Biologia Molecular

Tcnicas Moleculares

Luca s Bra n do

CONCEITOS BSICOS

Ncleo - Clula Humana

DENTRO DO DNA SE
ENCONTRAM OS GENE

Definio de Genes
Estrutura Gnica

n=23, X ou Y

Pai

5UTR

Introns

Promotor

2
a
A

Me

3UT

3
a
A

Exons

Locus
Gnico

Homozigoto
Homozigoto
Heterozigoto
Selvagem
Mutante

Alelo A
A

Alelo a
G

Porque diferente ?

MUTAO
!

O PROCESSO PELO QUAL OS GENES MUDAM DE UMA FORMA

A LLI C A PA R A O U T R A . U MA MUDANA PERMANENTE NU MA

SEQUNCIA DE BASES NO DNA.

a origem da diversidade gentica dos indivduos

DOGMA CENTRAL DA
BIOLOGIA MOLECULAR

Histrico do DNA

Estrutura do DNA

A Dupla Hlice

James Watson & Francis Crick (1953)

Estrutura das Bases nitrogenadas

Estrutura das Bases nitrogenadas

Purnicas

Pirimidina

Estrutura dos Nucleotdeos

Estrutura dos nucleotdeos mono-, di- e trifosfatados. Os desoxirribonucleotdeos
correspondentes so abreviados dNMP, dNDP e dNTP. N = A, G, C, U ou T.

Tipos de Nucleotdeos

dA ou A

ou dT ou T

ou dG ou G

, ou dC ou C

ou

Estrutura dos desoxirribonucleotdeos 5-monofosfatados (dNMP)

Polinucleotdeos
5-terminal

Ligaes
fofosdiester

3-terminal

Estrutura Secundria
Antiparalelismo
As fitas do DNA esto
dispostas em direes
opostas

Complementariedade
Cada base de uma fita pareada com a base complementar da outra fita

A Dupla Hlice

As duas fitas do DNA se

torcem para formar uma
dupla hlice (estrutura
secundria do DNA)

A Dupla Hlice
Fatores que estabilizam a dupla hlice:

interaes hidrofbicas
foras de van der Walls
pontes de hidrognio
interaes inicas

Entre as bases
nitrogenadas
Entre os grupos fosfato do
DNA e os ctions (Mg2+)
presentes na soluo
fisiolgica

A Dupla Hlice
A dupla hlice apresenta dois tipos de
sulcos aos quais se ligam as protenas da
cromatina
Sulco menor

Sulco maior

A Dupla Hlice

Origem do Material Genmico

Extrao de DNA
o
id
n
efi
D
o

si
Po
de
r
do
a
rc
a
M
de
o
xt
Te
pe lo Usur io

DNA
Clula Humana Nucleada
Ncleo

Existem inmeros materiais

biolgicos humanos que
apresentam clulas nucleadas
- Tecido
- Excreo
Saliva, sangue, urina, escarro
Lavagem broncoalveolar
Fluido cerebroespinhal, Fluido pleural
Secreo vaginal, esperma

Clula Humana Nucleada

Cortes de tecidos (bipsias frescas ou

em blocos de parafina).
Bulbo capilar, clulas aderida na unha

EXTRAO DE DNA DE SANGUE

PERIFRICO TOTAL

Reao em Cadeia da Polimerase

Histrico
Metodologia
Componentes
Adaptaes
Utilizaes
Riscos

Professor: Lucas Brando

www.lucasbrandao.org

Histrico

Mullis inovou: Conseguiu especificidade na cpia de

apenas segmentos especficos, introduzindo o conceito de
primer de PCR, e na utilizao de uma DNA polimerase
termoestvel.
Mullis
Taq DNA polimerase

Permite a
mudana na
temperatura

Thermus aquaticus
Primer
Especificidade da reao

Fig. 1: Kary Mullis,

inventor da PCR,
em foto de 1994
(Nobel Academy)

Mimetizar a replicao do DNA em regies especficas do genoma

Estrutura do DNA
Bases purnicas A e G
Bases pirimidnicas T e C

Polaridade
Fosfato
Fendas
Aucar
desoxirribose
Bases Nitrogenadas
Conformaes

Replicao do DNA
Um conjunto de enzimas ir atuar no
DNA para permitir sua replicao.
Resumidamente, o DNA deve ser
aberto, para que sejam inseridos
iniciadores, e a enzima DNA
polimerase construa uma fita
complementar no sentido 5 para 3.

PROCESSO DE REPLICAO
O movimento da forquilha de replicao revela uma
fita molde no sentido 3 5 e outra no sentido oposto
5 3
Desta forma, as fitas novas so sintetizadas em
sentidos opostos
FITA LEADING crescimento segue a
direo do movimento da forquilha de
replicao
FITA LAGGING crescimento no
sentido oposto ao movimento da
forquilha de replicao

PCR
Etapas

DNA

Aquecer

Desnaturao

Inserir os Primers

Anelamento

Sintetizar um fita de DNA

Extenso

Primers
So pequenas seqncias
DNA molde

Primer

Especificidade da Reao
8

oligonucleotdeos

Genoma

5 mil genes

Gene A

3
5

CC

G
G

3T OH

3 OH

Taq polimerase
pH
Atividade

Cofatores

Ideais

Temperatura
A enzima "l" a fita molde e faz a fita complementar incorporando
deoxirribonucleotdeos tri-fosfatados

10

dNTPs

Fosfato
Aucar
11

Componentes

dCTP

MgCldTTP
2

3 OH

Tampo
Taq

dATP

3 OH

12

Gene
A
G

C
G
dGTP

Polymerase Chain Reaction

Reagentes Necessrios para a

Reao
1. DNA molde;
2. Soluo Tampo da Taq polimerase:
*ons (Na, Cl e K, entre outros);
*Detergentes (Tween 20, Triton X-100, Nonidet P-40), inibindo a
formao de dmeros das cadeias enzimticas;
*Protenas estabilizantes (BSA) e
*Algumas substncias que agem na desnaturao da cadeia
molde de DNA (DDT e ! -mercaptoethanol), quebrando as pontes
de hidrognio entre as bases.
13

3. MgCl2, doador muito estvel de ons Mg2+, que so

cofatores indispensveis para atividade da enzima..

4. Primers Forward e Reverse
5. Os desoxinucleotdeos so a matria-prima
propriamente dita para a sntese das fitas-filhas. So
compostos por nucleotdeos (ATP, TTP, CTP, GTP).

6. Temperatura
14

Etapas

Ciclos

Desnaturao
Extenso

Anelamento

Tempo
15

Em 1989, o DNA Thermal

Cycler apareceu como o
primeiro termociclador
automtico

16

17

Polymerase Chain Reaction

A quantidade de DNA final segue uma funo

exponencial,
onde:

N = N0 . 2n

N = Nmero final de cadeias de DNA

N0 = Nmero inicial de DNA molde (template)
n = Nmero de repeties do ciclo
Portanto, a concentrao final do DNA molde
na soluo muito maior (da ordem de 235 ) do que
a inicial, possibilitando a sua identificao.
18

19

Utilidades
amplamente usada numa variedade de aplicaes na biologia
molecular:
Mapeamento gnico,
clonagem
sequencimento de DNA
expresso gnica
Paternidade
diagnstico de doenas genticas
deteco e identificao de vrus, como HIV e HCV

20

PORQUE OTIMIZAR A PCR?

Otimiza-se a reao da PCR para:

Aumentar o rendimento da reao
(eficincia)
Aumentar a especificidade
Aumentar a reprodutibilidade (poo-poo,
corrida-corrida)
21

22

23

24

25

26

27

28

29

TIPOS DE REAES MAIS RECENTES:

1. RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction):
!

Esta reao composta de 2 partes: a transcrio

reversa e a amplificao. Seu principal diferencial que
na verdade esta reao no parte de um molde de DNA
diretamente extrado da amostra; a amostra fornece o
RNA, que convertido em cDNA (DNA complementar).
Ferramenta til em estudos de expresso gnica, pois
avaliando o mRNA, podemos detectar quais protenas
esto sendo efetivamente expressas.
!

30

Alm disso, tambm so utilizados

primers, mais inespecficos e nunca em pares.
So oligonucleotdeos compostos por vrias
timinas consecutivas (6 a 35), que so anelados
s regies Poly-A (ou A-Rich) do RNA, ricas em
adeninas. Aps este ciclo, obtm-se o cDNA
que ser utilizado na PCR. importante
ressaltar que o round de transcrio reversa
no altera o nmero de fitas de RNA ou DNA.
!

31

2. Multiplex PCR:

!
!
Mais de um segmento genmico amplificado
numa nica reao, cada um com seu par de
primers especfico. Esta vantagem pode simplificar
alguns experimentos, como a investigao de
paternidade, onde vrios marcadores genmicos
devem ser analisados.

32

33

3. Nested PCR:

!
Para melhorar a especificidade e a eficincia
da reao, o segmento genmico amplificado
primeiro de forma abrangente, copiando at mesmo
seqncias localizadas fora dela, e depois,
utilizando este primeiro produto, a amplificao da
real seqncia-alvo. Estas duas etapas (rounds)
podem ser realizadas concomitantemente, ou em
duas reaes separadamente, caracterizando o
Semi-Nested PCR.
34

35

Fig. 5: Esquema de uma reao de Nested PCR. O produto da amplificao do

1 Round utilizado com template no 2 round. No final das duas etapas,
obtm-se um produto menor que o da primeira amplificao. Este tipo de
reao tem como vantagem o ganho em especificidade e eficincia, uma vez
que o DNA-molde do 2 round est em concentraes altssimas, e os
primers da segunda etapa tm menos chances de anelamento em seqncias
inespecficas, dada a reduo do tamanho do molde.
36

RAPD

DNA POLIMRFICO
AMPLIFICADO AO ACASO

37

Dois Primers

PCR
Construo

PRIMER

Conhecimento da
Seqncia do DNA

Produo de um fragmento especfico

38

Genoma

5 mil genes

1 pedao genes

Gene A

39

Estringncia x Especificidade
Temperatura

Especificidade
45oC

Gene A

40

RAPD
Randmico
3 OH

Apenas um primer
Pequeno = 10-15pb

3
G

CC

A
G

41

3T OH

3 OH

Foi descrita simultaneamente por

Williams et al. (1990) e Welsh &
McCleland. (1990).

amplificao de seqncias de
DNA randmicas
utilizando iniciadores pequenos de
seqncias arbitrrias
42

Utilidades :
Mapas genticos,
Diferenciao de espcies animais e vegetais e para
Impresses de DNA, com especial utilidade nos
estudos de gentica de populaes.

43

1 Indivduo

44

2 Indivduo

Surto Infeco Hospitalar

Kluyvera sp
1

Kb

6.3

3.2

1.5

4,5,6,7, Kluyvera sp

10

11

12

13 14

5. AFLP (polimorfismo de
tamanho de fragmento
amplificado)

!
!

53

RFLP

54

Zanichelli editore
S.p.A. Copyright 2005

ANLISE DOS PRODUTOS DA PCR

Eletroforese Horizontal

Idia
Equipamentos

Lucas Brando
1

Produto da PCR

3
Gene A

Baseada
Molcula de DNA
Carga
Negativa
Agrupamentos fosfatos

Tamanho e peso

Idia

DNA

Diferena de potencial

Eletroforese

Malha

Geis

Gel
Agarose

Poliacrilamida

Agarose
Derivado do agr-agr

Insolvel em agua fria

Rhodophytas

Malha

! ou " concentrao

Subunidades de galactose

Concentrao do Gel
0,6 %

1%

2,5%

Tamanho do Amplicon

Finalidade
Grandes

Mdios

Pequenos

Logstica

Preparao do Gel:
Aps o preparo os gis sero colados na
cuba de eletroforese contendo o tampo de corrida
TAE (Tris Acetato EDTA) ou TBE (Tris Borato
EDTA) os quais tambm so os diluentes da
agarose.
Em seguida, as amostras so adicionadas ao
gel e correro entre 70-100V durante 60 min.

Poos

10 a 150#L
Aplicar o produto da PCR

10

Preparo da Amostra

Amostra +

11

gua +

Tampo de amostra

Eletroforese

12

Eletroforese
50 a 100mV

DNA

13

Corante

Colorao com Brometo

Duas estratgias

Pr-corrida

Ps-corrida
BROMETO DE ETDIO
C21H2OBrN3

14

A T T

T A A

Visualizao

Aparelho que emite raios UV.

As bandas podem ser identificadas

como pequenas faixas fluorescentes

15

Ladder

16

17

Gel de poliacrilamida montado em cuba de eletroforese

e sendo submetido uma voltagem de 69V.
18

COLORAO COM

PRATA

A identificao dos produtos pode ser feita pela

colorao com EtBr, porm o mtodo mais utilizado a
impregnao do DNA contido no gel por nitrato de prata.
Logo aps a corrida, o gel fixado com uma soluo de
etanol e cido actico, para impedir a eluio (formar
borres no gel) das amostras.
A colorao por prata de bem mais fcil
visualizao do que a oferecida pelo EtBr, alm de ser mais
segura, levando-se em conta o fato de que este altamente
carcinognico.
19

Gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata.

Devido alta sensibilidade do mtodo de colorao,
observa-se bandas inespecficas e DNA no amplificado no
p da foto. A seta indica a corrida do Ladder.
20

Interpretao
Caso : Diagnstico viral
1

21

____________

_____________

_____________

Interpretao

22