para carbonila quelada de flavona em 181,9 corroborando com o sinal de OH quelada observado nos espectros de RMN de 1H realizados em acetona e piridina deuteradas (Figura 5-41, Figura 5-43); vrios sinais entre 167,0 e 94,7 podendo pertencer classe flavona (Sub. III) ou flavonol (Subst. VIII, XVII e XVIII); confirmou a presena da molcula de acar pelos sinais referentes aos carbonos carbinlicos em 78,4; 76,8 e 60,5 e mostrou o sinal relativo ao C de metoxila (Sub. VIII) em 56,1. Foi realizado um espectro de massas no modo negativo usando-se uma pr-coluna C-18 no injetor (Figura 5-34), com o intuito de promover a separao das possveis substncias da mistura na anlise por massas, o que no foi conseguido. Foram revelados um pico (100%), referente a uma das possveis substncias (XVII e XVIII) da mistura e em maior quantidade, relativo ao on pseudo molecular a m/z 463 [M-H]-; um pico (88%) a m/z 299 [M-H]-, relativo segunda substncia (Sub. III); um pico (40%) a m/z 329 [M-H]-, relativo terceira substncia (Sub. VIII). Os picos a m/z 299 e 329 foram atribudos s flavonas 3'-O-metil luteolina (Substncia III) e 3,3'dimetoxi,5,7,4'-triidroxiflavona (Substncia VIII), encontradas anteriormente em fraes prximas a esta estudada. O espectro de massas, ESI/modo negativo (voltagem do cone de 9,7 eV; Figura 5-35), de uma amostra passada vrias vezes no sephadex, revelou um pico (100%) relativo ao on pseudo molecular a m/z 463 [M-H]-. Usando-se as mesmas condies, porm com uma voltagem maior (30 eV; Figura 5-36), foi revelado um pico (100%) a m/z 283 [M-H-180]-, confirmando ser uma mistura de flavonides glicosilados e ismeros. No modo positivo, o pico de maior intensidade foi o relativo a m/z 465 [M+H]+. Tambm foi realizado o espectro no modo positivo com adio de cloreto de sdio para se confirmar a massa e um pico (30%), referente ao aduto de sdio, a m/z 487 [M+Na]+ foi observado. No modo negativo com adio de cloreto de sdio foi
105

observado um pico (20%), aduto de cloro, a m/z 499 [M+Cl]- (Figura 5-37). As informaes obtidas pelos espectros de ons filhos do pico a m/z 463 (Figura 5-38) nos forneceu dados para a proposio de um modelo de fragmentao (Esquema 5-1) que possibilitou a identificao dos flavonides como glicosdeos de frmula molecular C21H20O12. As correlaes obtidas pelo espectro de HMBC (Figura 5-42) indicaram serem dois flavonis ismeros de posio do acar. Baseando-se nos dados espectrais obtidos e na comparao com dados da literatura (AGRAWAL, 1989; Tabela 5-9), as estruturas 3-O--D-glucopiranosil quercetina e 4-O--D-glucopiranosil quercetina foram propostas, sendo inditas para a espcie.
OH O HO H OH O O OH m/z 463 HO O OOH OH OH O RDA HO m/z 283 H O OH OH OH glicose OH m/z 433 m/z 301 OH H
HO

O
O OH OH

OH O HO O OH O m/z 445
OH O OH OH

OO OH

H + H

OH Om/z 175
C

OH

OH OHO O OH O CO HO m/z 283

OH O-

O m/z 255 OH

Esquema 5-1- Proposta de fragmentao da Substncia XVIII

106

MAR5dR 110 (1.676) Sb (3,20.00 ); Cm (104:152-(170:209+56:92)) 100

463.6 463.3

Scan ES1.79e5

299.5

300.8 249.3 265.3 281.5 283.0 307.5 301.5

329.6 325.5 339.3 464.6 499.6

230.4 215.3 213.3 223.1

267.4 236.4

385.4

433.0

500.6

279.4

357.4 365.6 377.5

461.4 401.5 424.7 436.7

469.6 493.1 543.6 521.1 559.6 577.3

0 200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

m/z 600

Figura 5-34- Espectro de massas (ESI, modo negativo, pr-coluna G-ODS) da

mistura das Substncias XVII e XVIII e Substncias III e VIII

Margareth1802neg 62 (1.370) Sm (Mn, 2x1.00) 100

463

Scan ES9.76e5

OH
3'

OH

OH
5'

3'

6''

OH OH
3''

O O
5' 1''

HO
7 5

O
4

6''

OH OH OH

HO
7

O
4 5

OH

OH

O O
1 ''

O OH
3''

OH O

OH

OH

145 175

127

185 129 131 155 231 199 227 207 241

173

255 283 301 493 577 591

169

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

m/z

Figura 5-35- Espectro de massas (ESI, modo negativo, 9,7 eV) da mistura das
Substncias XVII e XVIII

107

margdh5dR5 81 (1.511) Cm (63:109-(7:51+130:196)) 100

283.1

Scan ES3.04e6

OH
3'

OH

OH
5' 6''

3'

6''

OH OH
3''

O O
5' 1''

HO
7 5

O
4

OH OH OH

HO
7

O
4 5

OH

OH

O O
1''

O OH
3''

OH O

OH

OH
463.2

112.9

255.3 299.1

325.4

339.2 433.3 485.2 577.2

0 100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

m/z 600

Figura 5-36- Espectro de massas (ESI, modo negativo, 30,0 eV) da mistura das
Substncias XVII e XVIII

Figura 5-37- Espectro de massas da mistura das Substncias XVII e XVIII

(ESI, A: modo negativo, B: modo positivo, com adio de NaCl)

108

283
OH
3'

OH

OH
5' 6''

3'

6''

OH OH
3''

O O
5' 1''

HO
7 5

O
4

OH OH OH

HO
7

O
4 5

OH

OH

O O
1 ''

O OH
3''

OH O

OH

OH

Figura 5-38- Espectro de massas (ESI, modo negativo, 25 eV) da mistura das
Substncias XVII e XVIII

109

Tabela 5-9- Dados do espectro de RMN 1H da mistura das Substncias III e VIII e
das Substncias XVII e XVIII em vrios solventes deuterados a
C5D5N (400 MHz) 13,73 (s) 7,77-7,76 (d; 2,2) 7,57-7,56 (d; 2,2) 7,41 (d; 1,4) 7,34 (sl) 7,33 (d; 1,5) 7,02 (sl) 6,88 (d; 2,0) 6,81 (d; 2,0) 5,52-5,50 (d; 8,0) 5,51-5,49 (d; 8,1) 4,48-4,47 (m) 4,26-4,23 (dd) 3,97-3,95 (dd) 3,85 (s) 3,80 (s) DMSO-d6 (400 MHz) 8,03 (s) 7,53 (d; 1,8) 7,48 (dl; 8,7) 6,97 (d; 8,5) 6,92 (sl) 6,77 (dl; 8,4) 6,72 (sl) 6,56 (d; 8,7) 6,35 (sl) 6,04 (sl) 4,90 (d; 7,7) 4,16 (m) 3,47 (dd) 3,27 (dd; 12,3; 4,5) CD3OD (400 MHz) 8,5 (s) 7,60 (d; 2,2) 7,54 (d; 1,8) 7,51-7,49 (dd; 8,4; 2,2) 7,12-7,10 (d; 8,5) 7,06-7,04 (d; 8,5) 7,05-7,03 (dd) 6,94-6,91 (m) 6,87-6,85 (d; 8,1) 6,86-6,84 (d; 8,1) 6,85-6,83 (d; 8,6) 6,56 (sl) 6,35 (d; 2,1) 6,13-6,12 (t; 2,1) 4,15-4,12 (m) 3,89 (s) 3,88 (s) 3,84-3,82 (d; 8,4) 3,76-3,73 (dd; 12,4; 2,4) 3,53-3,47 (dd; 12,4; 4,3)
a

(CD3)2CO (200 MHz) 12,98 (s) 7,61 (m) 7,19-6,98 (vrios m) 6,93 (sl) 6,88-6,86 (m) 6,70 (sl) 6,61 (t; 1,8) 6,28 (t; 2,0) 5,13-5,09 (d; 8,1) 5,09-5,05 (d; 8,4) 4,28-4,21 (m) 3,89 (s) 3,88 (s) 3,87-3,82 (m) 3,60-3,52 (dd; 12,4; 4,4)

em ppm; multiplicidade e J (Hz) entre parnteses

110

Tabela 5-10- Dados do espectro de RMN de 13C (100 MHz, DMSO-d6) da mistura
das Substncias III e VIII e das Substncias XVII e XVIII, da 3'-O-metil luteolina (1), 3O--D-glucopiranosilquercetina (2) e 4'-O--D-glucopiranosilquercetina (3) C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6''
a

1a 163,7 103,8 181,8 161,6 98,8 164,2 94,0 157,4 103,3 120,4 110,2 150,8 148,0 115,8 120,4

2a 156,5 133,7 177,6 161,3 98,8 164,2 93,6 156,5 104,2 121,4 115,2 144,8 148,5 116,5 121,6 101,4 74,3 76,8 70,3 77,5 61,3

3a 147,0 136,5 176,3 161,0 98,7 164,3 93,9 156,7 103,5 125,8 115,7 147,0 146,4 117,0 120,0 102,2 73,7 76,4 70,5 77,5 61,4

Mistura 167,0; 163,1 148,1 103,6 181,9 161,8 99,7 163,1 94,7 157,9 104,2; 103,6 120,2; 121,0 124,2; 127,3 112,1; 115,2 115,7 144,0; 147,5 148,1 115,7; 117,9 120,2; 121,0 99,7 * 76,8 * 78,4 60,5

* Sinais no observados; (AGRAWAL, 1989)

111

Tabela 5-11- Dados do espectro de RMN 1H /HMBC da mistura das Substncias III e
VIII e das Substncias XVII e XVIII H H-2' H-6' H-5' H-3 H-6' H-2' H-3 H-6 H-8 H-anomrico
a

ppm a 7,53 (d; 1,8) 7,48 (dl; 8,7) 6,97 (d; 8,5) 6,92 (sl) 6,77 (dl; 8,4)

C correlacionados a 167 (J3; C-2 flavona) 167 (J3; C-2 flavona) 145 (J3; C-3' flavona) 165 (J4; C-2 flavona) 167 (J3; C-2 flavona) 125 (J2; C-1' flavonol) 133 (J4; C-3 flavonol) 148 (J3; C-2 flavonol) 167 (J2; C-2 flavona) 183 (J2; C-4 flavona) 176 (J4; C-4 flavonol) 185 (J4; C-4 flavona) 116 e 125 99,7 (J1) 133 (C-3 flavonol) 148 (C-3' ou 4' flavonol)

6,72 (sl)

6,35 (sl) 6,04 (sl) 4,90 (d; 7,7)

(400 MHz;DMSO-d6); multiplicidade e J (Hz) entre parnteses

112

OH
3'

OH

OH
5'

3'

6''

OH OH
3''

O O
5' 1''

HO
7 5

O
4

6''

OH OH OH

HO
7

O
4 5

OH

OH

O O
1''

O OH
3''

OH O

OH

OH

Figura 5-39- Espectro de RMN de 13C (100 MHz, DMSO-d6) da mistura das
Substncias III e VIII e das Substncias XVII e XVIII

Figura 5-40- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) da mistura de

Substncias III e VIII e das Substncias XVII e XVIII
113

OH
3'

OH

OH
5' 6''

3'

6 ''

OH OH
3''

O O
5' 1''

HO
7 5

O
4

OH OH OH

HO
7

O
4 5

OH

OH

O O
1''

O OH
3''

OH O

OH

OH

Figura 5-41- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6) da mistura das

Substncias III e VIII e das Substncias XVII e XVIII

Figura 5-42- Espectro de 1Hx13C HMBC (400 MHz, DMSO-d6) da mistura das
Substncias III e VIII e das Substncias XVII e XVIII
114

Figura 5-43- Espectro de RMN 1H (400 MHz, A: C5D5N; B: CD3OD) da mistura das
Substncias III e VIII e das Substncias XVII e XVIII

115

Figura 5-44- Espectro de 1Hx13C HSQC (400 MHz, DMSO-d6) da mistura das
Substncias III e VIII e das Substncias XVII e XVIII

116

5.6. Identificao das Substncias XIX, XX e XXI em mistura

COOH COOH

COOH

OH OMe OH OH OH

OMe

cido vanlico

cido phidroxibenzico

cido 5hidroxivanlico

O extrato metanlico, partio diclorometnica, de folhas de V. polygama aps vrias etapas cromatogrficas em slica e sephadex LH-20, forneceu as fraes F4c6I, 64,7 mg, c5Iab2 e c5Iab3, 4,4 e 1,2 mg, respectivamente, as quais se apresentaram como um p branco e amorfo. O espectro de massas, EM/ESI modo negativo, da frao c5Iab2 revelou picos referentes aos ons pseudo moleculares [M-H]- a m/z 137, 167 e 183 (Figura 5-47) sugerindo uma mistura de cidos fenlicos. A anlise do espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6, Figura 5-48) mostrou sinais que, a princpio e em conjunto, pareciam com os de um flavonide, porm a CCDA indicava duas manchas bem prximas que se revelavam marrons no 254 nm da lmpada de UV e azuis brilhantes no 365 nm. As mesmas manchas ficavam incolores quando borrifadas com o revelador vanilina sulfrica e posterior aquecimento, diferentemente dos flavonides anteriormente isolados. O sinal revelado em 7,34 (s) poderia ser atribudo a um H de um anel aromtico cujos H so qumica e magneticamente equivalentes (Subst. XXI). Os sinais centrados em 7,92 e 6,92 (ambos d; J = 8,7 Hz), seriam caractersticos de H de um anel p-substitudo (subst. XX). O conjunto de sinais em 7,59 (dd; J = 8,2 e 1,8 Hz); 7,57 (d; J = 1,8 Hz) e 6,91 (d; J = 8,2 Hz) poderia ser relacionado a hidrognios de um anel trissubstitudo (Subst. XIX). A anlise do espectro de RMN de presena dos cidos.
13

C da mistura (100 MHz, acetona-d6;

Figura 5-45; Tabela 5-12), mostrou 3 sinais de carbonilas carboxlicas confirmando a

117

A preparao de uma placa preparativa 20,0 x 20,0 cm, usando-se Dic/MeOH 9:1 como eluente, apesar de no apresentar boa resoluo, foi suficiente para separar pequenas pores de duas substncias, as quais puderam ser, ento, identificadas pelos seus respectivos espectros de RMN de 1H. Um dos espectros de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6; Figura 5-50), revelou um sinal centrado em 7,61 (dd, J = 8,2 e 1,8 Hz, H-6); um sinal em 7,57 (d, J = 1,8 Hz, H-2) e um em 6,95 (d, J = 8,2 Hz, H-5), confirmando ser uma das substncias composta de um anel benznico 1,3,4-trissubstitudo, sendo um dos substituintes uma metoxila, cujo sinal foi revelado em 3,95 (s). O espectro de massas dessa substncia, ESI modo negativo (Figura 5-46), revelou um pico referente ao on pseudo molecular [M-H]- a m/z 167, corroborando para uma frmula molecular C8H8O4 atribuda Substncia XIX, cido vanlico (SAKUSHIMA et al., 1995). O outro espectro de RMN de 1H (200 MHz, acetona-d6, Figura 5-49) revelou um sinal de base alargada centrado em 7,90 (d, J = 8,7 Hz, H-2 e H-6) e um sinal tambm de base alargada em 6,90 (d, J = 8,7 Hz, H-3 e H-5) referentes a um sistema de acoplamento AAXX de um anel benznico para-substitudo, condizente com a Substncia XX, de frmula molecular C7H6O3 (DAYRIT et al., 1987).

118

Tabela 5-12- Dados do espectro de RMN de 13C (100 MHz, acetona-d6) da mistura
das Substncias XIX, XX e XXI e do cido vanlico C 1 2 3 4 5 6 COOH OMe
a

XIX 122,9 124,9 148,0 152,0 113,5 115,5 167,8 56,3

cido vanlico a 122,7 124,8 148,0 152,1 115,5 # 113,4 # 167,7 56,3
#

XX 123,3 116,7 115,9 148,4 115,9 116,7 162,6 -

XXI * 108,1 130,9 132,8 * * 167,9 56,6

(SANTOS, 2000) ; * Sinais no observados; Sinais trocados

COOH

COOH

COOH

OMe OH OH

OH OH

OMe

Figura 5-45- Espectro de RMN de 13C (100 MHz, acetona-d6) da mistura das
Substncias XIX, XX e XXI

119

MARG5Iab3 103 (1.399) Cm (81:138-(156:255+21:67)) 100

167.1

Scan ES4.98e6

COOH

OMe OH
61.9

%
61.6

62.1

136.8 81.2 83.1

113.1

197.1

225.0

0 50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

m/z 300

Figura 5-46- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia XIX

MARG5Iab2 106 (1.439) Cm (80:150-(182:257+25:70)) 100

136.8

Scan ES1.11e7

COOH

OH
%

61.9 61.6 62.1

167.1

173.1 275.0 81.2 83.1 182.9 112.8 174.9 213.2 251.0

0 50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

m/z 300

Figura 5-47- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias
XIX, XX e XXI

120

COOH

COOH

COOH

OMe OH OH

OH OH

OMe

Figura 5-48- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6) da mistura das

Substncias XIX, XX e XXI

Acetone-d6 7.9275 7.8835 6.9283 6.8839

COOH

OH

8.5

8.0

7.5

7.0

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0400 2.0

1.5

1.0

Figura 5-49- Espectro de RMN de H (200 MHz, acetona-d6) da Substncia XX

1

121

COOH

OMe OH

Figura 5-50- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia XIX

122

5.7. Identificao das Substncias XXII e XXIII em mistura

COOH HO HO OH COOH OH

cido cafeico

cido protocatquico

O extrato metanlico, partio diclorometnica, de folhas de V. polygama aps vrias etapas cromatogrficas em slica e sephadex LH-20, forneceu a frao F5btH2, a qual se apresentou como um p branco e amorfo. A anlise do espectro de RMN de 1H (200 MHz, acetona-d6, Figura 5-52) indicou ser uma mistura de cidos fenlicos por apresentar os sinais caractersticos de uma poro fenilpropanodica com os H olefnicos em configurao trans, devido aos dois sinais centrados em 7,52 e 6,25 (d, J = 15,9 Hz), alm de dois conjuntos de sinais caractersticos de anel benznico 3,4-dissubstitudo em 7,51 e 7,43 sobrepostos ao sinal de um dos H olefnicos, um sinal em 7,14 (d, J= 2,0 Hz, H-2); um em 7,03 (dd, J = 8,1 e 2,0 Hz, H-6); um em 6,88 (d, J= 8,1 Hz, H-5) e outro em 6,85 (d, J= 8,2 Hz, H-5). A constituio da mistura foi confirmada com base nos dados obtidos pelo espectro de massas EM/ESI, modo negativo (Figura 5-51), o qual apresentou dois picos relativos aos ons pseudo-moleculares a m/z 179 [M-H]-, correspondendo a 100%, e m/z 153 [M-H]-, correspondendo a 70%, das respectivas substncias em questo, relativos a frmulas moleculares C9H8O4 e C7H6O4. Baseando-se nos dados espectrais obtidos e dados da literatura (WANG et al., 2000; GERONTHANASSIS et al., 1998) foram propostas as estruturas dos cidos cafeico e protocatquico, como constituintes da mistura em questo.

123

MARG5btH2(ES-)
MARG5btH2 232 (1.961) Cm (189:307-(46:167+321:412)) 100

COOH COOH OH OH
153.2

179.2

Scan ES8.60e6

HO HO

62.0

137.0

177.2

0 50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

m/z 250

Figura 5-51- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias
XXII e XXIII
6.8969 6.8715 6.8566 6.8304 7.5620 7.5195 7.5098 7.4828 7.4436 7.4330 7.1489 7.1389 7.0502 7.0407 7.0096 7.0004 6.2915 6.2120 6.2

COOH HO HO OH COOH OH

7.7

7.6

7.5

7.4

7.3

7.2

7.1

7.0

6.9

6.8

6.7

6.6

6.5

6.4

6.3

6.1

Figura 5-52- Espectro de RMN de 1H (200 MHz, acetona-d6) da mistura das

Substncias XXII e XXIII
124

5.8. Identificao das Substncias XXIV e XXV em mistura

O O O
8 1'

6-O-cafeoil--D-glucopiranosdeo e o 6-O--D-glucopiranosdeo

HO
1 4

HO

HO HO

OH

OH

O extrato hidrometanlico de folhas de V. polygama, partio nbutanlica, depois de sofrer fracionamento em XAD-7, originou a poro metanlica, a qual foi submetida a vrias etapas cromatogrficas em sephadex LH-20 e CLAE no modo reciclante, fornecendo a frao 4Vc1 e 4Vx3, 8,0 mg, de aspecto oleoso e amarelo plido. Tambm as parties diclorometnica do extrato metanlico de folhas e acetato de etila do extrato metanlico de galhos forneceram as fraes 5bth3 e AMG5g2, 3,0 e 300,0 mg respectivamente. A anlise dos espectros de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6; Figura 553, Tabela 5-13) revelou sinais caractersticos de duas pores fenilpropenodicas com os H olefnicos em configurao trans, devido aos quatro sinais com valores altos de J em 7,56; 7,55; 6,31 e 6,30 (d; 15,9 Hz). Um sinal centrado em 7,18 (t; J = 2,5 Hz) juntamente com dois sinais exatamente iguais, centrados em 7,08 e 7,06 (ambos m), estando sobrepostos, e um sinal em 6,88 (d; J = 8,2 Hz) poderiam pertencer aos H do anel benznico trissubstitudo de duas molculas de cido cafeico. A presena de um sinal em 5,12 (d; J = 3,3 Hz) e outro em 4,53 (d; J = 7,7 Hz), juntamente com sinais de H carbinlicos entre 4,50-3,14, fortaleceu a idia de que se tratava de uma mistura de fenilpropenides glicosilados, derivados do cido cafeico e diferindo entre si apenas pela configurao dos H anomricos. O espectro de RMN de
13

C (100 MHz, acetona-

d6, Figura 5-54) contribuiu para a definio das estruturas, inclusive para indicar o local da ligao glicosdica, j que os valores de relativos aos C-6 esto deslocados em +3,0 ppm se comparados com a molcula no esterificada. A frmula molecular C15H18O9 foi deduzida com base nos dados obtidos pelos espectros de massas, EM/ESI modo negativo (Figura 5-57), medida no pico do on pseudo molecular a m/z 341 [M-H]-.

125

Baseando-se nos dados espectrais obtidos e nos dados descritos na literatura (SHIMOMURA et al., 1988; PAULI, 2000; AGRAWAL, 1989; Figura 5-55, Figura 5-56), as substncias foram identificadas como os ismeros 6-O-cafeoil--Dglucopiranosdeo e o 6-O-cafeoil--D-glucopiranosdeo.

126

Tabela 5-13- Dados dos espectros de RMN de 1H, de RMN

RMN de H (J em Hertz)
a 1 1

13

C, Correlaes

homonuclear (1H -1H) e heteronuclear (1H-13C) da mistura das Substncias XXIV e XXV
H Aglicona A 2 5 6 7 8 Aglicona B 2 5 6 7 8
-glucose

H- H
a

H- C
a

13

(COSY 45)

(HSQC) C-2 C-5 C-6

RMN de C 115,3 116,4 122,6 146,0 115,6 115,3 116,4 122,6 145,9 115,5 93,7 73,8 74,9 71,5 75,0 64,4 98,3 76,3 77,9 71,8 70,6 64,6 C-9 167,6

13

7,18 (tl; 2,5) 6,88 (d; 8,2) 7,08 (m) 7,56 (d; 15,9) 6,31 (d; 15,9) 7,18 (tl; 2,5) 6,88 (d; 8,2) 7,06 (m) 7,55 (d; 15,9) 6,30 (d; 15,9) 5,12 (d; 3,6) 3,38 (m)* 3,71 (t; 9,1) 3,36 (m)* 3,54 (ddd; 9,4; 6,2; 2,0) 4,26 (dd; 11,8; 6,2) 4,43 (dd; 11,8; 2,1) 4,53 (d; 7,7) 3,17 (t; 8,0) 3,42 (m) 3,39 (m)* 4,03 (m) 4,49 (dd; 11,8; 2,0) 4,30 (dd; 11,8; 5,8) C-1 127,6
b

H-8 H-7

C-7A C-8A C-2 C-5 C-6

H-8 H-7 H-2 H-1 H-2 H-5 H-6b; H-4 H-5 H-2 H-1

C-7B C-8B C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6

1 2 3 4 5 6b a

-glucose

1 2 3 4 5 6

Aglicona A e B
a

C-3 146,4

C-4 148,9

(400 MHz, acetona-d6); (100 MHz, acetona-d6) * Estes sinais podem estar trocados O artigo de PAULI (2000) foi usado para as atribuies dos valores de deslocamento do espectro de 1 RMN de H pertencentes aos H das molculas de glicose e a referncia de AGRAWAL (1989) para a atribuio dos C.

127

O HO
1 4 7 8

O O
1'

HO

HO HO

OH

OH

Figura 5-53- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6) da mistura das

Substncias XXIV e XXV
A: espectro completo; B: rea ampliada

128

O HO
1 4 7 8

O O
1'

HO

HO HO

OH

OH

Figura 5-54- Espectro de RMN de 13C (100 MHz, acetona-d6) da mistura das
Substncias XXIV e XXV

Figura 5-55- Espectro de 1Hx13C HSQC (400 MHz, acetona-d6) da mistura das
Substncias XXIV e XXV

129

Figura 5-56- Espectro de 1H-1H COSY (400 MHz, acetona-d6) da mistura das
Substncias XXIV e XXV

marg4vx3 131 (2.864) Cm (110:175-(201:277+46:101)) 61.9 100

62.1

Scan ES1.91e6

341.1

O HO
1 4 7 8

O O
1'

HO
%

HO HO

OH

OH

89.1

179.1 136.8 251.0 96.9 119.1 191.0

281.1 537.4 353.4 455.3 507.2

60

80

100

120

140

160

180 200

220

240

260

280

300

320 340

360

380

400

420

440

460

480

500 520

540

560

580

600

620

640

m/z

Figura 5-57- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias
XXIV e XXV

130

5.9. Identificao da Substncia XXVI

COOH

cido metacrlico

Do extrato hidrometanlico das folhas de V. polygama, frao aquosa, foram obtidos 280,0 mg deste cido atravs de recristalizao. A anlise do espectro de RMN de 1H (200 MHz, D2O, Figura 5-58) mostrou dois sinais em 5,68 e 5,38 (sl) integrando para 1H cada e um sinal em 1,89 (s) integrando para 3H. A anlise do espectro de RMN de
13

C (50 MHz, D2O, Figura 5-60) revelou

dois sinais caractersticos de C sp2 em 144,4 e 122,7, alm de evidenciar a presena de C carboxlico em 179,9 e C metlico, ligado a C sp2, em 21,2. As multiplicidades foram confirmadas pelo espectro de RMN de (DEPT invertido). A frmula molecular C4H6O2 foi deduzida com base nos dados obtidos pelo espectro de massas, ESI, modo negativo (Figura 5-59), medida no pico do on pseudo molecular a m/z 85 [M-H]-. Segundo KITAGAWA (1984), o cido metacrlico pode ser considerado como marcador sistemtico de dicotiledneas, acumulando-se em vrias famlias, entre elas a Verbenaceae. Encontra-se esterificado como um bom nmero de metablitos secundrios, pertencentes aos mais diferentes grupos biogenticos. Nunca foi isolado de plantas, mas j foi identificado na secreo de fmeas do besouro Pasimachus subsulcatus (DAVIDSON et al., 1989). O aldedo correspondente, -metil acrolena ou artemisal, j foi isolado naturalmente de Artemsia tridentata, Asteraceae (GIBBS, 1974). Acredita-se que a transaminao do cido aminado valina (M) resulta na formao do cido -cetoisovalrico (N), que pela reao de descarboxilao oxidativa converter-se-ia em cido metilpropanico (MP). Este, por sua vez, se transformaria em cido metacrlico (MC) atravs de uma reao de desidrogenao (Esquema 5-2). Logo, a grande quantidade deste cido encontrado no extrato hidroalcolico pode ser
131
13

C/DEPT-135 (50 MHz, D2O, Figura

5-60), sendo o sinal em 122,7 positivo, CH2, e o sinal em 21,2, negativo, para CH3

em decorrncia da decomposio de aminocidos ou acares, atravs da grande exposio ao aquecimento em rotaevaporador e resfriamento em liofilizador.

O HO NH2 (M) HO

O HO O (N) (MP) HO

(MC)

Esquema 5-2- Reaes de formao do cido metacrlico (KITAGAWA, 1984)

Legenda: (M)= Valina; (N)= cido -cetoisovalrico; (MP)= cido metilpropanico; (MC)= cido metacrlico

132

Deuterium Oxide 5.3794 5.6828 4.7500 1.8890 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5

COOH

7.5

7.0

6.5

6.0

5.5

5.0

1.0

0.5

Figura 5-58- Espectro de RMN de 1H (200 MHz, D2O) da Substncia XXVI

margamorfo 162 (1.377) Cm (108:399-(9:93+467:499)) 100

85.2 84.9

Scan ES5.53e7

COOH

35.2

37.3

103.1

143.0

193.3

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

m/z 200

Figura 5-59- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia XXVI

133

TSPA-d4 122.7152 21.1553 -0.0187

COOH

250

200

150

100

50

122.7071

179.5344

144.4055

21.1800

250

200

150

100

50

Figura 5-60- Espectro de RMN de 13C e DEPT135 (50 MHz, D2O) da Substncia
XXVI
A: espectro de DEPT-135 com fase invertida; B: espectro de RMN de C / referncia TSPA-d4 (sal de sdio do cido trimetilsililpropinico deuterado)
13

134

5.10. Identificao da Substncia XXVII

21 25 18 19 1 4 10 7 12 15 23 27

3-O--D-glucopiranosilsitosterol

GliO

Do extrato metanlico, partio diclorometnica, de folhas de V. polygama, aps vrias etapas cromatogrficas em slica e sephadex LH-20, foram obtidas as fraes F5c3n e 5d7b4, 19,7 mg, as quais se mostraram como cristal branco e brilhante. Tambm em mistura com outros esteris na frao F5c4c, 90,0 mg, como p branco amorfo. A anlise do espectro de RMN de
13

C (50 MHz, C5D5N, Figura 5-62)

revelou dois sinais caractersticos de C sp2 em 141,1 e 122,0, alm de evidenciar a presena de C carbinlicos em 102,7; 78,4; 78,5; 75,4; 71,9 e 62,9 pertencentes a uma molcula de acar. A anlise do espectro de RMN de 1H (200 MHz, C5D5N, Figura 5-61) apresentou um sinal em 5,37 (dl), caracterstico do H-6 dos fitoesteris, assim como os sinais entre 1,02-0,67 (todos s) referentes aos H metlicos. Entre 4,62-3,70 foram observados vrios sinais de H carbinlicos, confirmando a presena de acar na molcula. O sinal caracterstico de H anomrico em configurao se revelou em 5,07 (d, J = 7,6 Hz). O sinal tpico de H-3 (m) no foi observado devido sobreposio de sinais dos H carbinlicos.
A identificao da substncia foi confirmada por comparao com dados

obtidos na literatura (TANDOM, M. et al., 1990; Tabela 5-14).

135

Tabela 5-14- Dados do espectro de RMN de 13C das Substncias XXVII (50 MHz,
C5D5N) e XLVIII (50 MHz, CDCl3); do 3-O--D-glucopiranosilsitosterol (TANDOM et al., 1990) e do sitosterol ( FURUYA et al., 1987)
C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1 2 3 4 5 6 102,7 75,4 78,4 SUBSTNCIA XXVII 37,7 30,4 78,7 40,1 141,1 122,0 32,3 32,2 50,5 37,1 21,4 39,5 42,7 57,0 24,7 28,7 56,4 12,1 19,4 36,5 19,1 34,4 26,6 46,2 29,7 19,2 20,1 23,6 12,3 71,9 78,5 62,9 102,5 75,2 78,3 3-O--DGLUCOPIRANOSIL 37,5 30,2 78,5 40,0 140,9 121,8 32,1 32,1 50,3 36,9 21,3 39,3 42,5 56,9 24,5 28,6 56,3 12,0 19,4 36,4 19,1 34,3 26,5 46,1 29,5 19,2 20,0 23,4 12,2 71,7 78,2 62,8 37,5 31,9 72,0 42,5 140,9 121,9 31,9 32,1 50,4 36,7 21,3 40,0 42,5 56,9 24,5 28,4 56,3 12,0 19,6 36,3 19,2 34,2 26,3 46,1 29,9 18,9 20,0 23,3 12,2 37,4 31,7 71,9 42,4 141,1 121,9 32,0 32,0 50,3 36,6 21,2 39,9 42,4 56,9 24,4 28,3 56,3 11,9 * 36,2 19,1 34,1 26,3 46,0 29,3 18,8 19,9 23,2 12,0 SUBSTNCIA XLVIII SITOSTEROL

136

150 7.0 140.9667 6.5 Pyridine-d5 135.6158 6.0 121.9149

140

130

120

GliO

5.5

5.3766 5.3549 5.0919 5.0540

4 1 19

110 5.0 102.5764 4.5

7

10

100 4.0

12 21 18

90

15

80

23

Figura 5-61- Espectro de RMN de 1H (200 MHz, C5D5N) da Substncia XXVII

Figura 5-62- Espectro de RMN de 13C (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXVII
3.5
27 25

137
3.0 2.5 2.0 1.5 62.8667 56.8849 56.3031 46.0930 42.5285 39.3655 36.9563 36.4073 34.2604 32.2036 32.1135 29.5405 1.0 0.5 0.0 26.4758 24.5420 23.4439 20.0023 19.4533 19.2648 19.0518 12.1931 12.0129 0.0000 TMS

78.5670 78.3950 78.2229 75.3139 71.7330

4.5638 4.5546 4.4700 4.4443 4.3851 4.3335 4.3119 4.2902 4.0780 4.0366 3.9953 3.9734 3.8557

70

60

2.7937 2.7756 2.7267 2.7110 2.5415 2.4869

50

40

30

20

10

1.1131 1.0869 1.0166 0.9860 0.9474 0.9098 0.8922 0.8782 0.8584 0.6743 TMS 0.0000

5.11. Identificao da Substncia XXVIII

29 30

21 12 25 18 9 27 6 23

HO

15

COOH
28

HO

cido 2,3-diidroxiolean-12-en-28-ico

Do extrato metanlico, partio diclorometnica, de folhas de V. polygama, aps vrias etapas cromatogrficas em slica e sephadex LH-20, foram obtidas as fraes df4433K e df4436C que se mostraram como um p branco e amorfo. A frmula molecular C30H48O4 foi deduzida a partir dos dados obtidos pelo espectro de massas, ESI, modo negativo (Figura 5-64), medida no pico do on pseudo molecular a m/z 471 [M-H]-, do experimento de PENDANT e de RMN de 1H. O espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3, Figura 5-66) apresentou sinais caractersticos de triterpeno com esqueleto do tipo 12-oleaneno como os sete sinais para as metilas entre 1,14-0,74 (todos s); sinal do H-12 olefnico em 5,28 (tl, J = 3,3 Hz) e sinal em 2,80 (dd, J = 4,0 e 9,5 Hz) referente ao H-18 acoplado aos H19 ( 1,2 e 1,6) como determinado pelo espectro de COSY-45 (200 MHz, CDCl3, Figura 5-65). Em adio, o espectro de COSY exibiu dois H carbinlicos em acoplamento em 3,40 (d, J = 2,7 Hz, H-3) e 4,00 (td, J = 2,9 e 10,5 Hz, H-2). O valor da constante de acoplamento JH2-3= 2,65 Hz foi o indicativo da configurao do grupo OH ligado ao C-3, por ser um valor pequeno, mostrando que H-3 est orientado equatorialmente. Os valores das constantes de acoplamento JH2-H1= 2,9 e 10,5 Hz determinaram tambm a configurao do grupo OH ligado ao C-2 e a orientao axial para o H-2 do composto em questo. O espectro de PENDANT (50 MHz, CDCl3, Figura 4-70), exibiu sinais para um C carboxlico em 183,2; dois C olefnicos em 143,8 e 122,6 e dois C carbinlicos em 79,1 e 66,7, alm dos outros correspondentes aos C metlicos, metilnicos e metnicos.
138

Os dados espectrais descritos foram comparados com os do ster metlico do cido 2,3diidroxi-olean-12-en-28-ico (MAHATO & KUNDU, 1994; Tabela 5-15), e mostraram-se plenamente similares, sendo a substncia identificada como cido 2,3-diidroxiolean-12-en-28-ico.

TMS 143.7006 122.4742 182.9736 66.5314 48.1242 47.3538 46.5015 45.8622 41.6661 38.4371 38.2568 33.0772 32.4052 28.5041 27.6190 26.1110 23.5868 21.8001 18.0138 17.1779 16.3419 0.0000 50 0

29

30

21 25 12 9 6 27 18

HO

15

COOH 28

HO
23

150

100

Figura 5-63- Espectro de RMN de 13C/PENDANT/fase invertida (50 MHz, CDCl3) da Substncia XXVIII

139

Tabela 5-15- Dados do espectro de RMN de 13C/PENDANT da Substncia XXVIII (50

MHz, CDCl3) e do ster metlico do cido 2,3diidroxiolean-12-en-28-ico
C/ MULTIPLICIDADE 1 (t) 2 (d) 3 (d) 4 (s) 5 (d) 6 (t) 7 (t) 8 (s) 9 (d) 10 (s) 11 (t) 12 (d) 13 (s) 14 (s) 15 (t) 16 (t) 17 (s) 18 (d) 19 (t) 20 (s) 21 (t) 22 (t) 23 (q) 24 (q) 25 (q) 26 (q) 27 (q) 28 (s) 29 (q) 30 (q)
a

SUBSTNCIA XXVIII 41,8 66,7 79,1 38,6 48,3 18,9 32,6 39,6 47,5 38,4 23,5 122,6 143,8 41,8 27,7 23,1 46,6 41,1 46,0 30,9 34,0 32,6 28,7 21,9 16,5 17,3 26,3 183,2 33,2 23,7

STER METLICO 41,7 66,5 78,9 38,5 48,1 18,1 32,5 39,7 47,4 38,3 23,2 122,1 143,8 41,9 27,7 23,2 46,8 41,3 46,0 30,7 34,0 32,5 28,5 21,9 16,4 17,0 26,2 178,1 33,2 23,6

(MAHATO & KUNDU, 1994)

140

df4433k 10 (0.325) Cm (9:23-37:79) 112.6 100

29

30

Scan ES5.83e5

21 12 25
300.7

18 9 27 6

HO

15

COOH
28

255.0

HO
23

471.0

282.7 405.1 281.0 134.6 136.3 170.2 157.2 180.6 196.8 241.0 252.8 269.0 302.9 324.9 338.8 455.2 545.7

0 100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

m/z 600

Figura 5-64- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia XXVIII

Figura 5-65- Espectro de 1H-1H COSY (200 MHz, CDCl3) da Substncia XXVIII

141

Figura 5-66- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) da Substncia XXVIII

142

5.12. Identificao das Substncias XXX e XXXI em mistura

29 20 12 18 14 2 10 4 24 23 6 8 27 16
12

30
29

30 20 18 14 2 10 4 24 6 8 27 16

HO

25

26

COOH
28

HO

25

26

COOH
28

HO

HO

23

cido 2,3-diidroxiolean-12-en-28-ico ou cido maslnico

cido 2,3-diidroxiurs-12-en-28-ico

O extrato metanlico, partio diclorometnica, de folhas de V. polygama, aps vrias etapas cromatogrficas em slica e sephadex LH-20, forneceu a frao 4dh5eX, 11,4 mg, a qual se mostrou como um p branco e amorfo. A anlise do espectro de RMN de
13

C/PENDANT (50 MHz, C5D5N, Figura

5-70) totalmente desacoplado mostrou com clareza que a frao era constituda pela mistura de dois triterpenos do tipo 12-oleaneno e 12-urseno atravs dos deslocamentos caractersticos dos seus C sp2, C-12 e 13, em 144,9-122,5 e 139,3-125,6, respectivamente. Foram revelados dois sinais de C carbonlicos em 83,8 (C-3) e em 68,6 (C-2), sem que fosse mostrado algum C carboxlico. O espectro de RMN de
1

(400

MHz,

C5D5N,

Figura

5-68)

mostrou um sinal em 5,48 (sl, H-12); um em 4,12 (m, H-2), um em 3,42 e outro em 3,41 (ambos d, com J = 9,3 Hz), referentes ao H-3 com configurao ; um sinal centrado em 3,31 (dd, J = 4,0 e 12,0 Hz), pertencente ao H-18 de esqueleto oleaneno, e um sinal em 2,64 (d, J = 11,3 HZ), relativo ao H-18 de esqueleto urseno. Os sinais referentes aos H metlicos foram observados entre 1,29-0,96. Do espectro de HSQC (400 MHz, C5D5N, Figura 5-69) foram obtidas principalmente as correlaes entre H-2 em 4,12 com C-2 em 68,6; os H-3 em 3,42 e 3,41 com C-3 em 83,8; o H-18 em 3,31 com C-18 em 42,2 e o outro H-18 em 2,64 com o C-18 em 55,9.

143

A frmula molecular C30H48O4 foi deduzida com base nos dados obtidos pelo espectro de massas, ESI modo negativo (Figura 5-67), medida no pico do on pseudo molecular a m/z 471 [M-H]-. Comparando-se os dados relatados na literatura (MAHATO & KUNDU, 1994; Tabela 5-16) com os dados espectrais acima expostos, foram propostas as estruturas dos cido 2,3diidroxi-olean-12-en-28-ico (cido crateglico ou maslnico) e cido 2,3diidroxi-urs-12-en-28-ico.

144

Tabela 5-16- Dados do espectro de RMN de

maslinato de metila
C/ MULTIPLICIDADE 1 (t) 2 (d) 3 (d) 4 (s) 5 (d) 6 (t) 7 (t) 8 (s) 9 (d) 10 (s) 11 (t) 12 (d) 13 (s) 14 (s) 15 (t) 16 (t) 17 (s) 18 (d) 19 (d) 20 (d) 21 (t) 22 (t) 23 (q) 24 (q) 25 (q) 26 (q) 27 (q) 28 29 (q) 30 (q)
a

13

C/PENDANT (50 MHz, C5D5N) da

mistura das Substncias XXX e XXXI e do 2,3-diidroxi-urs-12-en-28-ato de metila e

MIISTURA 46,8 68,6 83,8 39,8 55,4 18,9 * 39,8 48,1 38,6 23,7 122,5 e 125,6 144,9 e 139,3 42,2 28,3 24,9 48,0 42,2 e 55,9 39,4 * 31,0 * 29,4 17,1 16,7 16,3 23,8 * 16,2 21,4

2,3-ursenato 46,8 68,9 83,8 39,1 55,4 18,4 32,9 39,6 47,5 38,3 23,4 125,3 138,1 42,1 28,0 24,3 48,1 52,8 39,1 38,9 30,7 36,7 28,7 17,0 17,0 17,0 23,7 177,9 17,0 21,2

Maslinato 46,4 68,8 83,8 39,1 55,3 18,3 32,6 39,1 47,5 38,3 23,1 122,0 143,6 41,7 27,6 23,5 46,6 41,3 45,8 30,7 33,8 32,3 28,6 16,8 16,8 16,8 26,0 178,0 33,1 23,5

(MAHATO & KUNDU, 1994) ; *Sinal no observado

145

margdh5ex 135 (2.951) Cm (128:169-(169:211+76:123)) 100

61.9 62.1

Scan ES2.07e6

29 20 12 18 14 2
81.0

30
29

30 20 12 18 14 2 10 4 24 6 8 27 16

HO
4 24

25 10 6 23

26 8 27

16

COOH
28

HO

25

26

COOH
28

HO

HO

23

89.2 471.5

97.0

225.3

271.1 255.2 261.2

283.3

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

600

620

640

m/z

Figura 5-67- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias
XXX e XXXI

29 20 12 18 14 2 10 4 24 23 6 8 27 16

30
29

30 20 12 18 14 2 10 4 24 6 8 27 16

HO

25

26

COOH
28

HO

25

26

COOH
28

HO

HO

23

Figura 5-68- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, C5D5N) da mistura das Substncias
XXX e XXXI
146

Figura 5-69- Espectro de 1Hx13C HSQC (400 MHz, C5D5N) da mistura das
Substncias XXX e XXXI
83.8360 68.6028 Pyridine-d5 125.5532 122.4639 144.8754 139.3114 135.8289 42.0122 39.8571 38.5051 33.2689 30.9663 29.3602 28.3031 26.1726 23.7799 21.4199 18.8715 17.6833 17.4949 16.8639
30 29 20 12 18 14 2 10 4 24 6 8 27 16

TMS 55.9180 47.7646 46.6748 0.0000 0

29 20 12 18 14 2 10 4 24 23 6 8 27 16

30

HO

25

26

COOH
28

HO

25

26

COOH
28

HO

HO

23

160

150

140

130

120

110

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

Figura 5-70- Espectro de RMN de C/PENDANT (50 MHz, C5D5N) da mistura das
13

Substncias XXX e XXXI

147

5.13. Identificao das Substncias XXVIII e XXIX em mistura

30 29 20 12 18 14 2 10 4 24 23 6 8 27 16 25 2 10 4 24 23 6 12 18 14 8 27 16 29 20 30

HO

25

26

COOH
28

HO

26

COOH
28

HO

HO

cido 2,3-diidroxiurs-12-en-28-ico

cido 2,3-diidroxiolean-12-en-28-ico

Do extrato metanlico, partio diclorometnica, de folhas de V. polygama, aps vrias etapas cromatogrficas em slica e sephadex LH-20, foi obtida a frao df4442c, 9,7mg, que se mostrou como um p branco e amorfo. A frmula molecular C30H48O4 foi deduzida a partir dos dados obtidos pelo espectro de massas, ESI modo negativo (Figura 5-72), medida no pico do on pseudo molecular a m/z 471 [M-H]-. A anlise do espectro de RMN de 13C/PENDANT (C5D5N, 50 MHz, Figura 5-71) mostrou com clareza que a frao era constituda pela mistura de dois triterpenos do tipo 12-oleaneno e 12-urseno atravs dos deslocamentos caractersticos dos seus C sp2, C-12 e 13, em 144,9 e 122,5; 139,3 e 125,6, respectivamente. O estudo de vrios modelos, com esqueletos ursnico e oleannico (MAHATO & KUNDU, 1994), mostrou que os carbonos C-12, C-13, C-18, C-19, C-27 e C-29 possuem deslocamentos bem distintos para cada um destes tipos de esqueleto. Os demais carbonos tm seus sinais iguais ou semelhantes em ambos os sistemas. O sinal em 180,2 indicou a existncia de carbonila carboxlica, sendo o mesmo para ambos, fato que tambm ocorreu com os C carbinlicos em 79,4 e 66,1. O espectro de RMN de 13C/DEPT 135 (C5D5N, 50 MHz), usando uma transferncia de pulso de 135o para obter sinais positivos para CH e CH3 e negativo para CH2, permitiu caracterizar os C metnicos, metilnicos e metlicos e, por diferena com o espectro de RMN de 13C/PENDANT, os quaternrios.
148

O espectro de RMN de 1H (C5D5N, 200 MHz) revelou um sinal em 5,48 (sl) referente ao H-12; um sinal centrado em 4,32 (m, H-2); um sinal em 3,78 (sl, H3), caracterstico da configurao do H-3; um sinal centrado em 3,29 (dd, J = 4,0 e 12,0 Hz), referente ao H-18 do esqueleto oleaneno; um sinal em 2,63 (d, J = 11,0 Hz) referente ao H-18 do esqueleto urseno e sinais entre 1,18-0,91 (todos s) relativos aos H dos grupos metlicos. Na CCDA, foram observadas duas manchinhas roxas azuladas, bem prximas uma da outra, sendo o eluente Dic/AcOEt 7:3. A superior em maior concentrao (oleaneno) que a inferior (urseno), concluso baseada nas intensidades dos sinais de RMN de 13C. Comparando-se os dados relatados na literatura (MAHATO & KUNDU, 1994; Tabela 5-17) com os dados espectrais acima expostos, foram propostas as estruturas dos cido 2, 3-diidroxiolean-12-en-28-ico e cido 2,3-diidroxiurs-12-en28-ico respectivamente.

149

Tabela 5-17- Dados do espectro de RMN de

C/ MULTIPLICIDADE 1 (t) 2 (d) 3 (d) 4 (s) 5 (d) 6 (t) 7 (t) 8 (s) 9 (d) 10 (s) 11 12 (d) 13 (s) 14 (s) 15 (t) 16 (t) 17 18 (d) 19 (d) 20 21 (t) 22 (t) 23 (q) 24 (q) 25 (q) 26 (q) 27 (q) 28 (s) 29 (q) 30 (q)
a

13

C/PENDANT (50 MHz, C5D5N) da

mistura das Substncias XXVIII e XXIX e do 2,3diidroxiurs-12-en-28-ato de metila

MISTURA 42,9 66,1 79,4 38,8 48,8 18,1 33,2 40,2 47,9 38,7 * 122,5 e 125,6 144,9 e 139,3 42,3 28,6 23,9 * 53,6 39,4 * 31,1 37,4 29,5 22,3 16,7 17,5 23,8 180,2 * 21,4 URSENATO 42,2 66,7 79,2 39,3 48,3 18,2 33,0 40,0 47,6 38,4 23,4 125,8 138,7 42,2 28,2 24,4 48,3 53,2 39,1 38,5 30,8 36,8 28,6 22,0 16,5 17,1 23,9 178,4 17,1 21,2
a

(MAHATO & KUNDU, 1994); * Sinais no observados

150

Pyridine-d5 144.8590 180.2174 135.8617 122.5131 48.7643 46.6748 46.4371 42.7661 41.9876 39.9882 38.8410 34.2276 33.2115 29.4831 28.2868 26.1398 23.7799 22.3049 18.4782 17.5030 16.6263 60 50 40 30 20 10
29 20 12 18 14 2 10 4 24 23
249.1 471.6

TMS 79.3455 66.1281 0.0000 0

Scan ES5.21e4 640 m/z

180

170

160

150

140

130

120

110

100

90

80

70

Figura 5-71- Espectro de RMN de C/PENDANT (50 MHz, C5D5N) da mistura das
13

Substncias XXVIII e XXIX

f4442c 72 (1.586) Sm (Mn, 4x1.20); Cm (59:79-(28:48+91:114)) 100

89.1

30 29 20 12 18 14 2 10 4 24 6 8 27 16 25

30

HO

25

26

COOH
28

HO

26 8 6 27

16

COOH
28

HO
%

HO

23

70.0 80.9 137.0 62.0

273.2 255.4 301.4 405.6 97.0 145.9 123.0 173.3 210.9 225.2 281.4 441.5 489.5 507.6 517.5

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

600

620

Figura 5-72- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias
XXVIII e XXIX
151

5.14. Identificao da Substncia XXXII

HO
29 12 20 18 14 2 10 4 6 23 8 27 16 28 30

HO

25

26

COOH

cido 2,3 ,19 -triidroxiurs-12-en-28-ico ou cido euscfico

HO
24

Do extrato metanlico, partio diclorometnica, de folhas e galhos de V. polygama, aps vrias etapas cromatogrficas em slica, foram obtidas as fraes f543, 11,3 mg (em mistura com a Substncia XXX) e DMG5L, 58,4 mg (puro), as quais se mostraram como um p branco e amorfo. A anlise dos espectros de RMN de 1H,
13

C e DEPT135 da respectiva
13

frao indicou ser um triterpeno pentacclico. O espectro de RMN de

C, PENDANT e

DEPT135 (C5D5N, 50 MHz; Figura 5-75, Figura 5-77 e Figura 5-76) revelaram um sinal em 180,9 referente carbonila carboxlica; dois sinais pertencentes a C sp2 em 140,1 e 128,1, foram atribudos a um esqueleto triterpnico do tipo 12-urseno. Trs sinais referentes a C carbinlicos em 79,5, 72,9 e 66,3 mostraram que o triterpeno continha trs grupos hidroxila. Os sinais exibidos pelo espectro RMN de 1H (C5D5N, 400 MHz, Figura 574) foram: um em 5,58 (sl) referente ao H-12 olefnico; um em 4,31 (dl, 9,8 Hz), atribudo ao H-2, o qual determinou a configurao do grupo hidroxila, devido ao valor alto da constante de acoplamento entre H-2 e H-1a ou 1b; o sinal em 3,78 (sl, H-3) tambm revelou a configurao do outro grupo hidroxila; um sinal em 3,03 (s), atribudo ao H-18, indicou a localizao do terceiro grupo hidroxila no C-19, tambm em configurao , devido a metila localizada neste mesmo C ter configurao por origem biossinttica. As correlaes observadas no espectro de HMBC (C5D5N, 400 MHz, Figura 5-78), como a do sinal em 5,58 com os carbonos 14 e 18; a do sinal em 3,78 com os carbonos 1, 5 e 2; a do sinal em 3,03 com os carbonos 14, 17, 28; a do sinal
152

em 1,90 (dd, H-1) com os carbonos 2, 5, 10 e 3; a do sinal em 1,63 (s, Me 27) com os carbonos 14 e 15; a do sinal em 1,43 (s, Me 29) com os carbonos 13,18 e 19; a do sinal em 1,26 (s, Me 26) com os carbonos 11,8 e 9; a do sinal em 1,13 (s, Me 30) com os carbonos 19 e 21; a do sinal em 1,09 (s, Me 25) com os carbonos 10, 1 e 5; a do sinal em 0,97 (s, Me 23) com os carbonos 4 e 5; a do sinal em 089 (s, Me 24) com os carbonos 23, 4, 3 e 5 confirmaram as atribuies mencionadas acima. A frmula molecular C30H48O5 foi deduzida a partir dos dados obtidos pelo espectro de massas, ESI modo negativo (Figura 5-73), medida no pico do on pseudo molecular a m/z 487 [M-H]-. A comparao com dados da literatura (MAHATO & KUNDU, 1994; Tabela 5-18) veio corroborar com a identificao do cido 2,3,19-triidroxiurs-12-en28-ico ou cido euscfico.

margf543 177 (3.861) Cm (137:188-(56:117+206:251)) 100

75.2

487.4

Scan ES1.34e5

HO
29 12
74.9 75.4 249.1

30 20 18

HO
2 4

25 10 6 23

26 14 8 27

16

COOH
28

HO
24
%
471.7

523.5

254.8 167.3 166.6 62.9 146.9 88.2 121.1 146.3 118.7 130.6 170.9 171.6 241.4 385.2 201.3 224.8 213.1 302.8 327.7 339.3 405.5 442.0 457.7 281.5 267.4 283.2 283.4 301.5 521.3 501.6 525.5 577.3

561.8 545.7 599.6 616.9

60

80

100

120

140

160 180

200

220

240

260

280

300

320

340 360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

600

620

640

m/z

Figura 5-73- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias
XXX e XXXII

153

Tabela 5-18- Dados do espectro de RMN de

C/MULTIPLICIDADE 1 (t) 2 (d) 3 (d) 4 (s) 5 (d) 6 (t) 7 (t) 8 (s) 9 (d) 10 (s) 11 (t) 12 (d) 13 (s) 14 (s) 15 (t) 16 (t) 17 (s) 18 (d) 19 (s) 20 (d) 21 (t) 22 (t) 23 (q) 24 (q) 25 (q) 26 (q) 27 (q) 28 (s) 29 (q) 30 (q)
a

13

C/DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da

URSENATO 42,8 66,0 79,0 38,6 48,4 18,5 33,4 40,7 47,6 38,6 24,1 128,2 139,1 42,0 29,3 26,0 48,4 54,3 72,5 42,0 26,9 37,6 29,0 22,2 16,7 17,4 24,5 176,8 26,7 16,7
a

Substncia XXXII e do 2,3,19-triidroxiurs-12-enato de -D-glucopiranosila

SUBSTNCIA XXXII 42,9 66,3 79,5 38,8 48,9 18,8 33,7 40,7 47,8 38,9 24,2 128,1 140,1 42,5 29,4 26,5 48,4 54,7 72,9 42,3 27,1 38,6 29,6 22,4 16,7 17,4 24,8 180,9 27,2 16,9

(JUNGES, 1994)

154

Figura 5-74- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXII

155

Pyridine-d5 180.874 140.050 128.144 149.900 66.310 54.723 48.881 47.758 42.948 42.505 42.317 40.735 38.933 38.629 29.567 27.248 24.789 22.429 17.431 16.923 20
16.79 18.78 10 17.44 16.95

0.25

HO
29 12 20 18 14 2 10 4 6 23 8 27 16

0.20

HO
0.15

25

26

72.873
30

79.462

COOH
28

HO
24

0.10

0.05

0.00 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30

Figura 5-75- Espectro de RMN de 13C (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXII
66.31 79.45

48.89

128.10

42.52

1.0

54.72

47.75

0.0

-0.5

130

120

110

100

90

80

70

60

50

40

30

27.26 30.16 24.24 26.53 27.10 29.39 33.66 42.95 38.65

0.5

29.61

24.80 20

Figura 5-76- Espectro de RMN de 13C/DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia

XXXII
156

22.43

139.3702 135.2321

127.4066

180.0796

65.5313 54.0183 48.1758 47.7005 41.7924 41.6039 38.2197 38.0886 37.9165 28.8700 26.4936 26.3543 25.7971 24.0517 21.6918 18.0289 16.6933 16.2016 16.0541 50

78.7651

72.1114

HO
29 12 20 18 14 2 4 10 6 23 8 27 16

30

HO

25

26

COOH
28

HO
24

150

100

Figura 5-77- Espectro de RMN de 13C/PENDANT (50 MHz, C5D5N) da Substncia

XXXII

Figura 5-78- Espectro de 1Hx13C HMBC (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXII
157

-0.5967 0

5.15. Identificao das Substncias XXXIII e XXXIV em mistura

30

21 12 25 1 9 27 18 15 28 12 18

21

COOH
1

25 9 27 15

28

COOH

HO
23

HO
23

cido urslico

cido oleanlico

Do extrato metanlico, partio diclorometnica, de folhas de V. polygama, aps vrias etapas cromatogrficas em slica e sephadex LH-20, foram obtidas as fraes df424 e df433, 11,3mg, as quais se mostraram como um p branco e amorfo e uma nica mancha roxa na CCDA, usando-se Dic/AcOEt 85:25. A anlise dos espectros de RMN de 1H e nmero de sinais. O espectro de RMN de
13 13

C/PENDANT das respectivas

fraes indicou tratar-se de uma mistura de substncias, devido complexidade e C/PENDANT (C5D5N, 50 MHz, Figura 5-80, Figura 5-81) revelou dois sinais em 180,0 e 176,1 referentes a C carboxlicos; quatro sinais pertencentes a C sp2, sendo que dois deles, 139,4 e 125,8, foram atribudos a um esqueleto triterpnico do tipo 12-urseno e os outros dois, 144,9 e 122,7, a um esqueleto triterpnico do tipo 12-oleaneno. Um s sinal referente a C carbinlico em 78,3 foi observado. O espectro de RMN de 1H (CDCl3, 200 MHz, Figura 5-82) mostrou um sinal centrado em 5,27 (m), referente ao H-12 olefnico. O espectro realizado com acetona-d6 revelou dois sinais centrados em 5,28 e 5,22 (t, J = 3,6 Hz) referentes aos mesmos H-12 olefnicos, dos cidos oleanlico e urslico respectivamente. O sinal referente ao H-3, carbinlico, apareceu centrado em 3,22 (m) e os sinais referentes aos H metlicos entre 1,25-0,78.

158

A frmula molecular C30H48O3 foi deduzida com base nos dados obtidos pelos espectros de massas, ESI modo negativo (Figura 5-79), medida no pico do on pseudomolecular a m/z 455 [M-H]-. A identificao das estruturas das Substncias XXXIII e XXXIV em mistura foi confirmada por comparao com dados relatados na literatura (MAHATO & KUNDU, 1994; JUNGES, 1994; Tabela 5-19) como os cidos oleanlico e urslico. .

159

Tabela 5-19- Dados do espectro de RMN de

oleanlico
C MULTIPLICIDADE 1 (t) 2 (t) 3 (d) 4 (s) 5 (d) 6 (t) 7 (t) 8 (s) 9 10 (s) 11 (t) 12 (d) 13 (s) 14 (s) 15 (t) 16 (t) 17 18 (d) 19 (d) 20 (d) 21 (t) 22 (t) 23 (q) 24 (q) 25 (q) 26 (q) 27 (q) 28 (s) 29 (q) 30 (q)
a b

13

C/PENDANT (50 MHz, C5D5N) da

13

mistura das Substncias XXXIII e XXXIV e do RMN de

C dos cidos urslico e

SUBSTNCIA XXXIV 23,8 37,6

A. URSLICO 38,9 23,5 78,3 37,3 55,7 18,7

a

SUBSTNCIA XXXIII 28,3 40,1

A. OLEANLICO 38,5 27,4 78,7 38,7 55,2 18,3

b

MISTURA 39,2 78,3 55,9 18,9 39,4 * 37,6 23,8

33,7 *

33,3 39,3 46,7 37,2 23,8

* *

32,6 39,3 47,6 37,0 23,1

125,8 139,4 42,6 28,8 * 53,7 39,5 39,6 31,2 37,4 16,7

125,5 139,2 42,0 28,4 22,7 47,9 53,4 39,3 39,8 30,9 37,3 28,6 16,5 15,6 16,5

122,7 144,9 * 28,4 * * * 30,1(s) * 31,1 15,7

122,1 143,4 41,6 27,7 23,4 46,6 41,3 45,8 30,6 33,8 32,3 28,1 15,6 15,3 16,8 15,8 16,7 28,9 25,1 *

24,0 180,0 17,7 21,5

23,5 179,8 17,3 21,3

26,3 176,1 * 23,9

26,0 181,0 33,1 23,6

(JUNGES, 1994); (MAHATO & KUNDU, 1994); * Sinais no observados

160

margf424 148 (3.234) Cm (139:169-(83:127+199:259)) 100

455.5

Scan ES8.24e5

30

21 12 25 1 9 27 18 15 28 12 18

21

COOH
1

25 9 27 15

28

COOH

HO
%
23

HO
23

69.4 301.2

405.5 58.6 89.1 113.1 255.2 283.7

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

600

620

640

m/z

Figura 5-79- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias
XXXIII e XXXIV

Figura 5-80- Espectro de RMN de 13C/PENDANT (50 MHz, C5D5N) da mistura das
Substncias XXXIII e XXXIV
161

30

21 12 25 1 9 27 18 15 28 25 1 9 27 15 12 18

21

COOH

28

COOH

HO
23

HO
23

Figura 5-81- Espectro ampliado de RMN de 13C/PENDANT (50 MHz, C5D5N) da

mistura das Substncias XXXIII e XXXIV

162

Figura 5-82- Espectro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) da mistura das Substncias
XXXIII e XXXIV
163

5.16. Identificao da Substncia XXXV

OH
21

HO
25 23 27 15

18 19 9 12

OH

HO HO

OH
4 6

20-hidroxiecdisona

O Do extrato metanlico, partio acetato de metila, de galhos de V.

polygama, aps vrios fracionamentos cromatogrficos em slica flash, sephadex LH20 e em placa preparativa, foi obtida a frao AMG3Eb, 77,7 mg, a qual se mostrou como um p incolor de aspecto cristalino. Aps a substncia ser eluda com Dic/Ace 1:1 na CCDA e revelada com vanilina sulfrica, foi observada uma mancha verde oliva. A frmula molecular C27H44O7 foi deduzida a partir dos dados provenientes do espectro de massas, ESI modo negativo, que revelou um pico (100%) relativo ao on pseudomolecular a m/z 479 [M-H]- (Figura 5-84). No modo positivo, o espectro revelou um pico referente ao aduto de sdio a m/z 503 [M+Na]+ (Figura 5-83). A anlise do espectro de RMN de
13

C (50 MHz, C5D5N, Figura 5-85)

totalmente desacoplado revelou trs sinais em 204,1, 166,6 e 121,9 indicando a existncia de carbonila cetnica ,-insaturada, a qual corresponde ao grupo 7-en-6ona caracterstico dos ecdisterides e responsvel pela sua absoro no UV observada em 254 nm. O espectro de
13

C/DEPT 135o (C5D5N, 50 MHz, Figuras 5-85 e 5-86)

forneceu evidncias de que a substncia possua 5 grupos metila, 3 carbonos quaternrios oxigenados, trs oximetnicos e 8 metilnicos. O espectro de RMN de 1H (C5D5N, 400 MHz, Figura 5-88) revelou os seguintes sinais: quatro em 1,62, 1,40, 1,23 e 1,08 (s, integrando para 5 grupos de metilas: Me-21, 26 e 27, 18 e 19 respectivamente); um sinal em 6,27 (dl, J = 2,2 Hz) referente ao H olefnico H-7, o qual mostrou acoplamento longa distncia com H-9 no espectro de COSY (C5D5N, 400 MHz, Figura 5-87); um em 4,23 (m; H-2 e 3); um em
164

 3,90 (dl; J = 9,4 Hz; H-22); um em 3,61 (m; H-9); um em 3,03 (m; H-5 e 17); um em 2,58 (dt, 13,0 e 4,8 Hz) atribudo ao H-11 atravs do acoplamento, revelado no espectro de COSY, com o outro H-11 em 1,8, que por sua vez acopla com o H-9. Baseados nos dados espectrais acima e na comparao com os dados relatados da literatura (SUKSAMRARN & SOMMECHAI, 1993; Tabela 5-20, Tabela 5-21), foi proposta a estrutura da 20-hidroxiecdisona, ou polipodina A.

165

Tabela 5-20- Dados do espectro de RMN de 13C e DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da
Substncia XXXV e da 20-hidroxiecdisona
C/ MULTIPLICIDADE 1 (t) 2 (d) 3 (d) 4 (t) 5 (d) 6 (s) 7 (d) 8 (s) 9 (d) 10 (s) 11 (t) 12 (t) 13 (s) 14 (s) 15 (t) 16 (t) 17 (d) 18 (q) 19 (q) 20 (s) 21 (q) 22 (d) 23 (t) 24 (t) 25 (s) 26 (q) 27 (q)
a

SUBSTNCIA XXXV 38,1 68,5 68,3 32,7 51,6 204,1 121,9 166,6 34,7 38,9 21,4 32,3 48,4 84,5 31,9 21,7 50,4 18,2 24,7 77,2 21,9 77,9 27,7 42,8 70,1 30,4 30,1

20HIDROXIECDISONA a 38,0 68,3 68,2 32,5 51,4 203,5 121,7 166,1 34,6 38,8 21,2 32,1 48,2 84,4 31,8 21,6 50,2 17,9 24,5 77,0 21,7 77,7 27,5 42,6 69,8 30,1 30,1

(SUKSAMRARN & SOMMECHAI, 1993)

166

Tabela 5-21- Dados do espectro de RMN de 1H (200 MHz, C5D5N, J em Hz) da

Substncia XXXV e da 20-hidroxiecdisona
H 2 3 5 7 9 17 22 24 18 19 21 26 27
a

Substncia XXXV 4,23 (m) 4,23 (m) 3,03 (m) 6,27 (sl) 3,61 (m) 3,03 (m) 3,90 (dl, 9,4 Hz) * 1,23 (s) 1,08 (s) 1,62 (s) 1,40 (s) 1,40 (s)

20-hidroxiecdisona 4,17 (m) 4,21 (m) 3,01 6,25 (d, 2,5 Hz) 3,58 (m) 3,00 3,87 (m) 1,81 e 2,28 1,21 (s) 1,06 (s) 1,58 (s) 1,36 (s) 1,36 (s)

(SUKSAMRARN & SOMMECHAI, 1993); * sinal no observado

marg180304
margAMG3E1 119 (2.554) 100
503.5

Scan ES+ 2.86e4

OH
21

HO
25 23 27 15

18 19 9 12

OH

HO
%

OH HO
4 6

520.0 463.9 355.0 284.4 331.0 411.0 365.2 440.8 485.7 535.6 595.4 585.8 639.3 685.0 741.4

260 280 300

320

340

360 380 400 420 440 460 480

500

520

540 560 580 600 620 640

660

680

700 720 740

m/z

Figura 5-83- Espectro de massas (ESI, modo positivo) da Substncia XXXV

167

marg180304
margAMG3E1neg 95 (2.045) 100
479.5

Scan ES3.10e5

OH
21
525.5

HO
25 23 27 15

18 19 9 12

OH

HO
%

OH HO
4 6

H
539.6

515.6 495.5 569.7 283.3 311.3 387.4 461.5 593.5

260 280 300

320

340

360 380 400 420 440 460 480

500

520

540 560 580 600 620 640

660

680

700 720 740

m/z

Figura 5-84- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia XXXV

204.124 166.602 150.000 121.935 70.073 68.352 51.644 50.366 48.383 42.819 38.959 50 32.699 32.281 31.970 30.355 30.191 24.709 21.735 18.187 84.544 77.899 77.259 100

200

150

Figura 5-85- Espectro de RMN de C (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXV

13

168

121.900

68.473 68.342

38.048 34.721 32.705 32.279 31.959 30.148 27.665 24.699 21.954 21.372 40 30

51.642 50.347

42.792

OH
21

HO
25 23 27 15

18 19 9 12

OH

HO HO

OH
4 6

120

110

100

90

80

70

60

50

20

Figura 5-86- Espectro de RMN de 13C/DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia

XXXV

Figura 5-87- Espectro de 1H-1H COSY (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXV
169

18.201

77.905

Figura 5-88- Espectro RMN 1H (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXV

170

5.17. Identificao da Substncia XXXVI

OH
21 18 19 12 15 9 4 6

OH
23

25

OH
27

HO HO

OH

polipodina B

OH O

Do extrato metanlico, partio acetato de etila, dos galhos de V. polygama, depois de vrios fracionamentos cromatogrficos em slica flash, sephadex LH-20 e em placa preparativa, foi obtida a frao AMG3Ec, 11,0 mg, a qual se mostrou como um p incolor de aspecto cristalino. Aps a substncia ser eluda com Dic/Ace 1:1 na CCDA e revelada com vanilina sulfrica, foi observada uma mancha amarela/verde oliva. A frmula molecular C27H44O8 (massa = 496 g/mol) foi deduzida a partir dos dados provenientes dos espectros de RMN de CH3 e negativo para CH2, e de RMN de 1H. A anlise do espectro de RMN de
13 13

C e

13

C/DEPT 135 (C5D5N, 50

MHz) usando uma transferncia de pulso de 135o para obter sinais positivos para CH e C (50 MHz, C5D5N, Figura 5-89)

totalmente desacoplado revelou trs sinais em 201,2, 167,0 e 120,1 indicando a existncia de carbonila cetnica ,-insaturada, a qual corresponde ao grupo 7-en-6ona caracterstico dos ecdisterides e responsvel pela sua absoro no UV observada em 254 nm. O espectro de
13

C/DEPT 135o (C5D5N, 50MHz, Figura 5-90) forneceu

evidncias de que a substncia possua cinco grupos metila, 4 carbonos quaternrios oxigenados, trs oximetnicos e 8 metilnicos. O espectro de RMN de 1H (C5D5N, 200 MHz, Figura 5-91) revelou os seguintes sinais: quatro em 0,94, 0,99, 1,16 e 1,38 (s, integrando para 5 grupos de metilas: Me-19, 18, 26 e 27, 21 respectivamente); um sinal em 6,06 (sl) referente ao H olefnico H-7; um em 4,05 (m; H-2 e 3); um em 3,66 (dl; J = 7,8 Hz; H-22); um em
171

 3,43 (m; H-9); um em 2,79 (m; H-5 e 17). Os sinais relativos aos carbonos 10 e 9 apresentaram-se 6 e 4 ppm mais desblindados respectivamente do que os mesmos carbonos referentes 20-hidroxiecdisona; os carbonos 3 e 4 apresentaram-se cerca de 2 ppm mais desblindados, enquanto o C-1 estava 2 ppm mais blindado e a Me-19 estava 7 ppm mais blindada (Tabela 5-22). Segundo KREPINSKY et al. (1977), a hidroxilao no C-5 resulta no deslocamento do sinal deste carbono de ~ 51,0 para ~ 80,0, ocorrendo outras mudanas pequenas, mas significantes, no C-6 (~ 2,0 mais blindado); C-19 (~ 5,0-6,0 mais blindado); C-3 (~ 1,5-2,0 mais desblindado); C-4 e 10 (~ 4,0 e 7,0 mais desblindados respectivamente). Estas observaes levaram-nos a situar uma das hidroxilas no C-5 e o restante nas mesmas posies da substncia 20-hidroxiecdisona. Baseados nos dados acima, foi proposta a estrutura da polipodina B, ou 5,20-diidroxiecdisona, obtida atravs da comparao com os dados relatados na literatura (KREPINSKY et al., 1977; Tabela 5-22).

172

Tabela 5-22- Dados do espectro de RMN de 13C e DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da
Substncia XXXVI e da polipodina B
C
(MULTIPLICIDADE)

SUBSTNCIA XXVI 36,1 68,1 70,0 34,9 80,1 201,2 120,1 167,0 38,5 44,9 22,2 32,3 48,3 84,2 31,8 21,6 50,2 17,3 18,3 77,1 21,8 77,8 27,6 42,8 69,8 30,1 30,3

POLIPODINA B 34,9 68,1 70,0 36,1 80,0 201,2 120,0 167,0 38,4 44,9 21,0 31,8 48,2 84,2 32,3 21,8 50,1 17,3 18,0 77,0 21,5 77,7 27,6 42,6 69,7 30,1 30,3

1 (t) 2 (d) 3 (d) 4 (t) 5 (s) 6 (s) 7 (d) 8 (s) 9 (d) 10 (s) 11 (t) 12 (t) 13 (s) 14 (s) 15 (t) 16 (t) 17 (d) 18 (q) 19 (q) 20 (s) 21 (q) 22 (d) 23 (t) 24 (t) 25 (s) 26 (q) 27 (q)
a

(KREPINSKY et al., 1977)

173

77.751 200

201.198

75 70.024 68.295 68.122 150 50.136

70

167.028

65

60

55

120.099

13

50

HO

HO

Figura 5-89- Espectro de RMN de C (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVI

Figura 5-90- Espectro de RMN de 13C/DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia

XXXVI
100 42.777 38.426 36.148 34.952 50 32.215 31.797 30.289 30.109 27.651 22.243 21.841 21.554 18.047

174

45

19

OH O
6 9

12 21

40

18

OH
15

OH
23

OH

35

27

25

OH

30

25

84.241 80.062 77.792 77.071 70.024 69.835 68.270 68.139 50.177 48.301 44.957 42.786 38.468 36.190 34.960 32.240 31.806 30.298 27.643 22.243 21.849 18.056 17.334

20

OH
0.9 0.8

21 18 19 12

OH
23

25

OH
27

0.7 0.6

HO HO

1 9 4 6

15

OH
1.38 3.11 1.34 1.39 3.5 3.0 2.81 2.77 2.74 1.11 2.5 2.0 2.35 2.27 2.10 2.03 4.13 3.98 3.68 3.64 3.42 3.38 1.93 1.88 1.79 1.63 3.35 1.5 0.99 0.94 6.38 1.0 0.5

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 7.0 6.5 6.06

OH O

Pyridine-d5

1.00 6.0 5.5 5.0 4.5

4.0

Figura 5-91- Espectro de RMN 1H (200 MHz, C5D5N, com supresso do sinal da gua
em 4,9 ppm) da Substncia XXXVI

175

1.16

5.18. Identificao da Substncia XXXVII

OH
21 18 19 12 9 6 15

HO
25 23 27

OH

HO HO

1 4

stachysterona B

Do extrato metanlico, partio acetato de etila, dos galhos de V. polygama, depois de vrios fracionamentos cromatogrficos em slica flash, sephadex LH-20 e em placa preparativa, foi obtida a frao AMG3Ee, 14,3 mg, a qual se mostrou como um p incolor de aspecto cristalino. Aps a substncia ser eluda com Dic/Ace 1:1 na CCDA e revelada com vanilina sulfrica, foi observada uma mancha amarelo ouro. A frmula molecular C27H42O6 (massa = 462 g/mol) foi deduzida a partir dos dados provenientes dos espectros de RMN de 13C, 13C/DEPT 135 (C5D5N, 50 MHz) usando uma transferncia de pulso de 135o para obter sinais positivos para CH e CH3 e negativo para CH2 e de RMN de 1H. A anlise do espectro de RMN de
13

C (50 MHz, C5D5N, Figura 5-93)

totalmente desacoplado revelou quatro sinais em 203,2, 155,8, 128,9 e 121,3 indicando a existncia de carbonila cetnica ,,,-insaturada, a qual corresponde ao grupo 7-en-6-ona caracterstico dos ecdisterides e responsvel pela sua absoro no UV observada em 254 nm. O sinal referente ao outro C sp2 foi encoberto pelo sinal do solvente. O espectro de
13

C/DEPT 135o (C5D5N, 50 MHz, Figura 5-94) forneceu

evidncias de que a substncia possua 5 grupos metila, 2 carbonos quaternrios oxigenados, trs oximetnicos e 7 metilnicos. Os sinais relativos aos carbonos 17 e 16 apresentaram-se 8 e 20 ppm mais desblindados respectivamente do que os mesmos carbonos referentes a 20-hidroxiecdisona (Tabela 5-24) e os carbonos 9 e 18

176

apresentaram-se cerca de 4,5 e 2 ppm mais desblindados. Estas observaes levaramnos a situar a ligao dupla extra entre os carbonos 14 e 15. O espectro de RMN de 1H (C5D5N, 400 MHz, com o sinal da piridina calibrado em 8,96, Figura 5-92) revelou sinais que esto expostos na Tabela 5-23. Baseados nos dados acima, foi proposta a estrutura da 14-15 20hidroxiecdisona ou stachysterona B, confirmada atravs da comparao com os dados relatados na literatura (IMAI et al., 1970; Tabela 5-23, Tabela 5-24, respectivamente). Segundo IMAI et al. (1970), a ocorrncia desta substncia, juntamente com a Shidasterona, de interesse biogentico.

Tabela 5-23- Dados do espectro de RMN de 1H (200 MHz, C5D5N) da Substncia

XXXVII e da stachysterona B
H Me-19 Me-18 Me-26 e 27 Me-21 H-5 H-22 H-1 H-2 H-3 H-15 H-7 H-17
a

Substncia XXXVII ( ppm, J em Hz) 1,24 (s) 1,61 (s) 1,74 e 1,73 (s) 1,81(s) 3,17 (m) 4,09 (dd; 9,3 e 2,2 Hz) * 4,57 (dl, 11,5 Hz) 4,79 (s; 11,8 Hz) 6,22 (s) 6,62 (s) 3,03 (m)

stachysterona B ( ppm, J em Hz) a 1,00 (s) 1,33 (s) 1,42 (s) 1,49 (s) 2,96 (dd, 5,0 e 13,5 Hz) 3,76 (m) 3,76 (m) 4,82 (m, W 4,40 (m, W

= 21 Hz) = 7,5 Hz)

5,94 (dd, 3,0 e 3,0 Hz) 6,31 (d, 2,5 Hz)

(IMAI et al., 1970); * Sinal no observado

177

Tabela 5-24- Dados do espectro de 13C e DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia
XXXVII e da 20-hidroxiecdisona
C/ MULTIPLICIDADE 1 (t) 2 (d) 3 (d) 4 (t) 5 (d) 6 (s) 7 (d) 8 (s) 9 (d) 10 (s) 11 (t) 12 (t) 13 (s) 14 (s) 15 (t) 16 (t) 17 (d) 18 (q) 19 (q) 20 (s) 21 (q) 22 (d) 23 (t) 24 (t) 25 (s) 26 (q) 27 (q)
a

SUBSTANCIA XXXVII 37,7 68,5 68,4 32,9 51,4 203,2 121,3 155,8 39,1 39,5 21,2 31,7 48,4 * 128,9 40,5 58,5 20,3 24,2 76,4 20,9 77,9 27,5 42,7 69,9 30,8 29,9

20HIDROXIECDISONA a 38,0 68,3 68,2 32,5 51,4 203,5 121,7 166,1 34,6 38,8 21,2 32,1 48,2 84,4 31,8 21,6 50,2 17,9 24,5 77,0 21,7 77,7 27,5 42,6 69,8 30,1 30,1

(SUKSAMRARN & SOMMECHAI, 1993); * Sinal encoberto pelo sinal do solvente

178

Figura 5-92- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVII

179

Pyridine-d5

0.09 0.08 0.07 76.37 69.95 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 -0.01 203.15

68.47

51.40 48.37 42.70 39.44 32.94 39.14 30.80 31.68 29.95 27.45 24.14 50
39.20 30.91 30.02 24.23 21.28 31.74 33.04 27.54 30

128.89

77.90

200

155.80

150

121.26

100

Figura 5-93- Espectro de RMN de 13C (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVII
OH
21 25 23 27 15

1.0 Pyridine-d5 121.30 128.98

19 12 9 6

18

OH
77.96

HO
0.5

0.0

130

120

110

100

90

80

70

60

50

40

Figura 5-94- Espectro de RMN de 13C/DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia

XXXVII
180

20.97 20.40 20

58.56

51.48

HO

68.54

HO

58.53

20.28

37.78 40.59 42.80

5.19. Identificao da Substncia XXXVIII

21 18 19 12

OH

25

23

HO HO

15 1 4 9

OH
6

shidasterona ou stachysterona D

O Do extrato metanlico, partio acetato de etila, dos galhos de V. polygama, depois de vrios fracionamentos cromatogrficos em slica flash, sephadex LH-20 e em placa preparativa, foi obtida a frao AMG3D5, 15,7 mg, a qual se mostrou como um p incolor de aspecto cristalino. Aps a substncia ser eluda com Dic/Ace 1:1 na CCDA e revelada com vanilina, foi observada uma mancha amarelo ouro. A frmula molecular C27H42O6 (massa = 462 g/mol) foi deduzida a partir dos dados provenientes dos espectros de RMN de CH3 e negativo para CH2, e de RMN de 1H. A anlise do espectro de RMN de
13 13

C,

13

C/DEPT 135 (C5D5N, 50

MHz), usando uma transferncia de pulso de 135o para obter sinais positivos para CH e C (50 MHz, C5D5N, Figura 5-97)

totalmente desacoplado revelou trs sinais em 203,8, 166,4 e 121,9 indicando a existncia de carbonila cetnica ,-insaturada, a qual corresponde ao grupo 7-en-6ona caracterstico dos ecdisterides e responsvel pela sua absoro no UV observada em 254 nm. O espectro de
13

C/DEPT 135 (C5D5N, 50 MHz, Figura 5-96) forneceu 7 metilnicos. A presena de sinais de carbonos

evidncias de que a substncia possua 5 grupos metila, 3 carbonos quaternrios oxigenados, trs oximetnicos e oxigenados em 85,2 (CH) e 80,6 (C) chamaram a ateno para o fato de que a cadeia lateral da substncia poderia estar modificada, formando um quinto anel com uma ligao ter (hemicetlica) entre os carbonos 22 e 25 (Tabela 5-25). O espectro de RMN de 1H (C5D5N, 400 MHz,; Figura 5-95) revelou sinais expostos na Tabela 5-25. Segundo ROUSSEL et al. (1995), a configurao 22R pode
181

ser confirmada quando no experimento NOE a irradiao de H-17 resulta em aumento do sinal de H-22 e a irradiao deste, resulta em aumento dos sinais referentes ao H17 e H-16. Estes resultados indicam que a molcula adota uma conformao na qual os tomos de hidrognios 17 e 16 esto espacialmente prximos. Esta conformao pode estar sendo estabilizada por ligao de hidrognio entre o grupo OH ligado ao C20 e o tomo de oxignio ligado ao C-22/25. Devido grande estabilidade termodinmica do anel furnico, e dependendo das condies de manipulao do extrato (fase de alumina), esta substncia pode ser um artefato originado da transformao da 20-hidroxiecdisona. A ocorrncia desta substncia, juntamente com a Stachysterona B, de interesse biogentico, pois concebido que na planta a 20hidroxiecdisona pode ser precursora destas substncias (IMAI et al., 1970). Baseados nos dados espectrais de HMBC (C5D5N, 400 MHz, Figura 5100), COSY (C5D5N, 400 MHz, Figura 5-98), HSQC (C5D5N, 400 MHz, Figura 5-99) e nos acima apresentados, foi proposta a estrutura da shidasterona, confirmada atravs da comparao com os dados relatados na literatura (ROUSSEL et al., 1995; Tabela 5-25 ).

182

Tabela 5-25- Dados do espectro de RMN de 13C e DEPT135 (50 MHz, C5D5N) e de
RMN 1H (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVIII e da shidasterona
H (J EM HZ)
1,97 (m) 2,17 (dd, 4,3 e 14,0 ) 4,23 (dl, 11,3) 4,29 (sl) 2,07 (m) 1,86 (m) 3,02 (dd) 6,26 (s) 3,61 (m) 1,88 (m) 1,71 (m) 2,60 (dt, 4,3 e 12,8)

C/ MULTIPLICIDADE
1 (t) 2 (d) 3 (d) 4 (t) 5 (d) 6 (s) 7 (d) 8 (s) 9 (d) 10 (s) 11 (t) 12 (t) 13 (s) 14 (s)

SUBSTNCIA XXXVIII
38,1 68,4 68,3 32,7 51,6 203,8 121,9 166,4 34,7 38,9 21,9 32,7 47,9 84,4 31,8 21,4 51,6 18,1 24,6 75,8 20,6* 85,2 27,9 39,1 80,6 28,5 29,0
1 1 13

SHIDASTERONA
37,3 68,6 68,4 32,7 51,7 206,4 122,0 167,9 35,0 39,2 21,6 32,2 48,6 85,2 31,6 21,4 51,7 18,0 24,3 76,9 20,6 85,4 28,4 39,5 81,7 28,3 28,9
1 1

1,93 (m) 2,37 (dl, 9,0) 2,11 (m) 2,84 (t, 9,0) 1,06 (s) 1,07 (s) 1,44 (s) 4,12 (t, 7,6) 1,82 (m) 1,63 (m)

15 (t) 16 (t) 17 (d) 18 (q) 19 (q) 20 (s) 21 (q) 22 (d) 23 (t) 24 (t) 25 (s)

1,24 (s) 1,23 (s)

a

26 (q) 27 (q)

(ROUSSEL et al., 1995); * Sinal observado na projeo de C do espectro de HSQC Dados atribudos segundo observaes dos espectros de RMN H, Hx C HSQC, H- H COSY e Hx
1 13

HMBC

183

Figura 5-95- Espectro de RMN 1H (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVIII

184

150

203.812

150.009

HO

HO

200 140
4 19 9 6 12 21 18 1

135.832 130

OH OH
15

O
25

23

166.397 120 110

123.762 121.541

150 100 90 121.861

84.864 80

XXXVIII

Figura 5-97- Espectro de RMN de 13C (50 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVIII
70 60 85.159 84.372 80.635 77.104 75.825 68.287 50 40 30 20 51.611 47.875 39.148 32.666 31.855 29.020 28.495 24.627 21.907 21.366

Figura 5-96- Espectro de RMN de 13C/DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia

185

100

67.983

51.300

50

38.853 37.812 34.362 32.396 31.625 28.733 28.225 27.618 24.341 21.596 20.981 17.818

Figura 5-98- Espectro de 1H-1H COSY (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVIII

186

Figura 5-99- Espectro de 1Hx13C HSQC (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVIII

187

Figura 5-100- Espectro de 1Hx13C HMBC (400 MHz, C5D5N) da Substncia XXXVIII

188

6.Estudo fitoqumico de S. densiflora Berg Experimental

6.1. Preparao dos extratos brutos

Para a preparao destes, as respectivas partes vegetais coletadas foram submetidas secagem em estufa de circulao de ar entre 45-55C e pulverizadas em moinho eltrico tipo Willey. As partes pulverizadas foram extradas com hexano, metanol e soluo MeOH/H2O destilada 1:1. A extrao com hexano e MeOH foi realizada durante 12 dias (trocando o solvente de 6 em 6 dias) temperatura ambiente e em repouso para cada solvente, sendo os extratos filtrados e concentrados em rotaevaporador. Na extrao hidroalcolica, a 100 g da torta a ser extrada foram adicionados 200 mL da soluo MeOH/H2O 1:1. Essa mistura foi levada ao ultra som para agitao por 30 min e depois filtrada e concentrada em rotaevaporador, sendo essa operao repetida por 6 vezes. Aps esse procedimento, o extrato aquoso obtido foi liofilizado. Os resultados se encontram na Tabela 6-1.

Tabela 6-1- Extratos brutos de S. densiflora

Material vegetal seco (kg) Folhas (0,923) Solvente hexano metanol MeOH/H2O 1:1 hexano metanol MeOH/H2O 1:1 Massa de extrato obtida (g) 8,2 164,8 22,1 0,9 177,6 5,5 1,0 131,1 5,7 0,3 73,2 2,4 Cdigo

HSF MSF HMSF HSC MSC HMSC HSG MSG HMSG HSCr MSCr HMSCr

Caule (2,247)

hexano metanol Galhos (1,288) MeOH/H2O 1:1 Casca da raiz (0,4) hexano metanol MeOH/H2O 1:1

190

6.2. Fracionamento dos extratos brutos e fraes de S. densiflora 6.2.1. caule

60,7 g do extrato metanlico de caule foram dissolvidos em 400 mL de uma soluo de MeOH/H2O 1:1 e submetidos partio lquido/lquido, sendo extrados trs vezes consecutivas, com 300 mL cada, com os solventes diclorometano, acetato de etila e n-butanol na ordem crescente de polaridade. As fraes obtidas e suas respectivas massas encontram- se na Tabela 6-2.

Partio lquido/lquido do extrato metanlico do

Tabela 6-2- Resultados da partio lquido/lquido do extrato metanlico do caule

Solvente diclorometano acetato de etila n-butanol gua Cdigo DMCS AMCS BMCS AgMCS Massa obtida g 1,62 7,67 12,7 35,4

6.2.2.

Frao em n-butanol do extrato metanlico de caule

e obteno das Substncias LVIII e LXV

1,54 g da BMCS foram submetidos a CCV, usando-se Sephadex LH-20 (TC= 34,0 cm x 3,0 cm) e MeOH com eluente. Aps reunio das alquotas semelhantes foram obtidas 20 fraes. A frao BMCl, 118,2 mg, foi identificada como a castalagina (Substncia LVIII) e a frao BMCj, 66,7 mg, como a -pedunculagina (Substncia LXV).

191

6.2.3. caule

Frao em acetato de etila do extrato metanlico de

6.2.4. caule

Frao em diclorometano do extrato metanlico de

192

6.2.4.1. Obteno das Substncias LIII e LIV em mistura e da Substncia LII

75,4 mg da frao DMC5 (Fluxograma sesso 6.2.4) foram submetidos a CCV (T.C. 2,0 x 45,0 cm) usando-se como F.E. Sephadex LH20 e F.M. MeOH. Foram obtidas cinco fraes. A frao DMC5q, 25,9 mg, foi submetida a CCD preparativa, placa 20,0 x 20,0 cm, usando-se Dic como eluente e fazendo-se quatro eluies consecutivas na mesma placa. Foram obtidas sete fraes. A frao 5qd, 8,3 mg, foi identificada, por RMN 1H, como uma mistura do 2,4,6-trimetoxibenzaldedo e do trans2,4,6-trimetoxifenilpropenaldedo (Substncias LIII e LIV). Parte desta frao foi submetida novamente a CCD preparativa, placa 20,0 x 20,0 cm, usando-se Dic:Ace 9:1 como eluente e fazendo-se uma eluio. Foram obtidas sete fraes. A frao 5qd5, 3,4 mg, foi identificada como o cido 2,4,6-trimetoxibenzico (Substncia LII), um artefato proveniente da oxidao da Substncia LIII, j que ele no havia sido detectado, por RMN 1H e espectrometria de massas, na frao de origem. A frao 5qd6, 0,5 mg, foi identificada como a substncia LIII pura.

6.2.4.2. Obteno das Substncias XIX e LV

A frao DMC6, 115,7 mg (Fluxograma sesso 6.2.4), foi submetida a CCV (T.C. 3,0 x 23,0 cm) usando-se como F.E. slica flash e F.M. inicial Dic, Dic/AcOEt a MeOH. Foram obtidas 55 fraes. A frao DMC62 foi identificada como o cido vanlico (Substncia XIX). A frao DMC68 como uma mistura das Substncias LIV e LII. A frao DMC611 foi caracterizada como um acar. A frao DMC69, 10,4 mg, foi submetida a CCD preparativa, placa 20,0 x 20,0 cm, usando-se Dic como eluente e fazendo-se trs eluies consecutivas na mesma placa. Foram obtidas seis fraes. A frao DMC698, 5,0 mg, foi identificada como o 5-hidroximetil-2-furfuraldedo (Substncia LV). A massa da frao DMC7 (Fluxograma sesso 6.2.4) foi dividida em duas e tambm submetida a CCD preparativa como a frao DMC69. Foram obtidos 8,7 mg da Substncia LV.

193

6.2.4.3. Obteno da Substncia XLIV e XLIX

600,0 mg da frao DMC8 (Fluxograma sesso 6.2.4) foram submetidos a CCV (T.C. 3,0 x 28,0 cm) usando-se Sephadex LH20 como F.E. e eluio gradiente a partir de Dic, Dic/Ace a MeOH. Foram obtidas 16 fraes. A frao DMC836, 12,0 mg, foi identificada como o cido arjunlico (Substncia XLIV). A frao DMC86, 51,9 mg, foi submetida a CCV (T.C. 2,0 x 23,0 cm) usando-se como F.E. slica flash e F.M. inicial Dic, Dic/Ace a MeOH. Foram obtidas 11 fraes. A frao DMC86J, 19,5 mg, foi caracterizada como o cido glico (Substncia XLIX).

6.2.5. casca da raiz

Partio lquido/lquido do extrato metanlico da

73,2 g do extrato metanlico de caule foram dissolvidos em 400 mL de uma soluo de MeOH/H2O 1:1 e submetidos partio lquido/lquido, sendo extrados trs vezes consecutivas, com 300 mL cada, com os solventes diclorometano e acetato de etila na ordem crescente de polaridade. As fraes obtidas e suas respectivas massas encontram-se na Tabela 6-3.

Tabela 6-3- Resultados da partio lquido/lquido do extrato metanlico da casca da

raiz Solvente diclorometano acetato de etila gua Cdigo DMSCr AMSCr RMSCr Massa obtida g 0,9 10,5 52,0

194

6.2.6. casca da raiz

Frao em acetato de etila do extrato metanlico da

6.2.6.1. Obteno das Substncias L e XLIX

A frao R11s, 25,3 mg (Fluxograma sesso 6.2.6), foi submetida CLAE reciclante, usando-se coluna preparativa com fase polimrica (PVA), 270 nm, eluente MeOH e fluxo de 2,0 mL/min. No segundo ciclo coletaram-se duas fraes. A frao R11se2, 1,9 mg, foi identificada como o cido sirngico (L) e a frao R11se4, 10,0 mg, foi identificada como o cido glico (XLIX).

6.2.6.2. Obteno da Substncia LVI

A frao R11x, 137,2 mg (Fluxograma sesso 6.2.6), foi submetida a CCV (T.C. 3,0 x 52,0 cm) usando-se como F.E. Sephadex LH20 e F.M. MeOH. Foram obtidas 6 fraes. A frao SR11xe, 59,3 mg, foi identificada como casuarinina.
195

6.2.6.3. Obteno das Substncias LXVI, LXVII e LXIV

A frao SR12e, 43,4 mg (Fluxograma sesso 6.2.6), foi submetida a CCV (T.C. 2,0 x 60,0 cm) usando-se como F.E. Sephadex LH20 e F.M. MeOH. Foram obtidas 8 fraes. A frao SR12e3, 8,7 mg, foi identificada como a ramnose (LXVI); a frao R12e4, 4,0 mg, como a -lactona do cido 3,4,5,6-tetraidroxihexanico (LXVII). A frao R12e6, 10,9 mg, foi identificada como o cido 4-O--D-glucopiranosil-3,5dimetoxifenil-[1,4]-dioxinil-2-hidroxiglico (LXIV) ou siphoneugenina.

6.2.6.4. Obteno da Substncia LX

A frao SR12gs (Fluxograma sesso 6.2.6) foi submetida a CLAE, usando-se coluna preparativa com fase ODS/C18, 375 nm, eluente MeOH/gua 6:4 e fluxo de 2,5 mL/min. Foram obtidas 7 fraes. A frao R12gs4,10,0 mg, foi identificada como o 4-O--L-raminopiranosdeo do cido elgico.

6.2.6.5. Obteno da Substncia LI

A frao AMSCr18 (Fluxograma sesso 6.2.6), 698,3 mg, foi submetida a CCV (T.C. 4,0 x 67,0 cm) usando-se como F.E. XAD-7 e F.M. MeOH. Foram obtidas 45 fraes. A frao R18a, 322,7 mg, foi subdividida em vrias partes e submetida a CLAE reciclante, usando-se coluna com fase polimrica preparativa, 270 e 330 nm, eluente MeOH e fluxo de 2,0 mL/min. Reunidas as fraes semelhantes, a frao R18a2, 109,4 mg, foi identificada como o cido elgico (LI). A frao R18c (Fluxograma sesso 6.2.6), 38,2 mg, foi submetida a CLAE, usando-se coluna preparativa com fase ODS; fluxo de 3,0 mL/min; 280 nm; H2O/MeOH 7:3 como eluente. No houve separao da mistura das substncias LI, LX, LXI, LXII e LXIII, frao denominada R18cB, 5,0 mg.

6.2.6.6. Obteno das Substncias LVIII e LIX em mistura e LVI e LVII em mistura
A frao AMSCr19, 434,5 mg (Fluxograma sesso 6.2.6), foi submetida a CCV (T.C. 3,0 x 52,0 cm) usando-se como F.E. Sephadex LH20 e F.M. MeOH. Foram
196

obtidas 7 fraes. A frao R19h, 127,6 mg, foi submetida a CCV (T.C. 3,0 x 52,0 cm) usando-se como F.E. Sephadex LH20 e F.M. MeOH. Foram obtidas 10 fraes. A frao R19hg, 31,0 mg, foi identificada como a castalagina (LVIII), que, aps ficar uma semana dissolvida em MeOH deuterado dentro do tubo de anlise de RMN, se transformou numa mistura contendo as Substncias LIX e LXVIII como artefatos. A frao R19hj, 19,6 mg, foi identificada como a casuarinina (LVI) que, sob as mesmas condies anteriores, formou uma mistura com a stachyurina (LVII) como artefato.

6.2.6.7. Obteno das Substncias LX, LXI, LXII e LXIII em mistura

A frao AMSCr20, 358,0 mg (Fluxograma sesso 6.2.6), foi submetida a CCV (T.C. 3,0 x 31,0 cm) usando-se como F.E. Sephadex LH20 e F.M. MeOH. Foram obtidas 8 fraes. A frao R20H, 15,7 mg, foi identificada como a Substncia LVIII. A frao R20A, 74,0 mg, foi submetida a CLAE, usando-se coluna preparativa com fase ODS/C18, 300 nm, eluente MeOH/gua 7:3 e fluxo de 2,0 mL/min. Foram obtidas 5 fraes. A frao R20A5, 8,2 mg, foi identificada uma mistura de taninos acetilados derivados do 4-O--L-raminopiranosdeo do cido elgico. A frao AMSCr15 (Fluxograma sesso 6.2.6) tambm teve uma parte, 20,0 mg, submetida a CLAE nas mesmas condies acima especificadas, originando uma subfrao, R153, contendo a mesma mistura.

197

6.2.7.

Extrato hidrometanlico do caule

HMSC 1,3 g
CCV XAD - 7; H2O; H2O/Ace 1:1 MeOH/Ace 1:1 T.C.: 4,5 x 63,0 cm

XAAHMCS CCV SEPHADEX-LH20 MeOH T.C.: 3,0 x 46,0 cm, 11 fraes 672,8 mg

XAHMCS

XAMHMCS

305,9 mg

48,6 mg

XAAHMC6 78,6 mg Subst. LXV

XAAHMC8 97,3 mg Subst. LVIII

6.2.8. folhas

Partio lquido/lquido do extrato metanlico de

70,0 g do extrato metanlico de folhas foram dissolvidos em 400 mL de uma soluo de H2O/MeOH 1:1 e submetidos partio lquido-lquido, sendo extrados trs vezes consecutivas, com 300 mL de cada um dos seguintes solventes: diclorometano, acetato de etila e n-butanol, na ordem crescente de polaridade, obtendo-se as fraes determinadas na tabela 6-4.

Tabela 6-4- Resultado da partio lquido/lquido do extrato metanlico de folhas

Solvente diclorometano acetato de etila n-butanol gua Cdigo DMFS AMFS BMFS AgMFS Massa obtida g 9,5 14,6 12,0 12,5

198

6.2.9. folhas

Frao em acetato de etila do extrato metanlico de

6.2.10.

Frao em diclorometano do extrato metanlico de

folhas e obteno das Substncias XLV, XLVI e XLVII em mistura

A partio DMFS, 9,2 g, foi submetida a CCV (T.C. 5,5 x 30,0 cm) usando-se como F.E. slica comum, e sobre a mesma 5,0 cm de florisil, e F.M. inicial Hx at MeOH. Aps reunidas as fraes semelhantes, foram obtidas 17 fraes. A frao DMFg, 381,8 mg, foi submetida a CCV (T.C. 3,0 x 25,0 cm) usando-se como F.E. slica flash e F.M. inicial Dic/Ace 1:1 at MeOH. Aps reunidas as fraes semelhantes, foram obtidas 18 fraes. A frao DMFg7, 32,5 mg, foi identificada como uma mistura dos triterpenos -amirina, -amirina e lupeol.

199

200

7.Estudo Fitoqumico de S. densiflora Berg Resultados e Discusses

201

7.1. Identificao da Substncia XXXIX

OH
2'

OH
4'

HO
7

O
4 5

quercetina

OH

OH

O extrato metanlico de folhas de S. densiflora, partio acetato de etila, aps vrias etapas cromatogrficas em slica e sephadex LH-20, forneceu a frao AMFSc10, 4,0 mg, sob a forma de p amarelo brilhante amorfo. A anlise do espectro de RMN de 1H (200 MHz, acetona-d6, Figura 7-1) mostrou sinais caractersticos de um flavonol com um sistema de substituio 3,4 no anel B: um sinal em 7,82 (d, 2,0 Hz, H-2), um sinal em 7,70 (dd, 8,0 e 2,0 Hz, H-6), um sinal em 7,00 (d, 8,0 Hz, H-5); um sinal em 12,17 (s, OH quelada na posio C5); dois sinais caractersticos de um sistema de acoplamento AB no anel A, correspondentes a 2H que mantm uma relao meta entre si, em 6,52 (d, 2,0 Hz, H8) e o outro em 6,26 (d, 2,0 Hz, H-6). Baseados nos dados acima e dados da literatura, foi proposta a estrutura da quercetina (AGRAWAL, 1989). .

202

TMS 12.173 7.832 7.821 7.717 7.685 7.675 7.017 6.975 6.530 6.520 6.271 6.261 0.000 5 4 3 2 1 0
6.530 6.520 1.98 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2 6.271 6.261

OH
2'

OH
4'

HO
7

O
4 5

OH

OH

0.76 12 11 10 9 8

2.23

1.00 1.98 7 6

7.728 7.71 7 7.685 7.675

7.832 7.821

2.23 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1

Figura 7-1- Espectro de RMN de 1H (200 MHz, acetona-d6) da Substncia XXXIX

203

7.017 6.975 1.00 7.0

7.2. Identificao da Substncia XL

OH
3' 5'

OH

HO
7

O
4 5

OH

O '' 1
3''

O OH OH

6''

quercitrina

OH

O extrato metanlico de folhas de S. densiflora, partio acetato de etila, aps vrias etapas cromatogrficas em slica e sephadex LH-20, forneceu a frao AMFSfe, 8,0 mg, sob a forma de slido amarelo brilhante. A anlise do espectro de RMN de 1H (CD3OD, 400 MHz, Figura 7-6) revelou que a amostra era um flavonol glicosilado com um sistema de substituio 3,4 no anel B: um sinal em 7,33 (d, 2,1 Hz H-2), um sinal em 7,31 (dd, 8,3 e 2,1 Hz, H6), um sinal em 6,91 (d, 8,3 Hz, H-5); dois sinais caractersticos de um sistema de acoplamento AB no anel A, correspondentes a 2H que mantm uma relao meta entre si, em 6,36 (d, 2,1 HZ, H-8) e o outro em 6,19 (d, 2,1 HZ, H-6); sinais que indicavam a presena de acar em 5,34 (d; 1,5 Hz; H-1, confirmando a ligao de configurao do acar aglicona ), sinal em 4,21 (dd; 3,3 e 1,7 Hz; H-2); um sinal em 3,75 (dd, 3,3 e 9,3, H-3); um sinal em 3,41 (m, H-5); um sinal em 3,35 (d, 9,4 Hz, H-4) e um sinal em 0,93 (d, 6,1 Hz) caracterizando o grupo metila do acar ramnose. A anlise do espectro de RMN de
13

C e DEPT135 (50 MHz, CD3OD;

Figura 7-2; Figura 7-3; Tabela 7-1) revelou um sinal para carbonila quelada de flavonol em 180,0; vrios sinais entre 166,5 a 95,2 pertencentes aglicona; os sinais referentes aos carbonos carbinlicos entre 73,7 a 72,3 e o sinal em 18,1 confirmou a presena da molcula de ramnose. O espectro de massas, ESI modo negativo (Figura 7-5), revelou um pico relativo ao on pseudo molecular a m/z 447 [M-H]-, referente a uma frmula molecular com C21H20O11.
204

As correlaes obtidas pelo espectro de HMBC (Figura 7-4) entre o H anomrico, 5,34, e o C-3, 136,6, indicaram a localizao da ligao do acar aglicona no C-3. Baseando-se nos dados espectrais obtidos e na comparao com dados da literatura (AGRAWAL, 1989; Tabela 7-1), a estrutura da 3-O--Lramnopiranosilquercetina ou quercitrina foi proposta.

Tabela 7-1- Dados do espectro de RMN de 13C (50 MHz, CD3OD) da Substncia XL e
da 3-O--L-ramnopiranosilquercetina
C (MULTIPLICIDADE) 2 (s) 3 (s) 4 (s) 5 (s) 6 (d) 7 (s) 8 (d) 9 (s) 10 (s) 1' (s) 2' (d) 3 (s) 4' (s) 5' (d) 6' (d) 1'' (d) 2'' (d) 3'' (d) 4'' (d) 5'' (d) 6'' (q)
a

SUBSTANCIA XL 158,9 136,6 180,0 163,6 100,3 166,5 95,2 159,7 106,3 123,4 116,8 146,8 150,2 117,4 123,3 103,9 72,5 72,6 73,7 72,3 18,1

3-O--LRAMNOPIRANOSIL QUERCETINA 156,4 134,4 177,7 161,2 98,6 164,0 93,5 157,0 104,2 121,0 115,4 145,1 148,3 115,8 121,0 101,9 70,4 70,6 71,5 70,1 17,3
a

(DMSO-d6; AGRAWAL, 1989)

205

Methanol-d4 166.465 163.613 159.729 158.967 136.654 106.294 103.975 100.312 180.059 117.389 116.816 150.224 146.840 123.289 95.199 73.714 72.460 49.426 18.075

OH
3' 5'

OH

HO
7

O
4 5

O
1'' 3''

OH

O OH OH

6''

OH

150

100

50

Figura 7-2- Espectro de RMN de 13C (50 MHz, CD3OD) da Substncia XL

Methanol-d4 116.627 116.070 122.552 103.238 99.567 72.960 71.608 94.454 49.000 17.370 40 30 20 10

130

120

110

100

90

80

70

60

50

Figura 7-3- Espectro de RMN de 13C/DEPT135 (50 MHz, CD3OD) da Substncia XL

206

Figura 7-4- Espectro de 1H13C HMBC (400 MHz, CD3OD) da Substncia XL

20/05/04
100
447.2 447.6

OH
3' 5'

OH

HO
7

O
4 5

O
1'' 3''

OH

O OH OH

6''

OH

121.1

183.4 232.5

0 100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

m/z

Figura 7-5- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia XL

207

Figura 7-6- Espectro de RMN 1H (400 MHz, CD3OD) da Substncia XL

208

7.3. Identificao das Substncias XLI e XLII em mistura

OH
2'

OH

OH
HO
6'
7

2'

OH

HO

O
4 5

O
4

2 6'

O
1'' HO

4''

OH OH

OH

OH

O OH '' 1 O
4''

OH

OH

3-O--D-xilopiranosilquercetina

3-O--L-arabinopiranosilquercetina ou guaijaverina

O extrato metanlico de folhas de S. densiflora, partio acetato de etila, aps sofrer vrias etapas cromatogrficas em slica e sephadex LH-20, forneceu a frao AMFSi6, 13,3 mg, sob a forma de slido amarelo brilhante. A anlise do espectro de RMN de 1H (CD3OD, 400 MHz, Figura 7-11) revelou que a amostra era uma mistura de dois flavonis glicosilados com um sistema de substituio 3,4 no anel B: um sinal em 7,74 (d, 2,2 Hz, H-2), um sinal em 7,58 (m), um sinal em 6,86 (d, 8,5 Hz, H-5) e outro em 6,85 (d, 8,4 Hz, H-5); dois sinais caractersticos de um sistema de acoplamento AB no anel A, correspondentes a 2H que mantm uma relao meta entre si, em 6,38 (d, 2,1 Hz, H-8) e o outro em 6,19 (d, 2,0 Hz, H-6). Tambm revelou sinais que indicavam a presena de acar em ambos flavonis em 5,17 (d; 7,2 Hz; H-1, confirmando a ligao de configurao do acar aglicona ) e 5,14 (d; 6,6 Hz; H-1, ligao em configurao ), alm de vrios sinais referentes a H carbinlicos em 3,89 (dd, 6,6 e 8,4 Hz); em 3,82 (m); em 3,77 (dd, 5,2 e 11,6 Hz); em 3,64 (dd, 3,1 e 8,4 Hz); 3,51 (dd, 7,4 e 8,7 Hz); em 3,43 (dd, 3,1 e 11,6 Hz); em 3,39 (t, 8,7 Hz); em 3,10 (d, 11,5 Hz) e em 3,75 (d, 11,6 Hz). A anlise do espectro de RMN de
13

C e DEPT135 (50 MHz, CD3OD,

Figura 7-8, Figura 7-9) revelou um sinal para carbonila de flavonol em 179,7; vrios sinais entre 166,9 a 95,2 pertencentes s agliconas, sendo alguns duplicados, o que tambm corroborou com a hiptese de uma mistura. O sinal em 104,9, relativo ao C
209

anomrico, juntamente com os sinais referentes aos carbonos carbinlicos entre 77,8 a 67,2, tambm duplicados e em nmero de oito, sendo dois metilnicos e seis oximetnicos, confirmaram ser os acares do tipo pentoses. O espectro de massas, ESI modo negativo (Figura 7-10) revelou um pico relativo ao on pseudo molecular a m/z 433 [M-H]-, pertencente, pois, a dois ismeros com uma frmula molecular de C20H18O11. Atravs das correlaes observadas no espectro de HMBC (400 MHz, CD3OD, Figura 7-7) entre os H anomricos em 5,17 e 5,14 com o carbono em 135,9, foi possvel determinar o local da ligao dos acares no C-3 da aglicona. Baseando-se nos dados espectrais obtidos e na comparao com dados da literatura (PLAZA et al., 2003; AGRAWAL, 1989; Tabelas 7-2 e 7-3), as estruturas da 3-O--D-xilopiranosilquercetina e 3-O--L-arabinopiranosilquercetina foram propostas.

Figura 7-7- Espectro de 1H13C HMBC (400 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias
XLI e XLII
210

Tabela 7-2- Dados do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da mistura das
Substncias XLI e XLII e de RMN de 1H (600 MHz, CD3OD) e dos grupos -L-arabinopiranosila e -D-xilopiranosila a
1 1

13

C (150 MHz, CD3OD)

H ( em
13

Posio Substncia XLI 1 2 3 5,17 (d, 7,2) 3,51 (dd, 7,4 e 8,7) 3,39 (t, 8,7) 3,82 (m)

ppm, J em Hz) xilopiranosila 4,59 (d, 7,5) 3,31 (dd, 7,5 e 9,0) 3,36 (t, 9,0) 3,56 (ddd,

H ( em ppm, J em Hz)

13

xilopiranosila

Substncia XLII 5,14 (d, 6,6) 3,89 (dd, 6,6 e 8,4) 3,64 (dd, 3,1 e 8,4) 3,82 (m) 3,75 (d,

arabino-

arabinopiranosila piranosila 4,43 (d, 7,0) 3,76 (dd, 7,0 e 8,2) 3,82 (dd, 3,0 e 8,2) 4,10 (m) 106,6 73,8 74,6

105,0 74,9 78,0

4,5; 9,0 e 11,0)

71,4

69,5

3,77 (dd, 5 5,2 e 11,6) 3,10 (d, 11,5)

a

3,28 (t, 11,0) 3,96 (dd, 4,5 e 11,0) 67,1

11,6) 3,43 (dd, 3,1 e 11,6)

3,59 (dd, 3,0 e 12,0) 3,87 (dd, 2,0 e 12,0) 66,8

(PLAZA et al., 2003)

211

Tabela 7-3- Dados do espectro de RMN de

Substncias XLI e XLII e da arabinopiranosilquercetina
C (MULTIPLICIDADE) 2 (s) 3 (s) 4 (s) 5 (s) 6 (d) 7 (s) 8 (d) 9 (s) 10 (s) 1' (s) 2' (d) 3 (s) 4' (s) 5' (d) 6' (d) 1'' (d) 2'' (d) 3'' (d) 4'' (d) 5'' (t)
a

13

C (50 MHz, CD3OD) da mistura das e 3-O--D-

3-O--D-xilopiranosilquercetina

MISTURA 158,8 135,9 135,7 179,7 163,3 100,4 166,9 95,2 158,8 105,4 123,6 116,5 116,3 146,8 146,3 150,2 150,3 117,7 117,5 123,3 123,2 104,9 74,4 73,2 77,8 75,5 71,3 69,4 67,4 67,2
b

3-O--D-XILOPIRANOSIL QUERCETINA 156,4 134,4 177,7 161,2 98,6 164,0 93,5 157,0 104,2 121,0 115,4 145,1 148,3 115,8 121,0 104,8 73,9 76,7 70,1 66,0
a

3-O- -DARABINOPIRANOSIL QUERCETINA 158,4 135,6 179,5 162,9 99,9 165,9 94,8 158,8 105,6 122,9 * 145,9 149,9 * 123,1 104,6 72,8 74,0 69,1 67,0
b

(DMSO-d6; AGRAWAL, 1989); (CD3OD; AGRAWAL, 1989); * Sinais no observados

212

150.255 146.797 146.264

123.582 123.337 123.206 117.748 117.510 116.486 116.322 110.701 105.768 104.981

100.401

166.914

163.284

135.923 135.710

158.760

179.705

OH
2'

OH

OH
HO
6'
7

2'

OH

HO

O
4 5

O
4

2 6'

O
1'' HO

4''

O
1''

OH

OH

OH

OH O
4''

OH
OH

OH

180

170

160

150

140

130

120

110

100

90

77.817 75.548 74.441 73.180 71.303 69.386 67.493 67.230 80 70 60

50

Figura 7-8- Espectro de RMN de 13C (50 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias
XLI e XLII
123.320 100.401 117.732 116.462 116.290 104.957 110.693 77.850 75.580 74.450 73.188 71.303 69.443 90 85 80 75 70 95.157 67.525 67.280 65

125

120

115

110

105

100

95

60

55

50

Figura 7-9- Espectro de RMN de 13C/DEPT135 (50 MHz, CD3OD) da mistura das
Substncias XLI e XLII
213

20/05/04
100
255.2 255.5 433.4 433.6

299.3 149.9 281.3 329.2 447.2

Figura 7-10- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da mistura das Substncias
XLI e XLII

0 100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

m/z

OH
2'

OH

OH
HO
6'
7

2'

OH

HO

O
4 5

O
4

2 6'

O
1'' HO

4''

OH

OH

OH

O OH 1'' O
4''

OH
OH

OH

Figura 7-11- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias
XLI e XLII
214

7.4. Identificao da Substncia XLIII

29 21 12 25 18 9 6 23 27 1' HO 15 28

O C
6'

HO HO

OH OH OH

OH

2,3,6-triidroxiolean-12-en-28-oato de -D-glucopiranosila ou 6-hidroximaslinato de -D-glucopiranocosila Do extrato metanlico, partio acetato de etila, de folhas de S. densiflora, aps sofrer vrias etapas cromatogrficas em slica e sephadex LH-20, foi obtida a frao AMFSfb, 151,5 mg, que se mostrou como um p branco e amorfo em mistura com outras substncias no identificadas, mas detectadas pela CCDA. A frmula molecular C36H58O10 foi deduzida a partir dos dados obtidos pelo espectro de massas, ESI modo negativo (Figura 7-16), medida no pico do on pseudo molecular a m/z 649 [M-H]-. O pico a m/z 487 [M-H-162]- indicou a sada de um fragmento de acar. Acredita-se que o pico em m/z 695 seja um artefato. O ponto de fuso foi observado a 144 C. O espectro de infravermelho revelou bandas caractersticas de grupo hidroxila (3389 cm-1), de C-H de metila (2941, 1462, 1378 cm1

), de C-H de metileno (2880 cm-1), de C=O de ster aliftico (1734 cm-1), de C=C (1646 A anlise do espectro de RMN de
13

cm-1), C-O de lcool (1069 cm-1) e C-O-C de ster (1028 cm-1). C (50 MHz, C5D5N, Figura 7-17; Tabela 7-4) totalmente desacoplado revelou um sinal em 176,9, indicando a existncia de carbonila de ster, por ser mostrar muito blindada para um grupo cido de triterpeno; um sinal em 143,9 (o outro sinal em 123,5 s foi observado no espectro de RMN de
13

C/DEPT 135o, Figura 7-18) relacionados a Csp2 de triterpeno com

esqueleto oleaneno; sinais em 96,1, 84,4 e 79,5 a 62,5 corroboraram a presena de acar, juntamente com trs carbonos carbinlicos situados no esqueleto triterpnico.

215

O espectro de RMN de

13

C/DEPT 135o (C5D5N, 50 MHz, Figura 7-18),

usando uma transferncia de pulso de 135o para obter sinais positivos para CH e CH3 e negativo para CH2, permitiu caracterizar 3 C metnicos, 8 C metilnicos, s um CH2 carbinlico, 7 metlicos e, por diferena com o espectro de RMN de desacoplado, os quaternrios. O espectro de RMN de 1H (C5D5N, 400 MHz, Figura 7-12; Tabela 7-4) revelou os seguintes sinais : um em 6,28 (d, 8,0 Hz) referente ao H anomrico; um em 5,52 (sl) referente ao H olefnico H-12; um em 4,29 (m; H-2); um em 3,43 (d, J = 9,4 Hz), referente ao H-3 com configurao /axial devido ao grande valor de J (logo OH em beta/equatorial), determinando tambm a configurao do H-2 (/axial) e do respectivo grupo hidroxila (/equatorial); vrios sinais entre 4,35 a 4,01, referentes aos H carbinlicos; um em 3,19 (dd, 4,1 e 13,2 Hz), referente ao H-18 do esqueleto oleaneno e 7 sinais entre 1,46 a 0,88 (s), confirmando que uma das 8 metilas, caracterstica de triterpeno de esqueleto oleaneno, suportava um grupo carbonila de ster. Sugere-se que o sinal referente ao grupo metila-24 esteja to desblindado ( 1,79) por se encontrar excludo do cone de blindagem do grupo -OH ligado ao C-6. No espectro de HMBC (C5D5N, 400 MHz, Figura 7-14) foi observada a correlao entre o H cujo sinal estava em 6,28 com o sinal referente carbonila em 176,9, determinando o local da ligao do acar ao C-28 da aglicona. As correlaes existentes entre os sinais em 1,72 (Me-25, ) e 2,50 (H-7) com o C em 67,9 reforou a posio de uma das hidroxilas no C-6. Segundo valores dos C da tabela de MAHATO & KUNDU (1994), o fato do grupo hidroxila se encontrar no C-6 em configurao beta, somado ao conjunto 2,3-diOH, pode provocar um deslocamento maior do C-1, variando de ~ 38,0 para ~ 50,0, o que foi observado e confirmado atravs do espectro de COSY (C5D5N, 400 MHz, Figura 7-13) pelo acoplamento entre o H com sinal em 2,30 e os hidrognios em 1,39 (H-1b) e 4,29 (H-2) e a correlao, obtida no espectro de HSQC (C5D5N, 400 MHz, Figura 7-15), entre o H com sinal em 2,30 e o C em 50,4. De acordo com os dados espectrais expostos acima, foi proposta a estrutura do 6-hidroximaslinato de -D-glucopiranosila, embasada em comparao com os dados relatados na literatura para substncias correlatas (MAHATO & KUNDU,
13

C totalmente

216

1994 ; ZUCARO et al., 2000; ARRAMON et al., 2002; Tabela 7-4). Esta substncia indita na literatura.

Tabela 7-4- Dados dos espectros de RMN de 1H,

13

C, DEPT135 (400 e 50 MHz,

C5D5N) da Substncia XLIII (P), do cido 2,3,6-triidroxiolean-12-en-28-ico (Q) e 2,3,19-triidroxiolean-12-en-24-ico-28-oato de -D-glucopiranosila (R)
1

H/P (J EM HZ)

C/ MULTIPLICIDADE 1 (t) 2 (d) 3 (d) 4 (s) 5 (d) 6 (d) 7 (t) 8 (s) 9 (d) 10 (s) 11 (t) 12 (d) 13 (s) 14 (s) 15 (t) 16 (t) 17 (s) 18 (d) 19 (t) 20 (s) 21 (t) 22 (t) 23 (q) 24 (q) 25 (q) 26 (q) 27 (q) 28 (s) 29 (q) 30 (q) 1 2 3 4 5 6

13

C/P

13

C/Q

13

C/R

2,30 (dd) e 1,39 (m) 4,29 (m) 3,43 (d, 9,4) 1,16 (m) 4,39 (m) 2,50 e 1,23 (m)

2,14 (t, 3,8) 5,52 (sl)

3,19 (dd, 4,1 e 13,2) 1,30 e 1,78 (m)

1,46 1,79 1,72 1,70 1,25 0,92 0,88 6,28 (d, 8,0) 4,21 (t, 8,3 e 8,9) 4,27 (m) 4,35 (d, 9,4) 4,01 (m) 4,45 (dd, 2,1 e 11,7) 4,39 (m)

50,4 69,2 84,4 39,7 56,9 67,9 32,8 41,1 49,1 38,7 24,4 123,5 143,9 43,2 28,6 24,4 47,4 42,2 *46,7 31,1 34,4 28,6 *29,0 19,6 19,2 19,6 26,5 176,9 33,5 24,1 96,2 74,4 78,9 71,5 79,5 62,5
b

49,9 68,2 83,9 39,2 56,4 67,4 41,1 40,6 48,6 38,3 23,9 122,7 144,0 42,6 28,1 23,6 43,3 41,9 46,5 30,8 34,1 33,1 29,0 19,1 18,4 18,3 26,2 180,0 33,2 23,6

48,0 68,6 84,3 50,1 57,0 20,8 33,0 40,2 47,9 39,1 24,4 124,0 144,3 42,2 28,9 28,0 46,5 44,7 80,9 35,6 29,1 33,4 25,2 180,1 17,5 15,2 24,8 177,3 28,8 24,6 95,9 74,1 78,9 71,0 79,4 62,1

H /Q+R (J EM a,b HZ) 1,83 e 1,29 4,28 (dt; 9,5 ;4,5) 3,42 (d; 9,5) 1,18 4,85 1,86 1,99 5,57 (tl)

2,20 3,33 (dd; 14 e 4) 2,32 e 1,40 1,85 1,46 (s) 1,78 (s) 1,71 (s) 1,61 (s) 1,30 (s) 0,96 (s) 1,02 (s) 6,32 (d, 8,0) 4,18 (t) 4,25 (t) 4,40 4,00 (t) 4,41 (sl)

(300 e 75 MHz, C5D5N; ZUCARO et al., 2000); 1 13 valores obtidos no espectro de Hx C HSQC

(400 e 100 MHz, C5D5N; ARRAMON et al., 2002); *

217

Figura 7-12- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, C5D5N) da Substncia XLIII

218

Figura 7-13- Espectro de 1H-1H COSY (400 MHz, C5D5N) da Substncia XLIII

Figura 7-14- Espectro de 1Hx13C HMBC (400 MHz, C5D5N) da Substncia XLIII
219

29 21 12 25 18 9 6 23 27 1' 15 28

O C O O HO
6'

OH OH OH

HO HO

OH

Figura 7-15- Espectro de 1Hx13C HSQC (400 MHz, C5D5N) da Substncia XLIII
20/05/04
100
695.7

649.8 487.6 299.4 255.4 281.4

%
685.7

301.3 331.4 303.4 253.3 227.3 269.3 307.3 329.4

503.6

0 200 220 240 260

280

300

320 340 360 380 400 420

440

460

480 500 520 540 560 580 600

620

640

m/z 660 680 700

Figura 7-16- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia XLIII

220

180

150 150.304 170 160 150 124.287 123.459 140 130 120 96.107 110

176.902

140

130

143.871

120

110 100 84.413 90

100

90

HO

HO
96.139
23 1

Figura 7-17- Espectro de RMN de 13C (50 MHz, C5D5N) da Substncia XLIII

Figura 7-18- Espectro de RMN de 13C/DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da Substncia

25 6 9

XLIII
80 79.472 78.915 74.343 71.442 69.188 67.935 62.469 70 60 50 40 30 20 56.897 52.439 50.448 49.055 46.687 42.172 41.557 39.025 34.379 33.519 32.838 28.635 26.529 24.390 24.021 19.809 18.900

221

80

70

OH

12

27

60

29

84.446 79.472 78.947 74.375 71.499 69.213

18 15 28 21

50

O O
1'

HO

40

6'

30

OH OH OH

20

62.526 56.929 49.087 47.424 46.703 43.163 42.188 41.090 39.787 38.713 33.510 31.134 26.537 24.029 19.604 19.129 18.916

7.5. Identificao da Substncia XLIV

30

21 12 25 18

HO HO
23

COOH
9 27 6 15 28

cido arjunlico

OH

Do extrato metanlico, partio diclorometnica, de caule de S. densiflora, aps vrias etapas cromatogrficas em slica flash e sephadex LH-20, foi obtida a frao DMC836, 12,0 mg, a qual se mostrou como um p branco e amorfo. Aps a frao ser eluda com Dic/Ace 8:2 com duas gotas de HAc na CCDA e revelada com vanilina sulfrica, foi observada uma mancha azul. A frmula molecular C30H48O5 foi deduzida a partir dos dados obtidos pelo espectro de massas, ESI modo negativo (Figura 7-20), medida no pico do on pseudomolecular a m/z 487 [M-H]-. A anlise do espectro de RMN de
13

C (50 MHz, C5D5N, Figura 7-19,

Tabela 7-5) totalmente desacoplado revelou um sinal em 180,4, indicando a existncia de carbonila carboxlica; dois sinais em 145,0 e 122,6 relacionados a Csp2 de triterpeno com esqueleto oleaneno e trs sinais em 78,4; 69,1 e 66,6 para carbonos carbinlicos. O espectro de RMN de
13

C/DEPT135o (C5D5N, 50 MHz, Figura 7-23),

usando uma transferncia de pulso de 135o para obter sinais positivos para CH e CH3 e negativo para CH2, permitiu caracterizar os C metnicos, metilnicos, incluindo um CH2 carbinlico, metlicos e, por diferena com o espectro de RMN de desacoplado, os quaternrios. O espectro de RMN de 1H (acetona-d6, 400 MHz, Figura 7-24) revelou os seguintes sinais : um em 5,25 (t, J = 3,5 Hz) referente ao H olefnico H-12; um em 3,67 (m; H-2); um em 3,55 e outro em 3,28 (ambos d; J = 10,8 Hz; H-23 geminais);
222
13

C totalmente

um em 3,39 (d; J = 9,5 Hz) referente ao H-3 em configurao axial e, conseqentemente com os grupos hidroxila nos C-2 e 3 em equatorial/alfa e beta respectivamente; um em 2,29 (dd; J = 3,4 e 12,1 Hz) ainda atribudo ao H-1, devido acoplamento deste com o outro H-1 em 1,43 e com o H-2 em 3,67 obsevado no espectro de COSY (C5D5N, 400 MHz, Figura 7-21); seis sinais em 1,17; 1,03; 0,94; 0,92; 0,80 e 0,72 (todos s) relativos aos 6 grupos metilas, confirmando que uma das 8 metilas, caracterstica de triterpeno de esqueleto oleaneno, continha um grupo OH e a outra havia se oxidado, formando um grupo carboxila. O mesmo espectro realizado em piridina deuterada no ficou suficientemente resolvido na rea dos H carbinlicos. Foi proposta a estrutura do cido arjunlico, ou cido 2,3,23-triidroxiolean-12-en-28-ico, confirmada atravs da comparao com os dados relatados na literatura (MAHATO & KUNDU, 1994; Tabela 7-5; Figura 7-22).

30

21 12 25 18

HO HO
23

COOH
9 27 6 15 28

OH

Figura 7-19- Espectro de RMN de 13C (50 MHz, C5D5N) da Substncia XLIV

223

Tabela 7-5- Dados dos espectros de RMN de 13C e DEPT135 (50 MHz, C5D5N) da
Substncia XLIV e do cido arjunlico
C/ MULTIPLICIDADE 1 (t) 2 (d) 3 (d) 4 (s) 5 (d) 6 (t) 7 (t) 8 (s) 9 (d) 10 (s) 11 (t) 12 (d) 13 (s) 14 (s) 15 (t) 16 (t) 17 (s) 18 (d) 19 (t) 20 (s) 21 (t) 22 (t) 23 (t) 24 (q) 25 (q) 26 (q) 27 (q) 28 (s) 29 (q) 30 (q)
a

SUBSTANCIA XLIV 47,8 69,0 78,3 43,8 48,3 18,7 33,4 39,9 48,1 38,6 23,9 122,6 145,0 42,4 28,4 24,1 46,8 42,1 46,6 31,1 34,4 33,0 66,6 14,5 17,7 17,5 26,3 180,4 *33,0 23,7

CIDO ARJUNLICO 47,1 68,9 78,7 43,5 48,4 18,6 33,1 40,1 48,5 38,5 23,8 123,5 144,1 42,4 28,3 23,9 47,0 43,5 46,3 30,7 34,2 33,0 67,2 14,0 17,6 17,2 26,1 178,6 32,9 23,7

(MAHATO & KUNDU, 1994); * Sinal observado na projeo de carbono do espectro 1 13 de Hx C HSQC

224

MARGRDMC836 289 (3.398) Cm ((231:317+368:418+140:198)) 100

487.7

Scan ES1.38e6

30

21 12 25 18

HO HO
23

COOH
9 27 6 15 28

OH

255.2

339.4

0 200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

320

330

340

350

360

370

380

390

400

410

420

430

440

450

460

470

480

490

m/z 500

Figura 7-20- Espectro de massas (ESI, modo negativo) da Substncia XLIV

Figura 7-21- Espectro de 1H-1H COSY (400 MHz, C5D5N) da Substncia XLIV
225

Figura 7-22- Espectro de 1Hx13C HSQC (400 MHz, C5D5N) da Substncia XLIV

Pyridine-d5 149.9000 123.7438 122.3179 135.8549 77.9867 68.7681 66.2115 48.0120 47.7334 47.5203 46.2584 41.8171 34.0489 33.0491 32.7132 28.1326 26.0184 23.8306 23.6421 23.5274 18.3895 17.3980 17.2095 14.2350 60 50 40 30 20 10

30

21 12 25 18

HO HO
23

COOH
9 27 6 15 28

OH

150

140

130

120

110

100

90

80

70

Figura 7-23- Espectro de 13C/DEPT135o (50 MHz, C5D5N) da Substncia XLIV

226

Figura 7-24- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia XLIV

227

7.6. Identificao das Substncias XLV, XLVI e XLVII em mistura

29 30 20 21 12 25 1 9 27 18 25 15 28 1 9 27 15 28 1 12 18 25 9 27 21 21 12 18 26 15

HO
23

HO
23

HO
23

-amirina

-amirina

lupeol

O extrato metanlico de folhas de S. densiflora, partio diclorometnica, aps sofrer vrias etapas de fracionamento em slica, forneceu a frao DMFgh78, 32,5 mg, que se apresentou como um slido branco e amorfo. A anlise do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz, Figura 7-28) revelou ser uma mistura de triterpenos devido aos seguintes sinais: seis sinais em 0,76; 0,79; 0,83; 0,94; 0,96 e 1,03 (todos s) referentes aos hidrognios de grupos metila; um sinal em 1,68 (s) referente a um grupo metila ligado a carbono sp2; um sinal em 2,38 (m) referente a um hidrognio allico (H-19); um sinal em 3,18 (dd, J = 11,1 e 5,1 Hz) relativo a um hidrognio carbinlico em configurao , e consequentemente o grupo hidroxila se encontra em configurao ; um sinal em 3,23 (dd, J = 10,2 e 5,9 Hz) de intensidade pequena (parcialmente encoberto pelo sinal em 3,18, com intensidade muito maior) tambm referente a hidrognio carbinlico em configurao ; um sinal em 4,56 (dd , J = 2,5 e 1,3 Hz) e em 4,69 (d, J = 2,4 Hz) referentes a H de dupla exocclica; um sinal em 5,18 (m) e outro em 5,13 (m) com intensidades bem menores que os dois primeiros, todos dois referentes a hidrognios olefnicos caractersticos de triterpenos com esqueleto 12-oleaneno e 12-urseno (AHMAD & RAHMAN, 1994). A anlise do espectro de RMN
13

C (CDCl3, 50 MHz, Figura 7-25) revelou

vrios sinais referentes a carbono sp2 em 150,8; 145,1; 139,3; 124,4; 121,7 e outro em 109,3. O conjunto de sinais em 150,8 e 109,3 foi atribudo a carbonos de ligao dupla exocclica caracterstica de triterpenos com esqueleto lupnico. O conjunto de
228

sinais em 145,1 e 121,7 foi atribudo a carbonos olefnicos caractersticos de triterpenos com esqueleto 12-oleaneno e o outro conjunto de sinais em 139,3 e 124,4 foi atribudo a carbonos sp2 caractersticos de triterpenos com esqueleto 12urseno. Foram ainda observados um sinal em 78,9, referente a carbono carbinlico, e vrios sinais entre 59,0 a 15,3. No foram observados todos os sinais referentes aos grupos metilas das trs substncias (Tabela 7-6) A frmula molecular C30H50O foi deduzida com base nos dados obtidos pelo espectro de massas, ionizao por impacto eletrnico (Figuras 7-26 e 7-27), o qual forneceu o pico do on molecular a m/z 426 [M]+ . Baseando-se nos dados espectrais obtidos e na comparao com dados da literatura (MAHATO & KUNDU, 1994; Tabela 7-6) foram propostas as estruturas do -amirina, -amirina e lupeol.

29 30 20 21 12 25 1 9 27 18 25 15 28 1 9 27 15 28 1 12 18 25 9 27 21 21 12 18 26 15

HO
23

HO
23

HO
23

Figura 7-25- Espectro de RMN 13C (50 MHz, CDCl3) da mistura das Substncias XLV,
XLVI e XLVII

229

Tabela 7-6- Dados do espectro de RMN

13

C (50 MHz, CDCl3) da mistura das

Substncias XLV, XLVI e XLVII; do lupeol, -amirina e -amirina

Carbono 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
a

Mistura 38,7 27,4 78,9 38,8 55,3 18,3 34,3 40,8 50,4 37,1 20,9 25,1; 124,4 e 121,7 38,0; 139,3 e 145,1 42,8 27,4 35,5 43,0 48,3 47,9 150,8 29,8 40,0 28,0 * 15,3 * 16,1 * 16,0 * 14,5 * 18,0 * 109,3 19,3 *

Lupeol 38,7 27,4 78,9 38,8 55,3 18,3 34,2 40,8 50,4 37,1 20,9 25,1 38,0 42,8 27,4 35,5 43,0 48,2 47,9 150,9 29,8 40,0 28,0 15,4 16,1 15,9 14,5 18,0 109,3 19,3

-amirina

-amirina

38,7 27,3 79,0 38,8 55,3 18,5 32,8 38,8 47,7 37,6 23,6 121,8 145,1 41,8 26,2 27,0 32,5 47,4 46,9 31,1 34,8 37,2 28,2 15,5 15,6 16,9 26,0 28,4 33,3 23,7

38,7 27,2 78,3 38,7 55,2 18,3 32,9 40,0 47,7 36,9 23,3 124,3 139,3 42,0 28,7 26,6 33,7 58,9 39,6 39,6 31,2 41,5 28,1 15,6 15,6 16,8 23,3 28,1 17,4 21,3

(MAHATO & KUNDU, 1994); * s foram observados estes sinais referentes aos grupos metilas

230

Abundncia relativa %

Tempo (min)

Figura 7-26- Cromatograma da mistura das Substncias XLV, XLVI e XLVII

(Tr= 33,3 min, e -amirina; Tr= 34,6 min lupeol)

29 20 21 12 18 25 1 9 27 26 15

HO
23

Figura 7-27- Espectro de massas, CG/EM-IE, da Substncia XLVII

(Tr = 34,6 min.)

231

Figura 7-28- Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) da mistura das Substncias
XLV, XLVI e XLVII
232

7.7. Identificao da Substncia XLVIII

29 21 18 19 1 12 15 10 7 23 27

25

sitosterol
HO

Do extrato metanlico, partio acetato de etila, da casca da raiz de S. densiflora, aps uma etapa cromatogrfica em slica, foi obtida a frao AMSCR6, 5,8 mg, a qual se mostrou como um slido branco amorfo. A anlise do espectro de RMN de 13C (50 MHz, CDCl3) revelou dois sinais caractersticos de C sp2 em 140,9 e 121,9, alm de evidenciar a presena de um C carbinlico em 72,0 e outros sinais caractersticos de esterol (FURUYA et al., 1987; TANDOM et al., 1990; Tabela 5-14). A anlise do espectro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, Figura 7-29) apresentou um sinal em 5,35 (dl, J = 4,8 Hz) caracterstico do H-6 dos fitoesteris, assim como os sinais entre 1,02-0,67 (todos s) referentes aos H metlicos. Em 3,58 (m) foi observado o sinal caracterstico do H-3 carbinlico. Baseando-se nos dados espectrais acima e dados da literatura (FURUYA et al., 1987; TANDOM et al., 1990; Tabela 5-14) foi proposta a estrutura do sitosterol.
TMS 5.3676 5.3438 3.6665 2.2895 2.2689 2.0464 1.8845 1.8242 1.6801 1.5998 1.4738 1.0098 0.9376 0.9060 0.8809 0.8463 0.8306 0.8184 0.7968 0.6808 0.0000 0.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

-0.5

Figura 7-29- Espectro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) da Substncia XLVIII

233

7.8. Identificao da Substncia XIX

Do extrato metanlico, partio diclorometnica, do caule de S. densiflora, aps vrias etapas cromatogrficas em placa preparativa de slica e sephadex LH-20, foram obtidos, da frao DMC62, 2,9 mg de uma substncia incolor de cheiro vanilado. A anlise do espectro de RMN de 1H (acetona-d6, 400 MHz, Figura 7-30) mostrou um conjunto de sinais caractersticos de anel benznico trissubstitudo em 6,99 (dd; J= 8,2 e 2,0 Hz, H-6), em 7,19 (d; J= 2,0 Hz, H-2) e em 6,81 (d; J= 8,2 Hz, H-5), alm de um sinal em 3,89 (s) referente a uma metoxila. A frmula molecular C8H8O4 foi deduzida com base nos dados obtidos pelo espectro de massas, ESI, modo negativo, medida no pico do on pseudo molecular a m/z 167 [M-H]-. Com base nos dados espectrais obtidos e nos dados relatados na literatura (SAKUSHIMA et al., 1995), a substncia foi identificada como cido vanlico.

COOH
1 3

OMe OH

Figura 7-30- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia XIX

234

7.9. Identificao da Substncia XLIX

O extrato metanlico, partio acetato de etila, da casca da raiz de S. densiflora, aps vrias etapas cromatogrficas em slica, sephadex LH-20 e CLAE, forneceu as fraes 11se4, R19df, 11xd4 e R19c, 15,0 mg. O extrato metanlico, partio acetato de etila, do caule forneceu a frao AMC3e e a partio diclorometnica forneceu a DMC865, 15,0 mg, as quais se apresentaram como um p branco em forma de cristais aciculares finos. A anlise do espectro de RMN de 1H (200 MHz, acetona-d6) mostrou um sinal em 7,12 (s) integrando para 2H. A frmula molecular C7H6O5 foi deduzida com base nos dados obtidos pelo espectro de massas, ESI modo negativo (Figura 7-31), medida no pico do on pseudo molecular a m/z 169 [M-H]-. Com base nos dados espectrais obtidos e nos dados relatados na literatura (TIAN et al., 2000), foi proposta a estrutura do cido glico.
MARGARETHR19df200103
MARGR19df 139 (1.511) Sm (Mn, 4x0.80); Cm (105:183-(7:94+211:310)) 100
169.0

Scan ES1.05e6

COOH
1 5 3

HO OH
%

OH

112.9 59.1 62.0

68.9 75.0

89.1

0 50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

m/z 300

Figura 7-31- Espectro de massas, ESI modo negativo, da Substncia XLIX

235

7.10. Identificao da Substncia L

O extrato metanlico da casca da raiz, partio acetato de etila, de S. densiflora, aps vrias etapas cromatogrficas em slica, sephadex LH-20 e CLAE, forneceu a frao 11se2, 3,5 mg, e o extrato metanlico das folhas, partio acetato de etila, forneceu a frao AMFSc5, 57,3 mg, as quais se apresentaram como um p branco em forma de cristais aciculares finos. A anlise do espectro de RMN de 1H (200 MHz, acetona-d6) mostrou um sinal em 7,25 (s) integrando para 2H e um sinal em 3,61(s) integrando para 6H . A frmula molecular C9H10O5 foi deduzida com base nos dados obtidos pelo espectro de massas, ESI modo negativo (Figura 7-32),medida no pico do on pseudo molecular a m/z 197 [M-H]-. Com base nos dados espectrais obtidos e nos dados da literatura (HUNG & YEN, 2002), foi proposta a estrutura do cido sirngico.
MARGR11pc 524 (3.087) Cm ((458:674+790:926+244:388)) 135.0 100
135.3 135.5

Scan ES1.57e7

COOH
1 5 3

MeO
165.0

OMe OH

197.1

153.0 113.0 167.3 183.0

0 100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

320

330

340

m/z 350

Figura 7-32- Espectro de massas, ESI modo negativo, da Substncia L

236

7.11. Identificao da Substncia LI

Do extrato metanlico, partio acetato de etila, da casca da raiz de S. densiflora, aps vrias etapas cromatogrficas em slica e sephadex LH-20, foram obtidos 100,0 mg deste cido, como p amarelo plido amorfo, das fraes R126d e R18a2. A anlise do espectro de RMN de 1H (CD3OD, 200 MHz) mostrou um sinal em 7,47 (s). A frmula molecular C14H6O8 foi deduzida com base nos dados obtidos pelo espectro de massas, ESI modo negativo, medida no pico do on pseudo molecular a m/z 301 [M-H]- (Figura 7-33). Com base nos dados espectrais obtidos e nos dados da literatura (MMMEL et al., 2000; NAWWAR et al., 1994), foi proposta a estrutura do cido elgico.
MARGR18a2neg 80 (1.493) Cm ((73:100+115:145+43:63)) 100
112.8

Scan ES9.59e5

OH
301.0 300.6

5'

OH
1'

7'

O
7

O HO

1 5

OH

168.8

255.3 164.9 134.8 150.3 114.5

291.0

283.2 178.9 183.3 214.9 247.0 269.5

311.1 325.4339.5

355.4

447.4 433.2 489.6

0 100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

m/z 600

Figura 7-33- Espectro de massas, ESI modo negativo, da Substncia LI

237

7.12. Identificao da Substncia LII

COOH

cido 2,4,6-trimetoxibenzico

MeO

OMe

OMe

Do extrato metanlico, partio diclorometnica, do caule de S. densiflora, aps vrias etapas cromatogrficas em placa preparativa de slica e sephadex LH-20, foram obtidos, da frao DMC5d5, 2,6 mg de uma substncia amarela de cheiro adocicado. A anlise do espectro de RMN de 1H (acetona-d6, 400 MHz, Figura 7-34) revelou um sinal em 7,33 (s), integrando para 2H, e dois sinais em 3,95 e 3,90 (singletos), integrando para nove hidrognios no total. O espectro de RMN de
13

(acetona-d6, 100 MHz, Figura 7-35) revelou somente quatro sinais, sendo dois referentes poro aromtica em 146,7 e 106,7 e dois referentes s metoxilas em 56,5 e 52,1. Se as posies das metoxilas fossem 3, 4 e 5, a metoxila 4 deveria ter um deslocamento em cerca de 60,0, caracterstica de metoxila ligada a carbono orto diortossubstitudo (ARRUDA, 1990), o que no foi observado no espectro. A frmula molecular C10H12O5, referente a 212 g/mol, no pode ser confirmada com base nos dados obtidos pelo espectro de massas devido este no haver revelado o pico do on pseudo molecular, tanto pelo tipo de ionizao por eletrospray quanto pelo APCI, no modo positivo ou negativo. Com base nos dados espectrais obtidos e de dados relatados na literatura (RUSSEL et al., 1990), foi proposta a estrutura do cido 2,4,6-trimetoxibenzico.

238

COOH OM e
3

Me O
5

OM e

Figura 7-34- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia LII

C OOH OM e
3

Me O
5

OM e

Figura 7-35- Espectro de RMN de 13C (100 MHz, acetona-d6) da Substncia LII
239

7.13. Identificao das Substncias LIII e LIV em mistura

CHO MeO OMe OMe CHO MeO OMe

OMe

2,4,6-trimetoxibenzaldedo

trans-2,4,6-trimetoxifenilpropenaldedo

Do extrato metanlico, partio diclorometnica, do caule de S. densiflora, aps vrias etapas cromatogrficas em placa preparativa de slica e sephadex LH-20, foram obtidos, da frao DMC5qd, 8,3 mg de um p amorfo amarelo, de cheiro adocicado. A anlise do espectro de RMN de 1H (acetona-d6, 400 MHz, Figura 7-36) revelou um sinal em 9,80 (s) e um em 9,62 (d; J= 7,8 Hz), caractersticos de H aldedicos; dois sinais atribudos a uma poro fenilpropenodica com os H olefnicos em configurao trans, devido apresentarem valores altos de J em 7,55 (d; J= 15,8 Hz) e 6,67 (dd; J= 15,8 e 7,6 Hz); dois sinais em 7,22 e 7,07 (singletos) referentes aos hidrognios aromticos, qumica e magneticamente equivalentes; dois sinais em 3,97 e 3,96 (singletos intensos) relativos aos H dos grupos metoxilas. A constituio da mistura foi confirmada com base nos dados obtidos pelo espectro de massas, ESI modo positivo, o qual apresentou trs picos relativos aos respectivos ons pseudo moleculares a m/z 283 [M+H]+, referente a uma substncia ou aduto no identificado; m/z 223 [M+H]+ e m/z 197 [M+H]+ das respectivas substncias em questo com frmulas moleculares C12H14O4 e C10H12O4. Com base nos dados espectrais obtidos e nos dados de substncias relatadas na literatura (NEVILLE, 1972), foi proposta a estrutura do trans-2,4,6trimetoxifenilpropenaldedo e do 2,4,6-trimetoxibenzaldedo.

240

Acetone-d6 9.7994 9.6304 9.6114 7.5708 7.5313 7.2225 7.0719 6.7079 6.6889 6.6683 6.6494 2.0400

CHO MeO OMe

OMe CHO MeO OMe

OMe

1.00 10 9 8

1.29

2.11 1.25 7 6 5 4 3 2 1 0

Figura 7-36- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6) da mistura das

Substncias LIII e LIV

241

7.14. Identificao da Substncia LV

HOH2C

CHO

5-hidroximetil-2-furfuraldedo

Do extrato metanlico, partio diclorometnica, do caule de S. densiflora, aps vrias etapas cromatogrficas em slica flash, placa preparativa de slica e sephadex LH-20, foram obtidas as fraes DMC698 e DMC7Ec, 10,0 mg, sob a forma de um leo amarelo. A anlise do espectro de RMN de 1H (CDCl3, 400 MHz, Figura 7-38) revelou um sinal em 9,60 (s, 1H) caracterstico de H aldedico; dois sinais em 7,21 e 6,52 (d, 3,6 Hz, 1H cada) peculiares de H ortoacoplados de um penta heterociclo aromtico, podendo ser do tipo furano ou pirrol (KEMP, 1986; Tabela 7-7) e um sinal em 4,73 (s, 2H). Este mesmo sinal, no espectro realizado com acetona (acetona-d6, 400 MHz, Figura 7-40), se modificou em um sinal do tipo dubleto em 4,63 (6,0 Hz, 2H) e 4,80 (t, 6,0, 1H), mais tarde atribudos aos H do grupo hidroximetlico e hidroxila respectivamente. A anlise do espectro de RMN
13

C (CDCl3, 50 MHz, Tabela 7-8, Figura

7-42) mostrou um sinal em 178,1 que, a princpio, poderia ser atribudo a uma carbonila carboxlica, porm, consultando-se uma tabela de valores de deslocamento para C (SILVERSTEIN, 1991; Tabela 7-7), tambm se encaixaria como uma carbonila aldedica conjugada pertencente a um 2-furano ou 2-pirrolcarboxialdedo, fato mais condizente com o sinal de H aldedico observado no espectro de RMN de 1H. Alm deste, foram observados quatro sinais relativos a C sp2 e um sinal em 57,5, o qual poderia ser referente a um grupo metoxila, porm sua correlao, no espectro de HSQC (acetona-d6, 400 MHz), com o H em 4,73 descartou esta hiptese, devido o sinal estar muito desblindado para ser do tipo metoxlico. As correlaes observadas nos espectros de HSQC e HMBC (acetona-d6, 400 MHz, Figura 7-39, Figura 7-43) contriburam para a definio dos valores de deslocamento imputados aos respectivos tomos da molcula.

242

A frmula molecular C6H6O3 foi deduzida com base nos dados obtidos pelo espectro de massas, EM/CG-IE (Figura 7-41), o qual apresentou o pico relativo ao respectivo on molecular a m/z 126 [M]+. A estrutura da substncia LV foi confirmada com base nos dados espectrais, a partir da biblioteca de compostos do CG e de dados da literatura (KULKARNI et al., 1989) como o 5-hidroximetil-2-furanocarboxaldedo ou 5-hidroximetil2-furfuraldedo. Segundo dados do Chemical Abstracts (1987-1991), esta substncia j foi isolada de razes de Cirsium chlorolepis (Asteraceae), entre outras plantas. precursora de aminocidos e protenas; produto de degradao de glicose em infuso e, por isto, indicador de qualidade do caf. Tambm uma das substncias responsveis pelo aroma de biscoitos assando e chocolate. O furfuraldedo um produto caracterstico de pentoses quando tratadas com cido (MORRISON & BOYD, 1972; Figura 7-37). Como o extrato no foi submetido a tratamento semelhante, talvez a substncia identificada seja produto de degradao natural de hexoses ou pentoses, muito abundantes na planta.

(C5H8O4)n pentosanas

H2O, H3O+

CHO (CHOH)3 CH2OH pentose

3 H2O

O furfural

CHO

Figura 7-37- Reao de degradao cida de pentoses (MORRISON & BOYD, 1972)

243

4 5

3 2

O
furano

N H
pirrol

CHO

CHO

furano-2-carboxaldedo
13

pirrol-2-carboxaldedo

Tabela 7-7- Dados de deslocamentos de RMN

respectivos 2-carboxaldedos a J J (Hz) furano J (Hz) pirrol Posio 13C furano 1H furano 13C pirrol 1H pirrol
13

C, 1H e J para o pirrol, furano e

(1-2)

(1-3)

(2-3) 1,3-2,0

(2-4) 0-1 1-2 5

(2-5) 1-2 1,5-2,5 CHO

(3-4) 3,13,8 3-4

2-3 2 144,0 7,4 118,0 6,5 153,3

2-3 3 111,0 6,3 108,0 6,1 121,7

2-3 4

C furano2112,9 148,5 178,2

carboxaldedo 13C pirrol-2carboxaldedo

a

134,0

123,0

112,0

129,0

178,9

(SILVERSTEIN, 1991; KEMP, 1986)

244

HOH2C

CHO

Figura 7-38- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) da Substncia LV

Figura 7-39- Espectro de 1Hx13C HMBC (400 MHz, acetona-d6) da Substncia LV

245

Figura 7-40- Espectro de RMN 1H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia LV

246

HOH2C

CHO

Figura 7-41- Espectro de massas, EM/CG-IE, da Substncia LV

Rampa: 100/1/7/250/5; tempo de reteno do aldedo: 5,4 minutos

Tabela 7-8- Dados dos espectros de RMN de

Posio 2 3 4 5 CHO CH2OH CH2OH C 153,4 123,7 110,2 162,9 178,1 57,5 9,59 (s)

13

C (50 MHz, CDCl3), 1H (400 MHz,

acetona-d6) e 1Hx13C HMBC (400 MHz, acetona-d6) da Substncia LV H (J em Hz) 7,38 (d, 3,5) 6,58 (d, 3,5) HMBC H3-C4, C2, C5 H4-C3, C2, C5 CHO-C2 CH2OH-C4 e C5 CH2OH- C5

4,63 (d, 6,0) 4,80 (t, 6,0)

247

Acetone-d6 162.9082 110.1615 178.0676 153.3946 123.7312 57.4885 29.8000 50 40 30

HOH2C

CHO

190

180

170

160

150

140

130

120

110

100

90

80

70

60

Figura 7-42- Espectro de RMN 13C (50 MHz, CDCl3) da Substncia LV

Figura 7-43- Espectro de 1H 13C HSQC (400 MHz, acetona-d6) da Substncia LV

248

7.15. Identificao das Substncias LVI e LVII em mistura

HO HO OH HO OH OH CO O
5

R1= H e R2= -OH = casuarinina ou 1-C,2,3-O-[(S)hexaidroxidifenoil]-4,6-O-[(S)-hexaidroxidifenoil]-5O-galoil--D-glucosdeo R2= H e R1= -OH = stachyurina ou 1-C,2,3-O-[(S)hexaidroxidifenoil]-4,6-O-[(S)-hexaidroxidifenoil]-5O-galoil--D-glucosdeo

OC O
1

O CO

O OC CO

R1 R2 OH OH

HO HO OH

HO OH

OH OH

O extrato metanlico de casca da raiz, de caule e folhas de S. densiflora, partio acetato de etila, aps vrias etapas cromatogrficas em slica e sephadex LH20, forneceu as fraes R11xf, R19hj, R12j, R12h, R127, R20H e AMC6w, 130,0 mg, sob a forma de p marrom avermelhado cristalino brilhante. A frao R20H foi eluda com AcOEt/HAc 95:5 em CCDA e revelada com vanilina sulfrica, originando uma mancha verde; com FeCl3, uma mancha azul escura. A anlise do espectro de RMN de 1H da frao R19hj (200 MHz, CD3OD) revelou sinais caractersticos de tanino hidrolisvel: um sinal em 7,06 (1 singleto para 2H, grupo galoil) e trs sinais em 6,80; 6,48 e 6,36 (3 singletos, 1H cada, referente ao grupo hexaidroxidifenoil-HHDP), e sinais de H carbinlicos entre 5,51-4,01, sendo o sinal em 5,50 (d; J = 4,8 Hz) atribudo ao H anomrico em configurao (conseqentemente OH em ). Uma semana aps, sem retirar-se a amostra do tubo de ressonncia, o espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, Figura 7-46) revelou ainda um sinal em 6,00 (d; J = 1,9 Hz), o qual foi atribudo ao H anomrico em configurao (conseqentemente OH em ), devido constante de acoplamento pequena. Segundo a literatura (MULLER, 1994; SPENCER et al., 1990), os taninos so muito sensveis ao solvente em que se encontram, e a solvatao tem papel muito importante na determinao das propriedades dos polifenis, podendo a unidade de acar assumir conformaes diferentes, o que explicaria o aparecimento de valores de deslocamentos e J diferentes para os hidrognios carbinlicos, mas no um sinal de H anomrico em configurao se revelando posteriormente, o qual se manteve no
249

espectro, mesmo depois de 2 semanas passadas no tubo, e em maior proporo do que o sinal do H anomrico referente configurao . Aps seca a amostra anterior e redissolvida em acetona-d6/D2O (Figura 7-47), o fenmeno de mistura tambm ocorreu, ficando em maior proporo os sinais referentes substncia de hidrognio anomrico em configurao . Mais tarde, foi realizado o espectro da frao AMC6w, sendo esta identificada como a casuarinina pura (400 MHz, acetona-d6/D2O, Figura 7-48). A anlise do espectro de RMN de
13

C (50 MHz, CD3OD, Figura 7-45,

Tabela 7-9), feita no mesmo dia em que se fez o primeiro espectro de RMN de 1H em CD3OD, porm 8h depois, revelou 4 sinais de carbonila de ster (sendo que o sinal em 167,6 estava de intensidade duplicada), diversos sinais entre 147,6-105,5 e 9 sinais de C carbonlicos, caracterizando uma mistura. O espectro de RMN de
13

C/DEPT135

(50 MHz, CD3OD, Figura 7-44, Tabela 7-9), realizado uma semana depois, revelou somente 6 sinais referentes ao acar, sendo o de valor mais desblindado, 79,7, atribudo a C-2, caracterstica de taninos C-glicosdicos com o centro anomrico em configurao . Apenas um sinal referente a CH2 em 65,1, com o restante relativo a CH, incluindo-se 4 sinais entre 110,2-106,8 de CH aromtico. Foi feito um espectro de RMN de
13

C/DEPT135 (50 MHz, acetona-d6, Figura 7-51), de outra frao, R11xe,

identificada como a Substncia LVI pura e somente 6 sinais de acar foram observados, sendo o de valor mais desblindado, 76,5, atribudo a C-2, caracterstica de taninos C-glicosdicos com o centro anomrico em configurao . A hiptese para explicar tal fato que talvez possa ter ocorrido uma reao de epimerizao da casuarinina (j que o centro anomrico se encontra livre de acilao) devido presena de impurezas cidas no solvente deuterado, ou mesmo uma solvlise, formando-se como intermedirio um carboction benzlico no C-1 (segundo QUIDEAU & FELDMAN (1996), esta espcie tem sido sugerida como intermedirio na gerao de taninos elgicos C-glicosdicos substitudos na posio 1 por flavan-3-ol), sendo este atacado na face mais estvel e desimpedida pelo grupo hidroxila da gua e a stachyurina, com a hidroxila em , seja um artefato (proposta de reao no Esquema 7-1), pois ela no foi encontrado em outras fraes dos extratos pesquisados. Segundo YOSHIDA et al. (1991), a vescalagina e stachyurina sofreram solvlise em condies brandas (37 C, 12 h), quando tratadas com MeOH/F3CCOOH
250

ou MeOH, transformando-se nos respectivos produtos C-1 metoxilados, mantendo-se a configurao . J a castalagina e casuarinina no foram afetadas sob as mesmas condies (100 h depois ou 4 dias). A explicao para tal fato baseou-se no menor impedimento estrico na posio de C-1 e/ou a estabilizao do grupo -hidroxila de C-1 por ligao hidrognio com o grupo hidroxila vizinho da parte HHDP no C-1/O-2/O3. No nosso caso, a exposio ao solvente/gua foi maior, o que pode justificar a reao ocorrida. O grupo HHDP apresenta atropoisomerismo. Sua configurao absoluta pode ser determinada atravs da anlise do espectro de dicrosmo circular do tanino correspondente, o qual deve ser previamente metilado e depois degradado por metanlise ou por via enzimtica: o efeito Cotton positivo corresponde configurao R e o negativo devido configurao S. Estes efeitos Cotton esto associados s bandas do espectro de UV originadas da conjugao do grupo bifenil (OKUDA et al., 1982). A teoria de Schmidt e Haslam, para a estereoqumica de taninos elgicos que suportam grupos HHDP nas posies 2,3- e 4,6- do esqueleto de acar na conformao 4C1, o mais termodinamicamente estvel, que os (S)-atropismeros so predominantes (FELDMAN & SMITH, 1996). Os deslocamentos qumicos atribudos aos hidrognios e carbonos foram baseados na interpretao das correlaes obtidas nos espectros de 1Hx13C de HMBC e HSQC (Figura 5-49, Figura 7-52, Tabela 7-11). A frmula molecular C41H28O26 foi deduzida com base nos dados obtidos pelo espectro de massas, ESI, modo negativo (Figura 7-50), medida no pico do on pseudo molecular a m/z 935 [M-H]-. Alm deste, o espectro apresentou fragmentos caractersticos da perda de cido glico [M-H-152]- e molculas de HHDP [M-H-302]-. Baseando-se nos dados espectrais obtidos e na comparao com dados da literatura (OKUDA et al., 1983; OKUDA et al., 1989; Tabela 7-9, Tabela 7-10), foram propostas as estruturas da casuarinina, ou 1-C,2,3-O-[(S)-hexaidroxidifenoil]-4,6-O-[(S)hexaidroxidifenoil]-5-O-galoil -D-glucosdeo, e da stachyurina, ou 1-C,2,3-O-[(S)hexaidroxidifenoil]-4,6-O-[(S)-hexaidroxidifenoil]-5-O-galoil -D-glucosdeo.

251

Tabela 7-9- Dados dos espectros de RMN 13C e DEPT135 (50 MHz) das Substncias
LVI e LVII e da casuarinina e stachyurina
de RMN
13

de RMN de RMN
13

Posio

C/DEPT-135 (CD3OD)

C
a

13

C/DEPT-135 (CD3)2CO

de RMN

13

C
a

stachyurina

casuarinina

Substncia LVII Glicose C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C=O Galoil C-1 C-2, -6 C-4 HHDP e g galoil C-3, 5 C-3, 5 143,3; 147,6; 145,1; 145,8; 146,1 (3); 140,7; 146,8 (2) HHDP C-1, 1 C-2, -2 C-4, -4 C-6, 6
a

Substncia LVI 65,0 81,0 70,9 73,3 72,0 64,5 168,9; 168,8; 168,4; 165,7; 165,2 67,3 76,5 69,6 73,9 70,9 64,3 71,1 76,7 67,8 74,3 69,8 64,5 170,3; 169,5; 169,2; 166,4; 165,0 125,4 109,7 110,5 139,6

63,2 79,7 67,3 73,9 69,8 65,1 167,6 (2); 169,9; 170,8; 171,4

125,5 110,2 e 108,9 140,7

125,2 110,1 (2) 139,1

144,5; 146,5; 145,9 (2); 145,7; 145,2 (2); 144,4; 144,1; 143,4 127,0; 127,9; 127,0; 122,8; 120,9 115,7; 116,0 (2); 115,2 136,7; 137,8; 135,9; 135,0 108,6; 107,3; 105,7; 119,1* 108,0; 106,7; 104,9

145,0; 146,8; 146,4 (3); 145,7 (2); 145,2; 144,0; 144,1 127,5; 128,0; 121,4; 121,0 116,3; 116,5; 116,1; 115,4 137,3; 138,8; 136,3; 135,3 108,7; 107,5; 105,7; 117,4*

127,3; 127,9; 127,1; 121,0 118,3; 117,3 136,2; 138,2; 137,5 107,4; 106,8

(50 MHz, (CD3)2CO; OKUDA et al., 1983; OKUDA et al., 1989); *Carbono ligado ao C da glicose

252

Tabela 7-10- Dados dos espectros de RMN 1H (400 MHz, em ppm e J em Hertz)
das Substncias LVI e LVII e da casuarinina e stachyurina Substncia Posio stachyurina a LVII (CD3OD) casuarinina a Substncia LVI pura (acetonad6/D2O) Mistura LVI + LVII (acetonad6/D2O)

Glicose 1 2 3 4 5 4,93 (d; 2,0) 4,86 (t; 2,0) 4,98 (t; 2,0) 5,62 (dd; 2,0 e 9,0) 5,36 (dd; 3,0 e 9,0) 4,84 (dd; 3,0 6 e 13,0) 4,02 (d; 13,0) Galoil H-2 e 6 HHDP H-6 e 6
a

6,00 (d; 1,9) 5,26 (m) 5,26 (m) 5,53 (dd; 9,7 e 2,0) 5,34 (dd; 9,7 e 3,9) 3,95 (d; 13,2) 5,00 (dd; 13,2 e 3,9)

5,64 (d; 5,0) 4,67 (dd; 2,0 e 5,0) 5,39 (sl) 5,39 (sl) 5,39 (sl) 4,18 (dd; 3,0 e 13,0) 4,06 (d; 13,0) 7,12 (s) 6,49 (s) 6,56 (s) 6,78 (s)

5,53 (d; 5,0) 4,58 (dd; 2,0 e 5,0) 5,39 (m) 5,39 (m) 5,26 (dd; 8,7 e 2,6) 4,80 (dd; 13,7 e 3,8) 4,02 (d; 13,1)

5,63 (d; 5,0) 5,48 (m) 5,48 (m) 5,50 (dd; 2 e 8,7) 5,36 (dd; 3,1 e 8,7) 4,90 (dd; 3,5 e 13,3) 4,03 (d; 13,3) 7,14 (s) 6,53 (s) 6,58 (s) 6,88 (s)

7,14 (s) 6,50 (s) 6,55 (s) 6,82 (s)

7,12 (s) 6,38 (s) 6,54 (s) 6,85 (s)

7,13 (s) 6,53 (s) 6,58 (s) 6,88 (s)

(200MHz, (CD3)2CO; OKUDA et al., 1983; OKUDA et al., 1989)

253

Me thanol-d4 110.170 108.974 107.368 106.778 69.797 63.225 73.886 79.737 67.290 65.085 49.000 60 55 50
Methanol-d4 147.225 146.504 145.487 144.783 143.267 140.341 137.203 135.867 127.583 126.985 126.731 125.158 124.789 120.782 119.717 117.963 117.021 116.324 110.432 109.089 107.573 105.139 171.111 170.472 169.562 167.243 80.032 77.942 74.697 71.772 70.731 69.961 67.929 67.609 65.348 65.077 63.520 49.000 50 70 60

HO HO

OH

HO

OH OH

CO O
5

OC O
1 OH

O HO HO OH CO

O OC CO

H OH OH

HO OH

OH OH

115

110

105

100

95

90

85

80

75

70

65

Figura 7-44- Espectro de RMN de C/DEPT135 (50 MHz, CD3OD) da Substncia

13

LVII

Observao: espectro obtido com amostra depois de uma semana no tubo de RMN

170

160

150

140

130

120

110

100

90

80

Figura 7-45- Espectro de RMN de C (50 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias
13

LVI e LVII

Espectro obtido no mesmo dia em que se colocou a amostra no tubo, porm 8h depois da preparao.

254

Figura 7-46- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias
LVI e LVII

255

Figura 7-47- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6/D2O) da mistura das

Substncias LVI e LVII
256

Figura 7-48- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, acetona-d6/D2O) da Substncia LVI

257

Figura 7-49- Espectro de 1Hx13C HMBC (400 MHz, CD3OD) da Substncia LVII Tabela 7-11- Dados dos espectros de RMN 1Hx13C HMBC (400 MHz, CD3OD) e
HSQC (400 MHz, acetona-d6/D2O) da mistura das Substncias LVI e LVII
Posio 1 2 3 4 5 6
H CD3OD
1

Hx C HMBC 171,4 (C=O) 67,3 (C3) 170,8 (C=O) 74,0 (C4) 167,6 (C=O)

13

H Acetona-

d6/D2O 5,63 (d; 5,0) 5,48 (m) 5,48 (m) 5,50 (dd; 2,0 e 8,7) 5,36 (dd; 3,1 e 8,7) 4,03 4,90

Hx C HSQC 67,3 69,6 73,9 70,9 64,3

13

6,00 (d; 1,9) 5,26 (m) 5,26 (m) 5,53 (dd; 9,7 e 2,0) 5,34 (dd; 9,7 e 3,9) 5,00 (dd; 13,2 e 3,9)

258

MARGR19hj 6 (0.232) Sm (Mn, 4x0.80); Cm (5:38-51:137) 100

935.4

Scan ES1.05e5

HO HO

OH

HO

OH OH

CO O
5

OC O
1

O HO HO OH CO

O OC CO

R1 R2 OH OH

HO OH

OH OH

957.4

633.3 481.3

783.4

965.5

0 400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950

1000

1050

1100

1150

m/z 1200

Figura 7-50- Espectro de massas, ESI modo negativo, da mistura das Substncias
LVI e LVII

Figura 7-51- Espectro de RMN de 13C/DEPT135 (50 MHz, acetona-d6) da Substncia

LVI
259

Figura 7-52- Espectro de 1Hx13C HSQC (400 MHz, acetona-d6/D2O) da mistura das
Substncias LVI e LVII

H2O
5 3 1

OH2 H
1 1

H OH H+

H OH 2
+

OH H

Esquema 7-1- Proposta de reao ocorrida com a Substncia LVI para troca de
configurao do centro anomrico

260

7.16. Identificao das Substncias LVIII, LXVIII e LIX em mistura

HO HO
OH HO HO HO HO OH CO CO O O
3 6

OH

HO

OH OH

OH HO O
1

CO
OH OH OH

OC O
5 1 R1

O O
OH OH OH

HO

OH

HOOC HOOC HOOC

HO HO OH HO

O CO

O OC CO

R2 OH OH

1-C-flavogalonil-4,6-O-(S)hexaidroxidifenoil--D-glucopiranosdeo

OH

OH OH OH

R1 = H e R2 = -OH castalagina ou 1-C,2,3,5-O(nonaidroxitrifenoil)-4,6-O-(S)-hexaidroxidifenoil--D-glucosdeo R1 = -OH e R2 = H vescalagina 1-C,2,3,5-O(nonaidroxitrifenoil)-4,6-O-(S)-hexaidroxidifenoil--D-glucosdeo

O extrato metanlico da casca da raiz e do caule de S. densiflora, partio acetato de etila, e o extrato metanlico de caule, partio n-butanol, aps vrias etapas cromatogrficas em slica e sephadex LH-20, forneceram as fraes R19hg, R126a, R12i7, R20F, AMC6z e BMCl, 200,0 mg, sob a forma de p marrom avermelhado cristalino brilhante. O eluente usado em CCDA foi AcOEt/HAc 95:5. Revelada com vanilina sulfrica, a frao originou uma mancha verde e com FeCl3, uma mancha azul escura. A anlise do espectro de RMN de 1H (400 MHz, (CD3)2CO/D2O, Figura 7-53) da frao R20F revelou sinais caractersticos de tanino hidrolisvel: 3 sinais em 6,70, 6,67 e 6,55 (3 singletos, 1H cada, podendo pertencer a um grupo hexaidroxidifenoil (HHDP) e outro nonaidroxitrifenoil ou valeonil), e sinais de H carbinlicos entre 5,61-3,94, sendo o sinal em 5,60 (d; J = 4,6 Hz) atribudo ao H anomrico de um tanino C-glicosdico em configurao (OH em configurao ). Este espectro no mudou aps a amostra ficar uma semana dissolvida dentro do tubo de RMN. A anlise do espectro de RMN de
1

H (400 MHz, CD3OD, Figura 7-54, Tabela 7-13) da frao R19hg revelou os mesmos

sinais da frao mencionada acima, porm, uma semana depois da amostra estar no tubo, surgiu um sinal em 5,92 (d; J = 8,1 Hz), relativo ao H anomrico de tanino
261

hidrolisvel (acar na forma cclica; LATT & KOLODZIEJ, 2000) em configurao , ou, segundo YOSHIDA et al. (1991) seria o sinal referente ao H-5 do epmero da castalagina, a vescalagina, alm de observarmos outros sinais se duplicando, como os de deslocamentos qumicos em 3,97 e 3,95 (ambos d; J = 13,3 e 11,5 Hz; H-6 do acar) e os referentes aos hidrognios aromticos (6 singletos). Aps a amostra ser retirada do tubo, seca e dissolvida novamente em acetona, seu espectro revelou sinais referentes aos dois/trs taninos, porm com a Substncia LVIII em maior proporo. Pode ter ocorrido hidrlise das ligaes steres, j que os taninos hidrolisveis so susceptveis hidrlise cida, alcalina ou enzimtica (KHAMBABAEE & REE, 2001), e ciclizao do acar, formando um artefato que menos solvel ou menos estvel em acetona, o qual denominamos Substncia LIX (proposta de formao no Esquema 7-3) e tambm ter ocorrido epimerizao, como foi observado com a casuarinina, formando a Substncia LXVIII. Segundo VIVAS et al. (1995), a castalagina ligeiramente mais estvel que a vescalagina (471,42 versus 472,98 kJ mol -1) devido ligao de hidrognio que se forma atravs da funo alcolica enantiomrica na posio 1, a qual no possvel na vescalagina, isso explicaria porque a castalagina/casuarinina no reagiram, quando submetidas metanlise (37 C, 100 horas), e a vescalagina/estaquiurina reagiram (em meio cido em 6 h, 100 %; em meio neutro, em 100 h, 95 %; YOSHIDA et al.,1991), produzindo o composto C-1-OMe com reteno de configurao. Quanto ao espectro de RMN de 1H, ocorrem duas principais diferenas. Na castalagina (Tabela 7-13), o sinal de H-1 e H-3 so mais desblindados do que na vescalagina. Nas duas substncias, estes hidrognios se encontram mesma distncia do centro do anel aromtico (3,50 ), mas na castalagina H-1 est 0,53 acima deste plano (dentro do cone de desblindagem) enquanto que na vescalagina est abaixo 1,1 (dentro da rea de blindagem). Na castalagina, H-3 mais desblindado por se encontrar mais prximo do grupo OH-1, resistindo ao forte efeito anisotrpico presente. A anlise do espectro de RMN de
13

C (50 MHz, CD3OD, Tabela 7-13),

obtido minutos depois em que se fez o primeiro espectro de H em CD3OD, revelou 4 sinais de carbonila de ster entre 170,5-166,4; diversos sinais entre 146,5-108,2 e 6 sinais referentes a C carbonlicos. O espectro de RMN de
13

C/DEPT135 (50 MHz,

CD3OD, Figura 7-55), realizado uma semana depois, revelou 9 sinais referentes aos C
262

carbinlicos do acar, com o carbono mais desblindado em 76,7, caracterstica de C-2 de taninos C-glicosdicos com o H anomrico em configurao (no caso, a vescalagina); os trs sinais entre 109,6-108,2 apareceram duplicados entre 110,4107,6 referentes aos CH aromticos. No espectro de outra amostra, R12i7, realizado em acetona-d6, esse fenmeno no ocorreu, revelando-se no espectro de RMN de
13

(50 MHz, acetona-d6, Figura 7-56) cinco sinais de carbonila de ster entre 169,5164,6 e somente 6 sinais de C referentes ao acar, sendo o de valor mais desblindado, 74,7, atribudo a C-2, caracterstica de taninos C-glicosdicos com o H anomrico em configurao , o mesmo ocorrendo com o espectro de RMN de
13

C/DEPT135 (50 MHz, (CD3)2CO, Figura 7-59), realizado uma semana depois. Os deslocamentos qumicos atribudos aos hidrognios e carbonos foram

baseados na interpretao das correlaes obtidas nos espectros RMN 1Hx13C HMBC e HSQC (Figura 7-57, Figura 7-58, Tabela 7-12). A frmula molecular da Substncia LVIII/LXVIII, C41H26O26, foi deduzida com base nos dados obtidos do espectro de massas, ESI/EM (Figura 7-60), modo negativo, medida no pico do on pseudomolecular a m/z 933 [M-H]-. No modo positivo, o pico de maior intensidade foi o relativo ao aduto de sdio de m/z 957 [M+Na]+, confirmando a massa molecular (Figura 7-61). Foram realizados espectros da amostra R19hg, contendo a mistura dos taninos, no momento da redissoluo e aps ficar algumas semanas dissolvida em metanol. O espectro de massas da mistura (Figura 7-62) revelou um pico de maior intensidade a m/z 933 [M-H]-, referente Substncia LVIII, e outro de menor intensidade a m/z 969 [M-H]-, referente Substncia LIX, de frmula molecular C41H30O28 (proposta de formao no Esquema 7-3). O espectro da mistura, depois de algumas semanas (Figura 7-63), mudou completamente, apresentando um pico de maior intensidade a m/z 963 [M-H+30]-, outro a m/z 995 [MH+62]- e o relativo ao pico do on pseudomolecular a m/z 933 [M-H]- foi mnimo, indicando produtos de solvlise da Substncia LVIII (proposta de reao ocorrida Esquema 7-2), pois os taninos hidrolisveis podem ter suas ligaes steres quebradas pelo metanol temperatura ambiente em pH neutro (MUELLER-HARVEY, 2001; Esquema 5-2). Tambm pode ocorrer metanlise em presena de MeOH 90 %, a 37 C e pH 5-6 (HASLAM et al., 1961). Foram realizados espectros de massas, ESI modo negativo (Figura 7-60), das Substncias LVI e LVIII puras, separadamente, e a anlise
263

dos espectros demonstrou picos muito semelhantes, referentes aos fragmentos, com diferenas de intensidade de uma ou duas unidades de massa, valendo ressaltar que a Substncia LVI, casuarinina, originou um pico mais intenso relativo ao cido elgico, m/z 301, que a Substncia LVIII. Baseando-se nos dados espectrais obtidos e nos relatados pela literatura (VIVAS et al., 1995), as estruturas foram propostas como castalagina ou 1-C,2,3,5-O(nonaidroxitrifenoil)-4,6-O-(S)-hexaidroxidifenoil--D-glucosdeo; vescalagina e o 1-Cflavogalonil-4,6-O-(S)-hexaidroxidifenoil--D-glucopiranosdeo.
HO HO CO OC O Me H O HO HO OH HO OH HO HO OH HO HO HO HO OH HO HO OH HO OH OH OH CO O CO HO O O O OH HO OH HO OH OH OH MM = 964 OH OH OH HO CO O CO O
Me
5

OH HO

OH OR OH
5

OR

OH

O
1

HO OH HO OH OH OH

HO MeOOC

OH OH OH

OC CO

OH HO OH OH OH

OC O CO

OH

HO

O O O

O OH

OH H O MeOOC

OC

OH

HO MeOOC MeOOC

OC

MM = 996

Esquema 7-2- Proposta de formao dos adutos de massa 964 e 996 a partir da
Substncia LVIII
264

Figura 7-53- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, (CD3)2CO/D2O) da Substncia LVIII

265

Figura 7-54- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias
LVIII e LXVIII
266

110.0473 108.6378 108.4248 107.9495 107.6218

76.6884

74.7464

71.9194

69.7069 69.4201 67.4781 66.6177 65.6753 63.1023

Methanol-d4

115

110

105

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

Figura 7-55- Espectro de RMN de C/DEPT135 (50 MHz, CD3OD) da mistura das
13

Substncias LVIII e LXVIII

HO HO

OH

HO

OH OH

CO O
5

OC O
1 H

O HO HO OH HO

O CO

O OC CO

OH OH OH

OH OH OH

Figura 7-56- Espectro de RMN de 13C (50 MHz, acetona-d6) da Substncia LVIII
267

Figura 7-57- Espectro RMN 1Hx13C HMBC (400 MHz, CD3OD) da mistura das
Substncias LVIII e LXVIII

HO HO

OH

HO

OH OH

CO O
5

OC O
1 H

O HO HO OH HO

O CO

O OC CO

OH OH OH

OH OH OH

Figura 7-58- Espectro RMN 1Hx13C HSQC (400 MHz, (CD3)2CO/D2O) da Substncia LVIII

268

Tabela 7-12- Dados dos espectros de RMN 1H e RMN 1Hx13C HMBC (400 MHz,
CD3OD) das Substncias LVIII e LXVIII e da castalagina e vescalagina
H Glicose 1 2 3 4 5
H H
a

H
b

Correlao HMBC 167,7 (C=O)

castalagina

LVIII 5,60 (d; 4,8) 5,03 (m) 5,03 (m) 5,17 (t; 7,1) 5,33 (d; 6,4) 5,43 (dl;

vescalagina

LXVIII 5,04 (sl) 5,04 (sl) 5,38 (d; 8,2) 5,58 (dl; 8,7) 5,92 (d; 8,1) 3,95 (d; 11,5) 5,08 (dd; 2,6 e 13,2)

5,69 (d; 4,8) 5,00 (d) 5,02 (d) 5,12 5,61

4,91 (d; 2,0) 5,28 (dd, 2,0 e 2,5) 4,57 (dd; 2,0 e 7,0) 5,22 (t; 7,0) 5,63 (ddd; 1,0; 2,5 e 7,0) 4,04 (dd; 1,0 e 13,0) 5,10 (dd; 3,0 e 13,0)

163,0 (C=O)

5,09 (d) 4,18 (d)

12,1) 3,97 (d; 12,6)

b

(400 MHz; DMSO-d6; VIVAS et al., 1995);

(400 MHz; acetona-d6/D2O; YOSHIDA et al., 1991);

em ppm e J em Hertz
Acetone-d6 108.4812 107.9650 107.2685 70.8532 68.8620 66.8954 65.9776 65.0435 73.7294 29.8000

HO HO

OH

HO

OH OH

CO O
5

OC O
1 H

O HO HO OH HO

O CO

O OC CO

OH OH OH

OH OH OH

120

110

100

90

80

70

60

50

40

30

Figura 7-59- Espectro de RMN 13C/DEPT135 (50 MHz, (CD3)2CO) da Substncia

LVIII
269

Tabela 7-13- Dados dos espectros de RMN 13C e 1H (50 e 400 MHz) da Substncia
LVIII C (CD3OD)/DEPT (acetona-d6/D2O) Substncia LVIII 67,9 / 65,9 75,1 / 73,7 66,9 / 66,9 70,0 / 68,8 72,2 / 70,8 65,9 / 65,0 170,5; 168,3; 167,7 166,4 (x2) 128,1; 126,8; 125,4 125,2; 121,8 117,0; 116,6; 116,3; 115,4; 114,9; 113,8 147,5; 146,5; 146,1 145,8 (x3); 145,7; 145,4; 145,0; 144,7 139,8; 138,1; 137,9; 137,5; 136,2 109,8; 108,9; 108,2 117,4* 6,70; 6,69; 6,55
13

Posio Glicose 1 2 3 4 5 6 C=O ster HHDP 1, 1, 1 HHDP 2, 2, 2 HHDP 3, 3, 3 5, 5,5 HHDP 4, 4, 4 HHDP 6, 6 6

1H (CD3)2CO/D2O) Substncia LVIII 5,60 (d; 4,6) 4,94 (m) 4,94 (m) 5,12 (t; 7,1) 5,49 (dl; 6,5) 4,94 (m) 3,95 (d; 12,6)

*Carbono ligado ao C da glicose; atribuies dos carbonos segundo correlaes observadas 1 13 no espectro de RMN Hx C HSQC

270

mar230503R19hh 66 (1.940) Cm (50:92-(7:42+111:134)) 100

466.4

Scan ES5.62e5

HO HO

OH

HO

OH OH

CO O
5

OC O
1 H

O HO
%

O CO

O OC CO

OH OH OH

HO OH HO OH
301.2

OH OH

933.7 391.7 481.5 446.5 785.5 969.4

299.5 182.9 213.2 255.0 281.6 325.4

339.6

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950

m/z 1000

mar230503R19hj 37 (1.098) Cm (24:57-(2:15+75:87)) 100

301.0

Scan ES1.08e6

HO HO

OH

HO

OH OH

CO O
5

OC O
1

H OH OH OH

O
%
467.0

O OC CO

HO HO OH

CO

HO OH

OH OH
935.4

391.4 783.4 585.0 615.5

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950

m/z 1000

Figura 7-60- Espectro de massas, ESI modo negativo, da Substncia LVIIII (A) e da
Substncia LVI (B)

271

MARGR12i7 59 (1.697) Sb (3,20.00 ); Sm (Md, 1.00); Cm ((51:72+79:95+28:47)) 100

957.5

Scan ES+ 5.76e4

200.8

269.3

240.9 218.9 391.7 399.7 329.5 355.5 301.4 657.5 267.3 371.6 429.7 482.9 503.8 487.8 519.6 551.0 575.9 620.0 663.9 809.7 413.6 443.7

952.7

987.4 973.5

0 200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950

m/z 1000

Figura 7-61- Espectro de massas, ESI modo positivo, da mistura das Substncias
LVIII e LIX

MAR19hh 81 (1.510) Sb (3,20.00 ); Cm (50:130-(144:170+10:45)) 933.6 100

Scan ES7.56e5

HO
OH HO HO HO HO OH
%

OH

HO

OH OH

HO
OH CO CO O O
3 6

HO O
1

OH OH OH

CO O
5

OC O
1 H

HO

OH

HOOC HOOC HOOC

OH OH OH OH

O HO HO OH HO

O CO

O OC CO

OH OH OH

OH OH OH

969.5

947.3 893.1 909.4

0 800

825

850

875

900

925

950

975

1000

1025

1050

1075

1100

1125

1150

1175

1200

1225

1250

1275

m/z 1300

Figura 7-62- Espectro de massas, ESI modo negativo, da mistura das Substncias
LVIII, LXVIII e LIX
Espectro realizado no momento da dissoluo da amostra

272

963
OH

OH HO

HO HO CO O CO O OH HO MeOOC C O O O O OH

HO HO HO OH HO HO

CO O CO O O O OH

HO HO

HO MeOOC MeOOC

OC

OH OH

OC

OH OH

HO OH HO OH OH OH

OH HO OH

OH OH

995

Figura 7-63- Espectro de massas, ESI modo negativo, da mistura das Substncias
LVIII e LIX
Espectro realizado algumas semanas depois da dissoluo da amostra em metanol.

273

HO HO

OH HO

OH OR OH
5

OR

OH

H OH OH

CO OC O
5
H HO

HO OH
H

HO HOOC

HO

OH

HOOC COOH OH

HO OH OH OH HO OH OH

O CO
HO H

OH

HO HO OH

OC CO OH

HO OH HO HO HO HO OH CO O CO HO OH

OH

Substncia LVIII MM= 934

OR OH HO OH O OH OH HOOC HOOC HOOC OH OH OH OH H+
5

H2O

OR

O OH

HO

HO

OH

OH OH

HO OC

OH

Substncia LIX MM= 970

Esquema 7-3- Proposta de formao da Substncia LIX, artefato, a partir da

Substncia LVIII

274

7.17. Identificao da Substncia LX

OH
5'

OH
1'

7'

O
7

O HO

1 5

O O HO HO OH

4-O--L-ramnopiranosdeo do cido elgico ou eschweilenol C

Do extrato metanlico, partio acetato de etila, da casca da raiz e do caule de S. densiflora, depois de vrias etapas cromatogrficas em slica comum, sephadex LH20 e CLAE em fase reversa C-18, isolaram-se 14,0 mg de uma substncia amorfa, de cor amarela plida, pouco solvel at nos solventes mais polares, soma das fraes R12fh2, R12gs4, R20B5 e AMSCR22. A frmula molecular C20H16O12 foi deduzida a partir dos dados obtidos pelos vrios espectros analisados. No espectro de massas, EM/ESI modo negativo (Figura 7-64), observou-se o pico do on pseudomolecular a m/z 447 [M-H]- e ainda um pico a m/z 301 [M-H-146]-, pertencente ao fragmento de cido elgico, caracterizando a perda de uma molcula de pentose. O espectro de RMN de
13

C (100 MHz, D2O, TSPA-

d4 padro interno; Figura 7-66), revelou um sinal em 162,0, caracterstico de funo lactona ,-insaturada, corroborando a presena do cido elgico, alm dos sinais em 102,2, 74,9, 72,8, 72,7, 72,1 e 19,8, indicando a existncia de uma 6-desoxiacar. A anlise do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD; Figura 7-65) revelou oito sinais, incluindo dois na regio de aromticos em 7,84 e 7,49 (singletos) e os sinais referentes molcula do acar entre 5,52-3,77 e em 1,27 (d; J = 6,2 Hz). O acar foi facilmente determinado como a ramnose atravs dos deslocamentos qumicos caractersticos e acoplamentos entre os hidrognios. O sinal referente ao H anomrico apareceu como um dubleto em 5,52 com constante pequena de 1,6 Hz, o que
275

possibilitou a atribuio da configurao da ligao acar-cido elgico como sendo . A posio 4-O desta ligao foi determinada atravs da correlao entre o H anomrico em 5,52 e o C-4 da aglicona em 149,0 presente no espectro de RMN 1Hx13C HMBC (400 MHz, CD3OD; Tabela 7-16; Figura 7-67). Baseando-se nos dados espectrais obtidos e na comparao com dados da literatura (KIM et al., 2001; YANG et al., 1998; Tabelas 7-14 e 7-15), a estrutura da Substncia LX foi proposta como 4-O--L-ramnopiranosdeo do cido elgico ou eschweilenol C. Esta uma substncia indita para a famlia Myrtaceae, porm ela foi primeiramente isolada na planta Eschweilera coriacea, Lecitidaceae, em 1998 (YANG, et al., 1998).

Tabela 7-14- Dados do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, J em Hz) da

Substncia LX, do eschweilenol C e do 3-O--L-ramnopiranosdeo do cido elgico H 5 5 1 2 3 4 5 6
a

3-O--Lramnopiranosdeo 7,46 (s) 7,47 (s) 5,73 (d, 1,6) 4,34 (dd, 1,6 e 3,4) 4,05 (dd, 3,4 e 9,6) 3,46 (t, 9,6) 4,46 (dd, 9,6 e 6,2) 1,21 (d, 6,2)
b a

eschweilenol C b 7,72 (s) 7,46 (s) 5,44 (sl) 3,98 (sl) 3,82 (dl, 9,4) 3,27 (dd, 9,4) 3,50 (m) 1,12 (d, 5,8)

Substncia LX 7,84 (s) 7,49 (s) 5,52 (d, 1,6) 4,20 (dd, 1,8 e 3,4) 4,02 (dd, 3,4 e 9,5) 3,48 (t, 9,5) 3,77 (dd, 9,4 e 6,2) 1,27 (d, 6,2)

(400 MHz, CD3OD; KIM et al., 2001); (400 MHz, DMSO-d6; YANG, et al., 1998)

276

Tabela 7-15- Dados do espectro de RMN de 13C (100 MHz, D2O) da Substncia LX,
do eschweilenol C e do 3-O--L-ramnopiranosdeo do cido 3-O-metilelgico C 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6
a

3-O--L ramnopiranosdeo 112,3 142,3 143,5 154,4 114,0 113,3 161,8 110,6 143,6 140,3 153,7 115,2 114,6 161,8 102,9 72,0 72,2 73,9 71,7 17,9
b

eschweilenol C b 108,4 136,8 141,0 146,4 111,7 114,6 159,3 107,8 136,5 139,5 148,6 110,5 112,0 159,1 100,3 69,9 70,1 71,8 70,1 18,0

Substncia LX 107,9 137,3 143,0 149,0 112,8* 113,5 * 162,0 107,5 137,3 143,0 150,3 112,8 * 113,5 * 162,0 102,2 72,7 72,8 74,9 72,1 19,8

(100 MHz, CD3OD; KIM et al., 2001); intercambiveis

(100 MHz, DMSO-d6; YANG, et al., 1998); *Valores

277

Tabela 7-16- Dados do espectro de RMN de 1Hx13C HMBC (400 MHz, CD3OD, J em
Hz) da Substncia LX, do eschweilenol C e do 3-O--L-ramnopiranosdeo do cido elgico
HMBC H-5 H-5 H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6
a

3-O--L ramnopiranosdeo C-1, C-3, C-7 C-1, C-3, C-7 C-3 b

eschweilenol C

Substncia LX C-4, C-6, C-7 C-3, C-4, C-6, C-7 C-4, C-2, C-3 C-3 C-5 C-6 C-3, C-5

C-1, C-3, C-4, C-6, C-7 C-1, C-3, C-4, C-6, C-7 C-4, C-3 C-4, C-5

(400 MHz, CD3OD; KIM et al., 2001); (400 MHz, DMSO-d6; YANG, et al., 1998)
Scan ES1.07e6

MARGR12fh2neg 81 (1.510) Cm ((63:103+118:161+31:54)) 100

447.4

OH
5'

OH
1'

O
112.8

7'

O
7

O HO
%

1 5

O
433.4 255.2

O HO HO OH

149.8

301.2

114.5

136.8

283.2 183.2

311.1 325.4

339.2 405.5

489.2

0 100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

m/z 600

Figura 7-64- Espectro de massas, ESI modo negativo, da Substncia LX

278

Figura 7-65- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da Substncia LX

279

OH
5'

OH
1'

7'

O
7

O HO

1 5

O O HO HO OH

Figura 7-66- Espectro de RMN de 13C (100 MHz, D2O, TSPA-d4 padro interno) da
Substncia LX

Figura 7-67- Espectro de RMN de 1Hx13C HMBC (400 MHz, CD3OD) da Substncia
LX
280

7.18. Identificao das Substncias LX, LXI, LXII e LXIII em mistura

OH
5'

OH
1'

O
R=R1=R2=H Substncia LX R= acetil; R1=R2=H 4-O--L-2-O-acetilraminopiranosdeo do cido elgico (LXI) R=R2=H; R1=acetil 4-O--L-3-O-acetilraminopiranosdeo do cido elgico (LXII) R=R1=H; R2=acetil 4-O--L-4-O-acetilraminopiranosdeo do cido elgico (LXIII)

7'

O
7

O HO

1 5

O O R2O OR1 OR

Do extrato metanlico, partio acetato de etila, da casca da raiz de S. densiflora, depois de vrias etapas cromatogrficas em slica comum, sephadex LH20 e CLAE em fase reversa C-18, foi obtida a frao R20A5, 8,2 mg, como uma substncia amorfa, de cor amarela plida. A anlise do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD, Figura 7-70, Tabela 7-17) revelou diversos sinais de intensidades diferentes do tipo singleto, na regio de aromticos; do tipo singleto na regio de metilas do grupo acetato de etila e do tipo dubleto, na regio de metilas de ramnose, indicando ser uma mistura de derivados acetilados da Substncia LX. Foram observados que alguns dos sinais referentes aos H carbinlicos estavam mais desblindados do que os pertencentes Substncia LX, o que possibilitou a localizao dos grupos acetilas no acar no C2/H-2 em 5,42 (dd; 1,6 e 3,4 Hz); C-3/H-3 em 5,23 (dd; 3,4 e 9,6 Hz) e C-4/H4 em 5,03 (t, 9,6 Hz). Porm, poderiam ser ismeros de posio de um grupo acetila ou compostos com dois ou com os trs grupos acetila na mesma molcula de acar. No entanto, a anlise do espectro de massas, ESI modo negativo (Figura 7-68), revelou somente dois picos referentes aos ons pseudo moleculares a m/z 447 [M-H]-, 100%, e a m/z 489, [M-H]-, 45%, corroborando com a hiptese dos derivados serem ismeros de posio de um grupo acetila e de frmula molecular C22H18O13.
281

A anlise do espectro de RMN de

13

C (100 MHz, CD3OD, Figura 7-69,

Tabela 7-18) confirmou a presena do grupo acetila pelos sinais revelados em 173,2 e 21,3, referentes aos carbonos da carbonila e da metila. Alm disso, mostrou vrios sinais duplicados, evidenciando a mistura dos ismeros. Os valores dos deslocamentos relacionados aos tomos de C do acar, que suportavam os grupos acetilas, puderam ser atribudos atravs das correlaes observadas no espectro de RMN 1Hx13C HSQC (400 MHz, CD3OD, Figura 7-72) entre o H em 5,42 com o C em 74,1; entre o H em 5,23 com o C em 75,3 e entre o H em 5,03 com o C em 75,6. A posio da ligao entre o acar e a aglicona foi determinada atravs da correlao obtida no espectro de RMN 1Hx13C HMBC (400 MHz, CD3OD, Figura 7-71) entre o H anomrico em 5,52 e o C-4 da aglicona em 149,2. A substncia LXIII foi isolada recentemente de uma espcie da famlia Combretaceae (ASAMI et al., 2003) e apresenta atividade inibitria do crescimento de clulas tumorais resistentes adriamicina; tambm apresentou inibio da enzima HIVprotease com CI50 de 11 g/mL. Baseando-se nos dados obtidos atravs dos espectros e nos dados de substncias correlatas relatados na literatura (KIM et al., 2001), foram propostas as estruturas 4-O--L-2-O-acetilraminopiranosdeo do cido elgico, 4-O--L-3-Oacetilraminopiranosdeo do cido elgico, ambas inditas na natureza, e o 4-O--L-4O-acetilraminopiranosdeo do cido elgico (ASAMI et al., 2003) respectivamente.

282

Tabela 7-17- Dados dos espectros de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da mistura das
Substncias LX, LXI, LXII e LXIII, da Substncia LX pura e dos 3-O--L-2; 3 e 4-Oacetilramnopiranosdeos do cido 3-O-metilelgico H 5 5 1 Substncia LX 7,84 (s) 7,49 (s) 5,52 (d, 1,6) 2-O-acetil a 7,46 (s) 7,48 (s) 5,67 (d; 1,6) 3-O-acetil a 7,47 (s) 7,51 (s) 5,64 (d; 1,6) 4-O-acetil a 7,47 (s) 7,48 (s) 5,68 (d; 1,6) Mistura 7,83; 7,81; 7,79; 7,78 (s) 7,47 (s) 5,56; 5,55; 5,54; 5,52 (sl) 5,42 (dd); 4,39; 4,21 (dd; 3,2 e 1,6) 5,23 (dd; 3,3 e 9,8); 4,02 (dd; 3,4 e 9,5) 5,03 (t; 9,6); 4 3,48 (t, 9,5) 3,40 (t; 9,6) 3,65 (t; 9,6) 5,04 (t; 9,6) 3,70 (t; 9,6); 3,49 (t; 9,5) 5 3,77 (dd, 9,4 4,32 (dq, 9,6 4,50 (dq, 9,6 4,60 (dq, 9,6 e 6,2) 1,27 (d, 6,2) e 6,2) 1,17 (d; 6,2) e 6,2) 1,21(d; 6,2) e 6,2) 1,09 (d; 6,2) 3,78 (dd; 9,6 e 6,2) 1,32; 1,15 e 6 1,12 (d; 6,3); 1,28 (d; 6,2); H3CCOO
a

4,20 (dd, 1,8 5,49 (dd; 1,6 4,44 (dd; 1,6 4,38 (dd; 1,6 e 3,4) e 3,4) e 3,4) e 3,4)

4,02 (dd, 3,4 4,18 (dd; 3,4 5,24 (dd; 3,4 4,19 (dd; 3,4 e 9,5) e 9,6) e 9,6) e 9,6)

2,09 (s)

2,12 (s)

2,14 (s)

2,18; 2,16; 2,11; 2,09 (s)

(400 MHz, CD3OD; KIM et al., 2001)

283

Tabela 7-18- Dados dos espectros de RMN de 13C (100 MHz, CD3OD) da mistura
das Substncias LX, LXI, LXII e LXIII e dos 3-O--L-2; 3 e 4-Oacetilramnopiranosdeos do cido 3-O-metilelgico C 1, 1 2, 2 3, 3 4, 4 5, 5 6, 6 7, 7 1 2 2 acet 3 3 acet 4 4 acet 5 6 H3CCOO H3CCOO
a

acetilramnopiranosdeos a 113,2; 113,5; 113,0; 112,9 142,2; 142,3; 143,6 142,0; 138,6 154,4; 154,3; 154,8; 153,7 114,4; 113,0; 113,4; 114,0 113,5; 113,2; 114,6; 114,4 160,4; 160,3 103,8; 100,0; 103,6 70,9; 71,8 75,4 73,6; 70,1 75,4 71,9 75,1 69,6; 70,4 17,8; 20,5; 17,7 21,1; 20,9; 21,0 172,7; 172,0; 172,6

Mistura 107,4; 105,3 138,9; 138,3 * 150,9; 149,2 110,7; 110,3 114,7; 114,6; 114,1 162,5; 162,6 101,5; 101,3; 101,2 69,7; 68,9 74,1 72,0; 72,3 75,7 71,4; 71,1 75,6 70,2 18,2; 17,9 21,3; 21,2 173,2

(100 MHz, CD3OD; KIM et al., 2001); * Sinais no observados

284

margR20A5neg 95 (2.085) Cm (81:120-(160:212+32:67)) 100

149.9 150.2

447.4

Scan ES1.99e7

OH
5'

OH
1'

7'

O
7

O HO
%
489.4

1 5

O O R2O OR1 OR

0 100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

600

620

640

660

680

m/z 700

Figura 7-68- Espectro de massas, ESI modo negativo, da mistura das Substncias
LX, LXI, LXII e LXIII

Figura 7-69- Espectro de RMN de 13C (100 MHz, CD3OD) da mistura das
Substncias LX, LXI, LXII e LXIII
285

Figura 7-70- Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da mistura das Substncias
LX, LXI, LXII e LXIII
286

Figura 7-71- Espectro de RMN 1Hx13C HMBC (400 MHz, CD3OD) da mistura das
Substncias LX, LXI, LXII e LXIII

Figura 7-72- Espectro de RMN 1Hx13C HSQC (400 MHz, CD3OD) da mistura das
Substncias LX, LXI, LXII e LXIII
287

7.19. Identificao da Substncia LXIV

Do extrato metanlico, partio acetato de etila, da casca da raiz de S. densiflora, depois de vrias etapas cromatogrficas em slica comum e sephadex LH20, foi obtida a frao R12e6, 8,2 mg, como uma substncia amorfa, de cor amarela plida. Na CCDA, usando-se AcOEt/MeOH 9:1 / 5% HAc como eluente, o Rf da substncia foi de 1,2 cm. Revelada na vanilina sulfrica, apresentou uma mancha marrom avermelhada. O espectro de infravermelho (Figura 7-76) revelou absores caractersticas para grupos hidroxila (3386 cm-1); metoxila (2925 cm-1); cido carbonlico (1705 cm-1) e anel aromtico (1613, 1507, 1425 cm-1). A anlise do espectro de RMN 1H (400 MHz, acetona-d6, Figura 7-77; Tabela 7-19) revelou que a substncia no estava totalmente pura. Dois sinais em 7,13 e 6,40 (ambos singletos), juntamente com os sinais de H carbinlicos e de H metoxlicos, indicaram que poderia ser um tanino hidrolisvel com um grupo HHDP e que este se encontraria metoxilado. No entanto, quando o espectro de massas foi realizado, o pico de maior intensidade, relativo ao on pseudo molecular, foi de m/z 497 [M-H]- (Figura 7-74), sendo que a massa esperada era de 496, ou esta massa mais adio de 14 unidades relativas a grupos metoxilas adicionais. Alm deste, os outros picos revelados em m/z 447 e 489 j eram esperados como sendo da mistura de taninos descrita anteriormente. Outro fato no esperado foi constatado no espectro de RMN 1Hx13C HSQC (400 MHz, acetona-d6, Figura 7-78) onde o H em 6,40 se correlacionava com o C em 95,5, valor bem mais blindado do que o esperado para um C aromtico do grupo HHDP ou cido elgico. A anlise do espectro de RMN
1

Hx13C HMBC (400 MHz, acetona-d6; Figura 7-79; Tabela 7-20) mostrou que o H em

6,40 se correlacionava com outros carbonos aromticos mas nenhum referente carboxila, enquanto o H em 7,13 se correlacionava com um C carboxlico em 167,5. O H anomrico mostrou correlao com um carbono em 154,9, valor muito baixo para ser atribudo a uma carboxila, mas que poderia ser assinalado ao C-4 aromtico ligado a um grupo O-glucopiranosil. A irradiao do sinal em 3,72 causou um efeito NOE no sinal referente ao H-6, porm, a irradiao do sinal em 3,63 no provocou nenhum efeito. Todos os
288

dados obtidos, somados simetria da molcula, levantaram a hiptese de vrios ismeros possveis. Foi proposta uma estrutura, de frmula molecular C21H22O14, contendo uma dibenzo-1,4-dioxina ligada molcula da glicose, que teria sua biossntese a partir de um acoplamento fenlico oxidativo entre grupos hidroxila de uma molcula de cido glico com uma molcula de cido sirngico, seguida de uma oxidao do anel aromtico (DEWICK, 1997; Esquema 7-4). No entanto, isto no seria o suficiente para se assinalar a estrutura. A estratgia considerada para se solucionar o problema estrutural de localizao dos grupos hidroxilas foi o uso de reagentes deslocadores no espectro de UV. A soluo metanlica da substncia apresentou absores mximas no UV de 276 e 356 nm. Quando o espectro foi determinado em metanol contendo cido brico e acetato de sdio, no houve mudanas nas absores, indicando a ausncia de um sistema orto-diidroxi . Porm, a adio de AlCl3 causou efeito batocrmico de 14 nm na banda de 370 nm, corroborando a hiptese de um grupo hidroxila quelado a um grupo cido (VOIRIN, 1983). Baseados nos dados espectrais obtidos (Figura 7-75), na comparao com um tanino obtido de Syzygium aromaticum (Myrtaceae), a syzyginina B (TANAKA et al., 1996; Figura 7-73) e com um derivado do cido elgico, o eschweilenol B, juntamente com seu derivado metoxilado (YANG et al., 1998; Figura 7-73), foi proposta a estrutura da siphoneugenina, indita na literatura, apresentando um novo tipo de aglicona para os taninos hidrolisveis. Porm, a quantidade de substncia isolada no foi suficiente para se promover as reaes de metilao e metanlise necessrias para a comprovao desta hiptese. Sugere-se que a substncia est ocorrendo juntamente com um ismero de posio, devido duplicao de vrios sinais de C na mesma regio, no entanto os dados no foram suficientes para se posicionar a ligao do acar.

289

OMe HO
4''

OH O
4 1

O
1''

O MeO

4' 1'

HO HO

OH

O OH

COOH

cido 4-O--D-glucopiranosil-3,5-dimetoxifenil-[1,4]-dioxinil-2hidroxiglico ou siphoneugenina

OR
OH 3'
1'

OH O
1

OR

HO HO

O
3

6'' 1'' 1 3

3''

6'

O HO HO

CO CO

O O O

6'''

O OH

O
O
1' 5' 3'

O 7' O
5

OH 1''' CO

OH HO OH

OH

RO OR

OR

syzyginina B

R = H eschweilenol B R = Me Penta-O-metil-eschweilenol B

Figura 7-73- syzyginina B; Substncia LXIV; eschweilenol B e seu derivado metilado

290

Tabela 7-19- Dados dos espectros de RMN 1H e 13C (400 e 100 MHz, acetona-d6) da
Substncia LXIV; do eschweilenol B (M; 400 e 100 MHz, DMSO-d6) e penta-O-metileschweilenol B (Q; CD3COD)
Posio
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5

CM
107,9 135,8 139,8 149,0 110,6 111,9 158,2 141,8 132,3 131,3 123,0 136,6 94,1

13

HM

CQ
111,8 * 134,6 141,5

13

HQ

13C LXIV
120,9 139,1 139,1 148,2

1H LXIV

7,48 (s)

112,5 114,7 158,0 127,6 135,7 141,7 139,5 148,7

7,60 (s)

145,9 109,8 167,5 * 133,9 138,1 154,9 148,4 7,13 (s)

6,14 (s)

96,0

6,39 (s)

95,5 101,9 74,7 76,7 70,8 73,9

6,40 (s) 4,99 (d; 7,6) 3,86 (m) 3,57 (m) 3,55 (m) 3,49 (m) 4,64 (dd; 1,8 e 12) 4,39 (dd; 6,0 e 12) 3,63 (s) 3,72 (s)

64,7

3-OMe 4-OMe 5-OMe

a

61,6 56,5 56,0

4,11 (s) 3,93 (s) 3,72 (s)

60,8 56,3

(YANG et al., 1998) ; * Sinal no observado

291

Tabela 7-20- Dados do espectro de RMN 1Hx13C HMBC (400 MHz, acetona-d6) da
Substncia LXIV
Posio 6 6 1 3 4 5 OMe-5 OMe-3 1H 7,13 6,40 4,99 3,57 3,55 3,49 3,72; 3,63 13C correlacionados 120,9 (C-1); 145,9 (C-5); 167,5 (C-7) 133,9 (C-2); 154,9 (C-4) 154,9 (C-4) 74,7 (C-2); 70,8 (C-4) 101,9 (C-1) 76,7 (C-3) 154,9 (C-4); 148,4 (C-5) 133,9 (C-2)

marg R12e6neg 93 (1.731) Cm (80:115-(156:182+29:66)) 100

182.9

Scan ES3.71e6

OMe HO
4''

OH O
4 1
497.5

O
1''

O MeO

4' 1'

HO HO

OH

O OH

COOH

255.4

283.3 281.5 447.5 150.1 299.5 300.7 120.8 152.8 330.8 483.2 511.6 539.6 575.6 489.4 533.5

0 100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

m/z 600

Figura 7-74- Espectro de massas, ESI modo negativo, da Substncia LXIV

292

OMe HO
4''

OH O
4 1

O
1''

O MeO

4' 1'

HO HO

OH

O OH

COOH

Figura 7-75- Espectro de RMN 13C (100 MHz, acetona-d6) da Substncia LXIV

Figura 7-76- Espectro de IV da Substncia LXIV

293

Figura 7-77- Espectro de RMN 1H (400 MHz, acetona-d6) da Substncia LXIV

294

OMe HO
4''

OH O
4 1

O
1''

O MeO

4' 1'

HO HO

OH

O OH

COOH

Figura 7-78- Espectro de RMN 1Hx13C HSQC (400 MHz, acetona-d6) da Substncia
LXIV

295

Figura 7-79- Espectro de RMN 1Hx13C HMBC (400 MHz, acetona-d6) da Substncia
LXIV

296

H O MeO OMe MeO O

H OMe MeO

OH OMe
-

O MeO H e OMe

H O C OH

tautomerizao O H

descarboxilao C O H

radical livre estabilizado por ressonncia

COOH

COOH MeO

O OMe

HO OH

OH

H e

O OH

OH

acoplamento fenlico oxidativo

OH O HO HO HO OP glucose
1- P

OH O H UTP HO HO HO O UDP O-glucosilao Reao de SN2 H O MeO

OMe

H O

OH

COOH

OMe GluO O

OH processo oxidativo COOH O2 NADPH mono-oxigenase FADH - 2 GluO

OMe H

OH O

MeO

MeO

O FAD

COOH

OMe GluO O

OH

MeO

O OH

COOH

Esquema 7-4- Proposta de formao biossinttica da Substncia LXIV

(DEWICK, 1997)

297

7.20. Identificao da Substncia LXV

OH HO O HO HO HO OH HO HO OH HO OH CO CO O O
3 1 6

O OH
2,3:4,6-di-O-[(S)-4,4,5,5,6,6hexaidroxidifenoil]--D-glucopiranose ou -pedunculagina

OC OC OH

O extrato metanlico de caule de S. densiflora, partio n-butanol, aps sofrer vrias etapas cromatogrficas em sephadex LH-20, forneceu a frao BMCjd, 66,7 mg; e o extrato hidrometanlico de caule, a frao XAAHMCS, 78,6 mg sob a forma de p marrom avermelhado cristalino brilhante. A anlise do espectro de RMN 1H (200 MHz, acetona-d6; Figura 7-81; Tabela 7-21) revelou dois sinais em 6,71 e 6,56 (sl) referentes a dois grupos HHDP e sinais referentes a H carbinlicos entre 5,70 a 3,22, estando o sinal referente ao H anomrico em 5,53 (d, 6,9 Hz) e sua constante de acoplamento indicando tratar-se de um ismero da glicose na sua forma cclica. A anlise do espectro de RMN
13

C (50 MHz, acetona-d6; Figura 7-80;

Tabela 7-21) corroborou com a hiptese da existncia de dois grupos HHDP quando revelou quatro sinais relativos s carbonilas destes grupos em 169,4; 167,3; 166,7 e 166,3. No foram observados todos os sinais de carbonos carbinlicos, mas o sinal em 99,8 foi atribudo ao C anomrico. Baseados nos dados obtidos dos espectros e nos dados relatados na literatura (OKUDA et al., 1982; OKUDA et al.,1983), foi proposta a estrutura do anmero da pedunculagina.

298

169.424 167.301 166.703 165.679 165.359

136.253 135.590 134.729 126.051 124.568

115.768 114.661 114.039 112.457 108.573 107.196 101.329 99.838

145.161 144.972 144.226

OH HO O HO HO HO OH HO HO OH HO OH CO CO O O
3 1 6

O OH

OC OC OH

170

160

150

140

130

120

110

100

90

80

70

65.340 62.734 60

70.904 70.773

50

40

30

Figura 7-80- Espectro de RMN C (50 MHz, acetona-d6) da Substncia LXV

13
Acetone-d6 5.7032 5.5537 5.5194 4.0296 3.9696 3.7003 3.3096 3.2277 6.7066 6.5633 5.1138 5.0797 2.0400 3.0 2.5 2.0

2.09 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0

1.00 5.5

2.97 5.0 4.5

1.44 4.0 3.5

0.40 1.5

Figura 7-81- Espectro de RMN 1H (200 MHz, acetona-d6) da Substncia LXV

299

Tabela 7-21- Dados dos espectros de RMN 13C e 1H (50 e 200 MHz, acetona-d6) da
Substncia LXV e da -pedunculagina a Posio 13C glicose Substncia LXV -pedunculagina Posio 1H Substncia LXV -pedunculagina
a

1 99,8 95,4 3 6,71 6,68

2 * 78,3 3 6,56 6,60

3 * 77,6 3 6,71 6,56

4 70,8 69,6 3 6,56 6,33

5 70,9 72,5 anomrico 5,53 (d; 6,9 Hz) 5,22 (d; 9 Hz)

6 65,3 63,6

(OKUDA et al., 1983; OKUDA et al., 1982); * Sinais no observados

300

7.21. Identificao da Substncia LXVI

OH
5 1 3

O OH

ramnose

HO

HO

O extrato metanlico de casca da raiz de S. densiflora, partio acetato de etila, aps sofrer vrias etapas cromatogrficas em sephadex LH-20, forneceu a frao R12e3, 8,7 mg, sob a forma de p branco amorfo. A anlise do espectro de RMN 1H (200 MHz, piridina-d5; Figura 7-82) indicou ser uma mistura do acar ramnose, em maior proporo, com outras duas substncias no identificadas tambm derivadas da ramnose, por apresentar diversos sinais na regio de metilas e H carbinlicos. O sinal em 1,59 (d; 6,2 Hz) foi atribudo aos H do grupo metila e o sinal em 5,86 (sl) ao H anomrico em configurao . A anlise do espectro de RMN
13

C (50,0 MHz, CD3OD; Figura 7-83)

confirmou ser o acar a ramnose e os sinais em 95,8; 74,3; 73,0; 72,1; 69,3 e 18,1 foram atribudos aos carbonos 1, 4, 3, 2, 5 e 6 respectivamente. O espectro de massas, ESI modo negativo, revelou um pico referente ao aduto de cloro em m/z 199 [M-H+35]- e o espectro de massas, ESI modo positivo, revelou um pico referente ao aduto de sdio em m/z 187 [M+23]+ (Figura 7-84). Tais dados possibilitaram a deduo da massa molecular de 164 g/mol referente frmula molecular C6H12O5. Os espectros tambm evidenciaram as massas de 206 e 222, relativas s duas substncias no identificadas.

301

Pyridine-d5 6.7790 6.7563 4.7280 4.6647 4.6461 4.5671 4.5398 4.4679 4.3457 4.2997 4.2465 4.2146 4.1838 3.7858 3.6966 3.5570 3.3856 5.8611 5.8195 2.9106 2.8803 2.8492 1.6371 1.6061 1.5852 1.5541 1.3481 1.3168 1.5 1.0 7.1900 2.0319 2.5 2.0

7.5

7.0

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

0.5

Figura 7-82- Espectro de RMN H (200 MHz, piridina-d5) da Substncia LXVI

1
Methanol-d4 18.1158 74.2629 73.0420 72.1324 69.2562 49.0000 95.8302

OH
5 3 1

O OH

HO

HO

110

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

Figura 7-83- Espectro de RMN 13C (50 MHz, CD3OD) da Substncia LXVI

302

marg R12e3 118 (2.189) Cm (105:143-(158:181+65:86)) 100

92.7

Scan ES5.74e6

92.5

OH
5 3
94.7 198.9

O OH

HO

HO

112.8

201.0 215.0 150.4 152.7 166.4 240.9 268.8 266.4 270.7 257.0 317.2

0 50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

320

330

340

m/z 350

marg R12e3pos 110 (2.042) Cm (93:134-(146:166+53:84)) 100

63.8

Scan ES+ 5.30e6

B
229.0

187.0

54.9 219.0 99.9 95.8 202.9 201.0 244.9 261.0

0 50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

320

330

340

m/z 350

Figura 7-84- Espectros de massas, ESI modo negativo (A) e positivo (B), da
Substncia LXVI

303

7.22. Identificao da Substncia LVII

6

OH
3

HOH2C O
1

OH
-lactona do cido 3, 4, 5, 6tetraidroxihexanico

O extrato metanlico de casca da raiz de S. densiflora, partio acetato de etila, aps sofrer vrias etapas cromatogrficas em sephadex LH-20, forneceu a frao R12e4, 4,0 mg, sob a forma de p branco amorfo. A anlise do espectro de RMN 1H (400 MHz, piridina-d5; Figura 7-90) da frao mencionada indicou ser uma mistura de dois acares, juntamente com cidos fenlicos metoxilados no identificados, devido aos muitos e intensos sinais presentes na regio de H carbinlicos. O sinal em 5,94 (d; 1,4 Hz) foi atribudo a um H anomrico em configurao . No foi observado outro sinal referente a H anomrico, fato que indicou que o outro acar poderia estar modificado. A realizao dos experimentos de RMN
13

C e DEPT 135 (50 MHz, piridina-d5; Figura 7-87; Figura 7-88),

NOE, HSQC e HMBC (400 MHz, piridina-d5; Figura 7-92; Figura 7-93; Figura 7-94; Figura 7-91; Figura 7-89; Tabela 7-22) permitiu que os valores de deslocamentos observados fossem imputados a uma molcula de ramnose (Substncia LXVI) e a uma -lactona do cido 3,4,5,6-tetraidroxihexanico (Substncia LXVII), esta molcula foi identificada principalmente pelas correlaes observadas no espectro de RMN 1Hx13C HMBC (Figura 7-89) entre o sinal em 5,02 (dd; 6,6 e 4,5; H-3) e 4,93 (dd; 5,3 e 3,3; H-4) com o sinal em 176,9 e a correlao observada no espectro de RMN 1Hx13C HSQC (Figura 7-91) entre o sinal em 4,93 (dd; 5,3 e 3,3; H-4) com o sinal em 89,4, indicando tratar-se de uma lactona pentacclica, devido aos valores observados de J. O espectro de massas, ESI modo positivo (Figura 7-86), revelou picos referentes ao aduto de sdio em m/z 187 [M+23]+, confirmando a presena da molcula de ramnose de frmula molecular C5H12O5, e ao aduto de sdio em m/z 203 [M+18+23]+, indicando estar a lactona na sua forma hidratada de frmula molecular C6H12O6. De acordo com MORRISON & BOYD (1972), os e -hidroxicidos perdem gua por esterificao. Esta reao intramolecular e o curso da reao determinado
304

pela tendncia a formar-se um anel pentagonal ou hexagonal. A lactonizao d-se espontaneamente, com formao de uma mistura em equilbrio (Esquema 7-5), constituda principalmente pela lactona, como foi detectado no espectro de RMN
1

Hx13C HMBC, sendo que a correlao observada entre o sinal em 5,02 (dd; 6,6 e

4,5; H-3) com o sinal em 175,9 revelou tambm a presena da forma aberta, em menor quantidade. H a possibilidade desta substncia ter se originado da oxidao de uma 2-desoxialdohexose. A proposta estrural relativa -lactona foi baseada em valores de deslocamentos de C referentes a modelos de molculas relatados na literatura (PFEFFER et al., 1979 ; Tabela 7-22; Figura 7-85; Tabela 7-23).

OH OH
6

OH
3

HOH2C

COOH 1

HOH2C O
1

OH

OH

Esquema 7-5- Reao de equilbrio da -lactona e do seu cido correspondente, o

cido 3,4,5,6-tetraidroxihexanico

305

Tabela 7-22- Dados dos espectros de RMN

13

13

C, DEPT135, 1H, NOEDIFF, 1Hx13C

HSQC e HMBC (50 e 400 MHz, piridina-d5) da mistura das Substncias LXVI e LXVII
Posio/ LXVI 1 2 3 4 5 6 Posio/ LXVII 1 176,9 (s) 3,34 (dd; 17,6 e 2 39,1 (t) 6,6) 2,88 (dd; 17,6 e 2,5) 3 4 5 68,9 (d) 89,4 (d) 73,2 (d) 5,02 (dd; 6,6 e 4,5) 4,93 (dd; 3,3 e 5,3) 4,78 (dd; 3,4 e 9,2) 4,14 (dd; 3,3 e 12,2) 6 61,8 (d) 4,05 (dd; 3,3 e 12,2) 68,9; 89,4 3,34; 5,02 3,34; 2,88; 4,14; 4,05 89,4 (C-4); 176,9 (C-1); 68,9 (C-3) 176,9; 61,8 (C6); 175,9 (C-1) 176,9; 68,9; 73,2 (C-5) C
1

H/HSQC (J em Hz) 5,94 (d; 1,4) 4,73 (dd; 1,6 e 3,4) 4,78 (dd; 3,4 e 9,2) 4,37 (t; 9,4) 4,68 (dd; 6,2 e 9,3) 1,69 (d; 6,2)

(multiplicidade) 95,6 (d) 72,4 (d) 73,2 (d) 74,1 (d) 68,9 (d) 18,6 (q)

NOEDIFF

HMBC 68,9 (C-5); 73,2 (C-3)

5,94 1,69; 5,94; 4,73; 4,37

74,1 (C-4)

18,6 (C-6); 68,9; 73,2

4,37; 4,68

68,9; 74,1

306

Tabela 7-23- Dados dos espectros de RMN

piridina-d5), do cido -D-glucopiranurnico glucofuranurnico cido -DPosio glucopiranurnico

13

C da Substncia LXVII (50 MHz, da -lactona do cido -D-

-lactona do cido -Dglucofuranurnico 177,8 70,4 76,7 85,6 74,8 99,1 Substncia LXVII

1 2 3 4 5 6

176,9 76,9 73,0 73,5 72,2 92,4

176,9 39,1 68,9 89,4 73,2 61,8

HO
2

HOOC
3

O
1

OH O 6 H H

O
6

HO HO OH

OH

O
4

OH

cido -D-glucopiranurnico

-lactona do cido -Dglucofuranurnico

Figura 7-85- Modelos usados para a identificao da Substncia LXVII

307

marg R12e4pos 213 (2.158) Cm (188:247) 100

187.0

Scan ES+ 1.19e7

OH
3

HOH2C O
1

OH

O
%

OH
106.9 173.0 203.0

5 3

O OH

HO
138.9 219.1 156.9 185.0

HO

0 100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

320

330

340

m/z 350

Figura 7-86- Espectro de massas, ESI modo positivo, da mistura das Substncias
LXVI e LXVII
Pyridine-d5 147.2343 135.5000 176.8895 110.0403 74.1410 73.2233 72.4202 68.9376 39.0940 89.4562 56.0808 55.7448 61.7922 18.6328 95.6511 100

150

50

Figura 7-87- Espectro de RMN 13C (50 MHz, piridina-d5) da mistura das Substncias
LXVI e LXVII
308

Pyridine-d5 123.5000 73.9572 73.0640 72.2364 68.7948 61.6248 38.9511 18.5063 95.4837 89.3133

OH
6

OH
3

HOH2C O
1

1 3

OH
HO

O OH

HO

120

110

100

90

80

70

60

50

40

30

20

Figura 7-88- Espectro de RMN 13C/DEPT 135 (50 MHz, piridina-d5) da mistura das
Substncias LXVI e LXVII

Figura 7-89- Espectro de RMN 1Hx13C HMBC (400 MHz, piridina-d5) da mistura das
Substncias LXVI e LXVII

309

Figura 7-90- Espectro de RMN 1H (400 MHz, piridina-d5) da mistura das Substncias
LXVI e LXVII

310

Figura 7-91- Espectro de RMN 1Hx13C HSQC (400 MHz, piridina-d5) da mistura das
Substncias LXVI e LXVII

Figura 7-92- Espectro de NOEDIFF (400 MHz, piridina-d5), irradiao em 5,02, da

mistura das Substncias LXVI e LXVII

311

A
OH
3

HOH2C O
1

OH
5 3

OH
1

O OH

HO

HO

Figura 7-93- Espectro de NOEDIFF (400MHz, piridina-d5) da mistura das Substncias

LXVI e LXVII
A: irradiao em 4,78 e B: em 2,88

312

OH
3

OH
OH
5 3 1

HOH2C O
1

O OH

HO
O

HO

Figura 7-94- Espectro de NOE (400MHz, piridina-d5) da mistura das Substncias

LXVI e LXVII
A: irradiao em 4,73 e B: em 1,69

313

314

8.Desenvolvimento de um mtodo para a anlise e quantificao da 20-hidroxiecdisona

8.1. Introduo 8.1.1. Ecdisterides: estrutura qumica

Os ecdisterides compreendem uma classe de esterides naturais (ciclopentano-peridrofenantreno). Pertencem principalmente srie 5-androstano, onde os anis A/B tm anelao cis. O esqueleto bsico tem de 27 a 29 tomos de C, retendo o esqueleto carbnico do colesterol (C-27) ou dos fitosteris (C-28 ou 29), podendo conter 19, 24 ou 21 tomos, se provenientes da quebra da cadeia lateral do colesterol. Apresentam a cadeia lateral dos esterides ou um anel lactnico na posio 17. Tm como caractersticas gerais a conjugao 7-en-6-ona no anel B (a qual responsvel pela absoro no UV) e o grupo 14-hidroxila, alm de vrias outras hidroxilas (com maior ocorrncia nas posies 1, 2, 3, 5, 11, 12, 16 a 18, 20 a 27; Figura 8-1). Tambm podem suportar outros substituintes, como carbonilas, nas posies 3, 12, 17, 20 ou 22; grupos carboxlicos, nas posies 26 ou 29, s vezes na forma lactnica, alm de glicosdeos, fosfatos, acetatos, benzoatos e vrias outras formas esterificadas (BTHORI, 1998).

29

18 19 12

R
17

R=

21

OH OH
20

24

HO HO

C
8

D
15

makisterona C
OH
27

A
4

10

B
6

OH
R=

OH OH

28

O
OH OH R=

OH

makisterona A

R= O O

sidisterona

OH

20 - hidroxiecdisona

Figura 8-1- Estrutura geral dos ecdisterides

316

8.1.2.

Ocorrncia na natureza
Os ecdisterides foram primeiramente encontrados em insetos, onde

atuam como hormnios responsveis pela metamorfose. Mais tarde, foram descobertos em artrpodes e vrias outras famlias de invertebrados, mas sempre em pequenas quantidades. Por isto, sua pesquisa foi incrementada quando foram detectados em plantas, numa concentrao muita mais alta do que a encontrada nos insetos (10 a 1000 mg/Kg. No caso da Leuzea carthamoides, suas sementes contm 20 g/Kg ou o extrato etanlico da raiz que contm 0,4 % da matria seca) sendo registrados em mais de 120 famlias, com exemplares comuns como o espinafre. O nmero de fitoecdisterides diferentes trs vezes maior do que os zooecdisterides (SLMA & LAFONT, 1995). O corpo humano obtm os ecdisterides atravs da dieta contendo vegetais. A funo dos ecdisterides nas plantas ainda conjetural, acreditando-se que eles podem fornecer alguma proteo contra insetos fitfagos no adaptados. No entanto, a atuao deles tanto em plantas como em vertebrados no pode ser considerada como hormonal (BTHORI, 1998).

8.1.3.

Atividade biolgica
Estudos realizados sobre os efeitos dos ecdisterides em vertebrados

foram iniciados com os trabalhos pioneiros de Burdette entre 1960-1974, inicialmente com extratos de insetos e, posteriormente, com a ecdisona sinttica (SLMA & LAFONT, 1995). Atualmente, sabe-se que a 20-hidroxiecdisona (20E) influencia a diferenciao da epiderme humana in vitro, aumentando o nmero de camadas celulares e melhorando a expresso de marcadores de diferenciao e maturao. Tal conhecimento rendeu a patente de uma formulao que contm a 20E, lecitina e sitosterol num lipossomo que se encontra incorporado a um gel, o qual usado para estimular a cicatrizao de ferimentos e regenerao da pele e no tratamento de

317

psorase, porm ainda no est sendo comercializada. usada na preparao de cremes hidratantes (50-300 mg/100 g) (SLMA & LAFONT, 1995). Todos os fitoecdisterides, tanto quanto a 4-clorotestosterona usada como controle, estimulam a sntese de protenas em fgado e tecido nervoso de mamferos. A 20E aumenta a atividade da enzima acetilcolinesterase no crebro humano, com atuao semelhante ao estradiol. Diminui a atividade da protena quinase em ratos. estimulante do metabolismo geral, produzindo efeitos anablicos (aumento de massa corporal devido ao aumento de tecido muscular, promovendo mais fora e eficincia dos msculos esquelticos). Tal funo a responsvel pela existncia e comercializao de cerca de 180 formulaes contendo a 20E pura sinttica ou extratos de plantas como a Leuzea carthamoides (Asteraceae; planta russa usada como anablico e rejuvenescedor); Pfaffia paniculata (Amaranthaceae; Ginseng brasileiro, usado como estimulante geral); Ajuga decumbens (Lamiaceae); Polypodium vulgare (Polypodiaceae); Cyanotis arachnoidea da Somlia (Commelinaceae) entre outras, juntamente com vitaminas e sais minerais, sendo a maioria indicada como suplemento alimentar ou anablico, com um preo mdio de $ 30 a 60 dlares (http://ecdybase.org/ ). Em contraste com hormnios esteroidais anablicos de vertebrados, a ao anablica da 20E no est associada com efeitos colaterais adversos andrognicos, antigonadotrpicos ou timoltico e no prontamente detectada em testes antidrogas corriqueiros (SLMA & LAFONT, 1995). A 20E atua ainda sobre o corao (antiarrtmico); sobre funes neuromusculares (anestsico fraco); antioxidante; estimulante leve de reaes imunes e fagocitose; antiinflamatrio (na dose de 10-20 mg/Kg/dia to ativo quanto o acetato de cortisona), espermicida e agente quimiopreventivo do cncer (SLMA & LAFONT, 1995). A toxicidade aos mamferos extremamente baixa, sendo cerca de 9 g/Kg da 20E em ratos e no tem efeito gentico direto (SLMA & LAFONT, 1995). Na Rssia e no Japo, sementes ou raizes pulverizadas de Leuzea so adicionadas rao de gados, porcos e codornas, na concentrao de 20 %, como aditivo alimentar que produz efeito anablico sem efeitos adversos nos rgos internos como intestino, clon, fgado e rins (SLMA & LAFONT, 1995).
318

A preparao farmacutica mais importante, cujo princpio ativo est baseado na presena de ecdisterides, o Ecdisten, comercializado desde 1982 na antiga Unio Sovitica pela Medexport, Moscou. Foi desenvolvida no Instituto de Compostos Naturais da Academia Uzbek de Cincias, em Tashkent. Originalmente foi intitulada como composto natural obtido de razes de L. carthamoides. O produto indicado para estados de astenia ou astnico-depressivo; fraqueza orgnica; intoxicaes; doenas somticas e infecciosas; neurastenia; neurose; hipotenso; fadiga e efeito tnico geral sob tenso fsica e mental. As doses recomendadas so de 5 a 10 mg (1-2 plulas) oralmente, 3 vezes ao dia, antes das refeies, por 15 a 20 dias, podendo o tratamento ser repetido, se necessrio, dentro de 1-2 semanas (SLMA & LAFONT, 1995).

8.1.4. analticos

Separao cromatogrfica de ecdisterides para fins

Muitos mtodos podem ser usados para se analisar os ecdisterides. A cromatografia gasosa um deles. Geralmente a fase estacionria usada a OV-101 CG com um detector de captura de eltrons, que proporciona alta sensibilidade. No entanto, necessrio se preparar derivados trimetilsillicos ou heptafluorobutricos para se aumentar a volatilidade dos compostos, sendo que estas reaes exigem condies severas, tendo seus rendimentos reduzidos mesmo por traos de gua (BTHORI, 1998). Quanto cromatografia de camada delgada, vrias fases estacionrias podem ser usadas. A slica a mais comum, contanto que a fase mvel contenha, no mximo, 5% de gua, juntamente com diclorometano e vrios tipos de lcoois como constituintes (BTHORI, 1998). Esta tcnica requer de 10 a 30 min para o seu desenvolvimento, resultando numa boa resoluo. Vrios ecdisterides podem ser separados numa nica corrida. Porm, quando so usadas placas de alumina, a ocorrncia de decomposio dos compostos freqente. A fase reversa prefervel nos casos especficos de ecdisterides que migram conjuntamente na fase normal. A cromatografia planar utiliza vrias possibilidades de deteco das substncias separadas. A luz UV (254 nm), se a placa contm aditivos fluorescentes (slica F254); a
319

luz solar, observando-se a reao de cor com cido sulfrico; reaes cromticas com vrios outros reagentes como a 2,4-dinitrofenilidrazina, anisaldedo, tricloreto de antimnio e vanilina sulfrica, o mais comum, originando cores turquesa, amarela, marrom etc. A resoluo da separao e sensibilidade de deteco podem ser aumentadas atravs da automatao da aplicao da amostra e desenvolvimento mltiplo. A CCDA bidimensional pode ser usada para se detectar traos do componente. A cromatografia planar com fluxo forado reduz o tempo de separao (BTHORI, 1998). Na cromatografia lquida de alta eficincia, de todas as fases estacionrias estudadas, a Zorbaxsil a mais resistente s mudanas na concentrao de gua do eluente (LAFONT et al., 1994). A slica normal origina boas separaes de ecdisterides contendo 7 hidroxilas (como a Polipodina B) ou que diferem um do outro na cadeia lateral (25-R e 25-S diastereoismeros da 26hidroxiecdisona). O diclorometano, como eluente, pode causar uma reduo na sensibilidade de deteco. Para resolver este problema, usa-se tanto o cicloexano quanto o isooctano, juntamente com o isopropanol, j que no interferem na deteco. Sugere-se tambm o uso de slica trimetilsililada como fase estacionria ou a fase reversa (octadecilslica), que capaz de cobrir a vasta gama de polaridade dos ecdisterides. Neste caso, como fase mvel usa-se misturas aquosas com metanol ou acetonitrila. Usualmente, 0,1-0,01 % de cido trifluoractico ou tampes, como o fosfato de trietanolamina, so adicionados para se otimizar o formato das curvas de eluio, tornando-as simtricas. Em fase reversa, tanto a 20E quanto a Polipodina B no so bem separadas, tendo que se usar MeOH-0,1 M fosfato de trietanolamina em pH 1,8 (45:55 v/v) para se melhorar a resoluo. A fase reversa prefervel para ecdisterides de mdia polaridade que no contm a cadeia lateral ou para os glicosdeos. Devido conjugao 7-en-6-ona, a deteco por UV em 254 nm usada para se monitorar a anlise, porm este comprimento de onda sofre interferncias causadas pela absoro dos solventes da fase mvel e impurezas, como os ftalatos (BTHORI, 1998). Outras combinaes como a cromatografia planar com deteco por FABEM; CCDA com TANDEM/EM; a extrao e cromatografia com fluido supercrtico acoplada ao detector de captura de eltrons e a eletroforese capilar usando-se
320

cromatografia eletrocintica micelar so exemplos de vrios dos mtodos promissores para separao preparativa e analtica dos ecdisterides (BTHORI, 1998).

8.2. Metodologia 8.2.1. Anlise quantitativa da 20-hidroxiecdisona

Devido aos vrios empregos, j citados, que a 20E pode ter, decidiu-se quantificar a mesma no extrato metanlico de galhos de V. polygama, para se verificar a viabilidade de sua explorao comercial. A concentrao de uma substncia contida em uma amostra pode ser determinada utilizando-se CLAE, atravs da construo de curvas de calibrao, as quais podem ser obtidas por 3 mtodos diferentes: padro externo, padro interno e adio de padro (RIBANI et al., 2004). A seguir, descrevem-se os mtodos empregados neste trabalho. O mtodo de padronizao externa compara a rea da substncia a ser quantificada na amostra com reas obtidas de solues de concentraes conhecidas preparadas a partir de um padro. Preparam-se solues da substncia a ser quantificada em diversas concentraes; obtm-se o cromatograma correspondente a cada uma delas e, em um grfico, relacionam-se as reas obtidas com as concentraes (RIBANI et al., 2004). O mtodo de adio de padro consiste na adio de quantidades conhecidas da substncia de interesse que est sendo analisada a quantidades conhecidas da amostra, antes do seu preparo. Estas amostras, que tm o padro incorporado, so utilizadas para a obteno dos cromatogramas. Constri-se uma curva analtica relacionando as quantidades da substncia adicionada amostra com as respectivas reas obtidas. O ponto onde a reta corta o eixo das ordenadas corresponde rea do pico da substncia que est sendo determinada, sem qualquer adio de padro. A extrapolao da reta define, no eixo das abcissas, a concentrao da substncia na amostra analisada. Este mtodo especialmente importante quando a amostra muito complexa, quando as interaes com a matriz so significativas e a

321

matriz no isenta da substncia de interesse (RIBANI et al., 2004), que o nosso caso. O mtodo desenvolvido para a quantificao da 20E foi validado seguindo-se uma srie de parmetros analticos recomendados pela ANVISA (2003) e INMETRO (2003): seletividade, linearidade, preciso, exatido, limite de deteco e limite de quantificao.

8.2.2.

Preparao do extrato
1,4 Kg de galhos frescos (coletados em Poos de Caldas, em abril de

2004) foram raspados superficialmente para retirada de musgos e lquens. Logo depois, foram deixados temperatura ambiente por quatro dias e, posteriormente, secos em estufa a 40C por 3 dias. O material seco foi modo e deixado em macerao com 6 litros de MeOH por 5 dias; depois foi filtrado e evaporado em rotaevaporador, sendo o restante evaporado na capela de exausto. Tal procedimento foi repetido quatro vezes, usando-se um total de 10 L de MeOH, sempre reutilizando-se o mesmo solvente aps evaporao.

8.2.3.

Preparao da coluna analtica

2,5 g de slica fenil-hexil Luna 10 foram suspensos em 45 mL de MeOH

grau CLAE, previamente filtrado, e sonicados por 2 minutos. Uma coluna de ao inox de 150 x 4,6 mm (DI) foi muito bem limpa interiormente com algodo embebido em metanol. Aps este procedimento, foi acoplada ao aparelho empacotador de colunas e a suspenso de slica foi transferida para o interior da coluna com o auxlio de um funil. A seguir, o sistema foi fechado e foram bombeados 100 mL de MeOH atravs da coluna no sentido de cima para baixo e, depois, 150 mL de MeOH no sentido inverso, para se retirar possveis bolhas formadas. Depois, desligou-se o aparelho e esperou-se a presso (7000 psi) zerar para se abrir o sistema, observando se a cabea da coluna ficou completa com a fase. A coluna recm empacotada foi acoplada ao aparelho de CLAE e condicionada por quatro horas em MeOH, ao fluxo de 0,5 mL/min. Aps ser condicionada, 10 L de uma soluo de padres (benzamida 3,7 mg; acetofenona 0,6
322

mg e benzofenona 0,7 mg para 100 mL 70 % MeOH/H2O) foi injetada, nas condies especificadas na Tabela 8-1, para se conferir se a coluna foi empacotada corretamente.

Tabela 8-1- Condies empregadas na CLAE para anlise qualitativa dos padres
benzamida, acetofenona e benzofenona na coluna analtica recm empacotada Coluna Temperatura da coluna Detector Fluxo da fase mvel Volume injetado da amostra Fase mvel Eluio isocrtica Bombas 1 e 2 Sistema de tratamento de dados Fenil-hexil Luna (150 x 4,6 mm x 10 m) Ambiente climatizado ( 25C) UV-VIS SPD-10A SHIMADZU = 254 nm 1 mL/min 10 L (soluo 1 mg extrato/1mL MeOH) A: H2O e B: MeOH 50 % de B LC-10 AD, SHIMADZU LC-Work Station Class LC-10

8.2.4.

Gradiente exploratrio
Para se determinar o tipo de eluio que seria usado na anlise e

quantificao da 20E, empregou-se a fase estacionria fenil-hexil Luna 5 e a mistura MeOH/H2O como fase mvel, no modo reverso, usando-se eluio gradiente (SNYDER, R. L. et al.; 1997). As condies de anlise esto expostas na Tabela 8-2.

323

Tabela 8-2- Condies empregadas na CLAE para anlise quantitativa da 20E

presente no extrato metanlico de galhos de V. polygama Coluna Temperatura da coluna Detector Fluxo da fase mvel Volume injetado da amostra Fase mvel Programao do gradiente Bombas 1 e 2 Sistema de tratamento de dados Fenil-hexil Luna (250 x 4,6 mm x 5 m) Ambiente climatizado ( 25C) UV-VIS SPD-10A SHIMADZU = 254 nm 1 mL/min 10 L (soluo 1 mg extrato/1 mL MeOH) A: H2O e B: MeOH 5-100 % de B em 30 min LC-10 AD, SHIMADZU LC-Work Station Class LC-10

8.2.5.

Pr-tratamento do extrato

Baseando-se no cromatograma obtido (Figura 8-3), pode-se observar que nos primeiros 16 minutos de corrida foram detectadas vrias substncias mais hidroflicas que a 20E e que deveriam ser previamente retiradas do extrato para se evitar interferncia na anlise do analito desejado aps o acerto do gradiente. Optouse, ento, pela extrao em fase slida, usando-se cartucho C-18 (1 mL) e vrias solues de H2O/MeOH em diferentes concentraes (1:1; 7:3; 8:2 e 85:15) foram testadas como eluentes de extrao destes interferentes. Cada cartucho foi previamente ativado com 4 mL de MeOH grau CLAE e condicionado com 4 mL de H2O desionizada (desativao). Posteriormente, aplicou-se a soluo, previamente preparada e sonicada de 10 mg do extrato com 1 mL H2O/MeOH na concentrao teste, no cartucho e efetuou-se uma lavagem do mesmo com mais 3 mL da soluo H2O/MeOH teste, coletando-se os 4 mL totais desta alquota. Depois, lavou-se novamente o cartucho com 4 mL de MeOH, supondo-se que o analito de interesse ficou adsorvido no cartucho e foi eludo com esta ltima lavagem. Para se verificar qual o melhor eluente de extrao (o que retirou maior quantidade de interferentes, deixando todo o analito de interesse retido no cartucho),

324

10 L de cada soluo metanlica final, obtida aps o pr-tratamento do extrato, foram injetados no aparelho de CLAE, usando-se as condies especificadas na Tabela 8-3.

Tabela 8-3- Condies empregadas na CLAE para anlise qualitativa da 20E

presente na soluo metanlica originada do pr-tratamento do extrato metanlico de galhos de V. polygama em cartucho C-18 Coluna Temperatura da coluna Detector Fluxo da fase mvel Volume injetado da amostra Fase mvel Programao do gradiente Bombas 1 e 2 Sistema de tratamento de dados Fenil-hexil Luna (150 x 4,6 mm x 10 m) Ambiente climatizado ( 25C) UV-VIS SPD-10A SHIMADZU = 254 nm 1 mL/min 10 L (soluo 1 mg extrato/1 mL MeOH) A: H2O e B: MeOH 50-100 % de B em 17 min e 35-100 % de B em 20 min LC-10 AD, SHIMADZU LC-Work Station Class LC-10

8.2.6.

Purificao e determinao da pureza do padro 20E

20,0 mg de 20E, isolada anteriormente da partio em acetato de etila do

extrato metanlico de galhos de V. polygama, foram aplicados numa placa preparativa com slica F254 de 20,0 x 20,0 cm. Uma soluo de diclorometano/acetona 4:6 foi usada como eluente e foram realizadas duas eluies consecutivas (tcnica do desenvolvimento mltiplo). 1 mg de 20E, obtido acima, foi dissolvido em 1 mL de MeOH. 10 L desta soluo foram injetados no aparelho de CLAE, usando-se as condies especificadas na Tabela 8-3, sendo que o gradiente foi de 40-100 % de B e usou-se o detector de UV acoplado ao arranjo de diodo (DAD/UV-VIS) para se determinar a pureza do padro. O mesmo volume de soluo metanlica final, obtida aps o prtratamento do extrato em cartucho C-18 empregando-se a soluo extratora de
325

H2O/MeOH 85:15, foi injetado no aparelho de CLAE, usando-se as mesmas condies de anlise do padro, para se estimar a concentrao do analito na matriz.

8.2.7.

Soluo estoque do padro externo e preparao das

amostras para a construo da curva de calibrao externa

Uma soluo estoque do padro 20E (1000 g/mL) foi preparada e acondicionada sob refrigerao (4 C). Alquotas de 100, 75, 50, 40, 30, 20 e 10 L foram transferidas para tubos de vidro (10 x 1,2 cm) e o solvente (MeOH) foi totalmente evaporado temperatura ambiente, sob uma fraca corrente de ar comprimido. O resduo seco foi redissolvido em 1000 L de uma soluo metanlica aquosa a 15 % e agitado no vortex por 10 s para se obterem ento solues de 100, 75, 50, 40, 30, 20 e 10 g/mL, repectivamente. Foram medidas alquotas de 50 L de cada soluo obtida para serem aplicadas em cartuchos C18 (1mL) previamente condicionados (4mL de MeOH e 4 mL de gua) e, posteriormente, lavadas com 4 mL de uma soluo metanlica aquosa a 15 %. Aps o cartucho secar, o analito adsorvido foi retirado com 1 mL de MeOH, resultando solues de 5, 3,75, 2,5, 2,0, 1,5, 1,0 e 0,5 g/mL. Estas amostras, preparadas em triplicata, foram transferidas para os vials e alquotas de 20 L foram injetadas na coluna. Os dados obtidos foram usados na determinao da curva de calibrao externa, a qual foi construda plotando-se as concentraes das solues do pradro 20E pelas reas correspondentes.

8.2.8. padro

Soluo estoque do extrato e preparao das

amostras para a construo da curva de calibrao por adio de

A soluo estoque do extrato (500 g/mL) foi obtida atravs da dissoluo de 2,0 mg do extrato bruto em 4 mL de metanol atravs de agitao por ultra som por 15 s. Alquotas de 50 L foram transferidas para os tubos de vidro seguidas de 50 L de soluo padro (sesso 8.2.7) nas concentraes de 3,75, 2,5, 2,0, 1,5 e 1,0 g/mL, respectivamente e agitadas por 10 s. O solvente (MeOH) foi totalmente evaporado temperatura ambiente, sob uma fraca corrente de ar comprimido. O resduo seco foi
326

redissolvido em 1000 L de uma soluo metanlica aquosa a 15 % e agitado no vortex por 10 s. Posteriormente a esta soluo foi passada atravs do cartucho C18 (pr-condicionados). Depois, seguiu-se o mesmo procedimento da sesso 8.2.7. Uma alquota da soluo estoque do extrato pr-tratada sem adio do padro foi obtida para se considerar a influncia da matriz.

8.2.9.

Recuperao
A recuperao relativa foi determinada usando-se solues controle do

padro nas concentraes de 0,55, 3,0 e 4,5 g/mL, preparadas segundo o mesmo procedimento da sesso 8.2.7. As mdias das reas dos picos de 5 amostras prtratadas (em cartucho C18) foram comparadas com aquelas de 5 amostras no tratadas para derivar a porcentagem de recuperao. A recuperao absoluta foi calculada usando-se os parmetros a e b obtidos na equao da curva de adio de padro.

8.2.10.

Preciso

Amostras nas mesmas concentraes usadas no experimento de recuperao relativa foram usadas para se avaliar a variabilidade inter- e intra-dia. O experimento foi realizado em quintuplicata e analisado em 3 dias no-consecutivos. A preciso foi expressa atravs da estimativa do desvio padro relativo ou coeficiente de variao (CV).

8.2.11.

Exatido

A exatido do mtodo foi avaliada pelo mtodo de adio de padro e atravs do teste do duplo cego (por no dispormos de amostras certificadas), onde duas solues de concentraes desconhecidas foram preparadas por um outro analista. As amostras tambm foram analisadas em triplicata.

327

8.2.12.

Seletividade

Amostras de padro e do extrato pr-tratado foram ensaiadas numa corrida analtica usando-se o detector de UV acoplado ao arranjo de diodo (DAD/UVVIS) para se avaliar a pureza do pico.

8.2.13.

Limites de deteco (LD) e quantificao (LQ)

O LD foi determinado usando-se o mtodo do sinal/rudo 3:1 (RIBANI et al., 2004). O LQ foi estabelecido analisando-se solues do padro 20E diludas em srie, e foi considerado como a concentrao na qual o mtodo capaz de quantificar o analito de interesse dentro de uma faixa de 20 % de variabilidade.

8.3. Resultados e discusses 8.3.1. Preparao do extrato

A utilizao de MeOH como nico solvente extrator possibilitou um rendimento de 4,9 % da massa seca (galhos secos e modos), o mesmo ocorrendo quando se usou hexano seguido de metanol. Logo, a extrao usando-se apenas MeOH eficiente e economiza tempo e solvente, porm no temos a quantia de 20 E presente em cada extrato para saber qual mtodo o mais eficiente na extrao da substncia de interesse.

8.3.2.

Preparao da coluna analtica

De acordo com o cromatograma obtido (Figura 8-2), pode-se observar

que os tempos de reteno dos padres benzamida, acetofenona e benzofenona (2,2; 3,8 e 9,7 min) esto prximos dos recomendados pelo fabricante. A coluna apresentou boa resoluo, com um nmero de pratos tericos N = 7900 (CASS & DEGANI, 2001), similar ao de uma coluna comercial (N = 6000-12000).

328

80

60

ABS(mABS)

40

20

0 0 2 4 6 8 10 12 14

Tempo(min.)

Figura 8-2- Cromatograma da mistura de padres

Vide condies cromatogrficas na Tabela 8-1

8.3.3.

Gradiente exploratrio
A partir do cromatograma obtido (Figura 8-3), observou-se que seria

necessria a retirada das substncias mais hidroflicas do extrato. Alm disso, foram possveis os clculos da inclinao da curva do solvente e da concentrao de MeOH necessria para extrao do analito de interesse da coluna, como se segue abaixo: Fluxo de MeOH/min (inclinao da curva) = variao de MeOH no gradiente exploratrio / tempo da corrida Inclinao da curva = (100-5 ) / 30 3,17mL/min O pico referente 20E foi detectado aos 23 minutos (na coluna de 5), logo, a concentrao de B na fase mvel necessria para a extrao do analito, nas condies especificadas na Tabela 8-2, foi: Conc. B = 23 x 3,17 72,7 + 5 (incio do gradiente) 78 % MeOH

329

20-hidroxiecdisona 20-OH-ecdisona
120 100 80

ABS(mABS)

60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo(min.)

Figura 8-3- Cromatograma do extrato metanlico de galhos de V. polygama

Vide condies cromatogrficas na Tabela 8-2

8.3.4.

Pr-tratamento do extrato
A soluo de H2O/MeOH 85:15 foi escolhida como melhor eluente de

extrao dos interferentes sem carrear conjuntamente o analito de interesse. Mantendo-se a mesma inclinao da curva, a variao de gradiente de 35-100 % de B em 20 minutos mostrou-se a melhor condio para a anlise quantitativa da 20E na soluo metanlica final. Baseando-se no tempo de reteno do analito e na concentrao de MeOH na qual o analito saiu da coluna, concluiu-se que a anlise poderia ser realizada no modo de eluio isocrtica. Aps serem testadas as fases mveis na concentrao de 50, 45 e 40 % de B, a ltima foi escolhida como a ideal, pois proporcionou uma separao de linha de base (Figura 8-4).

330

350

300

Extrato
250

Padro

pr Tratado

200 mABS 150 100 50 0 0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00 Tempo (Min)

12,00

14,00

16,00

18,00

20,00

Figura 8-4- Cromatograma da anlise da 20-hidroxiecdisona no extrato metanlico de

galhos de V. polygama: (azul) extrato; (verde) extrato pr-tratado em cartucho C-18; (rosa) padro
Condies cromatogrficas vide Tabela 8-3 (isocrtico 40 % B)

8.3.5.

Determinao da pureza do padro 20E e seletividade

Aps o trmino da corrida de 10 L da soluo padro, nas condies j

especificadas na sesso 8.2.6, a leitura do UV, acoplado ao dispositivo diodo, indicou que a banda cromatogrfica do padro apresentava pureza de 99,51 % (boa seletividade do mtodo) e a rea correspondente ao pico de 12975544 (Figura 8-4). A rea correspondente ao pico da soluo metanlica final, proveniente do prtratamento do extrato com a soluo H2O/MeOH 85:15, foi de 1502445. Como a soluo padro foi preparada na concentrao de 1000g/mL, fez-se a relao direta: 10 l = (0,01 x 0,9951) mg Conc. 20E em 10 l do extrato pr-tratado = (1502445 conc. em 4 ml = 0,46089 mg conc. x 0,009951) : 12975544 0,0011522 mg % do peso seco dos galhos (1,4 Kg).

em 69,2 g de extrato bruto = 3,19 g 20E, o que corresponde, aproximadamente, a 0,23

331

8.3.6.

Validao do mtodo

8.3.6.1. Linearidade
Os dados adquiridos da curva de calibrao do padro externo (Figura 85) e o valor do coeficiente de correlao (r) acima de 0,999 permitiram verificar que no houve desvio da linearidade dentro da faixa de concentraes de 20-hidroxiecdisona selecionadas. A curva de calibrao com adio do padro foi obtida para se verificar a influncia da matriz. Esta curva tambm revelou uma boa linearidade, com coeficiente de correlao (r) igual a 0,990 (Figura 8-5).

8.3.6.2. Preciso e exatido

A preciso intra- e inter-dia foi avaliada usando os dados obtidos das concentraes controle analisadas num perodo de 3 dias no-consecutivos. Os resultados esto na Tabela 8-4 e esto expressos como coeficientes de variao (CV). A exatido obtida atravs do clculo emprico entre a quantidade encontrada e a quantidade adicionada de padro nas trs concentraes examinadas est expressa em porcentagem. As duas solues de concentraes desconhecidas (cego) apresentaram CV de 1,56 e 0,32 %, com exatido de 102,8 e 103,6 %, respectivamente.

332

120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 0

y = 19378x + 2796,3 r = 0,9996

Area

Concentrao (g/mL)

120000 100000 80000 Area 60000 40000 20000 0 0 1 2 y = 19721x + 25196 r = 0,990 3 4

Concentrao (g/mL)

Figura 8-5- Curvas de calibrao para a 20-hidroxiecdisona:

padro externo (acima), adio de padro (abaixo)

Tabela 8-4- Dados da preciso e exatido da quantificao da 20-hidroxiecdisona,

inter-dia (n = 5) Concentrao (g/mL) 0.55 3.0 4.5 1 dia
CV % exatido %

2 dia
CV % exatido %

3 dia
CV % exatido %

1.76 1.22 0.91

97.5 100.2 106.5

1.73 1.05 0.62

97.1 101.4 107.2

1.18 1.16 0.52

95.0 99.4 103.4

333

8.3.6.3. Limite de quantificao e limite de deteco

O LQ para a 20-hidroxiecdisona foi de 400 ng/mL, com um CV de 0,25 % e 81 % exatido. O LD foi de 180 ng/mL.

8.3.6.4. Recuperao
A recuperao relativa foi de 100 4 (n = 5). A recuperao absoluta foi de 91 %, sendo determinada atravs da comparao da concentrao do analito obtida atravs da curva de calibrao externa com aquela originada dos parmetros obtidos da equao da curva de calibrao com adio de padro. A anlise dos dados revelou que o contedo de 20E no extrato metanlico de galhos de V. polygama equivalente a 0,27 % do peso seco dos galhos (2528 g/g), a qual relativamente alta em comparao com outras plantas que tm sido comercializadas, por exemplo, o extrato etanlico de razes da planta russa Leuzea (0,4 % da matria seca; SLMA & LAFONT, 1995). Vale ressaltar que estamos trabalhando com uma planta brasileira e que 25 mg de 20E sinttica custam $ 242,80 dlares.

334

9.Ensaios bioqumicos e biolgicos

9.1. Verificao de inibio das enzimas gliceraldedo 3fosfatodesidrogenase (GAPDH) e adenina fosforribosiltransferase (APRT) 9.1.1. Local de realizao
Estes experimentos foram realizados pelo tcnico de laboratrio Eli F. Pimenta, no laboratrio de cristalografia do IFSC/USP/SO CARLOS, com reagentes preparados por tcnicos do departamento sob a orientao dos professores doutores Glaucius Oliva e Otvio Henrique Thiemann.

9.1.2. gGAPDH
A

Mtodo para avaliao de inibio enzimtica da

medida

da

atividade

enzimtica

baseou-se

em

procedimento

previamente descrito por VIEIRA et al. (2001). A atividade da enzima foi medida colocando-a na presena do substrato, gliceraldedo-3-fosfato (G3P), do cofator NAD+ e do arseniato de sdio, inibidor da reao inversa, em cubeta de quartzo, nas seguintes concentraes finais: tampo Tris/HCl 50 mM pH 8,6 (1mM EDTA, 1mM p-mercaptoetanol), NAD+ (2 mM), arseniato de sdio 30 mM, G3P (300 M) e 5 L de enzima (100 nM; concentrao determinada pelo mtodo de BRADFORD, 1976) e 100 L da soluo do extrato a ser testado (1mg de extrato em 1 mL DMSO ou, para substncias puras, solues de 200 ou 100 M). Imediatamente aps a adio de todos os reagentes, iniciou-se a leitura. A reao foi acompanhada atravs da absoro de UV a 340 nm ao longo de 30 s de produto formado, o NADH. O teste foi feito em triplicata. Como controle, fez-se um teste para verificao da atividade enzimtica, onde foram adicionados 437,5 L de tampo e nada de extrato aos reagentes mencionados acima. O teste testemunha foi realizado substituindo-se os 100 L de soluo de extrato por 100 L de DMSO, tambm sendo repetido 3 vezes. A atividade especfica da enzima pura foi de 150 l de NADH formado por mg/min.
336

9.1.3. APRT

Mtodo para avaliao de inibio enzimtica da

A atividade da enzima APRT foi medida adicionando-se 3,8 L da mesma numa mistura reacional com a concentrao final de 0,01 mM de adenina, 0,5 mM de PRPP (5-fosforribosil-1-pirofosfato), 5 mM de MgCl2 e tampo Tris/HCl 100 mM, pH 7,4 (TUTTLE & KRENITSKY, 1980). Para cada teste foram usados 475 L da mistura reacional e 25 L das solues dos possveis inibidores, de forma que a concentrao final do extrato (ou frao) a ser testado fosse de 50 g/mL. Imediatamente aps a adio de todos os reagentes, iniciou-se a leitura. A reao foi acompanhada atravs da absoro a 259 nm, durante 60 s, do produto formado, AMP. A atividade especfica da enzima pura foi de 0,0011668 mM de AMP formado por mg/min.

9.1.4.

Metodologia para o ensaio de inibio da atividade da

enzima GAPDH em placa ELISA

Os experimentos para verificao da atividade inibitria dos extratos e substncias puras sobre a GAPDH tambm foram realizados em placa ELISA com 96 poos de 300 L cada. Em cada poo foram adicionados 9 L do substrato G3P (10 mM), 15 L do cofator NAD+ (40 mg/mL), 9 L do arseniato de sdio (1 M), 232,5 L do tampo Tris/HCL 50 mM, pH 8,6 (1 mM EDTA, 1mM -mercaptoetanol), 1,5 L da enzima e 30 L da soluo (1 mg/1 mL DMSO) da substncia ou extrato a ser testado. Imediatamente aps a adio de todos os reagentes, foi efetuada a leitura num espectrofotmetro de luz ultravioleta no comprimento de onda de 340 nm. A reao foi acompanhada ao longo de 60 s em intervalos de 12 s.

9.1.5.

Metodologia para o ensaio de inibio da atividade da

enzima APRT em placa ELISA

Os experimentos para verificao da atividade inibitria dos extratos e substncias puras sobre a APRT tambm foram realizados em placa ELISA com 96 poos de 300 L cada. Em cada poo foram adicionados 2,5 L da enzima, 132,5 L
337

de gua desionizada, 15 L da soluo (1 mg/1 mL DMSO) da substncia ou extrato a ser testado e 150 L da mistura reacional contendo 0,01 mM de adenina, 0,5 mM de PRPP (5-fosforribosil-1-pirofosfato), 5 mg de MgCl2 e tampo Tris 100 mM, pH 7,4. Porm, este ensaio no foi considerado, j que a placa era meio fosca e interferiu na leitura do resultado fornecido atravs da absoro no espectrofotmetro de luz ultravioleta do produto formado.

9.1.6.

Clculo dos resultados

A partir dos valores observados de absorbncia na reao sem inibidor

(controle) e na reao na presena do pretenso inibidor, calculou-se a atividade especfica da enzima e a porcentagem de inibio da atividade enzimtica, equaes 1.1 e 1.2, respectivamente, para uma dada concentrao do inibidor na cubeta (ou poo) de reao. Ativ. Espec. (U/mg) = da enzima x [enzima]} {[absorbncia/t] x volume da cubeta} / {NADH x volume [ 1.1]

Onde, para a GAPDH, t = 1/60 min; volume da cubeta = 0,5 mL ou 0,3 mL (placa de ELISA); NADH = 6,22 mM-1cm-1; volume da enzima = 0,0025 ou 0,0015 mL; [enzima] = varivel e dada em mg/mL; absorbncia = coeficiente angular da reta (calculado atravs do programa Origin ou Excel). Onde, para a APRT, os valores que mudam so o NADH = 1,24 mM-1cm-1 e o volume da enzima = 0,0038 mL ou 0,0025 mL. % Inibio = 100 [{[Ativ. Espec. (controle) Ativ. Espec. (c/ inibidor)]/(Ativ. Espec. (controle)} x 100] nica varivel e a equao 1.3 foi usada: % Inibio = 100 - {[mdia absorbncia (com inibidor) / mdia absorbncia (controle)] x 100} [1.3] [1.2] No caso dos clculos de CI50, levou-se em conta que a absoro a

338

9.1.7.

Determinao da CI50
At o presente momento, a CI50 era tratada como a concentrao de

inibidor que causava uma reduo de 50 % na atividade da enzima. Porm, os estudos de frmacos exigiram um tratamento desse conceito e a determinao da CI50 seguiu o seguinte procedimento: aps determinada a faixa de inibio da substncia, foi realizado um teste de inibio numa concentrao prxima CI50. Alm disso, foram efetuados mais quatro ensaios, sendo dois com concentraes inferiores CI50 e dois com concentraes superiores CI50. A partir destes dados, extrapolou-se o valor da CI50 por regresso linear dos cinco pontos ( entre 20-80 % de inibio), sendo cada ponto correspondente mdia de trs resultados. Posteriormente, tais dados foram tratados estatisticamente pelo programa Sigma Plot. Por isso, em alguns artigos, tal valor, obtido atravs deste clculo, chamado de I50. Com o objetivo de tambm se padronizar as concentraes, todas as sustncias foram testadas nas concentraes de 200 ou 100 M.

9.1.8.

Teste de interao qumica entre os taninos e a APRT

Os taninos so substncias naturais polifenlicas que se encontram

classificadas, de acordo com suas caractersticas estruturais, em quatro grandes grupos: a) Galotaninos, que apresentam unidades galoil, ou derivados metadepsdicos, ligadas a diversos poliis, catequinas ou triterpenides. b) Elagitaninos, nos quais pelo menos duas unidades galoil se encontram unidas por ligaes C-C e no contm ligaes com catequinas. c) Taninos complexos, onde uma unidade de catequina est ligada a um galotanino ou elagitanino. d) Taninos condensados, sendo todos do tipo proantocianidinas oligomricas ou polimricas formadas por ligaes entre o C-4 de uma unidade de catequina com o C-8 ou C-6 de outro monmero de catequina. Os trs primeiros grupos so passveis hidrlise quando tratados com gua fervente, enzimas ou em meios levemente cidos ou bsicos. Tal propriedade fez

339

com que fossem denominados de taninos hidrolisveis. Os taninos condensados, que no sofrem hidrlise, foram includos no grupo dos taninos no hidrolisveis (KHANBABAEE & REE, 2001). O termo tanino originou-se da palavra francesa tanin que siginifica curtir a pele dos animais transformando-a em couro. Isso possvel devido propriedade que os taninos apresentam de formar ligaes hidrognio entre os seus grupos hidroxlicos fenlicos e os grupos amina ou amida livres da protena da pele (colgeno), enfraquecendo as ligaes que mantm a forma desta protena, formando um dmero da protena envolvido com o polifenol, precipitando-a e tornando o couro imputrescvel (CHARLTON et al., 2002). Em virtude da grande diversidade qumica, esta classe pode proporcionar outros tipos de interaes biolgicas. As propriedades reacionais dos taninos tm sido investigadas nas mais diversas reas cientficas. Eles so frequentemente associados ao sabor amargo e sensao oral de adstringncia, conseqncia de suas interaes com protenas bsicas, ricas em prolina, presentes na saliva. Podem causar alguns efeitos prejudiciais aos animais, incluindo seqestro de ferro e outros minerais, por formar quelatos com aqueles, alm de inibirem enzimas digestivas, reduzindo a digestibilidade e a palatabilidade dos alimentos. So capazes de coagular as albuminas das mucosas e tecidos, sendo empregados, por isto, em preparaes contra as inflamaes da cavidade bucal ou antidiarricas. Em baixas concentraes (1-5 M) atuam como antimutagnicos e anticarcinognicos por funcionarem como capturadores de radicais livres (antioxidantes) e reguladores do ciclo celular (JAMART, 2000). Como os taninos podem se ligar a protenas, precipitando-as (CHARLTON et al., 2002), produzindo uma ao inibitria no especfica sobre as mesmas, foi realizada uma investigao para se observar o comportamento de alguns dos taninos identificados, que so do grupo dos taninos hidrolisveis, frente s enzimas APRT, GAPDH e pectinase e todos os outros reagentes do ensaio bioqumico.

9.1.8.1. Preparo das solues

Foram preparadas solues 1mg/mL dos taninos em gua (ST); soluo do PRPP + tampo + MgCl2 (PRPP); adenina + tampo + MgCl2 (AD) e enzima +
340

tampo (EZ). Todas as solues foram conservadas em gelo para se minimizar a degradao que podem sofrer. O comprimento de onda usado foi o mesmo do ensaio original, 259 nm.

9.1.8.2. Teste com a enzima

Foram feitas leituras no UV usando-se uma cubeta com a mistura de 250 L de tampo + 225 L H2O + 25 L ST (para zerar o aparelho) e 250 L de tampo + 225 L H2O + 25 L ST + 3,8 L EZ na outra cubeta.

9.1.8.3. Teste com o PRPP

Foram feitas leituras no UV usando-se uma cubeta com a mistura de 250 L de PRPP + 250 L H2O (para zerar o aparelho) e 250 L de PRPP + 225 L H2O + 25 L ST na outra cubeta.

9.1.8.4. Teste com a Adenina

Foram feitas leituras no UV usando-se uma cubeta com a mistura de 250 L de AD + 250 L H2O (para zerar o aparelho) e 250 L de AD + 225 L H2O + 25 L ST na outra cubeta.

9.1.9. enzima GAPDH

Teste de interao qumica entre os taninos e a

9.1.9.1. Preparo das solues

Foram preparadas solues de 200 M dos taninos castalagina, casuarinina e ramnopiranosdeo do cido elgico em DMSO (STT); solues tampo no pH 8,6 e 7,5; soluo 100 M de NAD+ e as demais solues reagentes foram preparadas como especificadas na sesso 9.1.3. Foram realizados os espectros de UV dos taninos e feita uma sobreposio ao espectro de UV do NADH (produto da reao) com o objetivo de se
341

verificar se as bandas de absoro dos taninos eram semelhantes s do NADH, o que poderia estar mascarando a leitura referente ao resultado final.

9.1.9.2. Teste com NAD+

Foram feitas leituras no UV usando-se uma cubeta com a mistura de 390 L de tampo (pH 8,6) + 40 L NAD+ + arseniato (para zerar o aparelho) e 390 L de tampo (pH 8,6) + 40 L NAD+ + arseniato + 50 l STT 10 M na outra cubeta.

9.1.9.3. Teste com G3P

Foram feitas leituras no UV usando-se uma cubeta com a mistura de 390 L de tampo (pH 8,6) + 40 L NAD+ + arseniato + 15 L G3P (para zerar o aparelho) e 390 L de tampo (pH 8,6) + 40 L NAD+ + arseniato + 15 L G3P + 50 L STT 10 M na outra cubeta.

9.1.9.4. Teste com a enzima

Foram feitas leituras no UV usando-se uma cubeta com a mistura de 390 L de tampo (pH 8,6) + 40 L NAD+ + arseniato + 15 L G3P + 5 L da enzima (para zerar o aparelho) e 390 L de tampo (pH 8,6) + 40 L NAD+ + arseniato + 15 L G3P + 5 L da enzima + 50 L STT 10 M na outra cubeta.

9.1.9.5. Teste com tampo TEA em pH 7,5

Foram feitas leituras no UV usando-se uma cubeta com a mistura de 390 L de tampo trietanolamina (TEA, pH 7,5) + 40 L NAD+ + arseniato + 15 L G3P + 5 L da enzima (para zerar o aparelho) e 390 L de tampo (pH 7,5) + 40 L NAD+ + arseniato + 15 L G3P + 5 L da enzima + 50 L STT 10 M na outra cubeta.

342

9.2. Verificao de atividade inseticida sobre Spodoptera frugiperda 9.2.1. Introduo

A Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), conhecida por lagarta dos milharais, ataca o cartucho do milho, chegando a destruir completamente a planta. Pode reduzir at cerca de 20 % da produo de milho. Ataca tambm as culturas de tomate, arroz, algodo, cana, amendoim, hortalias e capinzais (GALLO et al., 1988).

9.2.2.

Local de realizao
Este experimento foi realizado no Laboratrio de bioensaios do DQ-

UFSCar pela doutora Luciane Gomes Batista Pereira, Waldirene Caldas Rocha, Milana R. de Souza, Marina T. M. da Silva e por mim, Margareth B. C. Gallo, ou no Laboratrio de Plantas Inseticidas do Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrcola da ESALQ/USP Piracicaba, pelos alunos Uemerson Silva da Cunha e Fernanda Alessandro Diogo, sob a orientao do professor doutor Jos Djair Vendramim.

9.2.3.

Criao artificial da S. frugiperda

As lagartas de S. frugiperda foram obtidas a partir de uma criao

artificial, mantida no laboratrio de bioensaios, onde as pupas foram sexadas e colocadas separadamente em gaiolas de 40,0 x 40,0 cm e, como alimento, foram fornecidas solues aucaradas para os adultos que emergem das pupas. Os machos e as fmeas recm-emergidos foram coletados e transferidos para as gaiolas de PVC (tubos com 20,0 cm) forradas com papel branco e cobertas com fil. Foram alimentados diariamente com soluo aucarada de mel 5 %. Os ovos foram recortados e colocados sobre papel toalha ou sobre dieta, dentro de placas de Petri (Figura 9-1), e as lagartas recm eclodidas foram transferidas para os tubos de vidro

343

contendo a dieta artificial (KASTEN et al., 1978) onde foram realizados os experimentos.

Figura 9-1- Lagartas de S. frugiperda dentro do tubo de vidro contendo dieta artificial
(A); recm eclodidas na placa de Petri (B) e na forma adulta, mariposa (C)
Fotos de Waldir Tavares de Lima

9.2.4.

Metodologia
Os bioensaios foram divididos em duas etapas: teste preliminar, com

adio dos extratos na dieta, para verificao de atividade dos extratos brutos; teste de confirmao, com contaminao superficial da dieta, para verificao de atividade das substncias puras. No teste preliminar, os extratos e as fraes provenientes das parties dos mesmos foram dissolvidos em acetona/hexano, juntamente com o cido ascrbico (ingrediente da dieta), e deixados na capela de exausto para secagem do solvente, o qual poderia mascarar o resultado do teste por ter atividade tambm. Aps isso, foram incorporados dieta artificial, a uma concentrao de 1000 ppm, sendo misturados manualmente, a qual foi derramada em 10 tubos de vidro (8,5 X 2,5 cm, previamente esterilizados em estufa a 170oC por 1 h) que foram tampados com algodo hidrfugo (tambm previamente esterilizado). Aps isto, os tubos foram mantidos por 24 h em grades de arame para eliminao do excesso de umidade das suas paredes. A seguir, foi feita a inoculao de uma lagarta recm eclodida (1o instar) e os tubos foram mantidos sob condies de 25 1oC, 70 5 % U.R. e 12 h de fotofase (Figura 9-2). Os 10 tubos testemunhas foram confeccionados adicionando-se ao cido ascrbico
344

apenas o solvente utilizado na diluio do extrato, seguindo-se a metodologia citada. Foram avaliados os seguintes parmetros: durao da fase larval e pupal, massa das pupas e porcentagem de insetos vivos (viabilidade) e mortos ao final de cada fase. Cada recipiente contendo um inseto, independente da fase de desenvolvimento, foi considerado uma repetio, portanto o nmero de repeties foi varivel para cada tratamento. Os extratos selecionados no teste preliminar foram fracionados e as substncias identificadas, com quantidades suficientes, foram submetidas segunda etapa de testes. Nesta etapa, para os flavonides orientina/isoorientina, foram utilizados 30 tubos de vidro, contendo uma lagarta cada, e 30 tubos para as testemunhas. Os parmetros avaliados foram os mesmos do teste preliminar. Os dados foram submetidos anlise de varincia (ANOVA). A comparao das mdias foi feita pelo Teste de Tukey ou Duncan ao nvel de 1 e 5 % de significncia. Para os taninos e ecdisterides ensaiados, a segunda etapa de testes foi modificada em funo da disponibilidade de massas das substncias, mantendo-se a avaliao dos parmetros massa das lagartas e porcentagem de lagartas vivas (viabilidade) e mortas ao final de 10 dias. Nesta etapa, 12 mg de cada substncia foram dissolvidos em 3 mL de gua destilada (concentrao de 4000 ppm). 30 L desta soluo foram derramados sobre a dieta artificial, a qual se encontrava acondicionada em placa ELISA de acrlico (24 poos X 1,5 mL). Cada experimento foi realizado com quatro placas, logo, com 4 repeties. Esperou-se secar o excesso de gua da soluo derramada sobre a superfcie dos poos dentro de uma capela de fluxo laminar. A seguir, foi feita a inoculao de uma lagarta de dois dias de ecloso (ainda 1o instar) em cada poo (Figura 9-3). As placas foram bem fechadas e mantidas sob condies de 25 1oC, 70 5 % U.R e 12 h de fotofase por 10 dias. Ao fim destes, as lagartas vivas foram pesadas e o nmero de mortes foi computado. A comparao das mdias foi feita pelo Teste de Duncan ao nvel de 1 % e 5 % de significncia.

345

Figura 9-2- Teste preliminar dos extratos com lagartas de S. frugiperda (foto menor/autora) nos tubos de vidro, mantidas sob condies controladas (foto maior/ Waldir T. de Lima)

Figura 9-3- Aplicao da dieta em placa ELISA (foto maior) e inoculao das lagartas
(1 instar; foto menor) de S. frugiperda para o ensaio com substncias puras
Fotos de Waldir Tavares de Lima

346

9.3. Verificao de atividade inseticida sobre a formiga Atta sexdens rubropilosa 9.3.1. Introduo
As formigas cortadeiras (ordem Hymenoptera; famlia Formicidae; tribo Attini; gnero Atta), tambm conhecidas como savas, vivem em simbiose com o fungo do tipo basidiomiceto Leucoagaricus gongylophorus, o qual fornece alguns nutrientes e enzimas s formigas, enquanto que estas provm os fungos com grande variedade de substratos, estimulando o crescimento dos mesmos. Essas formigas, quando presentes em ambientes ecologicamente equilibrados, estimulam o crescimento das plantas por poda, fertilizam o solo e tambm contribuem na disseminao de sementes. Porm, quando ocorrem em reas de monoculturas agrcolas, podem se transformar em pragas, causando imensos danos econmicos (CHERRET, 1995). A ao das formigas cortadeiras como pragas est relacionada sua notvel capacidade de coletar folhas e outros materiais vegetais, os quais so usados para cultivar o fungo simbitico no interior de seus ninhos. Isto porque as formigas sustentam seu trabalho predominantemente com a energia extrada de carboidratos (ABOTT, 1991), entre os quais parecem ser essenciais os polissacardeos, os quais representam at 60 % da matria slida vegetal (BERNAYS & CHAPMAN, 1994). Para assimilar estes compostos, as formigas adultas necessitam de despolimerases, as quais so produzidas pelo fungo simbionte (SIQUEIRA et al., 1988). Os materiais vegetais so levados at ao formigueiro e cortados em pequenos pedaos. Em seguida, os insetos aplicam saliva sobre a matria vegetal com o objetivo de se retirar toda a cera da cutcula foliar. Aps a salivao, as operrias defecam sobre o substrato, depositando enzimas que auxiliam na degradao de protenas e polissacardeos. O fungo ento inoculado sobre essa matria vegetal recm-preparada e se desenvolve (QUINLAN & CHERRET, 1979). A cultura do fungo dentro dos ninhos denominada esponja ou jardim de fungo e uma parte vital nos ninhos de Attini. Em condies normais, as formigas mantm o fungo na fase vegetativa. Neste estgio, o fungo produz hifas espessas com
347

extremidades arredondadas chamadas gongildeos. Estas estruturas so agrupadas em cachos, chamados de estfilos, os quais so ricos em protenas e tambm consistem numa fonte energtica, tanto para o fungo quanto para as larvas das formigas, as quais os consomem. As larvas, por sua vez, produzem um lquido anal rico em glicose, o qual ingerido pelas formigas adultas (SCHNEIDER et al., 2000). Outra fonte excelente de nutrientes para as formigas adultas so os produtos da degradao fngica extracelular, presentes na esponja, decorrentes da ao das pectinases, alm de outros complexos enzimticos fngicos, sobre os polissacardeos amido e xilana, principalmente, gerando a glicose e a xilose (SIQUEIRA et al., 1988). Formigas do gnero Atta esto envolvidas em grande parte das ocorrncias de pragas agrcolas no Brasil. Para seu combate, os agricultores se valem de vrias tcnicas, desde receitas caseiras, barreiras fsicas, mtodos biolgicos e qumicos. Neste caso, existem as iscas txicas ou os inseticidas que, na maioria das vezes, no so muito eficientes, so altamente txicos devido ao seu amplo espectro de ao, alm de no serem biodegradveis, trazendo conseqncias nocivas ao meio ambiente (MARICONI, 1974). A crescente compreenso de como funciona o relacionamento simbitico entre a formiga e o fungo proporcionou o desenvolvimento de ensaios que possibilitam testar substncias que possam interferir mais especificamente nesta relao, sejam como inibidores enzimticos, fungicidas, bactericidas ou inseticidas com o intuito de se descobrir novos produtos no combate das formigas savas como praga.

9.3.2.

Local de realizao
Os ensaios com o fungo simbionte Leucoagaricus gongylophorus, com as

polissacaridases fngicas e os ensaios por ingesto com as operrias de Atta sexdens rubropilosa foram realizados no Centro de Estudos de Insetos Sociais (CEIS/UNESP/Rio Claro) pelas alunas Cnthia Zavan, sob a orientao do professor doutor Maurcio Bacci Jnior e Roberta Novaes de A. Almeida, sob a orientao do professor doutor Fernando Carlos Pagnocca.
348

9.3.3. fngicas

Metodologia do ensaio enzimtico com as pectinases

4 L da soluo da amostra a ser testada (1 mg substncia pura em 20 L DMSO) foram adicionados a uma mistura contendo 150 L de pectina ctrica Sigma P9135 (2 g de pectina em 100 mL de soluo tampo citrato/fosfato de sdio 50 mM, pH 5,0 -o mesmo do formigueiro-) e deixados em banho-maria para a soluo ficar mais homognea por alguns minutos. Aps isto, foram adicionados 75 L de lquido fecal (As formigas operrias so acondicionadas numa cmara fria, a -15oC por 10 min, para entrarem em estado de dormncia. Depois deste tempo, cada formiga tem o seu abdmem comprimido por uma pina, sendo o lquido obtido puxado com uma pipeta e transferido para uma soluo de tampo fosfato 50 mM, pH 6,0. Ao final da coleta, o total obtido diludo 500 vezes com gua) e 71 L de gua ultra pura. Como experimento controle, a mesma mistura reacional foi preparada, contendo DMSO puro, ao invs da soluo da amostra a ser testada. Como experimento "branco" (serve para zerar o aparelho de UV), a mistura reacional foi de 150 L de gua ultra pura e 150 L de pectina ctrica e s um experimento foi realizado. As misturas reacionais do controle e da amostra teste, preparadas em duplicata, foram incubadas a 37oC (A temperatura ambiente do formigueiro de cerca de 25oC). O experimento foi realizado a 37oC (tem por finalidade acelerar a atuao da enzima) sob agitao por 30 min e duas alquotas de 50 L foram coletadas nos tempos de incubao zero e final de cada experimento, a partir daqui ficando o ensaio em quadruplicata. A estas amostras foram adicionados 100 L de reagente ADNS (cido 3,5-dinitrossaliclico, oxidante dos monossacardeos redutores de cadeia aberta principalmente o cido galacturnico - formados nas reaes de hidrlise enzimtica; Esquema 7-1; HOSTETTLER et al., 1951) e 100 L de gua ultra pura e as misturas resultantes foram fervidas por 5 min. Aps isto, foram submetidas a um banho de gelo por 2 min, com a finalidade de se parar a reao enzimtica, e, logo em seguida, centrifugadas (1500 g/3 min), sendo o sobrenadante utilizado para a determinao da absorbncia a 540 nm.

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COOH OH O2 N NO2

COH H C HO C HO C OH H H O2N

COOH COOH OH NH2 H C HO C H C OH H OH

H C OH COOH
ADNS cido galacturnico

H C OH COOH

cido galactrico

ensaio bioqumico de determinao da inibio de atividade das pectinases fngicas As diferenas de absorbncia (A) entre o tempo zero e final so calculadas tanto para os experimentos feitos com a amostra em teste (AT) quanto para o controle (AC), sendo feita uma mdia dos quatro valores obtidos para cada experimento. Assim, o efeito da amostra teste sobre a atividade enzimtica foi calculado pela equao (AT/AC) x 100 e os resultados foram submetidos ao Teste Estatstico T-student (este requer, no mnimo, trs valores a serem analisados, sendo, por isto, o experimento realizado em quadruplicata).

Esquema 9-1- Reao de oxirreduo (HOSTETTLER et al., 1951) ocorrida no

9.3.3.1. Teste de interao dos taninos com a pectinase

Alm da habilidade dos taninos de se ligarem s protenas, precipitandoas (CHARLTON et al., 2002), os taninos hidrolisveis podem ser hidrolisados em meios cidos, bsicos ou por ao de enzimas (KHAMBABAEE & REE, 2001). Sendo assim, o resultado do experimento pode ser interpretado de maneira errnea. Por isso, foi realizada uma investigao para se observar o comportamento da castalagina, casuarinina e pedunculagina frente enzima pectinase e todos os outros reagentes do ensaio bioqumico, seguindo-se o procedimento j exposto (Figura 9-4).

350

Figura 9-4- Material para o ensaio bioqumico com as pectinases 9.3.3.2. Teste com a pectinase
Foram preparados os conjuntos de misturas reacionais referentes ao teste, controle do solvente e branco, sendo o teste constitudo de 4 L da soluo de tanino em DMSO (ST); 75 L do lquido fecal e 221 L de gua ultra pura. No controle, o volume relativo ST foi substitudo por igual volume de DMSO. No branco, foram misturados 150 L de lquido fecal com igual volume de gua ultra pura.

9.3.3.3. Teste com a pectina

Foram preparados os conjuntos de misturas reacionais referentes ao teste, controle do solvente e branco, sendo o teste constitudo de 4 L da soluo ST; 150 L da pectina e 146 L de gua ultra pura. No controle, o volume relativo ST foi substitudo por igual volume de DMSO. No branco, foram misturados 150 L de pectina com igual volume de gua ultra pura.

351

9.3.3.4. Teste com o tampo

Foram preparados os conjuntos de misturas reacionais referentes ao teste, controle do solvente e branco, sendo o teste constitudo de 4 L da soluo ST; 150 L da tampo e 146 L de gua ultra pura. No controle, o volume relativo ST foi substitudo por igual volume de DMSO. No branco, foram misturados 150 L de tampo com igual volume de gua ultra pura.

9.3.3.5. Teste com o ADNS

Foram preparados os conjuntos de misturas reacionais referentes ao teste, controle do solvente e branco, sendo o teste constitudo de 4 L da soluo ST e 296 L de gua ultra pura. No controle, o volume relativo ST foi substitudo por igual volume de DMSO. O branco foi constitudo apenas de 300 L de gua ultra pura.

9.3.4.

Metodologia para o ensaio com o fungo simbionte

O fungo Leucoagaricus gongylophorus foi isolado de um ninho de

formigas Atta sexdens rubropilosa, e foi mantido em condies de laboratrio por repiques mensais em meio de cultura (composio em g/L: dextrose = 10; cloreto de sdio = 5; peptona = 5; extrato de malte = 10; gar = 17) com pH de aproximadamente 6,5.

9.3.4.1. Preparo dos tubos contendo o meio de cultura

Cinco tubos de ensaio (15,0 x 2,0 cm) foram preenchidos com 9,0 mL de meio de cultura (PAGNOCCA et al., 1990) e 1,0 mL da soluo da substncia, ou extrato, a ser testada (1000 g/mL), de modo que a concentrao final da substncia fosse de 100 g/mL. Para os controles, tambm realizados em quintuplicata, aos 9,0 mL de meio de cultura foi adicionado 1,0 mL do solvente usado na preparao da soluo teste. As testemunhas continham 10,0 mL do meio. Depois disto, o conjunto de tubos, meio e substncia foram autoclavados a 120C/15 min e homogeinizados com o auxlio de um agitador tipo Vortex, por 2 min, para se propiciar uma boa incorporao
352

da substncia ao meio. Em seguida, os tubos foram inclinados e resfriados, temperatura ambiente, por trs dias, para se observar se no houve contaminao dos mesmos. Aps este tempo, 1,0 mL do inculo foi aplicado em cada tubo, sendo cuidadosamente manuseado para se obter uma distribuio uniforme dos fragmentos de miclio na superfcie do meio. Os tubos foram mantidos inclinados em sala climatizada temperatura de 25C por 30 dias.

9.3.4.2. Preparo do inculo

Para obteno do inculo, foram utilizadas culturas com 30 dias de desenvolvimento. O miclio, bem desenvolvido, de dois tubos foi transferido assepticamente para um erlenmeyer contendo 100 mL de gua peptonada estril (0,1 % p/v) para ser triturado de forma branda, num homogeinizador de Potter, visando a obteno de uma suspenso micelial homognea. Em seguida, uma amostra desta suspenso foi observada ao microscpio ptico para a constatao de possveis danos do material desagregado e da sua pureza.

9.3.4.3. Determinao da massa seca

Alquotas de 5,0 mL de inculo foram empregadas para a determinao da massa seca em cada srie de experimentos, com o intuito de se conhecer a concentrao do fungo na soluo (4-6 mg/mL o ideal). A alquota foi transferida para um vidro de relgio e levada a uma estufa de esterilizao a uma temperatura de 70C por 24 h, ou at a massa ficar constante.

9.3.4.4. Avaliao do crescimento do fungo simbionte

Aps 30 dias de incubao, a leitura do experimento foi realizada, baseando-se na quantidade e densidade do miclio, conforme padro pr-estabelecido, a saber: 5+ = crescimento idntico ao do controle = 100 % 4+ = crescimento equivalente a 80 % do controle 3+ = crescimento equivalente a 60 % do controle
353

2+ = crescimento equivalente a 40 % do controle 1+ = crescimento equivalente a 20 % do controle ou inferior 0 = ausncia de crescimento Os resultados foram baseados no valor modal entre as 5 repeties.

9.3.5.

Ensaio antimicrobiano
Alm do fungo simbionte da formiga sava, alguns extratos e substncias,

conforme a disponibilidade de massa, foram testados quanto ao potencial antimicrobiano em outras cinco bactrias e quatro leveduras, descritas abaixo respectivamente: a) Staphylococcus aureus (ATCC 6538) b) Bacillus cereus (CCT 1436) c) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442) d) Escherichia coli (CCT 1457) e) Micrococcus roseus (CCT 1469) f) Candida albicans (RJ/50008) g) Cryptococcus laurentii (RJ/50359) h) Saccharomyces cerevisae (CCT 0758) i) Trichosporon cutaneum (UCD 121) Os extratos, ou substncias, foram dissolvidos nos solventes de melhor miscibilidade, na concentrao de 1000 g/mL, e foram submetidos ao mtodo de difuso em gar. Caso os resultados fossem muito bons, determinava-se a MIC.

9.3.5.1. Mtodo de difuso em gar utilizando-se discos de papel de filtro (BAUER et al., 1966)
Alquotas de 10 L da soluo teste, previamente preparada, foram aplicada aos discos, aguardando-se a evaporao do solvente entre as aplicaes. Os discos foram colocados em estufa a 45C durante uma noite para a secagem final. Em placas de Petri contendo 15,0 mL de meio (gar Mueller-Hinton para bactrias e gar Sabouraud para fungos) foi espalhada, por meio de um swab estril,
354

uma suspenso de microrganismos recentemente preparados e diludos em soluo salina 0,9 % (previamente autoclavada, inoculada com pores do microrganismo utilizando-se uma ala de inoculao), correspondente escala McFarland 0,5. Aguardou-se um perodo de 10 a 15 min para, a seguir, se distribuir regularmente os discos (at 12 por placa) na superfcie das placas com o auxlio de uma pina, pressionando-os levemente sobre o gar. Foi mantida uma distncia mnima de 1,5 cm entre os discos e de 1,0 cm da borda para se evitar interferncia entre os halos de inibio. 15 min aps a semeadura, as placas foram invertidas e incubadas. Discos controle contendo antibiticos, antifngicos e solvente foram preparados de modo semelhante ao relatado acima. Aps o perodo de incubao, 24 h para as bactrias e 48 h para os fungos, foi realizada a leitura dos resultados. Os extratos ou substncias que provocaram um halo de inibio de 8 mm, ou superior, foram considerados ativos, sendo os microrganismos susceptveis a estes.

9.3.5.2. Determinao da concentrao inibitria mnima (MIC) pelo mtodo da microdiluio com Alamar Blue (MABA)
Esta tcnica (SALVAT et al., 2001) foi utilizada somente com bactrias, pois o meio adequado para leveduras (RPMI-1640) no estava disponvel. Em uma microplaca estril de 96 poos, foram depositados 100 L de meio Mueller-Hinton, com exceo da coluna A, o controle das amostras, que recebeu 150 L. Na coluna A foram acrescentados 50 L da soluo da substncia, ou extrato, a ser testada (uma substncia diferente para cada nmero); na coluna B, 100 L da mesma substncia foram homogeinizados com o meio e transferidos para o pocinho seguinte, repetindo-se este procedimento at coluna H, de modo a se obter uma concentrao decrescente da substncia. Os 100 L finais foram desprezados. Logo aps, foram adicionados, nos pocinhos (com exceo da coluna A), 100 L de uma suspenso do microrganismo teste de crescimento recente (24 h), cuja turvao foi comparada escala de McFarland 0,5, e diludos para a concentrao final de 104 clulas/mL. Por ltimo, foram adicionados 20 L de Alamar Blue (indicador de xidoreduo). As placas foram seladas com parafilme e incubadas a 35C/24 h. A MIC foi
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definida como a menor concentrao da substncia capaz de impedir a mudana de cor azul para rseo, ou a menor concentrao do composto que inibi completamente o crescimento macroscpico do microrganismo. Uma das colunas (a de nmero 1) sempre foi utilizada para um controle com antibitico conhecido (tetraciclina ou cloranfenicol) e em outra (geralmente a coluna de nmero 12) os pocinhos foram utilizados para os respectivos controles, a saber: controle do microrganismo, do solvente e do meio de cultura.

9.3.5.3. Determinao da concentrao inibitria mnima (MIC) pelo mtodo do TTC

Esta tcnica (ELOFF, 1998, modificado) foi utilizada para a determinao da MIC nas bactrias e o procedimento de preenchimento dos pocinhos da microplaca foi idntico, alterando-se apenas o corante utilizado, cloreto de trifenil tetrazolium a 0,5 %, e o tempo de incubao, pois s aps 24 h de incubao que foram adicionados 20 L do corante, sendo o experimento incubado por mais 2 h. A MIC foi definida como a menor concentrao da substncia capaz de impedir o aparecimento da cor vermelha (Figura 9-5). Esta colorao provm de alteraes qumicas que o corante sofre ao ser incorporado na cadeia respiratria (ciclo de Krebs) do microrganismo. Se no houver o aparecimento da mesma, significa que o microrganismo no est realizando atividade respiratria, ou seja, est sendo inibido.

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Figura 9-5- Placa contendo resultado da determinao da MIC pelo mtodo do TTC 9.4. Verificao de atividade sobre o T. cruzi 9.4.1. Introduo
O experimento foi realizado, primeiramente, com o objetivo de se descobrir substncias quimioprofilticas para a Doena de Chagas, que pudessem ser adicionadas ao sangue, dos bancos de sangue, para esteriliz-lo, j que a nica substncia em uso, a violeta genciana, um derivado do trifenilmetano, apresenta o inconveniente de alterar a colorao do sangue e a funo das plaquetas no estancamento de hemorragias (funo hemosttica), sendo que o contato da violeta genciana com o tecido de granulao pode resultar em pigmentao permanente da pele (GILMAN et al., 1983).

9.4.2.

Local de realizao
Este experimento foi realizado no Departamento de Cincias da Sade

da Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto (USP) por alunos psgraduandos e tcnicos sob a orientao do professor doutor Srgio Albuquerque.
357

9.4.3.

Metodologia
O sangue de camundongos albinos Swiss, infectados pela cepa Y do T.

cruzi (isolada pelo professor Pedreira de Freitas), foi obtido por puno cardaca no pico da parasitemia (7o dia) e diludo em soro fisiolgico, ou em sangue obtido de animal sadio, de forma a se obter uma concentrao final de 2x106 formas de tripomastigotas por mL de sangue. Os ensaios foram realizados em microplacas de titulao (96 poos), onde o sangue infectado e as substncias (1-2 mg) ou extratos brutos (4 mg), previamente dissolvidos em DMSO, foram solubilizados e o ensaio realizado em triplicata, sendo todo o conjunto incubado por 24 h a 4oC (temperatura na qual o sangue estocado nos bancos de sangue). Aps este tempo, as leituras foram efetuadas. As contagens das formas tripomastigotas foram realizadas seguindo-se a tcnica de BRENER (1962). Como controle, foram utilizados sangue de camundongo infectado, sem a adio de nenhuma substncia ou extrato; sangue infectado contendo a mesma concentrao de DMSO utilizada no preparo das solues e sangue infectado contendo violeta de genciana (controle positivo) na concentrao 1:4000 (PEREIRA & NUSSENZWEIG, 1953). Os resultados foram demonstrados na forma de % de formas celulares tripomastigotas destrudas (lise) em decorrncia da ao do extrato, ou substncia, em teste em comparao com o controle contendo DMSO.

358

9.5. Resultados e Discusses 9.5.1. a GAPDH

O extrato hexnico de folhas (HVF) de V. polygama no pode ser testado, pois no se dissolveu na quantidade de DMSO, o solvente do ensaio, exigida para se realizar o ensaio. Ento, ele sofreu partio e as fraes resultantes foram solveis e testadas. Destas, a frao acetato, AHVF, com 22 % de inibio (Figura 9-6), foi fracionada e suas fraes foram testadas, porm, a frao com maior atividade apresentou inibio de 37 %, sendo dela isolado o flavonide 3,7,4-trimetoxi-5-hidroxiflavona que, a uma concentrao de 305 M, causou uma inibio de 41 %, corroborando o resultado inicial da frao da qual se originou. Da frao metanlica,

Atividade inibitria enzimtica de V. polygama sobre

90

80

70

60

% inibio

50

40

30

20

10

0 HHVF DHVF AHVF MHVF MVF HMVF AHMVF BHMVF RHMVF HVG MVG HMVG MVFr

Extratos (100 g/mL)

Figura 9-6- Atividade inibitria enzimtica de extratos e fraes de V. polygama sobre

a GAPDH

359

MHVF, inativa, isolou-se o mesmo flavonide e, ainda, a 4-metoxipenduletina (200 M, 20 %). O extrato metanlico de folhas, MVF, com 3 % de atividade (Figura 9-6), sofreu partio. A partio diclorometnica, DMF, foi fracionada e dela foram isoladas vrias substncias, cujas atividades foram expostas na Tabela 9-1 e Tabela 9-2. Entre os flavonides, ficou evidente que a introduo de um grupo metoxila na molcula melhorou a atividade, como revelou a 3-O-metilquercetina, com uma CI50 de 36 9,6 M (Figura 9-7). No entanto, a presena de dois ou mais grupos tende a reduzir a atividade inibitria, indicando que muitos grupos metoxila no so um requisito para a atividade destas flavonas testadas sobre a GAPDH. A surpreendente CI50 de 20 M, referente mistura dos flavonides 3 e 4-O--D-glucopiranosilquercetina, mostrou que estes flavonides O-glicosilados so bem mais ativos que a orientina, que um flavonide C-glicosilado. Em relao aos triterpenos, os que suportavam apenas dois grupos hidroxilas foram mais ativos que os que continham trs. O contrrio ocorreu entre os ecdisterides, isolados do MVG (tambm inativo inicialmente), sendo a Polipodina B o mais ativo de todos, apesar de ser uma atividade inexpressiva. O cido vanlico no foi ativo na concentrao de 595 M. O p-hidroxibenzico teve uma atividade inibitria de 39 % s a uma concentrao de 1,3 mM. Da frao BHMVF, que no havia apresentado atividade inicialmente (Figura 9-6), foram isoladas misturas de flavonides glicosilados, a saber: orientina + isoorientina (223 M, 63 % inibio), relativamente ativo; schaftosdeo + isoschaftosdeo (200 M, 10 %); a mistura de 6-O-cafeoil + -D-glucopiranosdeo (322 M, 33 %) e o cido metacrlico (1,2 mM inativo). Notou-se que a presena de uma molcula adicional de acar no schaftosdeo diminuiu sensivelmente sua atividade em relao orientina (Tabela 9-3).

360

Tabela 9-1- Atividade inibitria enzimtica de substncias originadas da frao DMF

de V. polygama sobre a GAPDH (controle positivo, chalepina CI50 = 64 M) e APRT
Substncia Nome Concentrao
M
OH
2' 4'

% Inibio GAPDH

% Inibio APRT

OH

luteolina

200 100

56 40 73 84 75 80 37 25 22 16 92 50 95 33 24 0 46 44 71

HO
7

O
4 5

OH

O
2'

OH OH
4'

3-O-metil quercetina

200 100 200 100 200 100 200 100

HO

O
4 5

OMe O
2'

OH

OCH3
4'

OH

3-O-metil luteolina

HO

O
4 5

OCH3
2' 2

OH
4'

OH

HO
7

O
4 5

5,7,4-triidroxi3,34'

OCH3

OH

2'

OMe

dimetoxiflavona acacetina

HO
7

O
2 4 5

OH

OH
2' 4'

OH

3 + 4-O--D5''

200 20 100

HO

O
4 5

OH O
1''

glucopiranosil
OH

O HO

OH

OH

quercetina 6-O-cafeoil +

O HO
1 4 7 8

O O
1'

322 161 170 90 210 110

HO

HO HO
18 12 19 17

OH

OH

-D-

22 24 26

27

glucopiranosdeo sitosterol 3-O-Dglucopiranosdeo

H
15

HO HO HO

1 6'

10 5

O O
1'

OH

20 12 18 14 2 4 10 6 23 8 27 16

HO

25

26

COOH
28

cido 2, 3diidroxi olean12-en-28-ico

HO
24

361

Tabela 9-2- Atividade inibitria enzimtica de substncias originadas da frao DMF e

do extrato MVG de V. polygama sobre a GAPDH (controle positivo, chalepina CI50 = 64 M) e APRT
Substncia Nome
cidos 2,3-diidroxi
20 12 25 26 14 2 4 10 6 23 8 27 18 16

Concentrao M 210 120 219 110 200 100 200 100 595

% Inibio GAPDH 0

% de Inibio APRT

urs + olean-12-enCOOH
28

26 41 68 0 10 27 67 0 27 39 55 60 62 6 41 27 84 10 12 14 58

OH

28-ico cidos oleanlico +

HO
24

30 20 12 25 2 4 10 6 26 14 8 27
30

18 16

COOH
28

urslico cido 2,3,19triidroxiurs -12-en28-ico cidos 2,3-diidroxi urs + olean-12-en28-ico

HO
HO
29 12

20 18 14 16

HO
2 4

25 10 6 23

26 8 27

COOH
28

30 20

HO
24

12

HO
2 4

25 10 6 23

26 14 8 27

18 16

COOH
28

HO
24

COOH

cido vanlco
OMe

298 1,3 mM 725 100 g/mL 50 g/mL 200

COOH

OH

cido phidroxibenzico cidos p-

OH
OH
21

hidroxibenzico +
HO
25 23 27 15 9

vanlico
OH

18 19 12

HO HO

OH
4 6

20-hidroxiecdisona
25 23 27

100 200

O
21 18

OH OH

OH

19

12 15 9

HO HO

OH
21

polipodina B
25 23 27 15

100 200

OH

OH

HO OH

O
12 9 6

18

19

HO HO

1 4

stachysterona B
25

100 200 100

21 18

OH

23

19

12 15 9

HO HO

1 4

OH
6

shidasterona

362

NM
120

100

80

% inibio
60

Figura 9-7- Grfico da curva dose resposta para a determinao da CI50 da 3-O-metil
quercetina sobre a GAPDH

quando na presena da ligao dupla C2-C3, para render um composto que no til no cicloredox. A posio 3 , por isso, uma excelente escolha de substituio para originar flavonides com uma lipofilicidade maior, que permitam tanto melhor aplicao quanto facilidade de penetrao na membrana celular, em se tratando de flavonides teraputicos interessantes. Por este motivo, a 3-O-metilquercetina se torna atrativa para estudos futuros de modelagem molecular para se descobrir estruturas mais ativas contra a GAPDH.

% Inibio

40

20

CI50 = 36 9.63 M IC 50 = 36 r= 0.98776850

0 20 40 60 80 100 120

NM (M) 3-O-metilquercetina (M)

Segundo VAN ACKER et al. (1996), o grupo 3-OH pode ser bloqueado,

363

9.5.2. a APRT

Atividade inibitria enzimtica de V. polygama sobre

Nem todos os extratos puderam ser testados sobre a enzima APRT, pois inicialmente houve um problema de falta de reagentes para o ensaio bioqumico. Porm, os extratos e fraes ensaiados foram relativamente ativos, mostrando uma certa especificidade na atuao enzimtica. Da frao metanlica do extrato hexnico de folhas, MHVF, inicialmente no testada, isolou-se o flavonide 4-metoxipenduletina, o qual apresentou 12 % de inibio a 100 M. O extrato metanlico dos frutos e a frao AMF no foram fracionados, pois sua composio qumica j era conhecida segundo estudos anteriores (LEITO, S. G. et al., 1997) e, conforme relato, ricos em flavonides como a quercetina, 3-Ometilquercetina, luteolina e as C-glucosil flavonas orientina, isoorientina, vitexina e seu ismero, alm do cido p-hidroxibenzico. Algumas destas substncias tambm foram encontradas na frao DMF e ensaiadas e os resultados foram demonstrados na Tabela 9-1 e Tabela 9-2, justificando as inibies iniciais dos extratos e fraes (Figura 9-8).
80

70

60

50 % inibio

40

30

20

10

0 MVFr AMF AHMVF BHMVF Extratos (50 g/mL) AMG DMG DMF

Figura 9-8- Atividade inibitria enzimtica de extratos de V. polygama sobre a APRT

364

Da frao n-butanol do extrato hidrometanlico de folhas, BHMVF, isolouse, entre outros, a mistura dos flavonides orientina e seu ismero (Tabela 9-3). Estes apresentaram a maior atividade, indicando serem, talvez, os responsveis pela atividade inicial da frao, 67 % de inibio (50 g/mL; Figura 9-8). Quanto aos ecdisterides isolados da frao DMF (Figura 9-8), a polipodina B, contendo somente um grupo hidroxila a mais do que a 20-hidroxiecdisona, foi duas vezes mais ativa que esta (Tabela 9-2). Os outros ecdisterides tambm tiveram a intensidade de suas atividades correlacionadas com a polaridade.

Tabela 9-3- Atividade inibitria enzimtica de substncias originadas da frao

BHMVF de V. polygama sobre a GAPDH (controle positivo, chalepina CI50 = 64 M) e APRT Substncia Nome Concentrao M
OH OH
6 ''

% Inibio GAPDH 63

% Inibio APRT

3 ''

HO
1''

OH
3' 5'

orientina + isoorientina
OH

223 112 200 100

OH O O
2

63 10 47

HO
7

4 5

OH

OH HO O
1'' 5'' 3''

OH
2' 4'

schaftosdeo + isoschaftosdeo
OH
6'

HO OH O 6'''

O
7 3 1''' 5

HO HO
3'''

OH HO

HO O
1''

5''

OH 3'' OH
2'

OH
4'

carlinosdeo + isocarlinosdeo
OH

200 100

7 14

HO OH O 6'''

O
7 3 5 6'

HO HO
3'''

1''' OH HO

COOH

cido metacrlico

1,2 mM 580

0 14

365

9.5.3. a GAPDH

Atividade inibitria enzimtica de S. densiflora sobre

Como pode ser observado na Figura 7-9, os extratos hexnicos das diversas partes vegetativas de S. densiflora foram praticamente inativos frente GAPDH, enquanto que os extratos metanlicos e hidrometanlicos causaram altssimas inibies. A realizao de vrios fracionamentos e anlises espectroscpicas levou identificao de alguns taninos, cidos fenlicos, flavonides e triterpenos, estando suas respectivas atividades relatadas na Tabela 9-4. O extrato metanlico de folhas, MSF, com atividade inicial de 74 %, sofreu partio. Da partio acetato, AMFS, 90 % de inibio, isolou-se a quercetina, a qual apresentou uma atividade muito elevada, com uma CI50 de 24 3,9 M (200 M, 91 %, Tabela 9-4, Figura 9-10), quando comparada com a luteolina (Tabela 9-1), o que nos indicou que a presena de um grupo hidroxila extra na posio 3 parece ser uma condio favorvel para a inibio da enzima. De acordo com MORAES et al. (2003),

100

90

80

70

60 % inibio

50

40

30

20

10

0 HSF MSF HMSF HSC MSC HMSC HSG MSG HMSG HSCr MSCr HMSCr

Extratos (100 g/mL)

Figura 9-9- Atividade inibitria enzimtica de extratos de S. densiflora sobre a

GAPDH
366

flavonas altamente oxigenadas parecem possuir as exigncias estruturais ideais para a inibio da GAPDH. No entanto, seu respectivo derivado glicosilado, a 3-O--Lramnopiranosilquercetina, causou uma atividade inexpressiva de 19 %, muito diferente da atividade produzida pela mistura de 3 + 4-O--D-glucopiranosilquercetina (talvez tenham um efeito inibitrio sinrgico, Tabela 9-1), da a importncia de se conseguir isolar as substncias, para se detectar suas atividades isoladamente. Segundo LIO et al. (1985), a quercetina tambm produziu uma inibio de 90 % da xantina oxidase (166 M), enquanto que seu derivado glicosilado teve a inibio diminuda devido ser muito hidroflico e volumoso, reduzindo, por isso, o seu contato com a enzima. VAN ACKER et al. (1996), relaciona potencial antioxidante e inibidor enzimtico melhores para agliconas do que para glicosdeos. Para a captura de O2 , o grupo 3-OH, em associao com a dupla C2-C3, tem papel importante, assim como o grupo 5-OH em combinao com a parte 4-oxo da molcula pirano do flavonide. Eles ainda citam que a quercetina completamente conjugada, o que d maior estabilidade aos radicais formados, devido s possibilidades de deslocalizao. J os glicosdeos so mais volumosos, o que pode dificultar a conjugao completa devido impedimentos estricos. Entre os triterpenos ensaiados, a presena de uma molcula de acar, ou mais que dois grupos hidroxila, destri a atividade, enquanto que a funo cido parece ser requisito extremamente importante para que ocorra a inibio da enzima. Tais fatos puderam ser comprovados quando foram comparadas as atividades das misturas dos cidos oleanlico + urslico (41 %, Tabela 9-2) e lupeol + e -amirina (0 %, Tabela 9-4); cido arjunlico (0 %), 6 -hidroximaslinato (0 %) e cido 2,3,19triidroxiurs-12-en-28-ico (0 %) com o cido 2,3-diidroxiolean-12-en-28-ico (44 %). Inicialmente, os taninos castalagina, casuarinina e ramnosdeo do cido elgico se mostraram extremamente ativos sobre a enzima, porm suas atividades foram contestadas pelos testes que sero discutidos posteriormente (sesso 9.5.11). Os cidos glico e sirngico foram praticamente inativos, nas concentraes testadas, sobre a GAPDH e as formas tripomastigotas de T. cruzi. Porm, um estudo do efeito tripanocida do cido glico sobre as formas tripomastigotas e amastigotas do T. brucei (KOLDE et al., 1998) relata que sua CI50 foi de 15,6 M,
367

enquanto a CI50 do cido sirngico foi de 465 M. Neste mesmo estudo, o cido glico no se mostrou citotxico L. major, enquanto que nos nossos testes bioqumicos sobre a APRT de L. tarentolae sua CI50 foi de 352 M e a do cido sirngico de 319,5 M. Pode se notar, atravs destes resultados, que essas duas substncias apresentam um modo de atuao diferenciado sobre as espcies de protozorios citados. O cido elgico causou uma CI50 de 25 2,2 M (Figura 9-11). Tm sido reportadas muitas e diferentes atividades biolgicas a este composto, tais como inibidor do crescimento de algumas cepas de levedura; inibidor das enzimas N-acetiltranferase e DNA girase; antimutagnico e antioxidante potente (DENG et al., 2002).
KM
120

100

80

60

% inibio

Figura 9-10- Grfico da curva dose-resposta para a determinao da CI50 da

quercetina sobre a GAPDH
BM
100

% Inibio

40

20

CI50 = 24 3,9 M r = 0.99457453

IC 50 = 24 M
60 0 20 40 80 100 120

quercetina (M)

KM ( M)

80

% inibio
% Inibio

60

40

20

CI50 = 25 2.2 M r = 0.99853454

0 0 20 40 60 80 100 120

Figura 9-11- Grfico da curva

cido elgico (M) (M) para a determinao dose-resposta

BM ( M)

elgico sobre a GAPDH

368

da CI50 do cido

Tabela 9-4- Atividade inibitria enzimtica de substncias isoladas de S. densiflora

sobre a GAPDH (controle positivo, chalepina CI50 = 64 M) e APRT
Substncia Nome quercetina
OH
4'

Concentrao
M

% Inibio GAPDH 91

% Inibio APRT

OH
2'

200 100

HO
7

O
2 4 5

97 19 89 0 6 0 13 0 59 31 42 0 58 11 40 0 90 80 19 29 25 21 24

OH
OH
3'

OH

OH
5'

HO
7

O
4 5

3-O--Lramnopiranosil quercetina
6''

200 100 200 100 202 102 200 100

OH

O 1''
3''

O OH OH

OH
29 30

21 12 25 18 9 6 23 27
29

O
28

HO HO

15

O
1'

O HO

6'

6-hidroxi maslinato de -Dglucopiranosila OH

OH OH

OH
12 25 18 9 6 23 27 15 21

cido arjunlico

HO HO HO

COOH

30

29 20 12 21 18 15 27

21 12 25 1 9 6 23 27 15 18 28 1 25 9 6 23
21 18 12 19 1 3 10 5 17 22 24 26

lupeol + e amirina

26

HO

HO

29 27

sitosterol

314 157

H
15

HO

COOH

cido glico cido sirngico

824 412 505 253

OH OH

OH

COOH

MeO OH
C OOH Me O OM e

OMe

OM e

cido 2,4,6trimetoxibenzlico cido elgico 2,4,6-trimetoxi benzaldedo + trans-2,4,6trimetoxi fenilpropenaldedo 5-hidroximetil-2furfuraldedo

200 100 200 100 100 g/mL 50 g/mL 794 397

COH
MeO OM e OMe
7 5 3 1

+
OM e MeO

C OH
9

OMe

HOH2C

CHO

369

9.5.4. a APRT

Atividade inibitria enzimtica de S. densiflora sobre

Nem todos os extratos mais polares de S. densiflora puderam ser ensaiados, pois absorveram no mesmo comprimento de onda do teste. Dentre aqueles que foram testados, os mais polares apresentaram as maiores inibies, como ocorreu com a GAPDH. As trs substncias mais ativas, excetuando-se os taninos (discusso na sesso 9.5.11), foram o cido elgico (100 M, 80 %, Tabela 9-4), presente em todos os extratos polares estudados; a quercetina (100 M, 97 %, Tabela 9-4) e seu derivado glicosilado, a quercitrina (100 M, 89 %, Tabela 9-4), ambas provenientes do extrato metanlico de folhas (MSF), partio AMFS. Os triterpenos se mostraram semelhantes quanto ao seu modo de atuao em ambas as enzimas. Os cidos fenlicos foram bem mais ativos sobre a APRT, porm numa concentrao muito elevada.

100

90

80

70

60 % inibio

50

40

30

20

10

0 MSF DMFS AMFS BMFS RMFS HSG MSG HMSG HSC HSCr

Extratos e parties (50 g/mL)

Figura 9-12- Atividade inibitria enzimtica de extratos de S. densiflora sobre a APRT

370

9.5.5.

Atividade de S. densiflora sobre S. frugiperda

Como pode ser observado na Figura 9-13, os extratos mais polares foram

os mais ativos, atuando, inicialmente, como inibidores alimentares e, posteriormente, como inseticidas no teste preliminar, mesmo aps fracionamento. De todos os extratos ativos estudados, foram identificadas as seguintes substncias em comum: os taninos castalagina, casuarinina, ramnopiranosdeo do cido elgico, cido glico e elgico. Sabendo-se que folhas de eucalipto (Myrtaceae), rico em taninos elgicos, so misturadas s espigas de milho em paiol, para protegerem os gros contra o ataque de vrios insetos pragas (GALLO et al., 1988) e que os taninos podem ser responsveis pela diminuio da absoro de nutrientes, do crescimento, da metabolizao energtica e digestibilidade de protenas, inclusive de animais domsticos e do homem, alm de serem fagoinibidores e inseticida (CHUNG et al., 1998), pensou-se que eles poderiam ser os responsveis pela atividade inicial daqueles extratos. No entanto, os taninos isolados, ao serem testados atravs do ensaio de contaminao superficial da

100 90 80 70 % de insetos mortos 60 50 40 30 20 10 0 MSF MSC MSCr MSG HMSC HMSF HMSCr HMSG HSG HSCr HSCr HSF AMSCr RMSCr

Extratos (1000 ppm)

Figura 9-13- Atividade dos extratos (adio dieta) de S. densiflora sobre S.

frugiperda
371

dieta, no demonstraram a atividade inseticida ou inibidora alimentar esperada (Figura 9-14).

25

20

% mortalidade larval

15

10

a
5

0 Casuarinina Castalagina Ramnosdeo cido Elgico Pedunculagina controle

Taninos (4000 ppm, equivalente a 100 ppm no ensaio de tubo)

Figura 9-14- % de mortalidade, ao 10 dia, de lagartas (1 instar) de S. frugiperda

alimentadas em dieta contaminada superficialmente com taninos
Mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo Teste de Duncan (P 0,05)

Realizou-se, ento, o mesmo tipo de ensaio, o de contaminao superficial da dieta, com os extratos hidrometanlicos da casca da raiz e folhas para se checar o quanto o modo de aplicao do extrato, ou substncia, poderia estar influenciando nos resultados dos ensaios. Assim, pode-se observar que os resultados foram realmente diferentes do ensaio com adio dieta (Figura 9-15, Figura 9-16), sendo siginificativo apenas no parmetro reduo da massa larval. Vrias hipteses foram levantadas para se tentar explicar o fato ocorrido: os taninos em questo no so ativos separadamente, agindo de modo sinrgico; pode ter ocorrido oxidao dos mesmos, j que a dieta ficou ligeiramente escurecida aps algumas horas da aplicao, e suas atividades foram reduzidas; existem, no extrato, substncias capazes
372

de impedir a oxidao dos taninos; os taninos identificados no so os responsveis pela atividade inseticida, podendo esta ser imputada a alguma substncia no caracterizada. Para se provar a primeira hiptese, seriam necessrias grandes quantidades de cada tanino, para se preparar vrias misturas dos mesmos e ensailas, o que infelizmente no foi possvel. Quanto s hipteses segunda e terceira, j conhecido h tempos que os taninos hidrolisveis podem sofrer oxidao, degradao, hidrlise ou transesterificao por vrios fatores (KHANBABAEE & REE, 2001) e tm atividades antioxidante e anticorrosiva (MARTINEZ & TAGLJAR, 2003), ressaltandose dentre eles a casuarinina > cido elgico > cido glico > -tocoferol na concentrao de 10 M (SU et al., 1988). Alm disso, foram encontrados no extrato MSF os flavonides quercetina e derivados que tambm detm a propriedade de antioxidantes (VAN ACKER et al., 1996). Somando-se a estes fatos, os flavonides poderiam estar sendo os responsveis pela atividade inseticida do extrato metanlico de folhas (MSF). Segundo SIMMONDS (2001), flavonides glicosilados com o esqueleto bsico da quercetina, quando ingeridos por alguns insetos, tm a ligao glicosdica hidrolisada. A quercetina liberada na hidrlise pode inibir a enzima mitocondrial ATPase e oxidases de funo mista (MFO) dependentes do citocromo P450 destes insetos, explicando o efeito deterrente que causam no desenvolvimento de larvas, por exemplo, da Spodoptera litura. Os nveis de MFO aumentam com o grau de desenvolvimento das larvas. Logo, as larvas estariam mais susceptveis nos seus estgios iniciais, quando no teriam quantidade de MFO suficiente para destoxificar a quercetina. No entanto, esta atividade especfica. A S. eridania e S. littoralis (polfaga) no sofrem influncia destes flavonides no seu comportamento alimentar, enquanto que a S. exempta (oligfaga) sofre deterrncia causada por vrios deles, o que poderia explicar seu hbito alimentar restrito, j que estes tipos de flavonides so comuns a vrias espcies de plantas. Testes realizados com a quercetina e quercitrina, isoladas da frao AMSF, no ensaio de contaminao superficial da dieta (4000 ppm, equivalente a 100 ppm no ensaio de adio; ROCHA, 2004), sobre larvas de 1 instar de S. frugiperda revelaram 78 e 85 % de mortes respectivamente. Logo, a atividade inseticida de ambas substncias adicionadas atividade fagoinibidora dos taninos explicariam os resultados
373

iniciais do extrato MSF. Sabe-se tambm que o cido glico pode ser txico para alguns insetos (BERNAYS & WOODHEAD, 1982). Alm disso, para o propsito de defesa da planta, suficiente que um composto, ou vrios deles, tenham atividade biolgica moderada sobre o ataque de um inseto. Por esta razo, existem poucas substncias que, sozinhas, apresentaro uma potncia tal que as designem inseticidas (ELLIGER & WAISS, 1989). De acordo com YU & ABO-ELGHAR (2000), alguns metablitos secundrios como a quercetina (I50 2,4 M), cido elgico (I50 1,2 M), luteolina (I50 5,5 M), acacetina (I50 6,3 M) e quercitrina (I50 24 M) so excelentes inibidores das glutationas S-transferases, enzimas que participam da destoxificao inseticida nos lepidpteros, alm de metabolizarem vrios aleloqumicos txicos. Tal fato tambm poderia estar contribuindo para a atividade dos extratos. No entanto, no caso do cido elgico, este foi testado, no ensaio de contaminao superficial da dieta (4000 ppm, equivalente a 100 ppm no ensaio de adio), sobre larvas de 1 instar de S. frugiperda e no se mostrou ativo, naquela concentrao, quanto aos parmetros avaliados, indicando que a atuao de uma substncia sobre uma enzima in vitro nem sempre garantia de atividade in vivo.

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Mortalidade (%)

a a

Ext. de Casca da Raiz

Extrato de Folhas

Controle

alimentadas em dieta contaminada superficialmente com extratos hidrometanlicos de S. densiflora a 5 % (equivalente a 1000 ppm no ensaio do tubo)
Mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo Teste de Duncan (P 0,05)

Figura 9-15- % de mortalidade, ao 10 dia, das lagartas (2 instar) de S. frugiperda

374

45 40 35 massa (mg) 30 25 20 15 10 5 0 Ext. de Casca da Raiz Extrato de Folhas

a
Controle

frugiperda alimentadas em dieta contaminada superficialmente com extratos de S. densiflora a 5 % (equivalente a 1000 ppm no ensaio do tubo)
Mdias seguidas por letras distintas diferem entre si pelo Teste de Duncan (P 0,05)

Figura 9-16- Mdia das massas (mg), ao 10 dia, das lagartas (2 instar) de S.

9.5.6.

Atividade de V. polygama sobre S. frugiperda

O extrato hexnico de folhas (HVF, Figura 9-17), alm de causar 40 % de

mortes, atrasou a entrada das larvas vivas na fase de pupa e a emergncia dos adultos em cerca de 6 dias em relao testemunha. A massa mdia das pupas ficou cerca de 29,2 mg abaixo da mdia da testemunha. Aps o HVF ser fracionado, produziu a frao hexnica (HHVF) que no causou mortes, porm aumentou a massa das pupas em 13,3 mg e adiantou a entrada das larvas na fase pupal em 1 dia em relao testemunha. A frao diclorometnica (DHVF), alm de causar 30 % de mortalidade nos insetos, reduziu a massa das pupas em 29,1 mg e atrasou a entrada das larvas na fase pupal em 4 dias. A frao acetato (AHVF), na concentrao de 1000 ppm, reduziu a massa das pupas em 42,2 mg, atividade maior do que o extrato bruto, e atrasou a entrada das larvas na fase pupal em 2,5 dias. Estes resultados se assemelharam ao resultado inicial do extrato bruto, podendo-se concluir que a(s) substncia(s) ativa(s) estaria(m) concentrada(s) nesta frao. Pelas anlises espectromtricas da frao
375

AHVF, estas substncias foram identificadas como graxas. A frao metanlica no foi testada na concentrao de 1000 ppm por falta de material. A menor massa pupal pode significar que o extrato testado provocou uma inibio de alimentao (diminuio do consumo ou aproveitamento do alimento) e poderia gerar adultos pequenos, o que causaria um problema fsico na cpula daqueles com indivduos normais, alm do que as fmeas menores poderiam ser menos frteis. O aumento na durao do estado larval, nas condies de campo, deixaria o inseto mais propenso ao ataque de parasitas, predadores e entomopatgenos. Neste sentido, os adultos que emergissem destas larvas teriam assincronia com a populao normal. Em consequncia, a cpula se tornaria dificultada, mas se esta acontecesse, ocorreria a consanguinidade com o aparecimento de indivduos da mesma gerao (RODRIGUEZ, 1990). Tambm seria diminudo o nmero de geraes do inseto por ciclo agrcola. O prolongamento da fase larval se relaciona, geralmente, com um crescimento mais lento e pouca ingesto de alimento, devido existncia, naquele, de um ou vrios aleloqumicos txicos ou que provocam um desequilbrio nutricional. Nas condies de campo, o crescimento lento das larvas causaria menor consumo de alimento e, portanto, menores danos plantao. O extrato hexnico dos galhos (HVG), apesar de causar 30% de mortalidade, provocou um aumento mdio de 21,5 mg na massa das pupas dos insetos sobreviventes, o que poderia significar a presena de alguma(s) substncia(s) fagoestimulante para o inseto. No entanto, do extrato metanlico de galhos (MVG), partio acetato (AMVG), que no causou mortes e tambm teve ao estimulante alimentar, foram isolados vrios ecdisterides. Dentre estes, a 20-hidroxiecdisona foi testada atravs do ensaio de contaminao superficial da dieta a 4000 ppm (que equivaleria concentrao de 100 ppm no ensaio de adio da substncia), no ocasionando morte do inseto, mas causando uma reduo significativa, ao nvel de 1 e 5 % de siginificncia (Teste de Tukey), na massa das lagartas em comparao com o controle. De acordo com WILSON (1987), o efeito dos ecdisterides pode variar com a concentrao, com o estgio de desenvolvimento e durante o ciclo de vida de cada espcie. Sua atuao tambm dependente do tipo de dieta usada, sendo mais potente em dietas base de casena (nosso tipo). Deste modo, podem agir como inseticidas (atuando como hormnios, causando distrbios na ecdise) ou fagoinibidores
376

(agindo no metabolismo e excreo do inseto). Assim, a 20-hidroxiecdisona no produziu efeito deterrente nem inseticida em Spodoptera littoralis, em concentraes acima de 50 ppm (adio na dieta), porm causou entre 56-88 % de mortes de larvas (2 instar) de Bombyx, quando aplicada em concentraes de 25 a 100 ppm. As exigncias para a atividade incluem a presena da conjugao 7-en-6-ona, a 3- e 14-OH, o grupo hidroxila no C-22 com configurao R e o H ou OH no C-5 em ,

100 90 80 70 % de insetos mortos 60 50 40 30 20 10 0 HVG HVFr HVF MVFr HMVFr HMVF Extratos (1000 ppm) HMVG MVG MVF

100 90 80 70 % de insetos mortos 60 50 40 30 20 10 0 HHVF DHVF AHVF AHMVF Parties (1000 ppm) BHMVF RHMVF

Figura 9-17- Atividade dos extratos (adio dieta) e parties de V. polygama sobre
S. frugiperda
377

originada da fuso cis entre os anis A e B. A hidroxilao no carbono 5 torna a polipodina B quatro vezes mais ativa que a 20-hidroxiecdisona. O extrato hexnico dos frutos causou 90 % de mortalidade dos insetos e nos 10 % restantes atrasou o ciclo biolgico em 13 dias em relao ao controle. A anlise das fraes do HVFr indicou que as mesmas eram constitudas de vrios hidrocarbonetos e cidos graxos. O extrato hidroalcolico dos frutos apresentou atividade 100 % inseticida em apenas 15 dias de experimento, mas no houve quantidade suficiente para ser estudado quimicamente. Aps nova coleta de material (frutos parcialmente maduros, para se conseguir uma quantidade maior de frutos), os ensaios foram realizados novamente e a atividade no se repetiu, fato que nos indicou que o estgio de maturao dos frutos importante para se encontrar o princpio ativo. O extrato hidroalcolico de folhas (HMVF) causou 60 % de mortes dos insetos. Aps fracionamento, a frao acetato (AHMVF) no provocou mortalidade nos insetos, mas agiu como inibidor alimentar, reduzindo o peso das pupas em 25,1 mg em relao testemunha. A frao butanlica (BHMVF) foi dividida em duas: o precipitado amarelo que foi 100 % inseticida, apresentando um aumento de 40 % de atividade em relao ao extrato bruto, e o sobrenadante que, aps seco, adquiriu a cor marrom e de aspecto liquefeito, cuja atuao se deu somente na reduo da massa das pupas em 68,7 mg (fagoinibidor). Do precipitado amarelo foram identificados os flavonides C-glicosilados orientina, isoorientina, schaftosdeo e seu ismero e carlinosdeo e seu ismero, porm em quantidades insuficientes para serem submetidos ao ensaio de contaminao superficial da dieta. conhecido (SIMMONDS, 2001) que os flavonides podem atuar de diversas maneiras nos insetos: como inibidores alimentares ou fagoestimulantes; inseticidas; estimulantes da oviposio, etc. Como exemplo, o schaftosdeo pode modificar o comportamento alimentar da esperana marrom (Nilaparvata lugens), praga do arroz. Ninfas expostas a uma dieta artificial contaminada com este flavonide (tanto na concentrao de 250 quanto de 500 ppm) morreram entre 5-10 dias. Acredita-se, ainda, que a presena desta flavona di-C-glicosilada em certos tipos de arroz cumpra papel fundamental na resistncia que eles apresentam em relao a este inseto.
378

9.5.7.

Atividade de V. polygama sobre o T. cruzi

O extrato hexnico de folhas, que provocou 94 % de lise nas formas

tripomastigotas do T. cruzi (Tabela 9-5), foi fracionado. As atividades das fraes foram determinadas, como pode ser visto na Tabela 9-6. No entanto, aps suas fraes sofrerem refracionamento e as substncias isoladas serem testadas novamente, pode se notar que a frao relativa mistura de esterides, originada da DHVF, apresentou atividade similar inicial mostrada pelo extrato (500 g/mL, 93 % lise). As misturas de hidrocarbonetos isoladas das fraes HHVF e DHVF causaram uma lise mdia de 55 % (500 g/mL). Da frao AHVF, foi isolado o flavonide 3,7,4-trimetoxi,5-hidroxi flavona, cuja atividade foi de 31 % de lise (1,5 mM), talvez sendo o responsvel pela atividade inicial da frao. A frao MHVF rendeu o mesmo flavonide anterior, alm da 4-metilpenduletina (16 % lise a 1,4 mM). Baseando-se na porcentagem inicial de lise da frao, estes flavonides parecem produzir um efeito somatrio. Do extrato metanlico de folhas (MVF), partio diclorometnica, foram isoladas vrias substncias cujas atividades foram relatadas na Tabela 9-7. Interessante notar que os flavonides no tiveram uma boa atuao, diferentemente do que ocorreu na enzima GAPDH, com exceo da mistura do 3 e 4-O--Dglucopiranosilquercetina, que foi muito ativa em ambos os testes. No entanto, TAKEARA et al. (2003) relatam que o flavonide 3-O-metil luteolina teve uma atividade de 63 % (1,7 mM ou 500 g/mL), mostrando-se duas vezes mais potente que a 3-Ometil luteolina (Tabela 9-7), sendo que a nica diferena entre ambos a posio da metoxila. O mesmo trabalho reporta que a vicenina 2 (flavonide 6,8-di-C-glucosilado derivado da apigenina; 0,8 mM ou 500 g/mL) demonstrou a mesma atividade da orientina (Tabela 9-7), indicando que a introduo de uma molcula de acar no melhorou a atividade do flavonide sobre o T. cruzi. A penduletina (Figura 1-6; RIBEIRO & PIL-VELOSO, 1997; 1,4 mM), com um grupo metoxila a menos que a 4metoxipenduletina, causou 86 % lise, enquanto a calicopterina (suportanto um grupo a mais de metoxila na posio 8) no foi ativa.

379

Tabela 9-5- Atividade dos extratos (4 mg/mL) de V. polygama sobre o T. cruzi

Cdigo do extrato HVG HVFr HVF MVFr HMVFr HMVF HMVG MVG MVF CONTROLE Nmero de parasitas 16 13 12 08 16 10 04 04 02 08 10 15 40 28 34 40 30 28 12 10 10 39 40 42 28 22 20 58 53 56 % de lise 75 80 94 80 39 41 81 28 58 0

380

Tabela 9-6- Atividade das fraes (4 mg/mL) de V. polygama sobre o T. cruzi

CDIGO DA FRAO HHVF DHVF AHVF MHVF AHMF BHMF RHMF CONTROLE NMERO DE PARASITAS 22 34 30 30 40 44 36 48 44 28 28 32 24 20 25 26 18 30 40 24 32 60 68 56 % DE LISE 53 38 36 52 62 60 40 0

Quanto aos triterpenos, foram mais ativos aqueles que suportavam mais grupos hidroxilas (Tabela 9-7), diferentemente do comportamento com a enzima, indicando que a atividade dos mesmos pode estar relacionada com outros fatores. Vale ressaltar que o cido 2,3,19-triidroxiurs-12-en-28-ico apresentou 87 % de lise (250 g/mL ou 0,5 mM), atuao prxima da violeta genciana (0,6 mM ou 250 g/mL = 100 % ou CI50 = 31 g/mL ou 76 M), porm a atividade foi reduzida para 16 % a uma concentrao de 100 g/mL ou 0,2 mM. Por isso, esta substncia poderia ser usada como lder na busca de compostos mais ativos.

381

Tabela 9-7- Atividade de substncias isoladas de V. polygama sobre T. cruzi (controle

positivo violeta genciana, CI50 = 31 g/mL ou 76 M)
Concentrao mM 1,7

Substncia

Nome

% lise

OH
2' 4'

OH

luteolina orientina + isoorientina

27

HO
7

O
4 5

OH OH 3 '' OH
HO
1'' 6 ''

OH
3' 5'

1,1

13

OH O O
2

OH

HO
7 5

OH

O
2'

OCH3
4'

OH

3-O-metil luteolina cido metacrlico cido oleanlico

HO

O
4 5

1,7

33

OH

5,8

COOH
30 20 12 25 2 4 10 6 26 14 8 27 18 16

COOH
28

+ urslico 3 + 4-O--D5''

1,1

38

HO
2'

OH
4'

OH

HO

O
4 5

OH O
1''

glucopiranosil
OH

1,1

97

O HO

OH

OH

quercetina

O HO
1 4 7 8

O O
1'

6-O-cafeoil +
OH

HO

HO HO
30

-D-glucopira-

1,5

11

OH

nosdeo

HO
29 12 20 18 14 2 4 10 6 23 12 8 27 16

cido 2,3 ,19

COOH
28

HO

25

26

-triidroxi urs-

0,5

87

HO
24 20 18 14 2 4 10 6 23
21

12-en-28-ico
16

HO

25

26 8 27

COOH
28

cido 2,3diidroxi olean1,1 76 12-en-28-ico

HO
24

OH HO
25 23 27 15 9

18 19 12

OH

HO HO

20hidroxiecdisona

OH
4 6

1,0

70

382

9.5.8.

Atividade de S. densiflora sobre o T. cruzi

O extrato hexnico de folhas (HSF), diferentemente dos outros,

apresentou uma grande atividade, 82 %. Como os extratos de Vitex apresentaram resultados semelhantes devido presena de esterides e cidos graxos, foi decidido que no se iria trabalhar com o mesmo. O extrato metanlico de casca da raiz (MSCr), com 88 % de lise celular (Tabela 9-9), foi fracionado. A frao diclorometnica, DMSCr, causou 74 % de lise. Desta foram isolados os cidos glico e sirngico, os quais no se mostraram muito ativos, e o cido arjunlico, que causou 89 % de lise a uma concentrao de 1 mM (Tabela 9-8). Da frao AMSCr, 12 % de lise, foram isolados os taninos castalagina, casuarinina e raminopiranosdeo do cido elgico e o cido elgico, todos com atividades inexpressivas. O extrato metanlico de folhas (MSF), 34 % de lise, tambm sofreu partio. A frao acetato, AMFS, rendeu os flavonides quercetina e quercitrina, os quais tambm causaram pequenas atividades (Tabela 9-8).

Tabela 9-8- Atividade de substncias isoladas de S. densiflora sobre T. cruzi (controle

positivo violeta genciana, IC50 = 31 g/mL ou 76 M) Substncia quercetina quercitrina cido glico cido elgico cido sirngico casuarinina castalagina raminopiranosdeo do cido elgico cido arjunlico sitosterol glucosilado Concentrao mM (ou 500 g/mL) 1,7 1,1 2,9 1,7 2,5 0,5 0,5 1,1 1,0 (500 g/mL) 0,5 (250 g/mL) 0,2 (100 g/mL) 0,9 % lise 34 30 19 41 16 28 11 12 89 61 9 14

383

Tabela 9-9- Atividade de extratos (4 mg/mL) de S. densiflora sobre T. cruzi

CDIGO DO EXTRATO MSC HSC HMSC HMSG HSG MSG MSF HMSF MSCR HMSCR HSCR CONTROLE NMERO DE PARASITAS 64 58 80 48 44 44 01 83 86 90 22 22 23 108 94 52 78 72 48 16 16 14 32 68 52 72 44 22 128 132 125 % DE LISE 47 65 99 Lise total 33 83 34 49 88 61 64 0

384

9.5.9. rubropilosa

Atividade de S. densiflora e V. polygama sobre o

fungo Leucoagaricus gongylophorus simbionte de Atta sexdens

Somente os extratos hidrometanlicos de caule, galho, folha e casca da raiz de S. densiflora foram testados, devido haver material suficiente. Destes, apenas o HMSC (1000 g/mL) produziu 20 % de inibio do crescimento do fungo (controle = 0 %; peso seco do inculo: mdia 7, 2 mg/mL). Do extrato HMSC foi isolada a castalagina, a qual produziu 20 % de inibio do crescimento do fungo somente a uma concentrao de 100 g/mL. O 4-O-L-raminopiranosdeo do cido elgico tambm foi testado, causando 80 % de inibio do crescimento do fungo a 100 g/mL.

Tabela 9-10- Atividade de substncias de S. densiflora e V. polygama sobre o

crescimento do fungo L. gongylophorus Substncia (50 g/mL) cido glico castalagina casuarinina cido arjunlico cido sirngico 6-hidroximaslinato de D-glucopiranosila orientina + isoorientina luteolina cafeoil-6-O- + -Dglucopiranosdeo cido 2,3,19triidroxiurs-12-en-28-ico % inibio crescimento fungo 0 0 0 40 0 20 20 40 60 40

385

Das substncias testadas (Tabela 9-10), nenhuma apresentou atividade satisfatria, visto que j so conhecidas substncias mais potentes, como o siringaldedo e cido vanlico, que provocaram 80 % de inibio do crescimento deste fungo a uma concentrao de 50 g/mL (GODOY, 2002). A mesma referncia relata que o lupeol, constituinte da frao DMFS, a uma concentrao de 60 g/mL, no inibiu o crescimento do fungo.

9.5.10.

Atividade de S. densiflora e V. polygama sobre

microrganismos
Somente os extratos hidrometanlicos de caule, galho, folha e casca da raiz de S. densiflora foram testados, devido haver material suficiente. O extrato HMSF produziu uma atividade extremamente intensa (halo 11 mm), sendo mais ativo que o antibitico controle (10 e 12 mm) para as bactrias P. aeruginosa e M. roseus. Todos os extratos causaram 50 % de inibio sobre o S. aureus. Estas bactrias tm a tendncia de formar cepas resistentes com muita facilidade (Figura 9-18; Figura 9-19; Figura 9-20). Devido a estas significativas atividades, foi realizada a determinao da concentrao inibitria mnima (MIC) dos extratos sobre alguns dos microrganismos (Tabela 9-12). As concentraes dos extratos usadas neste teste foram de 1000, 500, 250, 125, 62,5 e 31,3 g/mL. A atividade antifngica no se mostrou significativa (Tabela 9-11). De todas as substncias testadas (Tabela 9-10), a 50 g/disco, a nica que apresentou atividade significativa sobre bactrias (S. aureus) foi o cido glico, causando um halo de inibio de 15 mm, enquanto que o halo da tetraciclina de 26 mm. As atividades antimicrobianas dos taninos so bem documentadas (CHUNG et al., 1998), sendo possvel que aqueles que no foram testados sejam os responsveis pela atuao antimicrobiana siginificativa dos extratos. Alm disso, flavonides tambm podem apresentar ao antibacteriana. A quercitrina demonstrou atividade antidiarrica causada por bactrias (HARBORNE & WILLIAMS, 2000) e tambm atividade antiinflamatria. De acordo com LI et al. (2002), a quercetina (CI50 40 M), o raminopiranosdeo do cido elgico (CI5016,7 M), cido elgico (CI50 66 M),
386

cido arjunlico (CI50 56 M) e cido urslico (CI50 83 M) so inibidores da enzima cido graxo sintase (presente na membrana celular de bactrias), podendo atuar como bactericidas ou bacteriostticos, porm o cido arjunlico e os flavonides luteolina e orientina e ismero foram inativos, na concentrao de 50 g/disco, sobre as bactrias testadas. Os taninos geraniina e galogeraniina, taninos elgicos, apresentaram atividade contra Herpes simplex (50 g/mL), mas no foram ativos contra as bactrias Enterobacter aeruginosa e Proteus vulgaris (500 g/mL) nem sobre outros fungos testados (CORTHOUT et al., 1991). Xilopiranosdeos do cido elgico foram citotxicos a cepas de leveduras com CI50 de 3,1 e 1,1 M (DENG et al., 2002).

Tabela 9-11- Dimetro dos halos (mm) de inibio dos microrganismos em presena
dos extratos hidrometanlicos de S. densiflora Extratos Tc HMSC HMSCr HMSF HMSG Control 8 10 9 7 32 Bc 9 9 11 9 22 Microrganismos Ec 9 9 11 9 24 Pa 8 8 11 9 10 Mr 9 10 11 10 12 Sa 13 11 11 14 22 Ca 0 0 0 0 20 Cl 0 0 0 0 24 Sc 0 0 0 0 25

Concentrao dos extratos = [1000 g/disco]. Concentrao do antibitico utilizado como controle: tetraciclina = 20g/disco (B. cereus = Bc; E.coli = Ec; P. aeruginosa = Pa;
M. roseus = Mr ; S. aureus = Sa); e nistatina = 20g/disco (C. albicans = Ca; C. laurentii

= Cl; S. serevisiae = Sc; e T. cutaneum = Tc).

387

Tabela 9-12- Determinao da MIC (g/mL) dos extratos hidrometanlicos de S.

densiflora sobre alguns microrganismos Extratos Bc HMSC HMSCr HMSF HMSG
> 1000 > 1000 > 1000 > 1000

Microrganismos Ec
> 1000 > 1000 > 1000 > 1000

Pa
< 31,3 < 31,3 < 31,3 < 31,3

Mr
> 31,3 > 31,3 > 125 > 125

Sa
> 250 > 250 > 250 > 250

Obs: Houve inibio nos microrganismos Bc e Ec, porm lenta. MIC Tetraciclina g/mL: Bc = 1,8; Sa e Ec = 3,7; Pa = 12,5

Figura 9-18- Mtodo de difuso em gar com discos de papel de filtro contaminados
com extratos de S. densiflora para determinao de atividade antimicrobiana sobre S. aureus e M. roseus
Sentido horrio, iniciando no primeiro disco vermelho: HMSG, HMSC, HMSCr e HMSF

388

Figura 9-19- Mtodo de difuso em gar com discos de papel de filtro contaminados
com extratos de S. densiflora para determinao de atividade antimicrobiana sobre E. coli e P. aeruginosa

Figura 9-20- Mtodo de difuso em gar com discos de papel de filtro contaminados
com extratos de S. densiflora para determinao de atividade antimicrobiana sobre T. cutaneum e B. cereus
Sentido horrio, iniciando no primeiro disco vermelho: HMSG, HMSC, HMSCr e HMSF

389

9.5.11.

Atividade de S. densiflora e V. polygama sobre a

enzima pectinase
De acordo com os resultados expostos na Tabela 9-13, o extrato mais ativo de S. densiflora, o HMSCr, s causou 29 % de inibio enzimtica. As substncias testadas, com exceo do tanino -pedunculagina que resultou 60 % de inibio, apresentaram a mesma tendncia, sendo praticamente inativas ou aumentando a atividade enzimtica, como ocorreu com as duas substncias glicosiladas ensaiadas. Este fato pode ser explicado pela capacidade da enzima pectinase de hidrolisar ligaes glicosdicas no s de polissacardeos, mas tambm de outros compostos como flavonides glicosilados e derivados glicosilados do cido elgico (VERSARI et al., 1997). Quanto aos resultados dos testes realizados com os taninos e cada reagente do ensaio bioqumico, visualmente no ocorreu precipitao nem turvao das solues reagentes; os testes com o tampo e a pectina no produziram mudanas na densidade tica em relao ao controle; no entanto, foi constatado um aumento significativo da densidade tica no teste da casuarinina e castalagina com a enzima (anlise estatstica pelo Teste t-student 95 %), o que indica que a pectinase provavelmente est causando hidrlise destas substncias, mas no totalmente, pois elas continuam parcialmente ativas (ou seus produtos de hidrlise), fato corroborado pelas suas atividades inibitrias de 28 e 4 % respectivamente (Tabela 9-13). No teste da enzima com a -pedunculagina houve aumento da densidade tica, porm no muito significativo. Entretanto, no teste da pedunculagina e casuarinina com o ADNS, foi observado um aumento significativo da densidade tica. Este resultado mascara a leitura real do ensaio, apontando uma atividade inexistente para a enzima, invalidando, assim, o efeito dos taninos ensaiados sobre a pectinase.

390

Tabela 9-13- Atividade de extratos e substncias de S. densiflora e V. polygama

sobre a enzima pectinase Extrato/Substncia HMSC HMSG HMSCr HMSF cido glico cido arjunlico 6-hidroximaslinato de D-glucopiranosila cido sirngico orientina+isoorientina cido 2,3,19triidroxiurs-12-en-28-ico cafeoil-6-O- + -Dglucopiranosdeo castalagina casuarinina 4-O--Lraminopiranosdeo do cido elgico -pedunculagina < 0,001 0,9 40* 0,003 1,5 85* P 0,002 0,38 0,0005 0,91 0,05 0,11 0,02 0,2 0,34 0,11 0,02 0,001 0,001 Concentrao mM 0,67 mg/mL 0,67 mg/mL 0,67 mg/mL 0,67 mg/mL 4 1,4 1,0 3,4 1,5 1,4 1,9 0,7 0,7 % atividade da pectinase 73* 103 71* 100 105 104 105# 97 96 95 108# 96 72*

*Teste estatstico t-student 95 %: atividade inibitria enzimtica significativa em relao ao controle # Teste estatstico Mann Whitney 95 %: aumento significativo da atividade enzimtica em relao ao controle Valores de P< 0,05 foram considerados significativamente diferentes do controle

391

9.5.12. APRT

Atividade dos taninos sobre as enzimas GAPDH e

Depois de todos os testes realizados para verificao de possveis reaes ou interferncias dos taninos com as enzimas e os outros reagentes dos ensaios bioqumicos, no se constatou nenhuma alterao significativa na absoro de luz UV (mximo de 0,004 abs) ao serem efetuadas as misturas dos taninos com os reagentes, conforme detalhado no procedimento. Os taninos castalagina e casuarinina apresentaram bandas de absoro na mesma regio do NADH (Figura 9-21), mas na concentrao testada no ensaio, este fato no produziu alterao na leitura final. Tais observaes nos foram suficientes para validar os testes dos taninos casuarinina, castalagina e raminopiranosdeo sobre a GAPDH e castalagina e casuarinina sobre a APRT.

Tabela 9-14- Atividade dos taninos sobre as enzimas GAPDH (controle positivo,
chalepina CI50 = 64 M) e APRT Substncia castalagina casuarinina 4-O--Lraminopiranosdeo do cido elgico
* absorveu no mesmo comprimento de onda da reao produzindo alterao na leitura (259 nm, Figura 9-21)

Concentrao M 7,5 3,3 1,8 239 119

% inibio GAPDH 50

% inibio APRT 50

50 86 33,5

50 *

392

4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 -0,5200 250 300 350 400 NAD-H-100M-1 ... Castalagin-100M ... Casuarinin-100M ... Raminosideo-100M ...

Figura 9-21- Espectro de absoro do NADH, castalagina, casuarinina e 4-O--Lraminopiranosdeo do cido elgico
Densidades para solues na concentrao de 100 M numa cela de 1 cm de caminho ptico

Tendo a casuarinina apresentado uma CI50 menor do que a da castalagina sobre ambas enzimas, pode se levantar a hiptese, em relao estruturaatividade, que o grupo galoil separado da parte HHDP, na casuarinina, seja o responsvel pela sua maior atividade. A pequena atuao do ramnopiranosdeo (Tabela 9-14) e do cido glico (Tabela 9-4), mas no a atuao do cido elgico, refora a concluso de KASHIWADA et al. (1992) sobre quanto maior o nmero de grupos galoil e de hidroxilas fenlicas na estrutura do tanino, mais potente este se mostra frente s enzimas testadas, porm esta afirmativa s vlida para monmeros. Eles tambm afirmam que a C-glicosilao no aumenta a atividade em comparao com os outros taninos. Porm, quanto maior a estrutura do tanino, mais distante se encontra de ser classificado como um inibidor competitivo (que se liga enzima no mesmo stio cataltico que o substrato), j que sua molcula muito grande para interagir especificamente com o stio ativo das enzimas em questo. Muitos frmacos eficazes atuam como inibidores competitivos. No entanto, os taninos podem estar agindo como inibidores no competitivos, se ligando em diferentes domnios da enzima (stios alostricos) provocando alteraes na sua conformao, e conseqentemente no stio ativo, que podem impedir e/ou dificultar a interao com o substrato (MURRAY et al., 1993). Segundo QUIDEAU & FELDMAN (1996), a estrutura rgida dos
393

elagitaninos, proveniente da ligao bifenil, pode lhes proporcionar uma plataforma tridimensional bem definida capaz de fornecer loci potenciais de ligaes hidrognio e resduos hidrofbicos para uma enzima alvo. A literatura relata que os taninos podem ter atividade seletiva sobre as enzimas, como por exemplo, a casuarinina e stachyurina apresentaram baixa inibio enzimtica sobre a enzima Protena Quinase C, enquanto a pedunculagina foi muito ativa, com uma CI50 de 4 M (KASHIWADA et al., 1992). A telimagrandina II, pedunculagina, vescalagina/castalagina so inibidores potentes da DNA topoisomerase II humana, tendo valores de CI100 entre 200 a 500 nM, sendo de 100 a 250 vezes mais potentes que o etoposdeo. Reforando o interesse que esta classe de substncias tem suscitado como potentes agentes anticancergenos, a castalagina/vescalagina causaram citotoxicidade seletiva em clulas humanas do tumor slido (melanoma RPMI-7951) com EC50 de 0,09 e 0,84 M (QUIDEAU & FELDMAN, 1996). A casuarinina e a 1-O-galoil-castalagina apresentaram efeito citotxico sobre clulas HL60 da leucemia humana, a partir da induo de apoptose daquelas, com uma CI50 de 10,8 e 12,5 M respectivamente (YANG et al., 2000).

394

10.Concluses

O estudo fitoqumico de V. polygama Cham. revelou vrias substncias no identificadas em estudos anteriores, como os ecdisterides shidasterona, stachysterona B e polipodina B, alm de alguns flavonides polimetoxilados. O relato das flavonas di-C-glicosiladas schaftosdeo, carlinosdeo e ismeros indito para o gnero Vitex. A Siphoneugena densiflora Berg foi a primeira espcie do gnero a ser submetida pesquisa fitoqumica, bem como a ensaios biolgicos e bioqumicos. Todas as substncias identificadas foram de suma importncia taxonmica, chamandose a ateno para os taninos elgicos C-glicosdicos castalagina e casuarinina, um dos tipos caractersticos de taninos da ordem Myrtales para o gnero Eugenia (OKUDA et al., 2000), do qual o gnero Siphoneugena foi segregado; os ramnopiranosdeos derivados do cido elgico, encontrados em vrias outras famlias, porm em Myrtaceae somente no gnero Eucalyptus at o presente momento, anexando grande valor taxonmico (YAZAKI & HILLIS, 1976; HILLIS & YAZAKI, 1973; KIM et al., 2001); os triterpenos pentacclicos, muito abundantes no gnero Eugenia (JUNGES, 1994); o flavonol quercetina, presente em 88 % das espcies de Eugenia do Novo Mundo, segundo HARON et al. (1992), e seus derivados glicosilados simples, que acompanham as caractersticas morfolgicas primitivas da famlia; e a siphoneugenina, como o primeiro representante contendo um novo tipo de aglicona para os taninos hidrolisveis. A espectrometria de massas demonstrou ser uma ferramenta

imprescindvel na identificao das substncias, principalmente nas misturas de flavonides e taninos. Alm disso, o uso desta tcnica, juntamente com a RMN 1H, foi fundamental para a monitorao de amostras contendo taninos, visto que nem sempre se conseguiu resoluo satisfatria na CCDA para a distino entre substncias puras ou misturas.

396

A inatividade biolgica ou bioqumica de um extrato no pode ser levada em considerao para a busca de uma substncia ativa, pois podem existir compostos antagnicos que interferem nos ensaios. Tal fato ocorreu com vrios extratos, como por exemplo com a frao diclorometnica do extrato metanlico de folhas de V. polygama, o qual se mostrou inicialmente inativo sobre a enzima GAPDH, que forneceu a mistura de flavonides 3-O + 4-O--D-glucopiranosilquercetina e o 3-metoxiquercetina, com CI50 de 20 e 36 M, respectivamente. esperado que os inibidores sejam seletivamente efetivos com afinidades na escala de nanomolar para enzimas, mas tambm afetem o crescimento dos tripanosomas na escala de micromolar (OPPERDOES & MICHELS, 2001). Em geral, as substncias submetidas aos ensaios biolgicos e bioqumicos no apresentaram resultados que justifiquem estudos posteriores, pois suas atividades se deram em concentraes relativamente altas. Exceo para a atuao dos taninos casuarinina e castalagina sobre as enzimas GAPDH e APRT e para o cido 2,3,19-triidroxiurs-12en-28-ico, o qual causou 85 % de lise das formas tripomastigotas (0,5 mM), atuao prxima da violeta genciana (0,6 mM = 100 %; CI50 = 76 M), porm a atividade foi reduzida para 16 % a uma concentrao de 0,2 mM. Por isso, esta substncia poderia ser usada como lder na busca de compostos mais ativos. A anlise quantitativa da 20-hidroxiecdisona (20E), no extrato metanlico de galhos de V. polygama, usando-se CLAE nas condies especificadas na metodologia, mostrou ser uma tcnica rpida e eficiente. A fase estacionria fenil/hexil Luna 10 , em conjunto com a fase mvel H2O/MeOH, no modo reverso, comprovou ser uma fase bem seletiva para modificadores para o ajuste de pH nem o uso de tampes. A quantidade de 20-hidroxiecdisona presente nos galhos, 0,27 % da matria seca, justifica a explorao comercial da planta tanto para a preparao de a 20E presente no extrato de galhos, com a vantagem de no ser necessria a adio de

397

extratos, plulas do material seco, quanto como fonte para a obteno da 20E pura, levando-se em conta o alto valor agregado que a substncia acumula. Os taninos castalagina e casuarinina, ao contrrio do que est constatado na literatura (YOSHIDA et al., 1991), podem sofrer solvlise em condies brandas, com mudana de configurao no C-1, dependendo do tempo que ficam submetidos a tais condies (37C e pH ligeiramente cido, porm num tempo maior que 100 h).

398

11.Perspectivas

Dar continuidade ao estudo fitoqumico dos extratos das folhas de S. densiflora para a identificao das substncias ativas sobre as bactrias, trabalho que j vem sendo realizado pelo aluno de iniciao cientfica Fernando Cotinguiba. Submeter a substncia 20-hidroxiecdisona ao ensaio de ingesto com a formiga Atta sexdens rubropilosa para verificao da sua atividade inseticida (foi submetida, mas no foi txico s formigas na concentrao de 1mg/mL). Realizar pesquisas para o desenvolvimento de meios de propagao e germinao das sementes de V. polygama com o objetivo de se obter mudas, visando uma plantao e cultivo em larga escala para a sua explorao comercial, j que a parte explorada ser composta inicialmente pelos galhos, os quais podem ser retirados da planta sem ter de mat-la. Efetuar estudos comparativos entre as tcnicas de recristalizao e cromatografia planar com o intuito de se identificar os mtodos de extrao e purificao que proporcionam melhor rendimento da 20-hidroxiecdisona. Os resultados dos ensaios com as enzimas GAPDH e APRT deveriam ser submetidos a tratamentos estatsticos para apresentarem maior confiabilidade e teor cientfico. Alm disso, todas as substncias deveriam ter suas CI50 calculadas para futuros estudos de estrutura-atividade. Verificar a atividade de vrias substncias sobre o Trypanosoma brucei e sobre a enzima Tripanotiona redutase, que atua como principal e nica via de proteo do T. cruzi contra a oxidao (foi verificada e j se encontra em fase de publicao). Foram deixadas vrias misturas de triterpenos e ecdisterides com a aluna Elaine Cabral para o desenvolvimento de mtodos de anlise dos mesmos em CLAE acoplado ao espectrmetro de massas. Foram deixadas amostras de vrias das substncias identificadas com a aluna Richelle Priscila Severino para serem testadas nas enzimas cisteno proteases, envolvidas em processos patolgicos diversos.

400

12.Referncias bibliogrficas

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