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Belo Horizonte
2011
2
SUMRIO
1 OBJETIVOS......................................................................................................................................... 3
2
CONCEITOS BSICOS ..................................................................................................................... 3
3
INTRODUO................................................................................................................................... 3
3.1
Princpio do Mtodo ........................................................................................................................ 4
3.2
Interferncias ................................................................................................................................... 4
3.3
Lista de Abreviaturas e Siglas ......................................................................................................... 4
4
MATERIAIS E SOLUES .............................................................................................................. 6
4.1
Materiais .......................................................................................................................................... 6
4.1.1
Aparelhagem ............................................................................................................................... 6
4.1.2
Outros Materiais .......................................................................................................................... 6
4.2
Reagentes ........................................................................................................................................ 6
4.3
Solues .......................................................................................................................................... 7
4.3.1
Soluo de EDTA 0,5 M, pH 8,0 (Soluo Estoque) ................................................................... 7
4.3.2
Soluo de Tris-HCl 1 M, pH 7,5-7,8 (Soluo-Estoque)........................................................... 8
4.3.3
Tampo TAE 50X, pH 7,5 (Soluo-Estoque) ............................................................................. 8
4.3.4
Tampo TAE 1X (Soluo de Uso Frequente)............................................................................. 9
4.3.5
Agarose 2% (Soluo-Estoque).................................................................................................... 9
4.3.6
Tampo de Amostra 6X ............................................................................................................. 10
4.3.7
Soluo de lcool 70% ............................................................................................................... 10
4.3.8
Brometo de Etdio ...................................................................................................................... 11
5
PREPARO DA PCR, TERMOCICLAGEM E ANLISE DOS RESULTADOS............................ 11
5.1
Preparo do Master Mix da PCR ..................................................................................................... 11
5.2
Preparo do Gel de Agarose e Eletroforese .................................................................................... 13
6
CONTROLE DE QUALIDADE ....................................................................................................... 14
6.1
Critrios de Qualidade para Aceitao de Resultado para Validao de Laboratrio Externo ...... 15
7
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................................................. 15
PROSAB MICROBIOLOGIA
3
1
OBJETIVOS
CONCEITOS BSICOS
INTRODUO
A PCR uma tcnica de biologia molecular que permite a replicao in vitro do DNA de forma
extremamente rpida. Com a PCR, quantidades mnimas de material gentico podem ser
amplificadas milhes de vezes em poucas horas, permitindo a deteco rpida e confivel de
microrganismos. Este POP descreve reaes da PCR com primers especficos para
amplificao de DNA extrado de culturas puras de arquias e de lodos de sistemas de
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PROSAB MICROBIOLOGIA
4
tratamento de efluentes. Essas anlises podem ser adotadas para investigao desses
microrganismos em outros tipos de amostras.
3.1
Princpio do Mtodo
A PCR constitui-se de ciclos de replicao in vitro de DNA, cada qual contendo trs etapas
bsicas: desnaturao do DNA, anelamento dos primers e extenso Na desnaturao
(normalmente a 94 C) ocorre a separao da duplafita de DNA para exposio dos stios - alvo .
Na segunda etapa, com a diminuio da temperatura (por exemplo, a 55 C) ocorre o anelamento
dos primers em regies especficas de cada fita de DNA separada, que serve como molde,
delimitando, assim, a regio inicial e a regio final da seqncia gentica a ser amplificada.
Finalmente, na etapa de extenso, ocorre a sntese de DNA complementar fita molde e;
geralmente, feita em uma temperatura em torno de 72C. Em teoria, aps 25 a 40 ciclos
possvel produzir em poucas horas milhes de cpias especficas de DNA , mesmo se amostra de
partida contiver apenas uma seqncia alvo original.
3.2
Interferncias
Quantidade de DNA adicionada reao: excesso de DNA pode inibir a reao da PCR ou
gerar bandas inespecficas, causando rastros no gel (smears), acima e/ou abaixo da banda de
interesse. Para uma reao de 50L, a quantidade de DNA genmico que deve ser aplicada
est entre 10pg a 1,0g. Sugere-se realizar testes de PCR com DNA diludo (por exemplo,
1:10, 1:20, 1:50, 1:100) e verificar qual amplificao oferece maior rendimento de produto,
sem rastros inespecficos;
Excesso de reagentes (enzima Taq polimerase, MgCl2, primers, dNTP) podem gerar
amplificaes inespecficas. Porm, esses reagentes em quantidade insuficiente podem
interferir na eficincia da reao;
Baixa temperatura de anelamento dos primers pode causar amplificao inespecfica;
M qualidade do DNA extrado: presena de substncias hmicas, fenol, protenas, etc.,
podem inibir a reao.
Cada reao individual e, por isso, ajustes adequados em seus parmetros geram resultados de
maior sucesso. Em caso de necessidade de alteraes, observar as recomendaes abaixo da
quantidade dos reagentes da PCR (www.fermentas.com ; www.phoneutria.com.br).
Componentes
Quantidade
Tampo da PCR 10X
5,0L
dNTP (2 mM cada)
5,0L
Primer foward
0,11,0M
Primer reverse
0,11,0M
MgCl2 25 mM *
1,04,0M
Taq DNA polimerase
0,51,25U
DNA-molde
10 pg1,0g
gua ultra-pura, livre de nuclease
at 50L
Volume
50L
* Opcional: em alguns casos, o MgCl2 j vem includo no tampo da PCR
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PCR
dNTP
MgCl2
Na2EDTA
TAE
Tris
UV
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4
MATERIAIS E SOLUES
4.1
Materiais
4.1.1
Aparelhagem
Agitador magntico;
Capela de fluxo laminar;
Capela de exausto;
Microcentrfuga;
Termociclador para PCR;
Cuba de eletroforese horizontal;
Fonte para a eletroforese;
Transiluminador de UV com cmera digital;
Computador com software de registro e anlise de imagem;
Balana digital;
Forno microondas;
Autoclave.
4.1.2
4.2
Outros Materiais
Barra magntica;
Bqueres (200 e 1000mL);
Bales volumtricos (100 e 1000mL);
Microtubos do tipo Eppendorf (1,5 mL e 200L) estreis;
Micropipetas (1mL, 200L, 10L);
e ponteiras (1mL, 200L, 10L) estreis;
Plstico tipo Parafilm;
Banho de gelo para microtubos;
Suporte tipo microplaca (96 poos);
Recipientes de plstico escuro (ou coberto com papel alumnio);
Esptula de plstico;
Tubo tipo Falcon (50mL);
Frascos tipo Shott (250mL);
Provetas (100 e 1000mL);
culos de proteo contra luz UV.
Reagentes
gua destilada;
Na2EDTA (para biologia molecular);
Tris base (para biologia molecular);
HCl concentrado;
NaOH (microprolas);
cido actico glacial (grau analtico);
Azul de bromofenol;
Xileno cianol;
Glicerol;
Agarose;
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gua ultra-pura;
Enzima DNApolimerase Taq pht (Phoneutria Biotecnolgia e Servios, Belo Horizonte,
Brasil);
Tampo 10X para PCR (com 50 mM de cloreto de magnsio);
Mistura de desoxinucleotdeos (dNTPs) Fermentas (Fermentas Life Sciences, Vilnius,
Litunia);
Iniciadores ou primers (concentrao de cada um: 25 pmol/L) Fermentas;
Marcador de peso molecular de 25 a 700 pb (DNA ladder, marca: Fermentas);
Brometo de etdio (0,5 g/mL).
4.3
Solues
a) Frmula
Na2EDTA
gua destilada
18,61g
100mL
b) Preparo
c)
Armazenamento
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8
4.3.2
a) Frmula
Tris base
gua destilada
12,11g
100mL
b) Preparo
c)
Armazenamento
a) Frmula
Tris-base
cido actico glacial
Na2EDTA 0,5M pH 8,0
gua destilada
242 g
57,1mL
100mL
1000mL
b) Preparo
c) Armazenamento
Temperatura ambiente (< 30C).
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d) Validade
30 dias. Observar a qualidade da soluo que dever estar isenta de slidos suspensos e fungos.
4.3.4
a) Frmula
TAE 50X
gua destilada
20mL
1000mL
b) Preparo
c)
Armazenamento
Agarose 2% (Soluo-Estoque)
a) Frmula
Agarose
TAE 1X
2g
100mL
0,3
1,0-70,0
0,5
0,7-45,0
0,8
0,4-20,0
1,0
0,3-10,0
1,2
0,2-8,0
1,5
0,2-6,0
2,0
0,1-5,0
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10
b) Preparo
c)
Armazenamento
Tampo de Amostra 6X
a) Frmula
Azul de bromofenol 0,25%
Xileno cianol 0,25%
Glicerol 30%
gua destilada
0,025g
0,025g
7,0mL
3,0mL
b) Preparo
c)
Armazenamento
a) Frmula
lcool comum (comercial)
gua destilada
70mL
30mL
b) Preparo
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c)
Armazenamento
Brometo de Etdio
a) Frmula
Brometo de etdio
gua destilada
1 gota
400mL
b) Preparo
Adicionar uma gota de brometo de etdio em 400mL de gua destilada (concentrao final:
cerca de 0,5 g/mL).
O brometo de etdio um corante utilizado para corar gis de agarose aps a corrida das
amostras de DNA. um corante fluorescente que se intercala entre as bases da duplafita de
DNA. Quando irradiado com luz UV, emite-se uma fluorescncia, o que permite a visualizao
do DNA no gel. A substncia cancergena e o laboratorista no se deve entrar em contato com
esta soluo. O gel corado deve ser manipulado com uma esptula grande e larga.
c)
Armazenamento
A soluo deve ser armazenada, em temperatura ambiente (< 30C), em recipiente escuro ou
embalado com papel-alumnio para proteo contra a luz. O recipiente e esptula devem ser
devidamente identificados, inclusive como contaminados, e separados de outras vidrarias e
objetos de uso comum no laboratrio. Sugere-se incluir um recipiente com gua destilada para
descorar o gel por alguns minutos, aps colorao na soluo de brometo de etdio, para melhor
visualizao da corrida.
d) Validade
15 dias.
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PREPARO
RESULTADOS
5.1
1.
2.
DA
PCR,
TERMOCICLAGEM
ANLISE
DOS
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3.
4.
Descongelar as amostras e reagentes da PCR (tampo 10X contendo MgCl2, H2O ultra-pura,
dNTP, primers) e homogeneiz-los gentilmente (se necessrio, centrifugar rapidamente para
concentrar os reagentes no fundo do microtubo). Mant-los em banho de gelo. A Taq DNA
polimerase dever ser retirada do freezer a 20 C somente no momento do uso;
Calcular, pelo nmero de amostras e incluindo o branco, os volumes necessrios de cada
reagente utilizando a Tabela 1 como referncia. Adicionar uma reao extra para compensar
erros de pipetagem. Para cada lote de reao, deve-se incluir sempre o branco de reao, que
o microtubo contendo somente o mix, sem adio de DNA. O branco de reao utilizado
para checar possveis contaminaes nos reagentes utilizados na PCR.
Tabela 1.
Reagentes
H2O ultra-pura
Tampo de PCR
dNTPs
Primer foward
Primer reverse
Taq polimerase
Amostra de DNA
Volume final
Concentrao
estoque
10X
10 mM cada
25 pmol/L
25 pmol/L
5,0 U/L
1:10 a 1:20
-
Concentrao final
por reao
1X
200 M cada
300 nM
300 nM
0,04 U/L
-
Volume por
reao (L)
20,2
2,5
0,5
0,3
0,3
0,2
1,0
25
Reaes
Multiplicar os
valores
da
coluna ao lado
pelo nmero
total
de
amostras,
controles
e
branco
5.
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PROSAB MICROBIOLOGIA
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Tabela 1.
Grupo-alvo
Arquias em geral
(Domnio Archaea)
Gnero
Methanosaeta
(verificar obs.
no item 6)
Gnero
Methanosarcina
Gnero
Methanobacterium
Par de
primers
Arch-348
Arch-786
GYGCAGCAGGCGCGAAA
GGACTACVSGGGTATCTAAT
Msaet-387
Msaet-573
GATAAGGGRAYCTCGAGTGCY
GGCCGRCTACAGACCCT
Msarc-450
Msarc-589
Mbac398
Mbac578
TAGCAAGGGCCGGGCAAGA
ATCCCGGAGGACTGACCAAA
CCCAAGTGCCACTCTTAACG
AGACTTATCAARCCGGCTACGA
Seqncia (5-3)
Perfis de
temperatura a
95C por 20s;
55C por 20s;
72C por 2
min
(40 ciclos)
Referncia
Adaptado de
SAWAYAM
A et al.
(2006)
Todas as reaes da PCR iniciam com desnaturao em 95C por 3 minutos e finalizam com
a etapa de extenso 72C por 10 minutos.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
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10. Ligar a fonte e iniciar a eletroforese com a aplicao de um campo eltrico de 100 V por 40
minutos;
11. Aps a corrida, colocar o gel na soluo de brometo de etdio (0,5 g/mL) durante 10
minutos;
Cuidado: Durante todo o procedimento de preparao do gel de agarose, aplicao e
colorao com brometo de etdio, o laboratorista deve usar luvas e jaleco.
Opcional: Em caso do gel ficar muito corado, pode-se descor-lo em banho de gua destilada
por cerca de 10 minutos no intuito de melhorar a visualizao das bandas de DNA
no transiluminador.
12. Aps registro da imagem do gel (realizado atravs de programa de imagem no computador),
deve-se descartar o gel em recipiente adequado destinado para este tipo de resduo. Limpar o
transiluminador com leno de papel e gua destilada (sempre usando luvas).
Cuidado: A luz UV nociva aos olhos e pele expostos a esta. Usar mscara e culos de
proteo quando estiver operando equipamentos contendo esta fonte de luz e que
no estiverem em cabines fechadas!
6
CONTROLE DE QUALIDADE
Realizar a extrao de DNA, mix da PCR, reao da PCR (termociclador) e a eletroforese
em setores separados dentro do laboratrio para evitar contaminaes;
De preferncia, o mix da PCR deve ser preparado dentro de uma capela de fluxo laminar
previamente esterilizada com luz UV por no mnimo cinco minutos;
Deve-se separar um conjunto de trs micropipetas (10 L, 100 L e 1000 L) para cada
etapa: i) extrao de DNA, ii) preparo de mix da PCR, iii) manipulao e diluio de DNA,
para evitar contaminao das amostras e das reaes;
As ponteiras e microtubos, antes de serem utilizados, devem ser esterilizados em autoclave
por 20 minutos a 121 C e, logo aps, colocados em estufa para secar;
Em cada reao da PCR, separar uma para ser o branco de reao (reao sem adio de
DNA) para checar ausncia de contaminao do mix;
Separar uma reao para ser o controle positivo da PCR, contendo DNA extrado de uma
cultura pura de arquia de referncia que amplifique com o par de primer utilizado;
Averiguar o tamanho do fragmento amplificado, em termos de pares de base: a posio da
banda do produto da PCR no gel deve ser aproximadamente a mesma que a posio da
banda do marcador de peso molecular (DNA Ladder) que apresente o peso desejado.
No caso de testar outros pares de primers, avaliar sua especificidade com DNA extrado de
culturas de referncia (sempre que possvel).
No caso dos primers deste protocolo, foram feitos testes com DNA de culturas puras de arquias
de referncia (Methanosaeta concilii DSM 6752, Methanosarcina barkeri DSM 800 e
Methanobacterium formicium DSM 1535). Verificou-se que os primers Arch 348/786
amplificaram com sucesso o DNA das trs culturas puras. Os primers Mbac 398/578 e Msarc
450/589 se mostraram especficos, amplificando somente DNA de Methanobacterium
formicium e Methanosarcina barkeri, respectivamente. O par Msaet 387/573, entretanto,
amplificou DNA de Methanosaeta concilii e de Methanosarcina barkeri, no sendo, portanto,
especfico para o gnero Methanosaeta, conforme diz o artigo (SAWAYAMA et al., 2006).
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Apesar disso, esse par de primer pode ser til para detectar populaes de arquias
acetoclsticas, uma vez que ambos os gnero, Methanosaeta e Methanosarcina, constituem as
nicas arquias produtoras de metano a partir da degradao do acetato. Os quatro pares de
primers foram tambm testados com DNA de bactria (Escherichia coli) e, em todos os testes, o
resultado foi negativo (sem nenhuma amplificao).
6.1
Tanto as reaes como o controle positivo devem ter um produto amplificado com banda
simples e ntida, sem rastros;
As bandas devem apresentar o tamanho esperado (em funo do par de primer utilizado)
mediante comparao com a banda de mesmo tamanho (usando o marcador de peso
molecular como referncia (DNA Ladder);
O controle negativo tem que apresentar ausncia de amplificao, e deve ser realizado
sempre em cada reao de amplificao;
Repetir a reao por mais 2 eventos distintos de amplificao de modo a confirmar os
resultados.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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