Cromatografia

Cromatografia é um método físico-químico de separação no qual uma mistura de substâncias é separada

através da distribuição de suas partículas entre uma fase móvel e uma fase estacionária.

M. TSWEET (1903): Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos
e solventes variados
 Jogou o éter na coluna;
 Dependendo da polaridade do pigmento em combinação com a coluna e com o solvente;
 Mais afinidade com o solvente, mostra o pigmento mais rápido, separa mais rápido; 
o Peso molecular;
o Tipo de estrutura;

Resultados  
 Pigmentos que interagiam mais fortemente com a fase estacionária (carbonato de cálcio) e tinham menor
afinidade com o solvente moviam para baixo mais devagar do que os pigmentos que tinham afinidade com o
solvente maior, e uma atração mais fraca com a fase estacionária.  
 Foi observado que os primeiros tinham sido separados em várias manchas com cores diferentes como um
resultado do fato de que haviam movido para baixo na coluna, com velocidades diferentes.

Aplicações 
1 - Controle de poluição do ar, água e solo. 
 Podemos analisar qualidade do ar;
o Pega uma seringa puxa o ar dos ambientes;
o Injetar no equipamento, e conseguimos analisar quais são os constituintes presentes no ar;
 Água para todos os segmentos;

2 - Análises clínicas 
 Drogas, toxicidade;
 Agricultura → defensivos agrícolas;

3 - Óleos essenciais 
 Podemos fazer essa análise com todos os alimentos que têm óleo;
 O óleo essencial tem uma propriedade interessante, são antimicrobianos, são caros;
 Precisa analisar se é óleo essencial mesmo ou óleo comum, tipo fraude;
o Antes não poderia adicionar óleo de soja, atualmente é permitido, desde que identificado;
 Verificar se tinha fraude em azeite;
o Pelo perfil de ácidos graxos (tem tabelado);
 FRAUDE DE CHOCOLATE;
o O chocolate tem que ter manteiga de cacau, então começamos analisamos se tem isso;
 Sacaria de juta= para pôr grão de café;
o Sacaria tem que ser confeccionada com óleo vegetal;
o Como saber se é óleo vegetal ou mineral? Tem que cortar ela, extrair a gordura por Soxhlet, pega a
gordura faz um tratamento para ver o perfil de ácidos graxos da sacaria;
 Alimentos exóticos → substância apreendida pela polícia;
o O óleo de peixe elétrico;
 Gergelim- muito fraudado pois é caro;
o Analisamos a vitamina E, ácidos graxos;
4 - Usinas de álcool de cana de açúcar 
 Cada bebida tem um perfil de fermentação;
 Toda fermentação deve-se conhecer a matéria prima, pois a primeira fração (chamada de cabeça) é a parte
tóxica, que é o metanol;
o PODE MATAR!
o Desde que, bem controlado a fermentação, tudo certo!
o O vinho e cerveja pode ter uma pouca concentração de metanol;
  Pode dar dor de cabeça;
o O problema é bebidas com maior concentração alcóolica;
5 - Resíduo de pesticidas 
6 - Indústria do petróleo 
7 - Drogas e medicamentos 
8 - Toxicologia 
 Doping nas olimpíadas;
9 - Bromatologia
 Composição de lipídeos, rotulagem, analisar se é gordura saturada, insaturada, trans.;
 Podemos diferenciar bases oleosas (exemplo: quando adicionamos para ser base de um corante);
10 - Outros tipos de aplicações

Princípio Básico 
Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA
(líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
 Cromatografia ou líquido-gás;
 Fase estacionária- fase fixa (geralmente é sólido);
 Fase móvel- o que empurra os componentes para separar;
o Por isso temos 2 tipos e cromatografia (líquida ou gás);
 Compramos a coluna com a fase estacionária pronta (parte cinza) e a fase móvel (onde vamos colocar a
substância);
o A líquida dá mais trabalho;
 Como escolher entre as duas? Depende do componente;
 Se o componente for volátil ou podermos transformá-lo em gasoso, usamos o cromatógrafo a gás;
o Bebidas, óleos e gorduras (por transformações);
 De acordo com afinidade, separamos os componentes;
o Se tiver muita afinidade, não sai do meio! Pode estragar o tubo;
 Sai primeiro quem não tem tanta afinidade do meio e com menor peso molecular;
o No caso da imagem abaixo, o composto azul tem mais afinidade pelo meio, e o composto vermelho
tem menos afinidade e menor peso molecular, então ele sairá mais rápido do meio;

Cromatografia Gasosa -Aplicabilidade 

 Quais misturas podem ser separadas por CG? → (para que uma substância qualquer possa ser
“arrastada” por um fluxo de um gás ela deve ser dissolvida - pelo menos parcialmente nesse gás) →
Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (=“evaporáveis”); 
 CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de
até 300°C e que termicamente estáveis.
  Tem vários gases acoplados no cilindro. 
 Utiliza o detector ionização de chama;
 Volatilizo a amostra, provoca um DDP, e o decodificador codifica isso em forma de picos;
 Tem vários tamanhos de coluna (mangueira vermelha);
o Quanto maior o tamanho da coluna, mais difícil de retirar a substância;
o Geralmente é feito de cobre a parte externa;
 Gás de arraste- utilizamos o H2 ou He (deve ser gás nobre o mais puro possível);
o He é muito caro (mas é o gás ideal);
o H2 é mais acessível, porém é explosivo;

TÉCNICAS DE IDENTIFICAÇÃO  
 Emprego de parâmetros cromatográficos:  
 Tempo de retenção: intervalo de tempo (min ou s) entre a injeção e a altura máxima de um pico.  
o Quanto tempo fica para sair;
 Retenção relativa: relação entre os tempos de retenção de duas substâncias.  
 Distância de retenção: distância entre o máximo do pico e o instante da injeção da amostra.  
o A identificação é feita comparando os parâmetros cromatográficos (tempo de retenção) dos
compostos em estudo com os de padrões puros dos mesmos.

Variação dos Parâmetros 

 Dimensão da coluna 
 Fase estacionária (tipo, quantidade) 
o Compramos a coluna para cada tipo de substância;
 Tipo do suporte da coluna 
o Mesmo no a gás, podemos usar 2 tipos:
 Capilar;
 Empacotada;
 Temperatura 
 Natureza e fluxo do gás de arraste

Problemas de análises qualitativas (tempo de retenção) 

1- Diferentes substâncias podem eluir no mesmo tempo de retenção. 
 Tentar separar melhor os picos (as vezes eles saem juntos no gráfico tornando difícil a leitura);
2- O tempo de retenção é sensível a qualquer variação nas condições experimentais.

Procedimentos utilizados para ajudar na identificação  

 Injetar junto com a mistura na qual se pretende determinar o composto, uma quantidade de padrão
conhecida do mesmo. 
o Às vezes, temos uma quantidade muito pequena de amostra, então adicionamos um composto para
adicionar quantidades, para ser possível a contabilização da área do pico;
 Empregar colunas cromatográficas com diferentes fases estacionárias. Verificar os tempos de
retenção do composto e de padrão puro do composto nas diferentes colunas.

ANÁLISE QUANTITATIVA 
1- Amostragem - isolar pequena quantidade da amostra que seja representativa do todo. 
2- Preparo da amostra - processos físicos e químicos para tornar a amostra adequada a análise cromatográfica 
3- Análise Cromatográfica - etapa crítica na introdução de erros. 
4- Integração: A integração de um pico visa relacionar o tamanho do pico com a concentração da amostra.

**Etapa crítica na introdução de erros. 

 Alguns cuidados:  
 O gás de arraste deve ser o mais puro disponível no mercado.  
 Manter constante os vários parâmetros experimentais, evitando que o detector forneça diferentes respostas.  
 Verificar se o injetor, a coluna e o detector estão limpos.  Selecionar as condições ideais de análise.

 Cromatógrafo parece um forninho, e dentro dele fica todos os equipamentos.

 Troca de coluna é difícil;

Exemplo:
 Antes de começar as análises, injetamos as amostras padrões puras para saber o tempo das curvas;
 Injetamos uma amostra de um ácido graxo puto (C140) para analisar o tempo que analisou, e esse tempo
para cada pico; Deve-se ter esses valores calculados para cada substância que queremos identificar;
 Podemos dizer que é uma calibração do equipamento com as substâncias que precisamos identificar;
 Fazemos isso para padrão;
 Não precisamos fazer isso sempre, podemos registrar esses valores em um computador, para não precisar
fazer toda vez essa “calibração”.
 Para cada padrão, obtemos um cromatograma (o gráfico é um cromatograma)!
  Após isso, pegamos o cromatograma do alimento que analisamos, e comparamos cada pico (seu tempo)
com os cromatogramas padrão;
o Por isso tem várias curvas, e cada uma será sobre uma substância presente;
 Quando os picos estão muito juntos, contabilizamos como um só!

Colunas capilares  
 As colunas capilares são as mais empregadas devido a sua alta eficiência e resolução.  
 É comum se atingir 4.000 ou 6.000 pratos teóricos por metro de coluna.
 Grande inércia superficial, alta flexibilidade mecânica e resistência térmica e química.  
 Desta forma, as colunas capilares são muito mais eficientes e rápidas, além de necessitar de um volume
menor de amostra.

Cromatógrafo a Gás 
 É um equipamento utilizado para a quantificação de compostos orgânicos voláteis. Os componentes da
amostra são separados em uma coluna por um gás de arraste e quantificados por um detector de ionização
de chama, captura de elétrons ou nitrogênio/fósforo.
o Mais utilizado é o de detector de ionização de chama;

Cromatógrafo Iônico 
 É um equipamento capaz de separar, identificar e quantificar um grande número de íons, simultaneamente,
com grande precisão, velocidade e alta sensibilidade. 

As quantidades de amostras são bem pequenas!

Cromatógrafo Gasoso acoplado a Espectrômetro de Massa  

Este equipamento tem a capacidade de identificar e quantificar compostos orgânicos voláteis, utilizando o tempo de
retenção do analito em uma coluna cromatográfica associado com o seu padrão de fragmentação. O resultado da
identificação é fornecido pelo software, por comparação com uma biblioteca de espectros.
 Este tem um banco de dados das amostras e calcula a probabilidade de ser a substância que está sendo
analisada é grande;
 Fragmenta o composto e calcula o espectro de cada substância.
 Equipamento bem caro e sofisticado;

Cromatógrafo Gasoso com Amostrador Automático Headspace  

O Headspace é um instrumento específico para a extração de compostos voláteis de amostras de difícil manipulação,
tais como: efluentes, sangue, solos, alimentos, bebidas e outros. A operação é realizada por um sistema de pressão
balanceada, que provoca a volatilização da substância aquecida que é coletada e transferida por injeção para o
cromatógrafo.
 Aquece, emite os voláteis, pegamos os voláteis e analisamos.

Cromatógrafo Líquido  
 Atualmente é uma das técnicas mais utilizadas.  
 A metodologia tem como princípio a separação dos componentes em uma coluna por uma fase móvel
líquida.  
 As substâncias separadas são detectadas e quantificadas por detector UV-VIS ou de fluorescência. 
 Sempre fragmenta da mesma forma, por isso o equipamento consegue fazer um banco de dados!
  Cromatógrafo líquido.
 Ao invés de ser um gás que empurra, é um líquido. Acaba sendo mais complicado por conta de ter muitas
torneiras;

IDENTIFICAÇÃO DOS GRÁFICOS

 Identificamos o pico de acordo com o tempo, e a quantidade do composto calculando a área.

 Calcula-se pela área do pico. Atualmente, o computador faz esses cálculos para nós;
 Sempre evitar ruídos na linha de base.
o Se tem ruídos, pode ter soluções que não conseguem ser contabilizadas ou sujeita dentro da
amostra.
 Temos alguns cromatógrafos que precisam ficar em temperaturas constantes, por conta do detector.
 Imagens de cromatógrafo a gás;
 Tipo de cromatógrafo;
 Tem a linha de base, e o computador calcula a área por essa linha de base;
 Picos menores podem ser substância não detectáveis, ou sujeiras.
 O primeiro pico, sem valor, geralmente é o pico do solvente!
 A concentração é de acordo com a área. Mas para identificar a substância, é pelo tempo;

 Muito comum os analistas experientes não precisarem comparar com o padrão, pois já decoraram os valores
e a sequência.
 Este é um exemplo de um gráfico está errado, pois a linha de base não seguiu contínua.
 Lembrando que, esta análise pode demorar por conta do preparo da amostra e realização do teste;

Podemos identificar os picos por números, para facilitar.