Ensaios de Bioequivalncia

Etapa Analtica

mtodo analtico
validado

Tcnicas de quantificao de frmacos em amostras

biolgicas:
cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE, HPLC high
performance liquid chromatography);
cromatografia gasosa (GC gas chromatography);
imunoensaios (radioimunoensaio, enzimaimunoensaio).

Tipos de amostras:
sangue;
plasma;
soro;
urina;
saliva;
...

Pontos crticos no processo de encaminhamento das

amostras biolgicas:
identificao (estudo, sujeito, fase, data e horrio da
coleta);
temperatura durante o transporte;
avaliao das condies das amostras no recebimento;
armazenamento no laboratrio analtico.

Pr-tratamento:
precipitao por protenas;
extrao lquido-lquido;
extrao por fase slida.

 fase mvel/fase estacionria;

migrao diferencial/separao;
deteco/cromatograma;
tempo de reteno/rea de pico;
padro interno;
CLAE/GC.

 fase mvel lquida;

tipos bsicos:
cromatografia lquido-lquido ou de partio;
cromatografia lquido-slido;
cromatografia de troca inica;
cromatografia de excluso.

Detectores:
absorbncia no ultravioleta e visvel (UV-VIS);
arranjo de diodos (DAD);
fluorescncia;
espectrometria de massas (LC/MSMS).

A CLAE permite separao e quantificao dos

componentes de uma amostra.

injetor

manmetro

vlvula injetora
integrador
coluna
DetectorA
fluconazol

Pk#

bomba

forno

detector

reservatrio
de fase mvel

dreno

UV-vis

fluorescncia

lorazepam m/z=321
transio: 321>275

bromazepam m/z=318
transio: 318>102

LC-MSMS

 fase mvel gasosa;

fase estacionria lquida ou slida;
volatilizao da amostra;
amostras volteis e termorresistentes.

 EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technique);

FPIA (fluorescence polarization immunoassay);
alta sensibilidade;
baixa seletividade;
fenobarbital, teofilina, digoxina, etc...

Parmetro importantes:
faixa de linearidade e limite de quantificao;
complexidade do processo de pr-tratamento;
tempo de anlise;
disponibilidade de padro interno;
toxicidade dos solventes e demais reagentes.

35.00
30.00
rea do pico (x 104)

A quantificao do
frmaco nas amostras
biolgicas feita por meio
de comparao com
amostras padro (curva
de calibrao) e
controlada por meio de
amostras de controle de
qualidade.

25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

Concentrao (m g/m L)

5.00

6.00

preparao das amostras:

precipitao de protenas
extrao lqido-lqido
extrao por fase slida

anlise
por CLAE/GC/IE

quantificao do frmaco:
curva de calibrao
controle de qualidade

Validao

A validao deve garantir que o mtodo atenda s

exigncias das aplicaes analticas, assegurando a
confiabilidade dos resultados.
Abrange os seguintes itens (RDC 27/2012):
seletividade;
efeito residual;
efeito matriz;
curva de calibrao;
preciso;
exatido;
estabilidade.

Outros parmetros (RE 899/03):

recuperao;
limites de deteco e quantificao;
robustez.

Capacidade do mtodo de diferenciar e quantificar os

analitos de interesse (frmaco e PI) na presena de outros
componentes da amostra.
So investigados pela anlise de amostras de plasma branco
(quatro amostras normais, uma lipmica, uma hemolisada)
para verificao da existncia de interferncia por parte de
componentes endgenos.
5% para PI
20% LIQ para analito

Aparecimento ou aumento do sinal do analito ou PI causado

por contaminao proveniente de amostras analisadas
anteriormente.
Devem ser realizadas, no mnimo, 3 (trs) injees da mesma
amostra branco, sendo uma antes e duas logo aps a injeo
de uma ou mais amostras processadas do LSQ.
5% para PI
20% LIQ para analito

Efeito na resposta do analito ou PI causado por componentes

da matriz biolgica.
Devem ser analisadas amostras de matrizes biolgicas
processadas (para plasma: 4 normais, 2 lipmicas, 2
hemolisadas), posteriormente adicionadas de analito e PI, e
solues, nas mesmas concentraes das amostras de CQB e
CQA.
Fator de matriz normalizado (FMN): CV<15%


=

A curva de calibrao indica a relao entre concentrao

de analito e resposta do mtodo, representada, no caso da
CLAE, pela razo de reas dos picos cromatogrficos de
analito e PI.
definida utilizando-se no mnimo seis concentraes de
padro em plasma e trs repeties. Deve-se estabelecer
correlao de preferncia linear entre concentrao,
considerada varivel independente (x) e rea do pico,
considerada varivel dependente (y).

A preciso de mtodos bioanalticos uma medida de erro

aleatrio e definida como concordncia entre vrias
medidas da mesma amostra, sendo expressa como
coeficiente de variao (C.V. %) dessas medidas:
preciso intracorrida: cinco replicatas
preciso intercorridas (3, dias distintos): cinco replicatas
Concentraes: LIQ, CQB, CQM, CQA, CQD.
No deve ser superior a 15% (20% para LIQ).

A exatido de mtodos bioanalticos uma medida de erro

sistemtico e definida como concordncia entre o valor
determinado e o valor real:
preciso intracorrida: cinco replicatas
preciso intercorridas (3, dias distintos): cinco replicatas
Concentraes: LIQ, CQB, CQM, CQA, CQD.
No deve ser superior a 15% (20% para LIQ).

Dados sobre estabilidade so necessrios para garantir que a

concentrao da substncia no sofre alterao entre a
coleta da amostra e o momento da anlise.
longa durao;
curta durao
ciclos de congelamento e descongelamento;
Ps-processamento;
solues-padro refrigeradas ou congeladas.
Concentraes: CQA e CQB

A recuperao corresponde ao resultado obtido aps anlise

de amostra de plasma branco acrescida de padro,
submetida a pr-tratamento, expresso como porcentagem do
resultado obtido aps anlise de padro puro, no submetido
a pr-tratamento.

Os limites de deteco e quantificao expressam a

capacidade do mtodo analtico em determinar pequenas
concentraes de analito:
limite de deteco: representa a menor concentrao que
pode ser diferenciada do nvel de rudo;
limite de quantificao: deve apresentar resposta , no
mnimo, duas vezes maior que a do limite de deteco, e
representa a menor concentrao que pode ser
determinada com exatido e preciso aceitveis (20%).

Avalia a suscetibilidade do mtodo analtico a variaes

nas condies analticas, tais como:
tempo de extrao;
pH da fase mvel;
composio da fase mvel;
coluna;
temperatura;
fluxo.