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European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 127 (2018) 19–28

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Jornal Europeu de Farmacêutica e Biofarmacêutica

página inicial da revista: www.elsevier.com/locate/ejpb

Trabalho de pesquisa

Um novo polimorfo solúvel e bioativo do praziquantel T

Débora Zanollaa, Beatrice Perissuttia, ÿ , Nadia Passerinibe, Michele R. Chierotti , luz hasad ,
Dario Voinovicha, Lara Gillie , Nicola Demitrie, Silvano Jeremias, Jennifer Keizerf,
Paolo Cerreia Viogliog , Beatrice Albertinibe
aDepartamento de Ciências Químicas e Farmacêuticas, Universidade de Trieste, P.le Europa 1/via L. Giorgieri 1, 34127 Trieste, Itália bDepartamento de
Farmácia e Biotecnologia, Universidade de Bolonha, Via S. Donato 19/2, 40127 Bolonha, Itália
c
Departamento de Química e Centro NIS, Universidade de Torino, V. Giuria 7, 10125 Torino, Itália
d
Escola de Farmácia de Leicester, Universidade De Montfort, The Gateway, LE1 9BH Leicester, Reino Unido Elettra – Sincrotrone
e
Trieste, SS 14 Km 163,5 em Area Science Park, 34149 Basovizza, Trieste, Itália
f
Unidade de Desenvolvimento de Medicamentos para Helmintos, Departamento de Parasitologia Médica e Biologia Infecciosa, Instituto Suíço de Saúde Tropical e Pública, Socinstr. 57, CH-4051 Basel,
Suíça gAix-
Marseille Université, CNRS, ICR (UMR 7273), 13397 Marseille cedex 20, França

INFORMAÇÕES DO ARTIGO ABSTRATO

Palavras-chave: O praziquantel é o único medicamento disponível para tratar a esquistossomose. No entanto, sua utilização é limitada
Praziquantel por muitos inconvenientes, incluindo a alta dose terapêutica necessária, resultando em comprimidos e cápsulas grandes
Mecanoquímica e difíceis de engolir, principalmente em pacientes pediátricos. Neste estudo, uma opção alternativa para superar essas
Reações de estado sólido
desvantagens é proposta: mudar para um novo polimorfo cristalino do composto racêmico praziquantel. A preparação
Polimorfismo do polimorfo cristalino foi realizada por meio de um processo de moagem pura em um moinho vibratório. A nova fase
Solubilidade 1
(Forma B) era quimicamente idêntica ao material de partida (conforme comprovado por HPLC, H NMR e polarimetria),
bioatividade
mas apresentava propriedades físicas diferentes (conforme avaliado por SEM, calorimetria exploratória diferencial,
Solução de estrutura cristalina
Cálculos DFT-D termogravimetria, espectroscopia ATR-FTIR, difração de pó de raios X e RMN de estado sólido). Além disso, a estrutura
Doenças tropicais negligenciadas cristalina da nova fase foi resolvida a partir do padrão de difração de raios X síncrotron do pó, resultando em uma célula
C2/c monoclínica e validada pelo cálculo DFT-D. Além disso, os desvios químicos simulados de NMR 13C no estado
sólido estavam em excelente acordo com os dados experimentais. A conversão do praziquantel original na Forma B
mostrou afetar positivamente a solubilidade em água e a taxa de dissolução intrínseca do praziquantel. Tanto a
atividade in vitro quanto in vivo contra o Schistosoma mansoni foram mantidas. Nossos achados sugerem que a nova
fase, que se mostrou fisicamente estável por pelo menos um ano, é um produto promissor para o desenho de uma
nova formulação de praziquantel.

1. Introdução
O praziquantel (PZQ) é um anti-helmíntico amplamente utilizado no tratamento da
esquistossomose. Estima-se que pelo menos 230 milhões de pessoas no mundo estejam
infectadas pelo gênero Schistosoma [1], principalmente com Schistosoma haematobium,
S. japonicum e S. mansoni. O Prazi quantel está incluído na Lista Modelo de
Medicamentos Essenciais da OMS para o tratamento de adultos e crianças [2]. O fármaco
é bem tolerado e seguro, porém é classificado como fármaco classe II do SBC,
caracterizado por alta permeabilidade, baixa solubilidade [3] e extenso metabolismo de
primeira passagem [4]. A dosagem recomendada para o tratamento de
esquistossomose é de 20 mg/kg três vezes ao dia, que deve ser repetido após 4 a –6
semanas. Para populações de risco, uma dose única de 40 mg/kg é usada como
quimioterapia preventiva. Uma vez que as crianças são o principal alvo do tratamento,
são necessárias pesquisas para aumentar a solubilidade e a biodisponibilidade do PZQ,
a fim de reduzir as altas doses terapêuticas e, portanto, as dimensões dos comprimidos,
que são difíceis de engolir, principalmente para pacientes pediátricos [ 5 ]. Vários estudos
visaram melhorar as propriedades do PZQ, como a preparação de dispersão sólida da
droga com Povidona [6-8] ou com Glicolato de Amido de Sódio [9], sistemas Prazi quantel-
Beta-Ciclodextrinas [10,11], nanopartículas
, lipídicas sólidas [ 12], sistemas coground
[13], grânulos de dispersão rápida [14] e fusão

Abreviaturas: ASU, Unidade Assimétrica; ATR-FTIR, Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier de Reflectância Total Atenuada; CPMAS, rotação de ângulo mágico de polarização cruzada; DFT-D,
Teoria do Funcional de Densidade Corrigida por Dispersão; DSC, Calorimetria Exploratória Diferencial; HPLC-UV, Detecção Ultravioleta por Cromatografia Líquida de Alta Performance; IC50, Metade Máxima
Concentração Inibitória; IDR, Taxa de Dissolução Intrínseca; RMN, Ressonância Magnética Nuclear; PZQ, Praziquantel inicial; SD, Desvio Padrão; RSD, Desvio Padrão Relativo; SEM,
Microscopia Eletrônica de Varredura; SSNMR, Ressonância Magnética Nuclear de Estado Sólido; TGA, Análise Termogravimétrica; XRPD, difração de pó de raios X
ÿ Autor correspondente.

Endereço de e-mail: bperissutti@units.it (B. Perissutti).

https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2018.01.018 Recebido
em 10 de agosto de 2017; Recebido em forma revisada em 21 de dezembro de 2017; Aceito em 29 de janeiro de 2018
Disponível online em 31 de janeiro de
2018 0939-6411/ © 2018 Elsevier BV Todos os direitos reservados.
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D. Zanolla et ai.
granulação combinada com congelamento por spray ultrassônico [15].
Neste estudo, é proposta uma maneira alternativa de melhorar a solubilidade e,
portanto, possivelmente reduzir a dose terapêutica, ou seja, mudar para um polimorfo
cristalino do composto racêmico PZQ.
O polimorfismo, propriedade inerente ao estado sólido, é a capacidade de um composto
existir em mais de uma forma cristalina que possui diferentes arranjos no estado sólido. Os
polimorfos têm distâncias intermoleculares e/ou interatômicas relativas diferentes, ou
células unitárias.
Às vezes, as diferenças estruturais são significativas, resultando em propriedades físicas
(por exemplo, mecânicas, térmicas, etc.) e químicas (por exemplo, reatividade química)
muito diferentes. Em outros casos, as diferenças são muito sutis, tornando difícil distinguir
diferentes formas cristalinas [16-18]. A busca por essas variedades polimórficas tornou-se
recentemente um tema de grande interesse.
Vários autores já atestaram a existência de modificações cristalinas do PZQ. O
composto racémico comercial cristaliza na forma de cristal anidro. Sua estrutura (TELCEU
em CSD) pertence ao grupo espacial triclínico P-1 com quatro moléculas cristalograficamente
independentes na unidade assimétrica com conformação syn (referente aos dois grupos
C=O presentes nas moléculas), onde dois deles estão desordenados [ 19].
Diferentemente do PZQ racêmico, os enantiômeros puros (R) ou (S)-PZQ cristalizam
em hemi-hidratos com interações intermoleculares diferentes das do cristal racêmico
[20,21]. O praziquantel racêmico também é conhecido como um excelente candidato para
formar cocristais com vários ácidos dicarboxílicos alifáticos, como os ácidos oxálico,
malônico, succínico, maleico, fumárico, glutárico, adípico e pimélico [19] .
Recentemente, também foi documentada a formação de um par de cocristais
diastereoisoméricos com ácido L málico na presença de acetona e o subsequente
isolamento do enantiômero R [22].
Em relação às variedades polimórficas anidras de prazi quantel racêmico, trabalhos
anteriores tentaram obter novos polimorfos de PZQ racêmico, por evaporação lenta usando
vários solventes, mas sempre obtiveram a mesma forma cristalina triclínica [23] .
Ao explorar todo o potencial de uma abordagem multitécnica aqui, relatamos uma
investigação detalhada de uma nova forma cristalina anidra polimórfica de PZQ (Forma B)
obtida por um método de moagem puro na ausência de solvente. A identificação do polimorfo
foi realizada por calorimetria exploratória diferencial, termogravimetria, análise SEM, RMN
de estado sólido (SSNMR) combinada com cálculos DFT-D, ATR FTIR. A estrutura cristalina
foi resolvida a partir do padrão de difração de raios X em pó e depositada no Centro de
Dados Cristalográficos de Cambridge com número de deposição: 1.557.658. A nova fase
também foi totalmente caracterizada por suas propriedades biofarmacêuticas (determinando
a solubilidade de saturação e a taxa de dissolução intrínseca) e realizando ensaios anti-
helmínticos in vitro e in vivo.
2. Materiais e métodos
2.1. Materiais
Praziquantel (PZQ) EUR.
Grau Ph. ((11bRS)-2-(Cyclohexylcarbonyl)-1,2,3,6,7,11b-
hexahydro-4-H-pyrazino[2,1-a]isoquinolin-4-one) foi gentilmente doado pela Fatro SpA
(Bolonha, Itália).
PZQ impureza A (2-benzoil-1,2,3,6,7,11b-hexahidro-4-H-pirazino[2,1-a]isoquinolin-4-ona) e
impureza B (2-Ciclohexanocarbonil-2, 3,6,7-tetra-hidro-pirazino[2,1-a]isoquinolin-4-ona)
foram Ph. Eur. grau e adquirido da Endotherm Gmbh (Saarbruecken, Alemanha). HiPersolv
Chromanorm Metanol (Ph. Eur. para HPLC Gradient Grade) e Etanol (Ph. Eur.) foram
adquiridos da VWR Chemicals BHD PROLABO®.
2.1.1. Preparação da Forma B O
praziquantel foi moído sozinho, por moagem pura, em um moinho vibratório Retsch
MM400 (Retsch GmbH) equipado com 2 frascos de óxido de zircônio tipo parafuso, cada
um com capacidade de 35 ml. Um material cerâmico como o óxido de zircônio foi selecionado
devido a sua alta
20
European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 127 (2018) 19–28
densidade (5,9 g/cm3 ), permitindo uma alta entrada de energia. A quantidade de pó a ser
introduzida no frasco de moagem foi determinada em 0,800 g por frasco, e três esferas de
óxido de zircônio de 15 mm (pesando 10,72 g) foram utilizadas como meios de moagem. A
frequência vibracional de 20 Hz foi aplicada por um tempo de 4 horas sem interrupção.
Após o tratamento, o produto sólido foi armazenado a 25 °C em dessecadores sobre
cloreto de cálcio anidro.
2.2. Métodos
Em todas as avaliações, a amostra de solo foi analisada em comparação com
composto racémico de partida PZQ.
2.2.1. Determinação do conteúdo da droga
Para a quantificação do PZQ foi utilizado o método HPLC-UV de fase reversa, utilizando
um método adaptado da literatura [24] e validado por meio de uma pequena modificação
no comprimento da coluna. O sistema HPLC utilizado consistia em duas bombas de
distribuição de fase móvel (LC-10 ADVP, Shimadzu, Japão), um detector UV-Vis (SPD-10Avp,
Shimadzu, Japão), um amostrador automático (SIL-20A, Shimadzu, Japão), um interface
(SCL-10Avp, Simadzu, Japão) para aquisição de dados através de um software Ez-Star e
uma coluna Kinetex 5 µm C18 100 Å (150 × 4,60 mm, Phenomenex, Bolonha, Itália). A fase
móvel era composta por metanol e água (65:35 V/V), a vazão foi de 1 ml/min e as leituras
de absorbância foram realizadas em comprimento de onda fixo de 220 nm. O tempo de
retenção do PZQ foi de cerca de 5,5 min e o tempo de execução foi de 12 min. A
quantificação foi realizada pela integração das áreas dos picos usando o método de
padronização externa. Nessas condições, a curva de calibração linear do PZQ foi obtida na
faixa de 0,3–10 mg/l (r2 = 0,99996).
Como referência, uma nova solução estoque foi preparada a cada vez antes de iniciar a
análise. A solução padrão de Praziquantel foi preparada pela dissolução de 10 mg de PZQ
em 20 ml de metanol grau HPLC.
A solução foi agitada por vários minutos e então diluída com a fase móvel nas proporções
1:10 e 1:20 para obter uma concentração de fármaco de 2,5 mg/l (ppm). De acordo com a
monografia PZQ na Eur. Ph. (Ed. 8.0), as impurezas especificadas, denominadas impureza
A e impureza B, devem ser detectadas. A curva de calibração linear de cada impureza foi
obtida na faixa de 0,05–1 mg/l (r2 = 0,9993 e 0,9994, para a impureza A e B, respectivamente).
Os tempos de retenção das impurezas foram de 3,45 min e 11,2 min. Ambas as impurezas
estavam ausentes na solução de referência.
O mesmo procedimento foi usado para caracterizar a forma sólida inicial de PZQ e a amostra
moída Forma B.
A determinação do teor de PZQ nas amostras moídas foi determinada pela dissolução
de cerca de 10 mg, pesados exatamente, de amostra em 20 ml de metanol grau HPLC. A
solução obtida foi então diluída 1:200 com a fase móvel, correspondendo a cerca de 2,5 mg/
l de PZQ, de forma a garantir a linearidade da resposta analítica. Na solução de amostra, o
tempo de retenção do PZQ foi de cerca de 5,4 a 5,5 min. Cada solução de amostra foi
analisada em triplicado e a média da soma das respostas de pico de Praziquantel foi então
calculada. Os resultados foram expressos como a porcentagem de recuperação de PZQ em
relação à soma de todos os picos presentes no cromatograma (PZQ e eventuais impurezas
relacionadas e/ou outros produtos relacionados detectáveis).
2.2.2. Análises polarimétricas As
rotações ópticas das amostras foram medidas em um polarímetro Jasco P-2000 (Lecco,
Itália), com um ÿ = 589 nm e uma concentração de 1 g/100 ml em etanol, de acordo com o
método relatado na literatura [25 , 26]. O etanol foi preferido ao invés do CHCl3, a fim de
evitar a formação de bolhas de ar na célula.
2.2.3. Difração de pó de raios X (XRPD)
O material inicial PZQ foi testado em um difratômetro convencional equipado com um
detector RTMS X'celerator, usando uma radiação Cu Kÿ filtrada por Ni (comprimento de
onda 1,5418 Å). Uma pequena quantidade de pó (15-25 mg) foi pressionada suavemente
em uma lâmina de vidro para obter uma superfície plana. O
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D. Zanolla et ai.
os dados foram coletados na faixa 2ÿ de 3 a 40° à temperatura ambiente.
2.2.4. Difração de pó de raios-X síncrotron Um
padrão de difração com resolução melhorada e relação sinal-ruído da Forma B
foi coletado na linha de luz de difração de raios-X (XRD1) do Elettra Synchrotron,
Trieste (Itália) [27] . O padrão de difração de pó foi coletado no modo de transmissão,
à temperatura ambiente (25 °C) com comprimento de onda monocromático de 0,700
Å (17,71 KeV) e tamanho de ponto de 200·200 µm2, usando um detector de área de
pixel híbrido Dectris Pilatus 2 M.
O pó da Forma B foi embalado em capilares de borosilicato com um diâmetro de
300 µm (espessura da parede de 10 µm).
O padrão de pó bidimensional foi integrado usando o programa Fit2D [28], após
calibração preliminar da configuração do hardware, usando um capilar preenchido
com pó de referência padrão LaB6 (NIST 660a).
2.2.5. Análises térmicas
As análises de calorimetria de varredura diferencial foram realizadas com um
DSC Mettler-Toledo DSC822e (Greifensee, Suíça) conectado a um calorímetro
celular Mettler DSC20, equipado com o software STARe.
Dois mg de ambas as amostras foram colocados em cadinhos de alumínio perfurados
com capacidade de 25 µL, aquecidos a uma taxa de varredura de 10 °C/min em uma
faixa de temperatura entre 30 e 180 °C, sob uma atmosfera de nitrogênio. A
calibração do instrumento foi realizada com índio, zinco e chumbo para a temperatura,
e com índio para a medição da entalpia.
As análises termogravimétricas foram realizadas em um instrumento Mettler-
Toledo TGA/SDTA851e. Amostras de aproximadamente 10 mg foram colocadas em
panelas de alumínio de 40 ÿL e aquecidas de 30 a 220 °C com taxa de aquecimento
de 10 °C/min, sob atmosfera de nitrogênio. Os diagramas peso-temperatura
resultantes foram analisados usando o software STARe 11.00 para calcular a perda
de peso.
2.2.6. Medições de NMR de estado sólido
As medições de RMN de estado sólido foram realizadas em um instrumento
1 2.2.11. Estudos de dissolução intrínseca
Bruker Avance II 400 operando a 400,23, 100,65 e 40,55 MHz para núcleos H, 13C
e 15N , respectivamente. Rotores cilíndricos de zircônia de 4 mm de diâmetro com
um volume de amostra de 80 ÿL foram empregados e girados a 12 (13C) e 9 (15N)
kHz. Todos os experimentos empregaram a sequência de pulso RAMP-CP
( 1desacoplamento
H pulso de 90° =H3,05
comÿs)
umcom o TPPM
campo 1
de rf de 75 kHz durante o período de aquisição.
124 transientes foram adquiridos com 3,5 ms de tempo de contato e atrasos de
relaxamento de 20 e 30 s para PZQ e Form B, respectivamente. Os deslocamentos
químicos 13C e 15N foram referenciados com a ressonância de hexametilbenzeno
( sinal 13C metil a 17,4 ppm) e (NH4)2SO4 ( sinal 15N a -355,8 ppm em relação a
CH3NO2).
2.2.7. cálculos DFT
Cálculos periódicos de rede foram realizados por meio do CASTEP [29] Academic
Release versão 17.2, que explora uma abordagem de onda plana e pseudopotencial
dentro da teoria do funcional da densidade (DFT) [30].
As blindagens magnéticas foram calculadas usando o algoritmo GIPAW [31] conforme
implementado no código CASTEP. A otimização de geometria e os cálculos de
deslocamento químico de NMR foram realizados empregando a aproximação de
gradiente generalizado (GGA) PBE troca-correlação funcional [32] com o esquema
de dispersão semi-empírica [33] TS [34] e pseudopotenciais ultrasoft que foram
gerados em o voo. A estrutura cristalina do polimorfo determinada a partir dos dados
PXRD foi usada como estrutura inicial para a otimização da geometria. A energia de
corte da onda plana foi igualada a 700 eV. A zona de Brillouin foi amostrada
automaticamente usando uma grade Monkhorst-Pack com um espaçamento de ponto
k de 0,05 Åÿ1 . A otimização da geometria foi realizada com os parâmetros da célula
unitária fixos, pois foram considerados de qualidade aceitável a partir dos dados
experimentais. A estrutura refinada foi usada no cálculo da blindagem magnética
subsequente, usando a mesma energia de corte acima. O 13C e 15N absolutos
teóricos isotrópicos
21
European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 127 (2018) 19–28
os valores de blindagem magnética (ÿiso) foram convertidos nos deslocamentos
químicos isotrópicos correspondentes (ÿiso) em relação à blindagem magnética
absoluta da substância de referência glicina calculada no mesmo nível.
A seguinte conversão foi usada: ÿiso = ÿref ÿ ÿiso, onde ÿref é a blindagem de
referência da glicina, aqui 170,1 ppm para 13C e 192,9 ppm para 15N.
2.2.8. Espectroscopia ATR-FTIR
Os espectros ATR-FTIR de PZQ comercial e Forma B foram realizados no
estado sólido sem qualquer diluição usando um espectrofotômetro Perkin Elmer
Spectrum 100 FT-IR (Beaconsfield, Inglaterra), software PE versão 6.3.4 equipado.
copyright 2008, anexado a um acessório de amostragem Universal ATR. A faixa
analisada variou de 650 cmÿ1 a 4000 cmÿ1
, com número de varredura igual a 4.
2.2.9. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
As amostras foram metalizadas com S150A Sputter Coater (Edwards High
Vacuum, Crawley, West Sussex, Reino Unido) e então observadas sob um
microscópio eletrônico de varredura Leica Stereoscan 430i (Leica Cambridge Ltd.,
Cambridge, Reino Unido).
2.2.10. Determinação da solubilidade do
fármaco As medições de solubilidade tanto do PZQ inicial como da Forma B
foram realizadas adicionando uma quantidade em excesso do fármaco a 10 ml de
água desionizada, respectivamente. As suspensões foram agitadas no escuro, a 20
°C por 48 horas, para garantir que o equilíbrio fosse alcançado, e então filtradas
através de uma membrana (tamanho de poro 0,2 ÿm). Finalmente, 1 ml de cada
solução, previamente diluído 1:200 com a fase móvel, foi analisado por análise de
HPLC, seguindo o método descrito anteriormente. Cada amostra foi analisada em
triplicado e a média foi relatada. Quarenta e oito horas foram suficientes para atingir
o equilíbrio, enquanto um tempo de agitação de 72 horas ou superior em meio aquoso
mostrou uma degradação química pronunciada da droga de acordo com os resultados
previamente publicados por Suleiman e colaboradores [35] .
A taxa de dissolução intrínseca (IDR) do PZQ comercial e da Forma B foi
determinada a partir de comprimidos em pó obtidos com uma prensa hidráulica
(PerkinElmer, Norwalk, EUA). Pastilhas de amostra de 150 mg foram comprimidas
diretamente a uma pressão de 1 tonelada por 60 s em um cilindro de aço inoxidável
que serviu de porta-amostras. Os comprimidos resultaram de um diâmetro de 1 cm e
com uma área de superfície plana de 0,785 cm2 . Os porta-amostras foram colocados
em 1000 ml de água destilada a 37 °C e agitados a uma velocidade de rotação de
100 rpm (a distância entre a pá e a superfície do comprimido era de 3,5 cm). Em
pontos de tempo predeterminados (10–20–30–40–50–60 min), 2 ml de alíquotas
foram retirados e imediatamente substituídos por 2 ml de meio de dissolução. As
amostras obtidas foram então analisadas por HPLC-UV (conforme descrito
anteriormente). Todos os experimentos de dissolução foram conduzidos pelo menos
em triplicado e tanto o SD (%) quanto o RSD (%) foram calculados em cada ponto
de tempo. As inclinações das curvas de dissolução intrínseca (quantidade de droga
dissolvida por unidade de área ao longo do tempo) foram comparadas pela aplicação
de regressão linear.
O comportamento de dissolução das amostras foi comparado por meio do teste
t de Student e as curvas foram consideradas estatisticamente diferentes com valores
de p < 0,05.
2.2.12. Determinação da atividade in vitro e in vivo contra Schistosoma mansoni adulto
Estudos in vitro e in vivo foram realizados de acordo com os regulamentos
nacionais e cantonais suíços sobre bem-estar animal (permissão nº 2070) no Instituto
Suíço de Saúde Tropical e Pública (Basel, Suíça), conforme descrito anteriormente
[36] . Camundongos fêmeas (estirpe NMRI; peso ÿ 20–22 g) foram adquiridos de
Charles River, Alemanha, mantidos em condições ambientalmente controladas
(temperatura ÿ 25 °C; umidade ÿ 70%; 12 horas de luz e 12 horas de ciclo escuro)
com livre acesso a água e dieta para roedores e aclimatados por uma semana antes
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D. Zanolla et ai.
infecção. Cercarias de Schistosoma mansoni foram obtidas de
caramujos hospedeiros intermediários (Biomphalaria glabrata).
Para os estudos in vitro de esquistossomos adultos obtidos por dissecação
de camundongos infectados foram incubados na presença dos compostos de teste em
diferentes concentrações (0,021–0,33 ÿg/ml) por até 72 h.
Os fenótipos foram monitorados em vários momentos com base na motilidade, viabilidade e
alterações morfológicas sob um microscópio inverso (Carl Zeiss, Alemanha, ampliação 80×).
Os valores de viabilidade do parasita de vermes tratados e não tratados obtidos a partir de
avaliação microscópica foram calculados (médias +/- desvio padrão) usando o software
Microsoft Excel. Os valores de IC50 foram calculados usando o software CompuSyn.
Para os estudos in vivo, grupos de 4 camundongos NMRI infectados caracterizados por
uma infecção patente por S. mansoni (49 dias após a infecção) foram tratados oralmente
com as drogas de teste por meio de doses orais únicas (400 mg/kg). Camundongos não
tratados (n = 9) serviram como controles.
Três semanas após o tratamento, os animais foram sacrificados pelo CO2
método e dissecado. Os vermes foram sexados e contados [37].
Cargas de vermes de camundongos tratados foram comparadas com as de controle
animais e as reduções da carga de vermes foram calculadas.
2.2.13. Estabilidade física durante o
armazenamento A fim de verificar possíveis modificações do estado sólido ao longo do
tempo, as análises XRPD de amostras moídas foram repetidas por um período de 12 meses.
Durante o tempo de armazenamento, as amostras sólidas foram armazenadas em
dessecadores sobre cloreto de cálcio anidro à temperatura ambiente.
3 Resultados e discussão
O tratamento mecânico livre de solventes, aqui apresentado, foi utilizado para obtenção
de um novo polimorfo a partir da fase comercial racêmica anidra do Praziquantel. Em
particular, o PZQ foi moído sozinho por moagem pura, nas condições operacionais
mencionadas na seção experimental, selecionadas após testes preliminares. O rendimento
do processo foi quase total, não se notando fenômenos relevantes de adesão ou
mecanicismo. A nova variedade polimórfica (Forma B) foi submetida a extensas
caracterizações, a partir de trometria, análise por HPLC e análise polarimétrica para verificar
1 c = 27,331(1) Å, ÿ = 90°, ÿ = 107,787(5)° e ÿ = 90° com uma densidade calculada de 1,232
possíveis modificações químicas após a moagem. Os espectros H NMR especificação H NMR
registrados (dados não mostrados para brevidade), corresponderam aos dados relatados na
1
literatura [25] e confirmaram a presença de dois rotâmeros de praziquantel, ao testar a falta
de alterações químicas no PZQ após tratamento mecanoquímico. Os resultados de HPLC
mostraram uma quantidade muito pequena de impurezas formadas durante o tratamento
mecânico (0,42%) e uma recuperação final da droga de 99,58% (valores médios, n = 3). No
entanto, a quantidade de impurezas nunca excede os critérios de aceitação USP/EP.
Devido ao fato de que PZQ é um composto racêmico [38-40], as amostras também
foram avaliadas por rotação óptica para quantificar o excesso en antiomérico. Ambas as
amostras têm um [ÿ]ÿ (média ± DP, n = 3) aproximando-se de zero. Em particular, foi
registrado um valor de 0,5 ± 2,9 e 0,1 ± 1,6, para iniciar PZQ e Forma B, respectivamente,
correspondendo a um excesso enantiomérico calculado de 0,4 e 0,1, como esperado para
um composto racêmico. De acordo com os dados da literatura para
Fig. 1. Imagens SEM de PZQ racêmico inicial (Ampliação 500 X (esquerda), 1,00 KX (meio), 5,00 KX (direita).
22
European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 127 (2018) 19–28
composto racêmico convencional [9], as imagens SEM relatadas na Fig. 1 mostram a forma
acicular dos cristais do PZQ inicial, semelhante a madeira de fósforo, com diâmetro de cerca
de 60–100 µm e espessura de 10–15 µm. A análise SEM revelou que a Forma B tem hábito
e tamanho muito diferentes, e o pó parecia ser formado por aglomerados de bigodes longos
e muito finos (Fig. 2).
O padrão de difração de pó de raios-X (Fig. 3) do quantel Prazi inicial registrado à
temperatura ambiente mostra picos de Bragg nítidos, confirmando a notável cristalinidade
da amostra. As posições dos picos estão de acordo com o padrão de difração da forma
racêmica, cuja estrutura foi determinada por Espinosa-Lara e colaboradores [19 ] como
pertencente ao grupo espacial triclínico P-1 com quatro moléculas cristalograficamente
independentes com conformação sin no unidade assimétrica, das quais duas são
desordenadas. Os mesmos autores identificaram 3 motivos homodiméricos nesta estrutura
cristalina, dos quais dois consistem em dois e quatro contatos CÿH···O, respectivamente
(motivos III e IV), enquanto descreveram o restante (motivo VII) como um Cÿ homodimérico
Complexo H···ÿ.
O padrão de difração da variedade polimórfica obtido por moagem pura é apresentado
na Fig. 4. A comparação com o padrão de difração do PZQ bruto (Fig. 3) indica claramente
que as duas fases cristalinas são diferentes.
O padrão de difração da variedade polimórfica obtido por moagem pura é apresentado
na Fig. 4. A comparação com o padrão de difração do PZQ bruto (Fig. 3) indica claramente
que as duas fases cristalinas são diferentes. Devido ao alargamento dos picos da amostra,
a indexação correta do padrão de pó foi muito desafiadora. Várias soluções foram
encontradas usando o programa EXPO2014 [41]. No entanto, uma solução levou a um
modelo significativo e pertence a uma célula unitária monoclínica com um volume de 3369,97
Å3 , muito semelhante ao volume do PZQ bruto. O grupo espacial sugerido é o centrosimétrico
C2/c. Assumindo uma densidade razoável para um cristal molecular totalmente orgânico, o
número de unidades de fórmula por célula unitária pode ser determinado como Z = 8. Um
primeiro ajuste de padrão de pó completo (método de Pawley) no padrão de pó experimental
resultou em um bom Rwp de 1,52% . A célula unitária refinada para a = 21,991(1) Å, b =
5,8884(3) Å, obtida
metros são
g·cmÿ3 . Todo o espectro é bem reproduzido tanto em ângulos baixos quanto altos de 2ÿ,
com exceção de dois picos em 7,01 e 10,2° de 2ÿ, de intensidade modesta, atribuível a uma
fase sólida menor ainda não identificada.
Para resolver a estrutura, uma abordagem de recozimento simulado implementada no
TOPAS V5 [42] foi aplicada com sucesso, a partir de um modelo molecular obtido da
estrutura SIGBUG [43] após a remoção da molécula de água. A solução que melhor
concorda com os dados experimentais é mostrada na Fig. 5. Esta solução carrega uma
molécula na unidade assimétrica (ASU) de acordo com a caracterização SSNMR. O
refinamento de Rietveld da estrutura da Forma B
rendeu um fator R-Bragg de 1,96% (Fig. 4).
O modelo da Forma B proposto mostra violações estéricas limitadas e uma densidade
significativa (o índice de empacotamento calculado com a rotina PLATON VOID [44] é de
66,6% para a Forma B, próximo ao índice de empacotamento de 67% encontrado para a
fase racêmica PZQ inicial).
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Fig. 2. Imagens SEM da variedade polimórfica B (Ampliação 500 X (esquerda), 1,00 KX (meio), 5,00 KX (direita).
Fig. 3. Padrão de difração de raios X em pó de PZQ bruto (registrado usando uma radiação Cu Kÿ filtrada por Ni, comprimento de onda: 1,5418 Å).
Para destacar as diferenças entre os polimorfos, o empacotamento cristalino é mostrado
na Fig. 6.
Os espectros 13C e 15N CPMAS, apresentados nas Figs. 7 e 8, respectivamente
confirmam e destacam a diferença entre as duas fases. De fato, é bem conhecido que
diferentes empacotamentos cristalinos alteram significativamente a posição dos picos nos
espectros SSNMR devido ao novo ambiente químico e magnético experimentado pelos
átomos [45-47].
Todos os deslocamentos químicos com atribuição estão listados na Tabela 1. Para átomo
números nos referimos ao Esquema 1.
O espectro 13C CPMAS do PZQ inicial é caracterizado pela divisão de todos os sinais,
particularmente claro para a ressonância em torno de 164 ppm atribuída ao carbonil C4, dando
origem a vários conjuntos de sinais (com intensidade diferente). Isso indica a presença de
quatro moléculas cristalograficamente independentes na célula unitária de acordo com a
estrutura de raios-X. O espectro 13C CPMAS da Forma B é completamente diferente do
cristal inicial PZQ indicando a formação de uma nova fase. Com efeito, o espectro é
caracterizado por um único conjunto de ressonâncias de acordo com uma molécula
independente na célula unitária (ver acima) em vez de quatro. Os picos são muito nítidos
(FWHM ~ 100 Hz), indicando a formação de um composto altamente cristalino, todo deslocado
de cerca de 0,2–3 ppm em comparação com o PZQ original. As mesmas conclusões podem
ser tiradas dos espectros 15N CPMAS (Fig. 8), onde sinais mais nítidos e ligeiramente
deslocados são observados para a Forma B em relação ao PZQ. Nenhum pico devido ao PZQ
bruto é observado nos espectros 13C e 15N CPMAS da Forma B, indicando a conversão
quantitativa durante o processo mecanoquímico.
O modelo estrutural obtido a partir de dados de pó de raios X síncrotron
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foi otimizado ainda mais por cálculos DFT-D de estado sólido usando a rede fixa com
parâmetros de célula unitária do refinamento de Rietveld e com posições atômicas totalmente
relaxadas. A otimização confirmou o grupo espacial centrosimétrico C2/c, e o modelo
otimizado foi muito próximo daquele obtido pelo refinamento de Rietveld (Fig. S2 em
Informações Suplementares). Para verificar a confiabilidade da otimização, os deslocamentos
químicos foram computados pelo método GIPAW e comparados com os experimentais
(Tabela 1). Os valores de deslocamento químico isotrópico de 13C experimentais e calculados
mostram uma excelente concordância. A Raiz do Desvio Quadrado Médio (RMSD) é de 2,4
ppm. Com base na literatura e em nossa própria experiência [48,49], um valor de RMSD de
cerca de 2,2 ± 0,5 ppm é esperado para um modelo correto.
No espectro ATR-FTIR do PZQ inicial (Fig. 9, inferior), de acordo com dados da literatura
[9,15,21,40,50], foram detectados os seguintes picos principais: na faixa de 3000–2900 cmÿ1
( vibrações de estiramento de –CH2 e –CH), 1650–1720-cmÿ1 (alongamento de grupos
carbonila e dobramento de ligações CH dos anéis aromáticos), em 1500–1400 cmÿ1 (vibrações
de estiramento de C aromático e dobramento vibrações de – CH2), e em torno de 760 cmÿ1
(vibração de flexão de aromático-CH). Nos espectros da Forma B (Fig. 9, topo) existem
diferenças significativas em termos de posição e transmitância. Vale a pena notar a modificação
no dupleto em 1700–1600 cmÿ1 que é bem resolvida no início do PZQ, enquanto os dois picos
quase se sobrepõem na variedade polimórfica B. Em particular, como visível no quadro, o
início do PZQ mostra dois sinais em 1647 e 1624 cmÿ1 atribuíveis, de acordo com Borrego-
Sanchez et al. [50], ao modo de estiramento simétrico do carbonil heterocíclico e ao do grupo
carbonil ligado ao ciclohexil,
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Fig. 4. Ajuste do perfil de refinamento de Rietveld (obtido após o recozimento simulado calculado com TOPAS V5) do PZQ Forma B: em preto o padrão experimental (registrado usando radiação síncrotron, comprimento de onda: 0,700 Å),
em vermelho o calculado. Os residuais são exibidos na parte inferior em azul e os tiques de reflexão em verde. Para interpretação das referências a cores nesta legenda de figura, o leitor deve consultar a versão web deste artigo.

Esses resultados também foram confirmados pela comparação dos espectros FTIR de
ambas as amostras adquiridas com alta resolução (relatado para brevidade em informações
suplementares, Fig. S3).
O comportamento térmico da amostra de solo foi analisado por DSC e TGA. Nas análises
de TGA (dados não mostrados), a natureza anidra da Forma B e PZQ foi avaliada. As curvas
DSC registradas em atmosfera de nitrogênio (Fig. 10) revelaram que a amostra moída é
caracterizada por um pico endotérmico em 112,10 °C, atribuído ao seu evento de fusão, com
uma entalpia de fusão de 56,57 J/g. Também não foi observado nenhum evento de desidratação,
confirmando sua natureza anidra.

Quando comparada com o PZQ inicial, com ponto de fusão de 142,56 °C, de acordo com os
dados relatados [39], a amostra moída apresenta um decréscimo de cerca de 30 °C. Deve-se
notar que, à luz dos dados de caracterização anteriores, esta fusão a baixa temperatura não
pode ser associada à fusão de cristais muito pequenos da fase nativa [51 ], via efeito Gibbs-
Thompson. Assim, a diferença de ponto de fusão reforça, entre outros resultados de

Fig. 5. Representação do bastão com tampa da estrutura proposta para a Forma B. A célula unitária monoclínica caracterização, as diferenças na natureza dos cristais e, conseqüentemente, na energia de
encontrada hospeda 8 moléculas, uma cristalograficamente independente, assumindo um C2/c rede dessas fases.
grupo espacial.

respectivamente. Para avaliar a adequação dessa variedade polimórfica para o propósito da pesquisa, que é
Além disso, um ombro típico aparece na inclinação de alta frequência da banda experimental melhorar a solubilidade do PZQ e, portanto, possivelmente reduzir a dose terapêutica, foram

(variando cerca de 1668 cm-1 ), conforme indicado por uma seta na Fig. 9. determinadas a solubilidade em água e a taxa de dissolução intrínseca.

Na variedade polimórfica B, de acordo com Borrego-Sanchez et al. [21] a diferença de A nova fase, conforme relatado na Tabela 2, tem o dobro de solubilidade em água em
frequência em ÿ(CO) entre os dois grupos carbonila é menor, devido à presença dos confôrmeros comparação com o PZQ (tempo de equilíbrio = 48 h). Esses dados reforçam a ideia de que a

anti (como visível na Fig. 5) ao invés de syn (ao contrário do PZQ original). Portanto, as diferentes nova fase cristalina possui uma energia livre diferente do PZQ original.
posições detectadas nos espectros ATR-FTIR dos dois sinais, conforme sinalizados para o
alongamento dos grupos CO, são uma confirmação adicional de um empacotamento cristalino Para verificar os desempenhos biofarmacêuticos e excluir os efeitos das variáveis

diferente. experimentais (como tamanho de partícula, padrão de agitação, etc.), a taxa de dissolução
intrínseca (IDR) do PZQ original e da Forma B foi

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Fig. 6. Empacotamento cristalino de PZQ (esquerda) e Forma B (direita) visto ao longo do eixo b. A visão completa da embalagem é relatada em Informações Suplementares (Fig. S1).

tabela 1

Deslocamentos químicos 13C e 15N experimentais e calculados (ppm) com atribuições para PZQ
e Forma B.

Átomo Grupo PZQ Formulário B Formulário B

exp exp calcular

13C
7ÿ C=O 175,4, 176,2 sh 173,6 172,6
4 C=O 165,8, 164,6, 162,1 137,7, 164,3 163,3
7a Cq 136,5 135,8, 134,6 135,7
11a Cq 134,6 129,7, 134,6 136,4
8 CH 127,5, 124,8 133,7, 132,0, 129,8 130,5
11 CH 130,5 127,5 128.2
Fig. 7. Espectros CPMAS 13C (100,65 MHz) com atribuições de grupo principal de PZQ (a)
10 CH 126,9 127,0
e Forma B (b) gravada em 12 kHz.
9 CH 125,8 126.1
11b CH 56.3, 55.5 55,5 54,6
3 CH2 46.1 49,8 47,8
1 CH2 47,9 45,0 41.6
1' CH 39,7 41.2 38,5
6 CH2 38,1 38.3 35.1
6ÿ CH2 32,0, 30,1, 27,9, 26,3, 25,3 29.4 26.1
2ÿ CH2 29.4 26.4
7 CH2 28.4 25,0
4ÿ CH2 26,7 24,0
3' CH2 26.1 22.4
5' CH2 25,0 21.6
15N
5 N 97.2 98,2 101,8
2 N 82,4 83.3 86,7

Fig. 8. Espectros CPMAS de 15N (40,55 MHz) com atribuições de PZQ (a) e Forma B (b) registrados em 9 kHz.

determinado. Este é um método cinético padronizado definido como a taxa de

dissolução de substâncias puras, após a compactação, em condições de superfície
constantes.
Conforme mostrado na Tabela 2 e na Fig. 11, a taxa de dissolução intrínseca
(IDR) da variedade polimórfica, maior de um fator de 2 do que o PZQ resultou
significativamente diferente do PZQ puro (teste t de Student: p < 0,0004).

Foi determinada a atividade antiesquistossômica in vitro do PZQ comercial e

variedade polimórfica contra S. mansoni adulto. Os valores de IC50 da Forma B
demonstraram que era altamente ativo contra S. man soni (IC50 = 0,135 µg/ml em
comparação com 0,165 µg/ml do PZQ inicial), provando que a atividade in vitro
permaneceu inalterada após trituração pura.
Em um estudo piloto, a variedade polimórfica foi então administrada por via oral
Esquema 1. Estrutura química do PZQ com numeração de átomos.
a um grupo de 4 camundongos infectados caracterizados por uma infecção patente
por S. mansoni, em dose única de 400 mg/kg. Quarenta e nove dias após a infecção,
uma redução da carga de vermes de 100% foi obtida em camundongos tratados com o

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Fig. 9. Espectros ATR-FTIR do PZQ inicial (parte inferior) em comparação com a Forma B (parte superior); uma imagem ampliada da faixa do espectro de 1700–1600 cmÿ1 está disponível no quadro.

4. Conclusões

Uma nova variedade polimórfica de Praziquantel racêmico é aqui apresentada. A

forma polimórfica B foi obtida a partir do composto racêmico original através de um
processo simples sem solvente: uma moagem pura em moinho vibratório. O novo
polimorfo foi totalmente caracterizado e a estrutura cristalina, correspondente a uma
célula C2/c monoclínica, foi resolvida a partir do padrão de difração de raios-X do pó. A
estrutura foi confirmada por cálculos DFT periódicos. Excelente concordância é observada
entre os dados 13C experimentais e calculados em espectros de NMR de estado sólido.

Curiosamente, a nova fase exibiu propriedades biofarmacêuticas favoráveis: alta

bioatividade in vitro e in vivo contra S. mansoni e estabilidade física prolongada. Mais
estudos da eficácia in vivo desta fase são necessários para determinar sua dose
terapêutica mínima.
No entanto, a partir das evidências experimentais relatadas acima, a nova variedade
polimórfica é um produto muito promissor para o tratamento da esquistossomose e para
o desenvolvimento de uma nova formulação de praziquantel para o tratamento de
crianças.

Fig. 10. Traços DSC de PZQ original e variedade polimórfica B.

Reconhecimentos

Tabela 2
Os autores agradecem a Dra. Teresa Gianferrara, Dr. Samuel Golob por sua ajuda
Solubilidade (Cs) e taxa de dissolução intrínseca em água (média ± DP, n = 3).
na análise de dados e pelas discussões construtivas. A MRC está em dívida com a Jeol

Amostra Cs a 20 °C mg/l IDR a 37 °C µg*cmÿ2 minÿ1 Company pela assistência técnica e cooperação úteis. PCV agradece a Dra. Giulia
Mollica pela discussão útil.
PZQ 140,30 ± 9,26 31,2 ± 0,6
Formulário B 281,31 ± 8,32 62,2 ± 1,3

Conflito de interesses

variedade polimórfica B, em comparação com cerca de 98% do PZQ inicial.

Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Finalmente, o estudo de estabilidade revelou que a fase polimórfica B era fisicamente
estável em condições secas à temperatura ambiente por pelo menos 12 meses, conforme
indicado pelo difratograma XRPD idêntico ao da amostra fresca (conforme relatado na Fontes de Financiamento

Fig. S4).
Este trabalho foi financiado pela University of Trieste – University Funding for
Scientific Research Projects – FRA 2015. Este trabalho teve acesso aos recursos HPC
da Aix-Marseille Université

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Fig. 11. Solubilidade e dissolução intrínseca de PZQ e Forma B.

financiado pelo projeto Equip@Meso (ANR-10-EQPX-29-01) do programa praziquantel por complexação com ÿ-, ÿ- e ÿ-ciclodextrinas, Int. J. Pharm. 179 (1999) 65-71.

«Investissements d'Avenir» supervisionado pela Agence Nationale de la

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