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Polímeros de Carboidratos

Página inicial do jornal:www.elsevier.com/locate/carbpol

Nanopartículas de quitosana sensíveis ao pH carregadas com dolutegravir como leite e

mistura alimentar para terapia anti-HIV pediátrica

K. Priya Dharshiniuma,1, Hao Fangb,c,1, Ramya Devi D.uma, Jin Xuan Yangb,c, Rong-Hua Luob, Yong
Tang Zhengb,*, Marek Brzezińskid, Vedha Hari BNuma,*
uma Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, ASK-II, Laboratório nº: 214, SASTRA Deemed-to-be-University, Thanjavur 613401, Tamil Nadu, Índia
bLaboratório-chave de Peptídeos Bioativos da Província de Yunnan/Laboratório-chave de Modelos Animais e Mecanismos de Doenças Humanas da Academia Chinesa de Ciências, Instituto
de Zoologia de Kunming, Academia Chinesa de Ciências, Kunming 650223, China
cFaculdade de Medicina Tradicional Chinesa, Universidade de Medicina Chinesa de Yunnan, Kunming 650500, China
d Centro de Estudos Moleculares e Macromoleculares emŁódź, Academia Polonesa de Ciências, Sienkiewicza 112, 90-363 Lodz, Polônia

INFORMAÇÕES DO ARTIGO ABSTRATO

Palavras-chave: O presente estudo tem como objetivo desenvolver nanopartículas poliméricas à base de quitosana do medicamento anti-HIV
Biopolímero Dolutegravir, para auxiliar no ajuste adequado da dose e facilidade de administração oral como leite e mistura alimentar para crianças. A
Quitosana
quitosana isolada das espécies de casca de caranguejoPortunus Sanguinolentofoi caracterizada por suas propriedades físico-químicas. As
Dolutegravir
nanopartículas foram desenvolvidas com proporção variável de droga: quitosana e avaliadas quanto ao tamanho de partícula (140-548
Secagem por pulverização
nm), potencial zeta (+26,1 mV) com um teor máximo de 75% de droga. As nanopartículas exibiram estabilidade e liberação do fármaco
Portunus sanguinolento
Nano-partícula
melhoradas no meio HCl 0,1 N em comparação com o fármaco puro. O ensaio MTT e o ensaio de inibição de Syncytia em C8166 (linhagem
de células linfáticas T) infectados com HIVIIIBcepa viral, que apresentou melhor eficiência terapêutica e menor citotoxicidade em relação
ao fármaco puro. Em consonância com os dados obtidos, o uso de quitosana de uma nova fonte para o transportador de entrega de
medicamentos abriu perspectivas excepcionais para a entrega de medicamentos eficientemente à pediatria

1. Introdução
As infecções por HIV que provocam uma grave queixa imunológica chamada
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida têm se destacado como um dos graves e
estimulantes problemas de saúde pública global.Chopra, Ni e Lim, 2019). De
acordo com estatísticas da OMS em 2017, cerca de 37,9 milhões de pessoas
vivendo com HIV, incluindo uma população pediátrica de 2,8 milhões (idade
inferior a<15 anos) no mundo (Mahy et al., 2017). O remédio médico existente,
conhecido como Tratamento Antirretroviral Altamente Ativo (HAART), reflete-se
como uma das melhorias substanciais no campo da terapia do HIV. A HAART é um
requisito vitalício e qualquer abandono leva a um aumento mais rápido da carga
viral (Sengupta & Siliciano, 2018). Os principais aspectos de alerta que governam a
responsabilidade pediátrica em relação à terapia HAART são as barreiras do
cuidador (esquecimento de administrar o medicamento) e as características do
medicamento (sabor amargo dos medicamentos, carga dos comprimidos e
duração do tratamento) (Menditto et al., 2020). O desenvolvimento da forma de
dosagem é uma questão crítica a ser abordada pelos pesquisadores para
melhorar a adesão dos pediatras ao tratamento anti-HIV.
Além disso, poucos medicamentos antirretrovirais estão sendo prejudicados com
preocupações de biodisponibilidade devido ao amplo metabolismo de primeira
passagem e deterioração gastrointestinal.Liu, Zheng, Zhang e Long, 2016). Esforços
modernos para derrubar esses distritos incluem a investigação de diferentes esquemas
de dosagem e, além disso, desenvolver novos sistemas de entrega de medicamentos que
possam aumentar a eficácia dos medicamentos antirretrovirais predominantes e novos.
Kirtane et al., 2018).
O dolutegravir (DTG), um inibidor da integrase, está disponível na forma de
comprimidos orais com a marca TIVICAY em doses fixas de 25 mg e 50 mg. O
dolutegravir é comumente administrado uma vez ao dia devido ao seu maior
período de meia-vida (14 h). Em 12 de junho de 2020, a Food and Drug
Administration dos EUA aprovou o Tivicay (comprimidos de dolutegravir) e o
Tivicay PD (comprimidos de dolutegravir para suspensão) para tratar a infecção
pelo HIV-1 em pacientes pediátricos com pelo menos quatro semanas de idade e
pesando pelo menos 3 kg (6,61 libras), em combinação com outros tratamentos
anti-retrovirais (FDA, 2020). O tratamento da AIDS por meio da forma convencional
de DTG apresenta algumas desvantagens para as crianças, devido à dificuldade de
deglutição e variação na dose pediátrica de 5 a 10 mg/dia para uma criança

* Autores correspondentes.
Endereço de e-mail:zhengyt@mail.kiz.ac.cn (Y.-T. Zheng),vedhahari@scbt.sastra.edu (BN Vedha Hari).
1# contribuição igual

https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2020.117440
Recebido em 31 de julho de 2020; Recebido em formulário revisado em 28 de setembro de 2020; Aceito em 19 de novembro de 2020
Disponível online em 23 de novembro de 2020 0144-8617/©
2020 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.

Por favor, cite este artigo como: K. Priya Dharshini,Polímeros de Carboidratos, https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2020.117440
K. Priya Dharshini et ai.
com peso inferior a 40 kg (Ruel et al., 2017). Um dos meios apropriados para
superar essas limitações poderia ser o processamento do fármaco puro com
carreadores poliméricos biodegradáveis para desenvolver o sistema de liberação
de partículas, que pode ser misturado com leite/mingau para administração
conveniente como mistura alimentar para crianças.Kersten, Barry e Klein, 2016). O
tamanho desses sistemas transportadores de polímeros na faixa nanométrica
permite permeabilidade efetiva através de membranas biológicas,
compatibilidade de tecidos aprimorada e absorção celular aprimorada.Mandal,
Prathipati, Belshan e Destache, 2019), facilitando assim a transferência eficiente
dos agentes terapêuticos para os locais alvona Vivo (Mandal et al., 2018). A
quitosana (Chn) possui as propriedades padrão de um carreador polimérico para
nanopartículas como biodegradabilidade, não toxicidade e biocompatibilidade. Ele
mantém uma carga positiva em sua superfície e possui um efeito de aumento da
absorção e também, o tamanho dos carreadores pode ser otimizado dependendo
da forma de administração desejada.Ahmed e Aljaeid, 2016). Essas características
da quitosana podem ser utilizadas para a preparação de nanopartículas de Chn
carregadas com a droga necessária. Doravante, é hipotetizado que a quitosana
isolada de uma nova fonte poderia ser usada para aplicações de entrega de
drogas. Portanto, o presente trabalho buscou formular nanopartículas de
quitosana contendo o fármaco anti-HIV DTG usando a técnica de spray dryer que
poderia ser administrado juntamente com a ingestão de alimentos pediátricos. As
formulações selecionadas devem ser avaliadas quanto ao rendimento do
processo, potencial zeta, tamanho de partícula, teor de droga, estabilidade
química, transição de estado sólido,em vitroliberação de drogas, estudos
cinéticos,em vitrocitotoxicidade e atividade anti-HIV.
2. Materiais e métodos
2.1. Materiais
O dolutegravir foi adquirido no laboratório do MSN (Hyderabad).
Metanol, di-hidrogenofosfato de potássio, hidróxido de sódio, ácido
clorídrico, N-acetil glucosamina e ácido acético (glacial), enzimas
(pancreatina, pepsina e tripsina) foram adquiridos da Himedia. Todos
os componentes e produtos químicos envolvidos neste experimento
são de grau analítico.
2.1.1. Células e vírus
Células de linfócitos T humanos C8166 foram doadas pelo AIDS Reagent
Project, o UK Medical Research Council (MRC), e foram inicialmente
cultivadas em meio RPMI-1640 com FBS (10%), Estreptomicina (100 μg/mL) e
Penicilina G ( 100 unidades/ml). Estirpe adaptada para laboratório HIV-1IIIB
foi contribuído por AIDS Research and Reference Reagent Program, National
Institutes of Health (NIH), China.
2.1.2. Coleta de casca de caranguejo para isolamento de quitosana
As conchas externas das espécies de caranguejos de três pontos
Portunus Sanguinolentoforam adquiridos nos mercados locais, Thanjavur,
Tamil Nadu e autenticados pelo Dr. Senthilkumar TNFU, Thanjavur.
Inicialmente, as conchas foram completamente aspergidas com água e
posteriormente limpas com água deionizada para remover toda a sujeira
das conchas. As cascas foram secas à luz da manhã por 10 dias e
transformadas em grânulos por moagem no almofariz e pilão estéreis.
2.2. Métodos
2.2.1. Extração de quitosana
A quitosana foi isolada das cascas de caranguejo por um processo de 3 etapas,
como desmineralização, desproteinização e desacetilação. As cascas de
caranguejo secas e granuladas foram expostas ao processo de desmineralização
com HCl 5% - 1:15w/v por cerca de 36 h a 25◦C. A quitina adquirida após o
processo inicial de desmineralização foi exposta à desproteinização e
desacetilação posteriormente para obtenção da quitosana. A desproteinização dos
grânulos foi realizada por tratamento com NaOH (5%, 1:10 w/v) a 90-95◦C por 6
horas. O produto desproteinizado foi limpo e lavado com água até a completa
remoção do NaOH e seco por 15 h em
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câmara quente na temperatura de 55-60◦C. Na etapa final do processo
de extração, os grânulos desproteinizados foram expostos à reação de
desacetilação por tratamento com NaOH (80%-1:20p/v) a 90-95◦C por
cerca de 5 horas. O produto final quitosana (quitina desacetilada) foi
cuidadosamente lavado com água da torneira e seco durante a noite na
câmara quente a 55-60◦C (Kumari, Annamareddy, Abanti e Rath, 2017).
2.2.2. Caracterização da quitosana extraída por análise MALDI-TOF A análise
MALDI-TOF é geralmente usada para determinar a distribuição da massa
molar do monômero/oligômero na cadeia principal do polímero. A análise
MALDI-TOF foi realizada em um espectrômetro Axima-Performance MALDI-
TOF (Shimadzu Biotech), armado com Laser de Nitrogênio com comprimento
de onda ajustado em 337×10−9m. A fonte de íons de abstração pulsada
aumentou os íons para a energia cinética de 20 keV. Os dados foram
adquiridos no modo linear positivo, relacionando o acréscimo de 400
varreduras/espectro. A análise de calibração do modelo linear foi realizada
empregando polietilenoglicol (PEG) na faixa de massa de 8000 Da como
máximo. A precisão da padronização foi de aproximadamente 15 Da. A
calibração da massa molar foi conduzida dependendo das massas médias.
Associado às massas monoisotópicas e dependente da precisão da
calibração, pode ser percebida variância de massa de 1–2 Da. A amostra de
quitosana foi dissolvida em H2O/TFA (ácido trifluoroacético) a uma
concentração de cerca de 5 mg/mL. A solução de matriz foi preparada
usando Ditranol (1, 8-di-hidroxi-9, 10-di-hidroantraceno-9-ona-10 mg/mL)
dissolvido em THF (Tetra-hidrofurano) na concentração de 10 mg/mL. A
amostra de quitosana dissolvida e a matriz foram então misturadas na
proporção de 2:1 (v/v). A solução resultante (cerca de 1 μL) foi pontilhada em
uma placa de experimento MALDI-TOF de 384 poços, seguida pela
vaporização do solvente à temperatura ambiente sem qualquer auxílio, e 1
μL de solução salina (KCl em água - 0,05 mol/L ) foi pontilhado na placa. O
alvo MALDI-TOF foi então investigado para produzir os espectros (
Menchicchi et al., 2014).
2.2.3. Grau de desacetilação determinado usando o método
espectrofotométrico UV
N-acetil glucosamina foi dissolvida em solução de HCl 0,001 M para
obter a solução padrão de 100 μg/mL. Além disso, uma série de
soluções de trabalho de 10, 20, 30, 40, 50 μg/mL foi preparada diluindo
a solução padrão e a absorbância de UV (UV1800, Shimadzu) das
amostras foi medida @ λmáximode 199 nm, usando solução de HCl como
branco. A quitosana extraída (20-30 mg) foi dissolvida em 100 mL de
solução de HCl 0,001 M. A concentração do grupo acetil na quitosana
extraída pode ser calculada a partir da curva de calibração padrão e o
grau de desacetilação (DDA) foi calculado usando a Eq.(1)(Yan, Wan e
Chai, 2019;Yuan, Chesnutt, Haggard e Bumgardner, 2011;Sweidan et
al., 2016).
DDA = 100% - [A/B] (1)
* A-acetil concentração de quitosana
* B - concentração da quitosana
2.2.4. Estado sólido13C CP/MAS NMR
As investigações estruturais da nova fonte de quitosana foram executadas por
Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13 de Fiação de Ângulo Mágico de
Polarização de Estado Sólido (CP/MAS -RMN) usando o espectrômetro Bruker-
Avance AV 400 (Bruker, Suíça) armado com uma sonda MAS de Banda larga de
ressonância dupla de 4 mm. Cerca de 500 mg de quitosana foram posicionados no
spinner e introduzidos no centro do campo mágico. Os espectros de RMN
juntamente com CP e MAS foram documentados na frequência de 8 kHz a 295 K.
Um total de mais de 1000 varreduras foram acumulados para um único espectro
em um intervalo de reciclagem de 2 s. O grau de acetilação (DA) da quitosana foi
avaliado a partir do valor de pico integral do CH3carbono dividido pelo valor de
pico integral abstrato do átomo C do anel glucopiranosil (átomos C1–C6) (Eq. 2). A
DDA foi calculada usando o
K. Priya Dharshini et ai. Polímeros de Carboidratos xxx (xxxx) xxx

Eq.(3)(Song, Yu, Zhang, Yang e Zhang, 2013). 2.2.9. FESEM: análise de microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo de
nanopartículas
Eu (CH3)
Grau de Acetilação (%) = (IC1+IC2+IC3+IC4+IC5+IC6)
∗100 (2) As nanopartículas de Chn sintetizadas e a droga pura DTG foram
6 analisadas através de Microscópio Eletrônico de Varredura com um feixe de
* I- Área integral sob o pico elétrons focalizado para comparar a textura das nanopartículas formadas e
DTG puro. Uma pequena quantidade de amostra foi retirada para análise
Grau de Desacetilação (%) = 100-[DA%] (3) microscópica com ampliação variando de 3.000X a 100.000× .A amostra
posicionada no stub foi revestida por sputter através do filme fino de ouro
empregando o auto sputter fine coater (JFC 1600, JEOL, Japão) antes da
imagem. A amostra revestida por pulverização catódica foi introduzida na
2.2.5. Análise IR comparativa de quitosana extraída e quitosana
câmara de amostra e a imagem foi realizada em uma energia elétrica
comercial
acelerada de 3 kV (Hari, Narayanan e Dhevedaran, 2015).
A quitosana extraída da nova fonte foi analisada por espectroscopia de
infravermelho usando o modo Atenuated Total Reflectance (ATR) para
2.2.10. Índice de inchaço das nanopartículas de quitosana
estudar sua similaridade estrutural em comparação com amostras de
O estudo do inchamento das nanopartículas de Chn foi realizado utilizando o
quitosana comercialmente disponíveis (Quitosana com 75% DDA (número de
procedimento descrito por Wani et al., com as modificações necessárias. O
catálogo: C3646) e o baixo peso molecular (LMW ) quitosano (número de
experimento foi realizado nas nanopartículas de quitosana secas por pulverização
catálogo: 448869) adquirido de Sigma Aldrich). A análise foi realizada com
que foram pesadas (1g) inicialmente (Wb) e imerso em água destilada à
um espectrômetro Nicolet 6700 equipado com um detector de sulfato de
temperatura ambiente (25◦C) por 24 horas. A mistura foi então centrifugada a 130
triglicina deuterado (DGTS). O ATR foi utilizado para registrar os espectros
xg de velocidade e o sobrenadante foi descartado. O peso inchado (Ws) foi obtido
incluindo 64 varreduras a 2 cm−1resolução.
pela pesagem do pellet. O índice de inchaço (SI) foi então calculado usando a
seguinte fórmula (Wani et al., 2020):
2.2.6. Comportamento térmico da quitosana extraída
O comportamento térmico da quitosana extraída de uma nova fonte de casca Ws - Wb
Índice de inchaço (%) = ∗100
de caranguejo foi medido empregando termogravimetria e calorimetria de Wb
varredura diferencial (Q100, instrumento TA) para descobrir a perda de massa na
* Wb- Peso inicial
forma de calor. Aproximadamente 20 a 30 mg da nova amostra de quitosana
* Ws- Peso inchado
foram colocados em panelas de alumínio e prensados usando uma prensa
hidráulica. Em seguida, as panelas contendo a amostra foram posicionadas no
2.2.11. Solubilidade das nanopartículas de quitosana
porta-amostras e o fluxo de calor foi aplicado a partir de 80◦C até 600◦C usando
Para confirmar os dados de solubilidade e analisar o aumento
paládio como padrão em uma atmosfera de nitrogênio (Gohel, Sanphui, Singh,
percentual na solubilidade do DTG após a secagem por pulverização
Bhat e Prakash, 2019).
com quitosana, o teste de solubilidade foi realizado pelo procedimento
descrito por Kin et al., A formulação livre de DTG e DC1 foi pesada (10
2.2.7. Preparação de nanopartículas de quitosana por spray dryer As
mg) e imersos em 5 mL dos seguintes meios (água destilada, 0,1 N HCl
nanopartículas de quitosana-DTG foram preparadas usando o Spray dryer
(com e sem pepsina), pH-6,8 tampão fosfato (PB) (com e sem
(Versão 1.0, Spraymate, Mumbai), que funciona na teoria da pulverização de bicos
pancreatina e tripsina). A mistura foi centrifugada e o sobrenadante foi
de fluxo paralelo (as partículas secas por pulverização e o ar de secagem derivam
medido para o absorbância usando um espectrofotômetro UV-vis (UV
na mesma trilha). Os parâmetros modificáveis compreendem a temperatura de
1800, Shimadzu) (Kim et al., 2006).
saída e entrada, vácuo do aspirador e a vazão da bomba de solução. No presente
experimento, as temperaturas de entrada e saída do ar foram mantidas em 140◦C
2.2.12. FTIR: análise por espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier de
e 55◦C respectivamente, com a vazão da bomba em 11 rpm e o aspirador
nanopartículas
ajustado em 1400 rpm (Pandey et al., 2019). Para avaliar o efeito da quitosana na
As nanopartículas preparadas foram submetidas à análise FTIR para estudar a
liberação e solubilidade do fármaco, o fármaco e o polímero foram combinados
estabilidade química do fármaco na presença do polímero de quitosana após o
em 3 proporções (Fármaco: Polímero - 1:1, 1:2, 1:3). A solução de quitosana foi
processo de spray dryer. A análise foi realizada através da técnica de pellets de
preparada como 0,5%, 1% e 1,5% (p/v) em 1% (v/v) de ácido acético glacial, e a
KBr, na qual cerca de 5 mg de DTG puro e as nanopartículas de Chn carregadas
droga foi dissolvida em metanol na concentração de 0,25% (p/v) e as soluções
com o fármaco foram misturadas individualmente com o KBr saturado
foram misturadas antes da secagem por pulverização. A solução fármaco:
anteriormente seco. Em seguida, os pellets foram moldados usando uma unidade
polímero foi então impelida para a unidade de alimentação do spray-dryer e o pó
de pressão hidráulica a 53,62 kp N cm−2. Os pellets obtidos foram deslocados para
resultante foi transportado através do extrator de ciclone e coletado em uma
o stub de varredura e digitalizados no número de onda variando de 4000 cm-1a
ampola. As nanopartículas de Chn carregadas com DTG foram obtidas na forma
500 centímetros-1(Maltesen et al., 2011).
de pó na cor branca pálida. A amostra foi armazenada em dessecador até
posterior caracterização (Ghanbarzadeh, Valizadeh, Yaqoubi, Asdagh e
2.2.13. XRD: análise de difração de raios X de nanopartículas
Hamishehkar, 2018).
Qualquer alteração nas propriedades cristalinas do fármaco em adição
ao polímero de quitosana após o processo de spray-drying foi analisada por
análise de difração de raios-X. As nanopartículas de Chn secas por spray e o
2.2.8. Distribuição do tamanho de partículas e exame do potencial Zeta da
fármaco puro foram colocados no suporte e expostos aos raios X usando
nanoformulação de quitosana
CuKα (Rigaku, Japão), com corrente (30 mA) e voltagem (40 kV). As amostras
As análises de tamanho de partícula e potencial zeta foram realizadas usando
foram escaneadas em uma faixa de 10◦–80◦em 2θ (Dapiaggi, Artioli e
o espalhamento dinâmico de luz e o princípio de condutividade de carga,
Petras, 2002).
respectivamente. Cerca de 10 mg das nanopartículas de quitosana foram
misturadas com 1 mL de água destilada e sonicadas por cerca de 10 min para a
2.2.14. TG-DSC: análise calorimétrica de varredura termogravimétrica
dispersão completa. A dispersão foi colocada em uma cubeta de duas vias e a
diferencial de nanopartículas
amostra foi analisada usando zeta-sizer (Malvern nano series ZS, UK) (Suganthi e
O comportamento térmico das nanopartículas de DTG pura, Quitosana e
Rajan, 2012).
de Chn carregadas com droga foi medido empregando termogravimetria e
calorimetria de varredura diferencial (Q100, instrumento TA).
Aproximadamente, 16-20 mg das nanopartículas e do fármaco puro foram

3
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colocados individualmente em panelas de alumínio, que foi posicionado no [

(〉50% CV) -50
porta-amostras e fluxo de calor aplicado a 80◦C min-1 até 900◦C, CC50= 10 Exp registro[C](〉50% de viabilidade celular) + ]
(〉50%cv) − (〈cv)
mantendo o composto de paládio como padrão em uma atmosfera de
nitrogênio (Gohel et al., 2019). × log(DF)

2.2.15. Estudos de liberação de drogas in vitro das nanopartículas de (5)

quitosana-dolutegravir
* C- Valor de concentração
Para confirmar a quantidade de fármaco presente na formulação seca por
* CV- Viabilidade Celular
pulverização, foi realizada a análise do conteúdo do fármaco. Uma solução
* DF- Fatores de diluição
estoque das nanopartículas foi preparada com concentração de 5 μg/mL e
submetida a análise UV (UV1800, Shimadzu) a 259,8 nm (Balasaheb et al., 2015). o
2.2.18. Atividade anti-HIV
em vitroO estudo de liberação de drogas das nanopartículas de Chn carregadas
A eficácia comparativa do fármaco puro e das nanopartículas de Chn
com DTG foi comparado com o DTG puro em três meios diferentes, a saber, água
carregadas com fármaco em termos de inibição de células HIV foi avaliada com
destilada (pH 7,0), tampão fosfato (PB) (pH 6,8), HCl 0,1 N (pH 1,2), PB com
base no ensaio de formação de sincícios. A proteína viral facilita a fusão de uma
pancreatina e tripsina, HCl 0,1 N com pepsina pelo método da bolsa de diálise
célula infectada com células adjacentes, levando ao desenvolvimento de células
(membrana de diálise Himedia, valor de corte - 12-14 kDa). A absorção máxima do
multinucleadas aumentadas chamadas sincícios. Geralmente, esses sincícios são o
Dolutegravir foi encontrada no intestino delgado proximal, que é o duodeno.
resultado da expressão de uma proteína de fusão viral na membrana da célula
Cimino et al., 2018). Assim, o fluido intestinal simulado (no estado alimentado,
hospedeira no decorrer da replicação viral. O efeito de inibição do HIV de várias
com Pancreatina e Tripsina do pâncreas suíno) foi usado como meio de dissolução
concentrações de amostras de teste foi investigado. Inicialmente, 4×104As células
e os estudos de liberação foram realizados. Além disso, o fluido gástrico simulado
C8166 foram adicionadas com HIV-1IIIBe as células foram infectadas na
com pepsina (estado rápido) foi testado para a liberação do fármaco a partir das
Multiplicidade de Infecção (MOI) de 0,04. As células foram cultivadas sob infecção
nanopartículas de quitosana.Jantratid et al., 2008). Cerca de 10 mg de
em placas de 96 poços a 5% de CO2e 37◦C por 3 dias. Após 3 dias de infecção, o
nanoformulação foram misturados com 0,5 mL do meio correspondente,
efeito citopático (CPE) foi avaliado numerando os sincícios (as células gigantes
colocados dentro da bolsa de diálise e imersos em 10 mL de meio em um frasco.
multinucleadas) em cada poço usando um microscópio invertido. O efeito
Em cada ponto de tempo predeterminado, as amostras de 10 mL foram coletadas
inibitório (%) das amostras de teste sobre a formação de sincícios foi calculado
e imediatamente substituídas pelo meio fresco correspondente. A temperatura e a
pelo número de sincícios em células tratadas com amostra em relação ao HIV-IIIB
velocidade de agitação magnética da amostra foram mantidas em 37
células de controle infectadas (Eq. 6). A concentração inibitória mediana (IC50) é a
concentração de droga que inibe a formação de 50% de sincícios, que foi calculada
◦
C±2◦C e 200 rpm, respectivamente, durante todo o período de estudo de 24 h (
usando a Eq. 7.
Jain et al., 2008).
(
Razão de inibição (%) = 1
2.2.16. Cinética de liberação de drogas das nanopartículas
)
O mecanismo de liberação de drogas de nanopartículas de Chn carregadas Número de sincícios em teste
− ∗100％
com DTG foi determinado ajustando os dados de liberação de drogas adquiridos Número de sincícios no controle positivo
para diferentes meios às várias simulações de cinética de liberação, a saber, (6)
ordem zero (F = k0*t), primeira ordem (F = 100*[1- Exp(-k1*t)]), Higuchi (F =
[ ]
kH*t^0,5), Hixson–- Crowell (F = 100*[1-(1-kHC*t)^3]), Korsmeyer–Peppas (F = (〉50% euV) -50
CI50= 10 Exp log[C](〉50%4) + ×registro (DF)
kKP*t^n), Makoid Banakar (F = kMB*t^n*Exp(-k*t)), Gompertz (F = 100*Exp {- (〉50%4) − (〈4)
α*Exp[-β*log(t)]} ), Hopfenberg (F = 100*[1-(1-kHB*t)^n]) e Baker Lonsdale (3/2*[1- (7)
(1-F/100)^(2/3)]-F/ 100=kBL*t). O R2valor e o valor de n obtidos a partir desses
* C- Valor de concentração
modelos foram comparados para concluir o modelo de ajuste perfeito para cada
* IV- Valor de inibição
tentativa. A modelagem de liberação de drogas foi analisada usando o software
* DF- Fatores de diluição
DD solver (Dash, Murthy, Nath e Chowdhury, 2010).
O índice de seletividade é a medida do efeito terapêutico e da segurança de
determinado medicamento, eliminando o patógeno alvo sem afetar as células
normais. Para que qualquer formulação de medicamento seja eficaz, o valor do
2.2.17. Ensaio de citotoxicidade in vitro em linhas celulares humanas
índice de seletividade deve ser bastante maior, o que significa que o medicamento
A citotoxicidade de amostras em linhagens de células C8166 (leucemia de
mata o alvo primeiro antes do hospedeiro (representando IC50<CC50). O efeito
células T humanas) foi determinada por meio do ensaio MTT. Sobre, 4×104as
terapêutico da nanopartícula de Chn carregada com DTG foi calculado pela Eq. 8 (
células foram semeadas em placas de 96 poços e segregadas para o controle
Wang et al., 2009).
negativo, controle positivo e seis concentrações de amostra de teste para análise
em triplicado. As amostras de teste foram adicionadas aos poços em CC50
Índice de seletividade (SI) = (8)
concentrações diluídas em série predeterminadas e incubadas por 3 dias a 37◦C e IC50
5% CO2. Cerca de 20 μL de MTT foram adicionados a cada poço e incubados por
4-5 horas a 37◦C. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e mais 100 μL de 3. Resultados
15% de dodecil sulfato de sódio e 50% de dimetilformamida foram adicionados e
depois incubados durante a noite à temperatura de 37◦C. O valor de absorbância 3.1. Caracterização de quitosana isolada
das amostras foi medido usando um leitor ELx800 (Bio-Tek, EUA) a 630 nm.
Viabilidade celular e concentração de citotoxicidade (CC50) foi calculado usando as 3.1.1. MALDI-TOF
equações 4 e 5. A análise MALDI-TOF foi realizada para ilustrar a estrutura química
( ) dos oligômeros de quitosana e determinar sua composição con-
Valor OD do teste - OD de BC
Viabilidade celular(％) = ∗100％ (4) que consiste em porções glucosamina GlcN (D) e N-acetil glucosamina
Valor OD de NC - OD de BC
GlcNAc (A). Observam-se oligômeros funcionalizados com grupos terminais
* BC-controle em branco esperados (grupos H e OH) e grau de polimerização (DP) variando de 4 a 8,
* NC- Controle negativo cationizados por sódio e potássio, respectivamente (Figura 1) (Trombotto,
Ladavière, Delolme e Domard, 2008). A comparação dos espectros de massa
revelou a presença da mistura de três diferentes

4
K. Priya Dharshini et ai.
Figura 1.Determinação da massa molecular e do grau de desacetilação de
oligossacarídeos de quitosana (D - glucosamina (GlcN), A - N-acetil glucosamina
(GlcNAc)).
oligômeros: oligômeros totalmente desacetilados (D6UMA0, D7UMA0), uma
mistura de oligômeros acetilados e desacetilados (D1UMA3, D1UMA4, D3UMA1, D3
UMA2, D3UMA5, D6UMA1), e um oligômero totalmente acetilado (D0UMA6), como
mostrado emFigura 1. Por exemplo, o pico em 127 unidades de massa pode ser
reconhecido como oligômero com DP7, enquanto a partir dos cálculos foi
encontrado 1226,58 unidades de massa (D6UMA1= 6×161,07 (D) + 203,07 (A) + 1,00
(H) + 17 (OH) + 39,0983 (K, o íon de cationização). Além disso, a fragmentação das
estruturas de carboidratos pode ser detectada, pois a amostra foi degradada à
força durante a análise para resolver os problemas de solubilidade. Como
resultado, a perda de 18 e 59 unidades de massa correspondem à fragmentação
de C2H5LIGADO e H2moléculas de O, respectivamente (Trombotto et al., 2008).
Para resumir, a quitosana isolada dePortunus Sanguinolentoconsiste em
glucosamina (D) e N-acetil glucosamina (A) com a distribuição de todos os DxUMAy
em vez disso, na ordem aleatória, no entanto, a população de ambas as espécies
parcialmente ou totalmente desaciladas prevalece. Além disso, com base no
método espectrofotométrico UV (como explicado na Seção2.2.3), foi estabelecido
que o DDA (%) da quitosana extraída era de cerca de 95%. Este resultado está de
acordo com a análise MALDI-TOF, que novamente confirma a ocorrência de
monômeros desacetilados em proporção superior aos monômeros acetilados no
esqueleto da quitosana.
3.1.2. Estado sólido13C CP/MAS NMR
A análise estrutural por13C CP/MAS NMR no estado sólido é
obviamente benéfico para polímeros de carboidratos, como quitosana,
Figura 2.Caracterização de Quitosana [A] Estado Sólido13C Espectro de RMN de CP/MAS e [B] FTIR de Quitosana Extraída, Quitosana Comercial (75% desacetilada e LMW).
5
Polímeros de Carboidratos xxx (xxxx) xxx
instigando nenhuma destruição às amostras.Figura 2A mostra o
espectro da quitosana extraída e da quitosana comercial (quitosana
com 75% de DDA e o baixo peso molecular (LMW), Sigma Aldrich). O
espectro da quitosana isolada é altamente análogo ao comercial com
desvios desprezíveis (Senra et al., 2017). O espectro individual da
quitosana isolada (Portunus sanguinolento) exibiram (Fig. 1
suplementar) picos definidos de C1 (101,47 ppm), C2 (57,07 ppm), C3
(53,26 ppm), C4 (80,92 ppm), C5 (73,52 ppm), C6 (60,87 ppm) e CH3
(20,67 ppm). O espectro também apresentou um pico em 169,86 ppm,
que é atribuído ao átomo de carbono no grupo C–O. Além disso,
detectamos um pico de metila extremamente frágil (20,67 ppm),
indicando um DDA relativamente alto (Heux, Brugnerotto, Desbrieres,
Versali e Rinaudo, 2000). Também é aparente que o produto é
altamente puro, uma vez que os picos em 174 ppm, 146 ppm e 117
ppm, pertencentes aos sinais de carbono de catecol e compostos
proteicos, estão ausentes no espectro.Zhang, Haga, Sekiguchi e Hirano,
2000). O DDA da quitosana extraída e da quitosana comercial foi de
93,2% e 75%, respectivamente. A área integral sob este pico para a
quitosana isolada é menor do que a quitosana comercial, o que pode
ser devido ao maior valor de DDA (%) da quitosana isolada. Os
resultados obtidos também estão de acordo com o valor determinado
pelo método Espectrofotométrico UV. Pesquisas anteriores mostraram
que a quitosana com alto grau de desacetilação é biologicamente mais
ativa que a quitina e a quitosana com baixo DDA.Howling et al., 2001).
3.1.3. Análise FTIR comparativa de quitosana extraída e quitosana
comercial
Como uma ferramenta de investigação influente, a análise FTIR tem sido
amplamente adotada para detectar a ocorrência de grupos funcionais
definidos e ligações químicas significativas em uma amostra. Os espectros
FTIR comparativos (Figura 2B) da quitosana isolada e da quitosana
comercialmente disponível apresentaram picos idênticos com leve variação
nos valores de intensidade de absorção. A quitosana extraída apresentou
uma banda forte em 3354 cm−1, que corresponde à vibração de estiramento
OH, as ligações de hidrogênio intermoleculares do polissacarídeo. A banda
de absorção em 2963 cm−1na quitosana comercial corresponde à vibração
de estiramento assimétrico C–H, que foi observada com menor intensidade
na quitosana extraída. O aparente desaparecimento da banda em 1647 cm−1
para a quitosana extraída revelou a N-desacetilação bem sucedida. As
bandas em 1374 cm−1foram atribuídas às vibrações de estiramento da
ligação C-N. O pico em 1152 cm−1pode estar relacionado com a vibração de
flexão OH. A vibração de estiramento C-O da quitosana foi obtida em um
número de onda de 1068 cm−1. Além disso, pico em 765 e
K. Priya Dharshini et ai.
749 centímetros−1foi atribuída à vibração C-H fora do plano e à vibração
NHtwist, respectivamente (Equipes, Rodriquez, Jaspars e Equipes, 1998
).
3.1.4. Comportamento térmico da quitosana extraída
A curva TG-DSC da quitosana isolada mostrou em Figura 1, em que foi
observada uma degradação térmica passo a passo da amostra. Uma curva
endotérmica inicial foi percebida entre 40-100◦C, atingindo o pico em 81◦C.
Cerca de 9,5 % de perda de massa pode estar relacionada a esta
consequência e é atribuída à evaporação do conteúdo de água absorvida no
polímero. Um pico exotérmico em 318◦C pode estar ligado a uma perda de
massa (10%), que corresponde à degradação térmica do esqueleto
polimérico com a evaporação dos componentes voláteis. O polissacarídeo é
pirolisado e a estrutura começa a se deteriorar pela divisão arbitrária das
ligações glicosídicas.Neto et al., 2005). A segunda curva exotérmica
observada em 389◦C pode ser devido à degradação residual da quitosana.
Além disso, o segundo processo endotérmico da quitosana isolada ocorreu
entre a faixa de temperatura de 300-400◦C com um pico em 360◦C, que
representava o ponto de fusão do polímero. Finalmente, um pico
endotérmico em 752◦C na curva DSC representou a degradação completa
do polímero com a correspondente perda de peso na curva TG. A
degradação térmica da quitosana aconteceatravés daquatro etapas; no
entanto, o processo exotérmico que ocorre em 318◦C é o mais significativo,
pois está associado à quebra da espinha dorsal polimérica.López, Mercê,
Alguacil, & López-Delgado (2008)demonstraram que a degradação da
quitosana é uma reação multifacetada, que não pode ser denominada em
um único par de parâmetros de Arrhenius.López et al., 2008). Também,
Rubini et al., 2018 relataram o padrão DRX da quitosana extraída de
Portunus Sanguinolentoque mostrou um padrão de difração único no valor
de 2θ de 20̊, que corresponde à sua propriedade cristalina e também
confirmou a semelhança estrutural da quitosana extraída com a quitosana
comercial (CC).
3.2. Caracterização da nanoformulação de quitosana
3.2.1. Distribuição de tamanho de partícula e exame de potencial Zeta
O tamanho de partícula e a análise do potencial zeta foram realizados para as
nanopartículas de quitosana secas por pulverização carregadas com DTG. O
tamanho médio de partícula, potencial zeta e valor PDI das nanopartículas
formuladas com diferentes proporções de droga e polímero são dados emtabela 1
. A formulação DC1 contendo a proporção 1:1 de droga:polímero apresentou
tamanho médio de partícula na faixa de 140 nm-548 nm e o valor potencial zeta de
26,1 mV, o que garantiu a estabilidade ideal da nanoformulação.
3.2.2. FESEM: microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo
A Microscopia Eletrônica de Varredura foi realizada para as nanopartículas de Chn
selecionadas carregadas com DTG(DC1) e comparada com a droga pura (Fig. 3). Os
resultados mostraram que o DTG puro não processado era em forma de bastão e de
tamanho irregular, enquanto as nanopartículas de Chn eram em forma de esfera. O
tamanho de partícula observado a partir da análise SEM pode ser correlacionado com o
resultado da análise do tamanho zeta.
3.2.3. FTIR: espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier
A análise FTIR foi realizada para o DTG puro e as nanopartículas de quitosana
secas por pulverização (Fig. 4) para confirmar a presença de ligações químicas
significativas. Os picos de alongamento das ligações de O–H, C–H e COC–– foram
obtidos em 3434 cm−1, 2976 centímetros-1,e 1258 centímetros−1,
tabela 1
Propriedades físico-químicas da formulação de quitosana carregada com dolutegravir.
Código de formulação Proporção de drogas proporção de quitosana Droga (g) Quitosana (g)
DC1 1 1 5 5
DC2 1 2 5 10
DC3 1 3 5 15
Polímeros de Carboidratos xxx (xxxx) xxx
respectivamente. O pico de vibração de flexão da ligação C-H foi observado
em 856 cm−1. As ligações duplas de CO e conjugado CC–– foram visualizadas
em 1643 cm−1e 1539 centímetros−1, respectivamente. A ligação CN– no DTG
puro foi observável em 1023 cm−1. O trecho OH, trecho C–H, CC, trecho COC,
curva C–H, ligação conjugada CO––––– e as ligações C–N também foram
observadas nas formulações de nanopartículas com um deslocamento
muito leve no pico valores que mostraram interações químicas desprezíveis.
Portanto, a natureza química do fármaco não foi afetada durante o processo
de spray dryer, além do polímero isolado quitosana. O pico único em 1060
cm-1 para a presença de ligação C–F no DTG puro também foi observado
para as formulações DC1, DC2 e DC3 em 1066 cm−1, 1061 centímetros-1,e
1056 cm−1respectivamente, o que agregou valor significativo à estabilidade
química das nanopartículas poliméricas (Osman e Arof, 2003;Albrecht et al.,
2018).
3.2.4. XRD: análise de difração de raios-X
Os picos de DRX intensos e nítidos obtidos para o DTG e a quitosana
isolada confirmaram a natureza cristalina das amostras puras (Fig. 5). No
entanto, esses picos estavam ausentes nas nanoformulações, em que a
formulação DC1 era amorfa, enquanto as nanopartículas DC2 e DC3
exibiram uma natureza cristalina parcial devido à presença de uma maior
proporção de quitosana. A natureza amorfa da formulação DC1 pode ser
atribuída à transição de estado sólido ou conversão dos materiais cristalinos
para a forma amorfa durante o processo de secagem por pulverização, o
que pode levar ao aumento da solubilidade do fármaco.Monshi, Foroughi e
Monshi, 2012).
3.2.5. Análise termogravimétrica e calorimétrica de varredura diferencial
(TG-DSC)
A análise TG-DSC da amostra pura DTG e suas nanopartículas Chn
correspondentes (Fig. 6) foram comparados para avaliar a estabilidade
térmica do fármaco nas nanopartículas formadas. O pico endotérmico
representando o pico de fusão (Tm) de DTG puro e quitosana isolada foi
encontrado em 359◦C e 360◦C, respectivamente. No entanto, não foram
observados picos endotérmicos correspondentes ao ponto de fusão do DTG
e do polímero nas formulações de nanopartículas de DTG-Chn. A ausência
de um pico endotérmico nas nanopartículas pode ser atribuída à conversão
em estado sólido do DTG puro da forma cristalina para a forma amorfa após
o processo de secagem por pulverização na presença de quitosana. A
formulação DC1 mostrou um pico endotérmico a 80◦C correspondente à
evaporação das moléculas de água, que estava ausente nas formulações
DC2 e DC3 devido à remoção completa da umidade nas nanopartículas
formadas com alta concentração de polímero durante o processo de spray
dryer(Shete, Puri, Kumar e Bansal, 2010).
3.2.6. Estudo de liberação de drogas in vitro
As nanopartículas de DTG-Chn formuladas mostraram 75±2%, 60±3% e
45±2% de conteúdo de droga para formulações DC1, DC2 e DC3,
respectivamente. À medida que a razão fármaco:polímero aumentou de 1:1
para 1:2 e 1:3, verificou-se que o teor de fármaco estava diminuindo, o que
pode ser devido à rápida secagem do polímero antes do encapsulamento do
fármaco. oem vitroO experimento de liberação do fármaco das
nanopartículas formadas foi realizado pelo método da membrana de diálise
em 3 meios diferentes e comparado com o fármaco puro. Em meio de água
destilada, o fármaco puro atingiu 50,10 % de concentração ao final de 24 h,
enquanto a nanoformulação DTG-Chn DC1, DC2 e DC3 apresentou 36,44 %,
40,49 % e 39,96 % de liberação do fármaco, respectivamente (Fig. 7UMA). No
meio PB, o fármaco puro liberou 58,39% de sua concentração total, e o
Colheita (%) Tamanho da partícula (nm) O índice de polidispersidade (PDI) Potencial Zeta (mV)
60±2,5 140− 548 0,9 26.1
66±3,0 210-1000 0,7 10,4
65,5±2,0 > 5000 1,0 4,91
6
K. Priya Dharshini et ai.
Fig. 3.Micrografia eletrônica de varredura de [A] nanopartículas de Dolutegravir puro [B] DC1.
Fig. 4.Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier de nanopartículas de DTG
puro, quitosana isolada e DTG-Chn.
nanoformulação DC1, DC2 e DC3 mostraram 59,69%, 54,64% e 66,42% de
liberação de drogas, respectivamente (Fig. 7B). Uma vez que a nanoformulação foi
desenvolvida para mistura por via oral de administração, o perfil de liberação no
meio ácido é considerado um parâmetro importante.Ghareeb e Neamah, 2017).
Em meio HCl 0,1 N (pH estomacal 1,2), todas as formulações e o fármaco puro
atingiram 100% de liberação do fármaco ao final de 24 h (Fig. 7C). Além disso, as
formulações de nanopartículas foram avaliadas além do leite (15 min), seguidas
dos estudos de liberação do fármaco em meio HCl 0,1 N pelo processo de
membrana de diálise. O padrão de liberação da droga de todas as 3 formulações (
Fig. 7D) foi semelhante, como observado em meio simples de HCl 0,1 N. Isso
confirmou a estabilidade das formulações quando adicionadas com leite e sua
adequação para dosagem de mistura de leite (Alhawmdeh, Barqawi e Alkhatib,
2018).
7
Polímeros de Carboidratos xxx (xxxx) xxx
Fig. 5.Espectro de Difração de Raios-X de DTG puro, Quitosana isolada e
nanopartículas de DTG-Chn.
Para manter a eficácia terapêutica do fármaco, uma quantidade
considerável de fármaco deve estar presente na corrente sanguínea.na Vivo.
Para avaliar este parâmetro, o T30, T50,e T80valores (tempo necessário para
liberar 30%, 50% e 80% do seu conteúdo de droga) foram calculados. A
Tabela II exibe a liberação baseada no tempo do DTG puro e das
nanoformulações. O tempo necessário para liberar 80% da droga foi de 20
h, 6 h, 9 h e 9 h para o DTG puro, DC1, DC2 e DC3, respectivamente. Como a
meia-vida do Dolutegravir é de 14 h, a liberação aprimorada do fármaco das
nanopartículas seria adequada para terapia uma vez ao dia e melhor
biodisponibilidade em uma dose baixa em pacientes pediátricos. O DC1
K. Priya Dharshini et ai.
Fig. 6.Análise Calorimétrica de Varredura Diferencial Termogravimétrica [A] DTG puro [B] Quitosana isolada [C] DC1 [D] DC2 [E] Nanopartículas DC3.
As nanopartículas foram consideradas ótimas em comparação com outras formulações
de proporção, que apresentaram o menor tamanho de partícula e maior potencial zeta
positivo, o que provavelmente poderia ser o motivo de sua liberação mais rápida do
fármaco.Griesser et al., 2018).
A formulação otimizada DC1 foi ainda analisada quanto à liberação do
fármaco na presença das enzimas (pepsina, pancreatina e tripsina). Ao final
de 24 h, a porcentagem de liberação de DTG puro foi em torno de 47,71±
1,0%, 42,28±2,3% e 44,10±3,2% no HCl 0,1 N com pepsina, PB-6,8 com
tripsina e PB-6,8 com pancreatina, respectivamente (Fig. 8). A taxa de
liberação de DTG da formulação selecionada DC1 atingiu um máximo de
59,49±2,5%, 62,33±2,3%, 56,82±3,3% em HCl 0,1 N com pepsina, PB-6,8 com
tripsina e PB-6,8 com pancreatina, respectivamente, no final de 24 h (Fig. 8).
A presença de enzimas (tripsina e pancreatina) não influenciou
significativamente a liberação de DTG no meio PB pH 6,8 (Anal, Stevens e
Remunan-Lopez, 2006). No caso do meio HCl 0,1 N (sem pepsina), as
nanopartículas apresentaram 100% de liberação do fármaco ao final de 24 h,
enquanto apenas 60% de liberação foi observada na presença de pepsina.
De forma semelhante, a droga livre DTG mostrou 100% de liberação da
droga em meio HCl 0,1 N (sem pepsina) e 44,10±Liberação de 3,2% na
presença de pepsina ao final de 24 h. Isso pode ser atribuído
8
Polímeros de Carboidratos xxx (xxxx) xxx
às interações físico-químicas entre o fármaco e a pepsina (do
Nascimento, Montalvão, & Aversi-Ferreira, 2012).”
O medicamento puro Dolutegravir é ligeiramente solúvel em água (<1 mg/mL)
e metanol (0,5 mg/mL) (o solvente usado para secagem por pulverização). A droga
é praticamente insolúvel em HCl 0,1 N pH 1,2 (<0,1 mg/ml). Um aumento no pH
para 6,8 resulta em um leve aumento na solubilidade do Dolutegravir, mas
continua a ser muito pouco solúvel (0,1-1 mg/mL) (Meergans et al., 2016). A
solubilidade do Dolutegravir foi de 190,18±9,8 μg/mL em água destilada e 36,14±
5,8% μg/mL em meio de HCl 0,1 N. No aumento do pH de 6,8, a solubilidade foi
ligeiramente aumentada para 84,04±
5,6 μg/mL. Esses resultados são comparáveis aos dados de solubilidade relatados
anteriormente (Meergans et al., 2016). A presença de enzimas (pepsina, tripsina e
pancreatina) não afetou a solubilidade do fármaco livre (Tabela I complementar).
Após a secagem por pulverização do DTG com Quitosana, houve um grande
aumento de vezes na solubilidade do fármaco nos diversos meios de dissolução.
Embora não tenha havido aumento na solubilidade em água destilada (200±4,3
μg/mL), as nanopartículas de quitosana apresentaram um aumento de 20 vezes
na solubilidade da droga (400±2,8 μg/mL) no meio de HCl 0,1 N. Isso pode ser
devido à solubilidade do polímero de quitosana (polímero solúvel em ácido) das
nanopartículas da matriz, o que permitiu
K. Priya Dharshini et ai. Polímeros de Carboidratos xxx (xxxx) xxx

Fig. 7.Em vitroestudo de liberação de drogas de nanopartículas DTG e DTG-Chn puras em [A] Água Destilada [B] Tampão Fosfato pH 7,4 [C] HCl 0,1 N pH 1,2 [D] Liberação de drogas do
leite em meio HCL 0,1 N.

2001).
Para utilizar o parâmetro de cinética de liberação da Korsemeyer Peppa
para determinar o mecanismo de intumescimento e difusão da formulação
em vários meios, o índice de intumescimento da formulação otimizada foi
encontrado. A razão de intumescimento das nanopartículas foi de 9,25±
1,03%, que foi inferior a 25%. Portanto, o valor n do modelo Korsmeyer
Peppas de cinética de liberação tem sido usado para determinar o
mecanismo de expansão e difusão da liberação do fármaco.Gouda, Baishya
e Qing, 2017). A equação e o valor de n são os seguintes
Equação de Korsmeyer Peppas:

Mt/Mo = KP*t^n

Mt- Quantidade de droga liberada no momento t Mo-

Quantidade inicial de droga na forma farmacêutica KP-
Fig. 8.Em vitroliberação do fármaco puro e formulação DC1 em meio HCl 0,1 N
Constante de liberação de Korsemeyer Peppa
(com pepsina) e PB (pH-6,8, com pancreatina e tripsina).
No meio de HCl 0,1 N e junto com o leite, o valor n de todas as 3
formulações (DC1, DC2, DC3) foi menor que 0,5, o que confirma que a
a droga aprisionada se dissolva mais rapidamente. As nanopartículas DTG-
cinética de liberação seguiu a difusão Fickiana (Tabela Suplementar III) .
Chn exibiram em torno do aumento de 3 vezes na solubilidade no meio PB
Neste caso, a difusão do solvente é muito maior do que o processo de
pH-6,8 (262±5,7 μg/mL), o que é mais desejável, pois a droga é altamente
relaxação da cadeia polimérica. A difusão Fickiana refere-se ao processo de
absorvida no duodeno (pH-6,8)”
transporte de soluto no qual o tempo de relaxação do polímero (tr) é muito
maior do que o tempo de difusão característico do solvente (td). Em outros
3.2.7. Cinética de liberação de drogas
meios (água e PB pH-6,8), os valores foram ligeiramente superiores a 0,5,
Com base nos valores do R mais alto2e SSR mais baixo obtido a partir de
mas inferiores a 1,0 o que mostra que as formulações seguiram o
vários modelos matemáticos, calculou-se o mecanismo de liberação do
mecanismo de difusão não Fickiano, em que tr≈td, a liberação macroscópica
fármaco relacionado ao tempo. A liberação do fármaco das nanopartículas
do fármaco torna-se anômala (Fu & Kao, 2010).
puras de DTG e DTG-Chn em três meios diferentes seguiu o modelo de
cinética Makoid Banakar (MB). O valor n<5 representou o mecanismo
3.2.8. Citotoxicidade in vitro e atividade anti-HIV em linhagens de células humanas
Fickiano de difusão de drogas. Como o modelo Makoid-Banakar é um
de HIV O CC50o valor da formulação pura de DTG e DC1 foi muito maior do
modelo hipotético e não abstraído de nenhuma base cinética, ele não ilustra
que seu IC correspondente50valores (Fig. 9), que representou a eficácia do
suficientemente as propriedades cinéticas de liberação do fármaco. Como o
fármaco e a nanoformulação com alto índice terapêutico.
valor k do modelo Makoid-Banakar obtido para todos os meios foi quase
O valor de citotoxicidade (CC50) da formulação DC1 (195,28±68,26
igual a zero, a equação da cinética de liberação pode ser ajustada ao modelo
μg/mL) (Fig. 9A) foi muito maior do que o DTG puro (88,88±5,10 μg/mL)
de dissolução de Korsemeyer Peppa (KP)(Costa & Sousa Lobo, 2003). Existem
que evidenciou a adequação da natureza biocompatível do polímero
vários processos simultâneos considerados no modelo KP, como difusão de
quitosana. O IC50valor de DTG puro é 0,26±0,08 ng/mL e as
água nas partículas, inchaço das partículas devido à entrada aquosa,
nanopartículas DC1 foram 0,82±0,71 ng/mL (Fig. 9B). Embora o CI50
formação de gel, difusão do fármaco para fora das membranas e dissolução
valor das nanopartículas parece ser 2 vezes maior do que o puro
do fármaco no meio. (Costa & Lobo,

9
K. Priya Dharshini et ai.
Fig. 9.[A] Toxicidade celular e [B]Em vitroatividade anti-HIV de nanopartículas DTG e DC1 em linha celular C8166 infectada com HIVIIIBestirpe viral.
fármaco, a proporção de DTG:Chn na formulação DC1 é de 1:1, o que
significa 50% de fármaco e 50% de quitosana. Portanto, não houve diferença
substancial entre as nanopartículas DTG puras e DTG-Chn em termos de sua
inibição de sincício. Isso confirmou que a atividade inibidora do HIV do DTG
não foi afetada após o encapsulamento dentro das nanopartículas
formuladas com o biopolímero quitosana. Com o nível obtido de
concentração citotóxica e inibitória, o índice de seletividade da formulação
DC1 foi amplo (83010-2395818). Isso indicou que a quitosana isolada pode
ser adequada para encapsular drogas e para ajustar formas de dosagem
com uma proporção menor ou maior do polímero, conforme necessário.
4. Discussões
A quitosana isolada da nova espécie de caranguejo apresentou um
rendimento ótimo de 40% com peso molecular variando de 1200
− 1300 Da. Um resultado notável de 93% de DDA foi obtido pelo método
químico de isolamento da quitosana, que poderia decidir a pureza e as
propriedades químicas da amostra. A maior desacetilação do precursor da
quitina levou a quitosana prontamente solúvel em meio ácido.Islã, Bhuiyan
e Islã, 2017) e, portanto, ofereceu melhor entrega do DTG no meio de pH do
estômago. As análises de tamanho mostraram o tamanho mínimo de
partícula de 140 nm para as nanopartículas DTG-Chn otimizadas, o que
mostrou a compatibilidade do processo de spray dryer para a produção de
partículas nanométricas. A transformação do DTG puro em forma de bastão
em nanopartículas esféricas também pode ser confirmada pela análise SEM
pós-processo de secagem por pulverização. O potencial zeta eletrostático ao
redor das nanopartículas foi altamente positivo, o que explica a tendência
das nanopartículas carregadas de drogas permearem as membranas
biológicasna Vivo.Uma vez que o teor de fármaco das nanopartículas é um
fator crucial para a fixação eficaz da dose, a formulação DC1 com teor de
fármaco superior a 75% foi considerada ótima. A estabilidade química do
fármaco na nanoformulação foi confirmada por análise de FTIR, que
também evidenciou que o processo de spray dryer em adição ao polímero
quitosana não afetou a natureza química da molécula ativa do fármaco. Os
perfis de DRX das nanopartículas DTG-Chn confirmaram a transição do
estado sólido do fármaco do estado puro cristalino para o estado amorfo
nas nanopartículas. O mesmo tipo de resultados foi relatado por outros
pesquisadores também (Cervera et al., 2011 eNunthanid et al., 2004).
Cervere et al., obtiveram os sais de ácido de quitosana secos por
pulverização exibindo o pico característico de DRX a 20◦(2θ) inferior ao
respectivo pico observado para quitosana pura de referência, que indicou a
transformação amorfa do material cristalino após o processo de spray dryer.
As vantagens da formulação amorfa foram explicadas por (Ambike, Mahadik
e Paradkar, 2005), em que a alta energia interna e o volume específico dos
materiais do estado amorfo podem levar a uma maior dissolução e
biodisponibilidade, então ao estado cristalino. Outro fator importante para
aumentar ana Vivoadministração das nanopartículas de drogas é aem vitro
10
Polímeros de Carboidratos xxx (xxxx) xxx
perfil de liberação de drogas. As nanopartículas de DTG-Chn mostraram 100% de
liberação do fármaco em meio de HCl 0,1 N dentro de um período de tempo
menor em comparação com o fármaco puro, o que poderia melhorar a taxa de
dissolução e a biodisponibilidade geralna Vivo. O aumento dramático na
porcentagem de liberação do fármaco pode ser explicado pela redução do
tamanho das partículas, resultando em um aumento da área de superfície
específica.Yang et al., 2012). Além disso, a transição do estado sólido do DTG puro
do estado cristalino para o estado amorfo após a secagem por pulverização com
quitosana causa o aumento na taxa de liberação do fármaco no meio de
dissolução. Belgamwar et al., obtiveram o mesmo resultado, onde a dissolução do
Dolutegravir aumentou substancialmente de 19,12% para 54% devido à redução
da cristalinidade após encapsulamento com HPβCD (Belgamwar, Khan e Yeole,
2019). A distribuição de tamanho de partícula das nanopartículas de DTG-Chn
desenvolvidas mostrou-se multimodal com alto valor de PDI, o que influenciou o
padrão de liberação do fármaco. As partículas de tamanho menor foram
dissolvidas primeiro, seguidas pelas partículas de tamanho maior (Rodríǵuez, Vila-
Jato, & Torres, 1998) para exibir um perfil linear de liberação de droga. O ensaio
MTT mede a viabilidade das células, que depende diretamente do nível de
metabolismo nas células vivas. O uso de linhagens de células C1866 infectadas
com HIV para medir a toxicidade celular e a atividade anti-HIV foi previamente
relatada por Wang et al. Tanto a formulação de nanopartículas de DTG puro
quanto de DTG-Chn não foram tóxicas até a concentração de 3,2 μg/mL, o que
forneceu evidências de menor toxicidade associada à formulação. Maior aumento
na concentração de drogas e as nanopartículas causou uma redução na
viabilidade celular. O CC50valor de DTG puro e DC1 foi de 88,88±5,10 μg/mL e
195,28±68,26 μg/mL, respectivamente. Quanto maior o CC50O valor associado à
formulação de quitosana comprovou a biocompatibilidade do polímero, o que
também indicou que uma dose maior da nanoformulação pode ser administrada
sem causar qualquer citotoxicidade. O CI50o valor de DTG e DC1 não foi
significativamente diferente, o que representou que a atividade anti-HIV da droga
não foi alterada após o processamento em nanopartículas em adição ao polímero
de quitosana.
5. Conclusão
A extração sequencial e elucidação completa da estrutura da quitosana da
casca do caranguejoPortunus Sanguinolento, o exame de suas propriedades
físico-químicas e sua aplicação como carreador de drug delivery tem sido
explorado com sucesso. A quitosana extraída possui menor peso molecular, maior
% de DDA em comparação com a quitosana comercialmente disponível. No geral,
nossos resultados validaram que o biomaterial identificado pode ser uma nova
fonte do polímero devido às suas propriedades únicas e também sugerindo que a
quitosana isolada pode ser usada como um excipiente eficiente na indústria
farmacêutica. O dolutegravir foi processado com sucesso como uma formulação
otimizada de nanopartículas usando a quitosana extraída como carreador, com
distribuição de tamanho de 140 nm–548 nm, o que é um resultado notável através
da técnica de spray dryer. O DTG não foi quimicamente degradado durante a
secagem
K. Priya Dharshini et ai.
processo que comprovou a compatibilidade da técnica de produção de
nanopartículas sólidas de fármacos. A estabilidade química e o rearranjo da
cristalinidade do DTG após o processo de secagem por pulverização foram
confirmados por análise de FTIR e DRX, respectivamente. Um aumento
significativo na área de superfície das nanopartículas devido à redução efetiva do
tamanho para a faixa nanométrica favoreceu o aumento da taxa de dissolução do
fármaco. O ensaio de citotoxicidade celular utilizando linhagens linfáticas T por
meio do ensaio MTT e a atividade anti-HIV por meio do ensaio de inibição de
sincício evidenciou que as nanopartículas de DTG-Chn selecionadas foram menos
tóxicas em relação ao fármaco puro. Este trabalho de pesquisa evidenciou a
conversão de uma molécula anti-retroviral em um sistema nanoparticulado com
maior dissolução e efeitos tóxicos mínimos, encapsulando-a dentro de um
biopolímero. Esta nanoformulação à base de quitosana em pó seria altamente
compatível como mistura leite/alimento para pacientes pediátricos com HIV
devido à menor dificuldade de consumo do medicamento antirretroviral, sem
comprometer sua eficácia terapêutica. ona Vivo estudo será realizado usando
modelos de camundongos para analisar a biodistribuição e aprimoramento na
biodisponibilidade das nanopartículas otimizadas e relatado em um futuro
próximo.
Contribuições do autor
PDK, RD e VH BN envolvidos no projeto e desenvolvimento de
nanopartículas pela técnica de spray dryer. PDK gerou os dados e VHBN e
DRD envolvidos na interpretação dos dados. MB envolvido na caracterização
de quitosana usando MALDI, RMN em estado sólido e FTIR. H. F, JY, RHL e
YTZ envolvidos na citotoxicidade e atividade anti-HIV. Todos os autores
participaram da redação do manuscrito, desenharam e revisaram
criticamente o manuscrito e foram aprovados por todos os autores. VH BN
Obteve os fundos.
Fontes de financiamento
O trabalho foi realizado com o apoio do SERB-DST, prêmio Early
Cancer Research (ECR/2016/001856).
Declaração de Interesse Concorrente
Os autores não relataram declarações de interesse.
Agradecimentos
Os autores agradecem à SASTRA Deemed University, Thanjavur,
pelo suporte de infraestrutura e recursos online. O primeiro autor e o
autor correspondente (VH BN) agradecem a DST-SERB, Governo da
Índia pelo JRF e financiamento de pesquisa através do prêmio Early
Career Research (ECR/2016/001856), respectivamente e também
Departamento de Biotecnologia, Ministério da Ciência e Tecnologia,
Nova Delhi (BT/ PR23592/MED/29/1203/ 2017) agradece o apoio
financeiro.
Apêndice A. Dados Suplementares
O material complementar relacionado a este artigo pode ser encontrado,
na versão online, em doi:https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2020.117440.
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