ANLISE

MICROBIOLGICA DE
POLPA DE FRUTAS
Profa. Dra. Hassa R. Cardarelli

2014

NORMAS DE SEGURANA NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

As normas de segurana nos laboratrios de Microbiologia foram elaboradas com o objetivo de

proteger a sade do pessoal do laboratrio e do pblico, assim como o meio ambiente, dos
riscos associados exposio acidental a microrganismos e materiais biolgicos experimentais.
Os acidentes em laboratrio de Microbiologia, normalmente, ocorrem pela formao de
aerossis, por respingos, pipetagens incorretas, injees, trabalhos com grandes quantidades
e/ou concentraes elevadas de microrganismos, laboratrios superlotados de pessoal e
material, infestao por roedores e insetos, entrada de pessoas no autorizadas. Para evitar a
maior parte destes riscos, devem ser tomados cuidados especiais, desde a concepo geral e
instalao do laboratrio.
As infeces por microrganismos em laboratrio de Microbiologia podem ocorrer atravs da
pele, da via digestiva, da via respiratria e dos olhos e ouvidos.
As regras enumeradas a seguir constituem a base das prticas seguras de laboratrio e devem
ser consideradas regulamento de trabalho.
Sero apresentadas aqui as regras mais
importantes, s quais podem ser acrescentadas outras, muitas delas especficas para cada
laboratrio onde se trabalhe com agentes patolgicos especficos.
1. No se alimente, no beba ou fume, no guarde alimentos e no aplique cosmticos no
recinto de trabalho;
2. No pipete com a boca qualquer tipo de material; proteja a ponta superior das pipetas com
algodo antes da esterilizao;
3. O laboratrio deve ser mantido limpo e em ordem, devendo ser dele retirados quaisquer
materiais que no tenham relao com o trabalho;
4. As superfcies de trabalho devem ser descontaminadas, pelo menos, uma vez por dia e
sempre que ocorrer caso de derramamento de substncias potencialmente perigosas;
5. O pessoal de laboratrio deve lavar as mos antes de iniciar os experimentos, depois de
haver manipulado materiais e animais infectados, e tambm ao deixar o laboratrio;
6. Conservar as mos longe da boca, nariz, olhos e rosto;
7. Deve ser evitado o uso de barba e os cabelos compridos devem estar sempre presos;
8. Todos os procedimentos devem ser efetuados de maneira a se evitar, ao mximo, a
formao de aerossis;
9. As superfcies das bancadas devem ser recobertas com papel absorvente, sempre que
exista a possibilidade de respingamentos de material perigoso;
10. As subculturas de microrganismos infecciosos devem ser feitas em capelas;

11. Todos os lquidos e slidos contaminados devem ser descontaminados antes de eliminados
ou reutilizados. Os materiais esterilizados em autoclaves ou incinerados fora do laboratrio
devero ser acondicionados em recipientes fechados, impermeveis e devidamente
indentificados;
12. Use sempre avental ou uniforme enquanto estiver no laboratrio; estas roupas no devem
sair do recinto de trabalho e devem ser desinfetadas por procedimentos adequados;
13. Sempre que for necessrio, proteja os olhos e o rosto de respingos ou impactos usando
culos de segurana, escudos faciais, mscaras ou qualquer outro dispositivo de segurana;
14. As bancadas do laboratrio devem ter a superfcie muito lisa, de maneira a serem
facilmente limpas e desinfetadas;
15. Somente devero ser autorizadas a entrar no laboratrio pessoas que tenham sido
informadas sobre os possveis riscos e satisfaam os requisitos que se exigem para o acesso;
durante o trabalho, as portas devem ser mantidas fechadas; somente tero acesso ao local,
animais e pessoas autorizadas; no se deve permitir a entrada de crianas no laboratrio;
16. No se deve permitir a entrada no laboratrio, de animais que no tenham relao com os
trabalhos que esto sendo efetuados;
17. Deve ser estabelecido um programa de luta contra os insetos e roedores;
18. As pipetas usadas devem ser imediatamente imersas em desinfetantes;
19. Em caso de respingos, cubra imediatamente a rea com desinfetantes;
20. Nunca umedea rtulos com a lngua; use gua ou rtulos auto-adesivos;
21. Use seringas e agulhas hipodrmicas somente para injeo parenteral, aspirao de
lquidos dos animais de laboratrio e de vacinas contidas em frascos com tampas perfurveis.
No as use para manipular lquidos infecciosos; nestes casos, devem ser empregadas pipetas
automticas;
22. No empregue chumaos de algodo ao esvasiar uma seringa contendo ar ou excesso de
lquido. Use um pequeno frasco cheio de algodo embebido em desinfetante;
23. Antes e depois de injetar materiais infecciosos em animais, esfregue o local da infeco
com desinfetante;
24. Utilize seringas com acessrio especial para evitar que a agulha se separe da seringa;
25. Em todos os trabalhos nos quais existem possibilidades de contato direto acidental com
sangue, material infeccioso ou animais infectados, devem ser usadas luvas. Estas luvas, antes
de descartadas, devem ser esterilizadas em autoclaves;

26. Todos os derramamentos, acidentes e exposies reais ou potenciais por material

infectado devem ser imediatamente notificados ao diretor do laboratrio. Devem existir
protocolos escritos destes episdios, onde so previstas avaliaes, vigilncia e tratamento
mdico apropriados;
27. Amostras de soro sanguneo de todo o pessoal do laboratrio e demais pessoas expostas
aos riscos a ele inerentes, devem ser conservadas como referncia;
28. As centrfugas usadas para material contaminado ou infeccioso devem ser protegidas por
anteparos;
29. Use para centrifugao somente tubos no danificados e tampados. Tenha a certeza de
que o lquido contido no tubo no transbordar durante a centrifugao;
30. Culturas lquidas de organismos altamente infecciosos requerem cuidados especiais, pois,
qualquer movimento que agite a superfcie do lquido, produzir aerossol; os liquidificadores
do origem a pesados aerossis.

I.

PREPARO DO MATERIAL PARA UMA ANLISE MICROBIOLGICA

1 - Vidraria - Uso do Forno de Pasteur

Todo material de vidro, metal ou plstico que entrar em contato com o alimento deve ser
esterilizado. Normalmente emprega-se o forno de Pasteur para esterilizar vidraria e material
de metal e o xido de etileno ou irradiao para esterilizao de material plstico
(normalmente comercializados j esterilizados, podendo ser usados uma s vez).
O forno de Pasteur trata-se de uma cabine de metal, com paredes isoladas termicamente,
aquecido a eletricidade. Todo material de vidro ou metal a ser esterilizado deve ser mantido a
170-180 C, durante uma hora. Os frascos de vidro (erlenmeyers, tubos de ensaio, bales,
provetas, etc.) devem ter sua boca protegida por um chumao de algodo hidrfobo recoberto
por papel. Placas de Petri devem ser embrulhadas em papel antes de colocadas no forno, o
mesmo acontecendo com pipetas (que devem ter um chumao de algodo hidrfobo na
extremidade a ser colocada na boca), e demais utenslios (pinas, esptulas, etc.). Decorrido
o tempo de esterilizao, deixar o forno esfriar por si s uma vez que sua abertura quando
ainda quente poder danificar o material devido brusca variao de temperatura. Aconselhase esterilizar o material necessrio na vspera do seu emprego.
2 - Meios de cultura
Com raras excees (determinada nas frmulas de preparo), todos os meios de cultura
empregados numa anlise microbiolgica devem ser esterilizados.
Preparar os meios de cultura conforme instrues . Colocar um chumao de algodo hidrfobo
na boca de cada frasco e cobrir com papel. Alguns meios de cultura especiais no podem ser
autoclavados, devendo ser esterilizados por simples fervura ou em vapor fluente (autoclave
aberta), ou ainda filtrados. Nunca se deve utilizar os meios de cultura na temperatura que
saem da autoclave. Se necessrio abaixar a temperatura em gua corrente e manter os meios
num banho-maria a 45-50 C at o instante do uso.
Uso da autoclave
Princpio de funcionamento: obteno de altas temperaturas por aquecimento de gua em
recipiente fechado, sob presso.
Tcnica: colocar gua no fundo da autoclave, introduzir a cesta contendo o material a ser
autoclavado, adaptar a tampa e fechar os parafusos, deixando a vlvula de escape de vapor
aberta. Ligar a autoclave no mximo de intensidade. A princpio, haver expulso do ar
contido na caldeira. Quando a gua comear a ferver haver sada de um jato intermitente de
ar misturado com vapor de gua. Quando todo o ar for expulso, comear a sair, apenas, um
jato contnuo de vapor de gua. Neste momento, fechar a vlvula de escape de vapor e
observar o aumento de presso acusado pelo manmetro. Ao atingir a temperatura desejada,
regular o aquecimento de modo que o ponteiro do manmetro fique estvel, mantendo-se
neste nvel pelo tempo desejado. Decorrido este tempo, desligar a autoclave e esperar que a
presso desa a zero e, ento, abrir a vlvula de escape de vapor. Quando no h mais sada
de vapor, abrir a tampa e retirar o material.

3 - Outros reagentes
Outros reagentes como solues tampes de diluio, gua, soluo de cidos ou lcalis, etc.,
precisam estar estreis se forem entrar em contacto com o alimento, podendo ser esterilizados
na autoclave junto com os demais meios de cultura, ou ento filtrados em filtros de
esterilizao.
Uso de filtros de esterilizao
Ex: Filtros tipo Millipore ou Nuclepore (de celulose).
Colocar a membrana de esterilizao no local adequado, e esterilizar todo o conjunto
(Kitassato, funil, membrana, copo) na autoclave a 121 C, durante 30 minutos.
Colocar o lquido a ser esterilizado no copo do filtro, ligar a extremidade do Kitassato trompa
d'gua (ou bomba de vcuo) e proceder a filtrao, que no deve demorar muito. Filtrado todo
o lquido, transfer-lo assepticamente para um frasco previamente esterilizado.

II.

PREPARO DO ALIMENTO PARA ANLISE

1 - Alimentos slidos
Pesar, assepticamente, 25 g do alimento e homogeneizar com 225 mL de tampo diluente ou
gua peptonada. *A homogeneizao pode ser feita em homogeneizador prprio para
alimentos ou em liquidificador com o copo "higienizado" pela lavagem, por 3 vezes, com lcool
70% e posteriormente com gua destilada estril. Usar velocidade baixa para no aquecer a
mistura. Transferir a diluio 10-1 assim obtida para um frasco estril e proceder diluio
seriada decimal (1 mL da diluio 10-1 adicionado 9 mL de diluente, e assim por diante).

2 - Alimentos lquidos
Pipetar, assepticamente, 25 mL de alimento e transferir para um frasco contendo 225 mL de
diluente e homogeneizar. Proceder diluio seriada como descrito acima.
*Preferencialmente, a homogeneizao deve ser feita em aparelho do tipo stomacher.

III.

METODOLOGIAS

1. ENUMERAO DE BACTRIAS AERBIAS MESFILAS

1.1. Material necessrio

Meio de cultura:
gar Padro para Contagem PCA
Vidraria esterilizada:
Placas de Petri
Pipetas
Alas de Drigalski
Estufas a 35-37 C
Banho-maria a 45-50 C
Contador de colnias
1.2. Metodologia
1.2.1. Preparar a quantidade necessria do gar para contagem padro (PCA), conforme
instrues no frasco, calculando 15 a 20 mL para cada placa de Petri.
1.2.2. Efetuar a pesagem, homogeneizao e diluio seriada do alimento em diluente
gua peptonada.
1.2.3. Procedimento
1.2.3.1. Bactrias aerbias mesfilas e termfilas
a) De cada diluio do alimento transferir 1 mL para placas de Petri
esterilizadas.
b) Adicionar cerca de 20 mL de PCA, esfriado a 45 C, em cada placa semeada e
homogeneizar girando suavemente as placas em movimentos na forma de oito.
c) Uma vez solidificado o gar, inverter as placas e incub-las a 35-37 C
durante 48 horas, para as bactrias aerbias mesfilas e a 55 C durante 48
horas, para as bactrias aerbias termfilas.

1.2.3.2. Bactrias aerbias mesfilass

a) De cada diluio do alimento semear 0,1 mL na superfcie de placas contendo
PCA. Espalhar com a ala de Drigalski. Incubar a 35-37 C durante 48 horas.
1.2.4. Enumerao

a) Decorrido o tempo de incubao, selecionar as placas contendo 25 a 250 colnias e

cont-las com o auxlio de contador.
b) Calcular o nmero de unidades formadoras de colnias de bactrias aerbias
mesfilas por grama de amostra (UFC/g ou mL), multiplicando o nmero de colnias
encontradas pelo inverso do fator de diluio.
Considerar o volume semeado para o clculo de UFC/g ou mL. Multiplicar pelo inverso
da diluio e ainda por 10 (uso de 0,1 mL de amostra diluda).
1.3. Resultados
Expressar os resultados em Unidades Formadoras de Colnias por grama ou mL de
alimento (UFC/g ou UFC/mL).
Em caso de se obter apenas placas com nmero inferior a 25 ou superior a 250
colnias, expressar os resultados como: Contagem estimada: UFC/g ou UFC/mL.

1.4. Esquema

25gg/25
amostra
25
mL da amostra

225 mL de diluente
10

-1

Homogeneizao

9 mL de diluente
1 mL

1 mL
10

0,1 mL

PCA
(Superfcie)

Mesfilos
35-37C/48h

9 mL de diluente

-2

0,1 mL

PCA
(Superfcie)

Mesfilos
35-37C/48h

10

-3

0,1 mL

PCA
(Superfcie)

Mesfilos
35-37C/48h

2. ENUMERAO DE FUNGOS

2.1. Material necessrio

Meio de cultura:
gar Batata Dextrose com Cloranfenicol

Vidraria esterilizada:
Placas de Petri
Pipetas de 1 mL
Basto de vidro
Alas de Drigalski
Banho-maria a 45 C
Contador de colnias
2.2.

Metodologia
2.2.1. Preparar a quantidade necessria de gar batata dextrose com cloranfenicol
(adicionar ao meio de cultura pronto, aps resfriamento antes do plaqueamento),
conforme instrues do frasco, e esterilizar em autoclave a 121 C durante 15 min.
Distribuir o meio de cultura em placas de Petri esterilizadas.
2.2.2. Efetuar a pesagem, homogeneizao e a diluio seriada adequada da
amostra.
2.2.3. Procedimento
a) De cada diluio do alimento, transferir 0,1 mL para a superfcie das placas de
gar batata dextrose.
b) Espalhar com a ala de Drigalski.
c) Incub-las a 25 C, sem inverter, durante 3-5 dias.
d) Decorrido o perodo de incubao, selecionar as placas contendo entre 15 e 150
colnias e contar as colnias.
e) Determinar o nmero de colnias de fungos por grama ou mL de alimento,
conforme o item 1.2.4.

2.3. Resultados
Expressar os resultados em Unidades Formadoras de Colnias por grama ou mL
de alimento (UFC/g ou UFC/mL).

2.4. Esquema
25 g/ 25 mL amostra

225 mL de diluente
10

9mL de diluente

9mL de diluente

-1

Homogeneizao

1 mL

1 mL
-2

-3

10
0,1 mL

gar BD (superfcie)
25C/3-5dias

Contagem total

10

0,1 mL

0,1 mL

gar BD (superfcie)

gar BD (superfcie)

25C/3-5dias

Contagem total

25C/3-5dias
Contagem total

3. ENUMERAO DE COLIFORMES TOTAIS, COLIFORMES A 45 C

(TERMOTOLERANTES) E DE Escherichia coli

3.1.

Mtodo dos tubos mltiplos

3.1.1. Material necessrio:

Meios de cultura:
Caldo Lauril Sulfato Triptose LST
Caldo Bile Verde Brilhante 2% VB
Caldo EC
gar Eosina Azul de Metileno Levine
Banho-maria a 45 0,2 C (alimento)
Banho-maria a 44,5 0,2 C (gua)
Estufa a 35 C

3.1.2. Metodologia
3.1.2.1. Preparo do alimento para anlise
Efetuar a pesagem, homogeneizao e a diluio seriada do alimento. Preparar,
no mnimo, 3 diluies decimais subsequentes.
3.1.2.2. Procedimento
Teste presuntivo para coliformes totais, coliformes termotolerantes e E.
coli
a) De cada diluio do alimento, transferir alquotas de 1 mL para 3 tubos
contendo o caldo Lauril Sulfato Triptose (LST).
Homogeneizar atravs de
agitao cuidadosa.
b) Incubar a 35 C durante 48 horas.
c) Decorrido o tempo de incubao, separar os tubos positivos, ou seja, os que
apresentarem turvao do meio e gs no interior do tubo de Durham; dispensar
os demais.
Teste confirmatrio para coliformes totais
a) Transferir, com o auxlio de ala, um inculo de cada tubo positivo de LST para
outro tubo contendo caldo Bile Verde Brilhante (VB).
b) Incubar a 35 C durante 48 horas.
c) Selecionar os tubos positivos (turvos e com gs no interior dos tubos de
Durham) e anotar os resultados.
d) Utilizar a Tabela NMP adequada para calcular o "Nmero Mais Provvel" (NMP)
de coliformes totais por grama ou mL de alimento.

Teste confirmatrio para coliformes termotolerantes e E. coli

Obs.: A legislao em vigor (Resoluo RDC 12 de janeiro de 2001) estabelece
limites para coliformes a 45 C, sinnimo de coliformes fecais ou
termotolerantes.
a) Transferir um inculo com o auxlio de ala de cada tubo positivo de caldo LST
para outro tubo contendo caldo EC.
b) Incubar a 45 C 0,2 (alimento) ou 44,5 C 0,2 (gua) durante 24 horas.
c) Selecionar os tubos positivos (turvos e com gs no interior dos tubos de
Durham) e anotar os resultados.
d) Utilizar a tabela NMP adequada para calcular o "Nmero Mais Provvel" de
coliformes a 45 C por grama de alimento.
Teste confirmatrio para E. coli
a) Semear, por estrias, os tubos positivos de caldo EC em gar Levine, de modo a
obter colnias isoladas.
b) Incubar a 35 C durante 24 horas.
c) Observar o surgimento de colnias tpicas de E. coli, isto , de colorao negra,
com brilho metlico esverdeado (este brilho pode estar ausente ou pouco visvel).
Deve-se posteriormente fazer a confirmao bioqumica das colnias suspeitas
atravs da srie IMViC (prova do indol, do vermelho de metila, de VogesProskauer e do citrato).
d) Expressar os resultados em NMP de E. coli/g ou mL do alimento consultando a
tabela do NMP.

3.1.3. Tabelas

Tabela 1: Nmero Mais Provvel (NMP) e intervalo de confiana a nvel de 95% de probalidade,
para diversas combinaes de tubos positivos e negativos na inoculao de 10 pores de 10 mL
da amostra por tubo (APHA, 1985)

Intervalo de confiana (95%)

(valores aproximados)
N de tubos
positivos
0
1
2
3
4
5

NMP/100
mL
<1,1
1,1
2,2
3,6
5,1
6,9

Mnimo

Mximo

0
0,03
0,26
0,69
1,3
2,1

3,0
5,9
8,1
10,6
13,4
16,8

6
7
8
9
10

9,2
12,0
16,1
23,0
>23,0

3,1
4,3
5,9
8,1
13,5

21,1
27,1
36,8
59,5
Infinito

Tabela 2: NMP por grama e intervalo de confiana (95%), para sries de 3 tubos com 0,1, 0,01 e
0,001 g/mL de inculo.
Pos. tubes

Conf. lim.

Pos. tubes

Conf. lim.

NMP/g
0.10

0.01

0.001

MPN/g
Low

High

0.10

0.01

0.001

Low

High

<3.0

--

9.5

21

4.5

42

3.0

0.15

9.6

28

8.7

94

3.0

0.15

11

35

8.7

94

6.1

1.2

18

29

8.7

94

6.2

1.2

18

36

8.7

94

9.4

3.6

38

23

4.6

94

3.6

0.17

18

38

8.7

110

7.2

1.3

18

64

17

180

11

3.6

38

43

180

7.4

1.3

20

75

17

200

11

3.6

38

120

37

420

11

3.6

42

160

40

420

15

4.5

42

93

18

420

16

4.5

42

150

37

420

9.2

1.4

38

210

40

430

14

3.6

42

290

90

1,000

20

4.5

42

240

42

1,000

15

3.7

42

460

90

2,000

20

4.5

42

1100

180

4,100

27

8.7

94

>1100

420

--

http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html#tables

3.1.4. Esquema
25g amostra

225 mL de diluente
-1
10

9 mL de diluente

9 mL de diluente

1 mL

1 mL

Homogeneizao

-2

-3

10

10

1 mL

1 mL

1 mL
Caldo LST
(Teste
Presuntivo)

35-37C/48h

Multiplicao e produo de gs
(tubos positivos)
Caldo VB
(Teste confirmativo
para Coliformes
Totais)

1 alada
Caldo EC
(Teste confirmativo
para Coliformes a
45C)
Multiplicao e
produo de gs
NMP coliformes a
45C

E. coli

E. aerogenes

35-37C/48h
Multiplicao e
produo de gs
NMP coliformes
totais

45/24h
Citrato de
Simmons

35-37C/96h

1 ala

gar EMBA
(Teste confirmativo
para E. coli)

1 ala
35-37C/24h

Caldo
MR-VP

Caldo
Triptona

Citrato (-)

35-37C/48h (VP)
35-37C/96h (VM)
35-37C/24h

VP (-) e VM (+)

Indol (-) ou (+)

4. Pesquisa de Salmonella

4.1. Material necessrio

Meios de cultura:
Caldo Lactosado
Caldo Rappaport-Vassiliadis RV
Caldo Tetrationato TT
gar Bismuto Sulfito BS
gar Xilose lisina deoxicolato - XLD
gar Lisina Ferro LIA (10)
gar Trplice Acar Ferro TSI (21)
Vidraria esterilizada:
Placas de Petri
Pipetas de 1 mL
Estufa a 35 C
Contador de colnias

4.2. Metodologia
4.2.1. Pr-enriquecimento
Homogeneizar 25 g ou 25 mL do alimento com 225 mL de caldo Lactosado.
Incubar a 35-37 C, por 18-24 horas.
4.2.2. Enriquecimento
Transferir 1 mL do homogeneizado para um tubo contendo 10 mL de caldo
tetrationato e 0,1 mL para um tubo contendo 10 mL de caldo RappaportVassiliadis. Incubar o primeiro a 35 C e o segundo a 43 C em banho-maria por
24 horas.
4.2.3. Semeadura em gar seletivo
Semear superficialmente por esgotamento os caldos de enriquecimento em placas
de gar Bismuto Sulfito (BS) e Agar xilose lisina deoxicolato (XLD), de modo a
obter colnias isoladas. Incubar a 35-37 C por 24 horas.
4.2.4. Identificao de colnias suspeitas
gar BS: as colnias podem ser de cor marrom, cinza ou preta; algumas vezes
apresentam-se com brilho metlico.
gar XLD: as colnias so vermelhas e algumas com centros negros. O Agar se
torna vermelho pela presena de Salmonella.
4.2.5. Identificao bioqumica

Semear uma colnia em tubo contendo gar Trplice Acar Ferro (TSI), inclinado,
e gar Lisina Ferro (LIA). Incubar a 35-37 C/24h.
TSI: rampa alcalina (vermelha) e fundo cido (amarelo), com ou sem produo de
H2S (escurecimento do gar). Reao atpica em TSI que no deve ser descartada
se as demais reaes em LIA se apresentarem tpicas: rampa e fundo cidos
(amarelos), com ou sem produo de H2S.
LIA: fundo e rampa alcalinos (prpura, sem alterao da cor do meio), com ou
sem produo de H2S (escurecimento do meio). Reao atpica em LIA que no
deve ser descartada se as demais reaes em TSI se apresentarem tpicas: fundo
amarelado com rampa alcalina, com ou sem produo de H2S.
4.3. Resultados
Expressar os resultados como ausncia ou presena de Salmonella spp. em 25
g ou 25 mL de alimento.

4.4. Esquema
25g amostra

225 mL de caldo de pr-enriquecimento

Homogeneizao

Incubao 35-37C/18-24h
1 mL

Enriquecimento
seletivo

gar BS

0,1 mL

Caldo Tetrationato
(TT) 10 mL

Caldo RappaportVassiliadis (RV) 10 mL

35C/24h

43C/24h

gar BS

gar XLD

gar XLD

35-37C/24h

Identificao

gar
TSI

gar LIA
35-37C/24h

IV.

MEIOS DE CULTURA

1 - gar Bismuto Sulfito (BS)

Preparar conforme instrues no frasco.
Neste meio de cultura, sulfito de bismuto e verde brilhante inibem o crescimento
de gram positivos e coliformes, permitindo o vigoroso crescimento de Salmonella.
A produo de H2S ocorre devido presena de compostos de sulfurados no meio
e o H2S gerado reage com o ferro contido no meio, formando um precipitado,
gerando colnias caractersticas marrons ou negras, com brilho metlico. A
reduo dos ons bismuto a bismuto metlico que confere brilho metlico s
colnias. As colnias de Salmonella podem ser de cor marrom, cinza ou preta;
algumas apresentam brilho metlico.
2 - gar Eosina Azul de Metileno (EMBA) - Levine
Preparar conforme instrues no frasco.
Esse meio possui uma combinao de eosina e azul de metileno como
indicadores, permitindo uma ntida diferenciao de colnias fermentadoras e no
fermentadoras de lactose. Os microrganismos lactose positivos podem produzir
aldedos que, combinados aos corantes, originam cor caracterstica.
E. coli
aparece com centro escuro e caracterstico brilho verde metlico e outros
coliformes produzem colnias rseas.
3 - gar Lisina Ferro (LIA)
Preparar conforme instrues do fabricante.
O meio de cultura contm, entre outros ingredientes, a seguinte composio:
Glicose
fonte primria de energia
L-lisina
aminocido a ser descarboxilado
Citrato frrico amoniacal e tiossulfato de sdio
reveladores de H2S
Prpura de bromocresol
indicador de pH
( cido = amarelo, bsico = prpura)
A glicose, ao ser metabolizada, acidifica o meio tornando-o amarelo. Quando
depletada a glicose, se a bactria produzir a enzima lisina-descarboxilase, a lisina
ser degradada, dando origem a metablitos alcalinos e a cor do meio voltar a
ser prpura. Ainda nesse meio, pode-se observar a produo de H2S, que reage
com o ferro presente no meio, produzindo colorao negra. Tambm pode haver
produo de gs a partir da glicose.
+

4 gar Padro para Contagem (PCA)

Preparar conforme instrues no frasco.
um meio rico (contm triptona, extrato de levedura e dextrose) que permite o
desenvolvimento de praticamente todas as bactrias presentes na amostra,

permitindo que se tenha uma medida quantitativa do nmero de bactrias. Este

nmero importante porque d idia das condies de higiene e conservao do
produto. Se variarmos a temperatura de incubao podemos avaliar a populao
de bactrias psicrotrficas (7 C / 10d), mesfila (37 C / 48h) ou termfilas (45
C / 48h).

5 gar Trplice Acar Ferro (TSI)

Preparar de acordo com as instrues do fabricante.
O meio de cultura contm, entre outros ingredientes, a seguinte composio:
Glicose
1 g
Lactose e Sacarose
10 g cada
Citrato frrico amoniacal e tiossulfato de sdio
reveladores de H2S
Vermelho de fenol
indicador de pH ( cido = amarelo, bsico = vermelho)
Este meio permite avaliar a capacidade de utilizao de lactose e sacarose com
produo de gs (constatada pela presena de bolhas no meio de cultura), e
ainda a produo de gs sulfeto (visualizada pela presena de um precipitado
negro). Esse meio contm uma pequena quantidade de glicose e dez vezes mais
de lactose. As Enterobacteriaceae e outros fermentadores de glicose metabolizam
primeiramente a glicose, aerbia e anaerobiamente (tanto na superfcie do gar
como na base), causando a acidificao do meio e consequente mudana de
vermelho para amarelo (devido presena de indicador de pH vermelho de
fenol), dentro de 6 h. Depois da utilizao da glicose, organismos fermentadores
de sacarose ou lactose comearo a utilizar esses acares. Como a lactose est
presente em alta concentrao, o organismo continuar produzindo cidos e o
meio permanecer amarelo, aps 24 h de incubao (reao cido/cido, A/A).
Se o organismo que est sendo testado no capaz de utilizar a lactose e/ou
sacarose do meio, ele deve produzir energia, metabolizando as protenas e
aminocidos presentes no meio. O metabolismo protico ocorre principalmente na
superfcie do meio, onde o oxignio abundante. Os subprodutos da quebra da
peptona (como por exemplo, amnia) so alcalinos e fazem com que a superfcie
do meio se torne vermelha. A base permanece cida devido prvia fermentao
da glicose. Essa reao chamada Alcalina/cida (K/A) Os organismos no
fermentadores da glicose podem tambm produzir compostos alcalinos a partir de
peptona, verificado na superfcie do meio.

6 gar xilose lisina deoxicolato (XLD)

O Agar XLD (Xilose Lisina Desoxicolato) um meio seletivo utilizado para o
isolamento de Salmonella e Shigella a partir de amostras clnicas e alimentos,
como recomendado pela ISO 6579: 2002. A recuperao de Salmonella e Shigella
no ocultada pelo crescimento abundante de outras espcies, portanto o Agar
XLD ideal para a anlise de amostras que contenham flora mista e com suspeita
de abrigar patgenos entricos, por exemplo, espcimes clnicos ou em produtos
alimentcios. Colnias vermelhas falso-positivo podem ocorrer com algumas
espcies de Proteus e Pseudomonas. A incubao por mais de 48 horas podem
levar a resultados falsos positivos.

O gar de XLD tambm um meio de diferenciao. Contm extracto de

leveduras como fonte de nutrientes e vitaminas. Utiliza o desoxicolato de sdio
como agente selectivo e, por isso, possui uma aco inibitria em relao aos
microrganismos gram positivos. A xilose incorporada no meio uma vez que
fermentada por praticamente todos os microrganismos entricos, exceto pelas
Shigellae, e esta caracterstica permite a diferenciao das espcies de Shigella. A
lisina includa de modo a permitir que o grupo de Salmonella seja diferenciado
dos microrganismos no patognicos uma vez que, sem a lisina, as salmonelas
rapidamente fermentariam a xilose, tornando-se impossvel distingui-las das
espcies no patognicas. Depois das salmonelas terem acabado com a fonte de
xilose, a lisina atacada atravs da enzima lisina decarboxilase, revertendo a um
pH alcalino que imita a reaco da Shigella. De modo a evitar que se d uma
inverso deste tipo por coliformes positivos lisina, adiciona-se lactose e
sacarose para produzir cido em excesso. Para aumentar a capacidade de
diferenciao da formulao, inclui-se um sistema de indicador de H2S, composto
por tiossulfato de sdio e citrato de amnia frrico, para a visualizao do sulfeto
de hidrognio produzido, resultando na formao de colnias com centros pretos.
Os produtores de H2S no patognicos no decarboxilam a lisina; assim, a
reaco cida que produzem impede que as colnias se tornem negras, o que
acontece apenas com um pH neutro ou alcalino.
Preparar de acordo com as instrues do fabricante.

7 - gua Peptonada a 0,1%

peptona
gua destilada

1g
1 litro

Dissolver a peptona na gua destilada. Ajustar o pH a 7,0 0,2. Autoclavar a

121 oC durante 15 minutos.
Diluente para homogeneizao e diluio de amostras para a anlise.
8 Caldo Bile Verde Brilhante 2% (VB)
Preparar conforme instrues no frasco. Distribuir 10 mL por tubo, introduzindo
um tubinho de Durham em cada tubo, antes de autoclavar.
Serve como agente inibitrio de microrganismos gram positivos e dos no
fermentativos. Contm sais biliares e o corante verde brilhante, sendo mais
seletivo que o LST e, permitindo a confirmao da presena de coliformes totais.
Novamente neste caldo observada a produo de gs a partir de lactose, dentro
de 48 h a 35 C.
9 - Caldo EC
Preparar conforme instrues no frasco. Distribuir 10 mL por tubo, introduzindo
um tubinho de Durham em cada tubo, antes de autoclavar.
Consiste de um caldo lactosado tamponado, contendo 0,15% de sais biliares.
Nesse meio inibido o crescimento de organimos formadores de esporos e de

estreptococos fecais, enquanto que o crescimento de Escherichia coli

favorecido. A temperatura de incubao (44,5 C/24h) tambm favorece o
desenvolvimento de E. coli. A turvao do meio com produo de gs (devido
fermentao da lactose), indica prova positiva para a presena de coliformes
fecais.
10 Caldo Lactosado
Extrato de carne
Peptona
Lactose
gua Destilada

3,0 g
5,0 g
5,0 g
1000 mL

Misturar os ingredientes, ajustar o pH para 6,9 0,2. Autoclavar a 121 C por

15min.
11 Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST)
Preparar conforme instrues no frasco. Distribuir 10 mL por tubo, introduzindo
um tubinho de Durham em cada tubo, antes de autoclavar.
O LST possui alguma seletividade para organismos coliformes devido presena
do surfactante lauril sulfato, mas ainda permite a recuperao de bactrias que
possam estar injuriadas (expostas a condies adversas como a presena de
cloro, por exemplo). Para anlise de gua utiliza-se 10 tubos com 10 mL de LST
dupla concentrao, contendo um tubo invertido (tubo de Durham), que
aprisionar o gs que poder ser produzido a partir da fermentao da lactose
presente no meio de cultura. Os tubos inoculados so incubados a 35 C/48 h e
so observados para a produo de gs.
12 Caldo Rappaport-Vassiliadis (RV)
Preparar conforme instrues no frasco. Distribuir 10 mL por tubo
Contm verde malaquita, cloreto de magnsio e um baixo pH (5,1) como agentes
inibidores, permitindo a seleo de membros do gnero Salmonella. Esse meio
explora a capacidade de Salmonella sobreviver a presses osmticas
relativamente altas e apresentar capacidade de multiplicao em baixos pHs,
maior resistncia ao verde malaquita, e menores requerimentos nutricionais.
importante que o tamanho do inculo seja pequeno o suficiente para no
interferir na seletividade (1:100).
13 Caldo Tetrationato (TT)
Preparar conforme instrues no frasco. Distribuir 10 mL por tubo de ensaio. No
autoclavar. No instante do uso, adicionar 0,1 mL de uma soluo de verde
brilhante 1:1000 e 0,2 mL da seguinte soluo de lugol:
iodo
iodeto de potssio
gua destilada

6g
5g
20 mL

O meio de cultura contm a seguinte composio: proteose peptona, sais biliares,

tiossulfato de sdio, carbonato de clcio, verde malaquita e iodo-iodeto de
potssio.
A efetividade do meio na inibio de coliformes decorrente da presena de ons
tetrationato (S4O6--) originrios do tiossulfato presente na formulao deste meio.
Organismos que possuem a enzima tetrationato redutase crescem nesse meio,
por exemplo, Salmonella e Proteus. Os sais biliares inibem os organismos que
no vivem no intestino e o carbonato de clcio netraliza os produtos cidos da
decomposio do tetrationato. Atuam ainda, como agentes seletivos o verde
malaquita e o iodo-iodeto de potssio.
Dos caldos de enriquecimento secundrio (TT e RV), com auxlio de uma ala de
nquel cromo, so estriadas placas de gar Rambach (RAM), gar Hektoen Enteric
(HE) e gar sulfito de bismuto (BSA) ou tambm Agar xilose lisina deoxicolato
(XLD).

V.

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