Determinação de proteínas

PROFESSOR JOHAN GUSTAV CHRISTOFFER THORSAGER KJELDAHL

 Fazia várias pesquisas, inclusive o primeiro teste para determinar proteínas foi feito com carne;
 Pegou ácidos fortes e colocou na carne para digerir;
 Digerir, decompondo o alimento e liberar proteínas para conseguir classificar, demorou mais de
duas semanas para desintegrar os alimentos;
o Pensou que a carne ficou apodrecendo no organismo, porém, eles não sabiam que em
nosso organismo há a presença de enzimas para acelerar o processo!
 Serve para determinar qualquer proteína, só não dá para separar os aminoácidos;

DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA
 Determinar um elemento ou um grupo pertencente à proteína e em seguida convertemos.
 A conversão para conteúdo de proteína é feita através de um fator de conversão.
 Os elementos analisados geralmente são carbono ou nitrogênio, e os grupos são
aminoácidos e ligações peptídicas.

1- ANÁLISE DE CARBONO
 Digestão mais fácil do que para o nitrogênio;
 Achavam que ocorria menores erros no resultado por causa da maior quantidade em relação
ao nitrogênio;
o Carbono tem em tudo: lipídeos, carboidratos, acaba sendo difícil separar;
 Fator de correção mais constante que para o nitrogênio;
 Maior dificuldade em separar os carbonos pertencentes à proteína dos carbonos de outros
componentes.
o Um só, hoje em dia, não faz mais teor de proteína por carbonos, porque para separar
é muito mais difícil;

2. ANÁLISE DE NITROGÊNIO
 É a determinação mais utilizada;
 Considera que as proteínas têm 16% de nitrogênio em 100 g em média (vai depender do tipo
de proteína);
 Determina o teor de nitrogênio e multiplica pelo fator de correção;
 O fator geral na transformação de nitrogênio para proteína é de 6,25.
% de nitrogênio x 6,25 = porcentagem de proteínas

CONVERSÃO DE NITROGÊNIO PARA PROTEÍNA

16 g N 100 g proteínas
ngN  x g proteínas

FATORES DE CONVERSÃO
Fatores de conversão para casos específicos, porque nem todas as proteínas têm a mesma quantidade de
nitrogênio;
 Quando tem laudo técnico, deve ser informado o fator de conversão utilizado para proteínas!
 Se não falarem nada = 6,25;
 Trigo: 5,70;
 Leite: 6,38;
 Gelatina: 5,55;
 Ovos: 6.68;
 Soja: 6,00;
 Arroz: 5,95;

LEGISLAÇÃO
Pode ser usado um fator diferente quando estiver indicado em um Regulamento Técnico específico
ou na sua ausência o fator indicado em um método de análise específico validado e reconhecido
internacionalmente.
Resolução - RDC nº 360, de 23 de dezembro de 2003 D.O.U de 26/12/2003
Tentaram homogeneizar isso:
 5,75 proteínas vegetais;
  6,38 proteínas lácteas;
 6,25 proteínas da carne ou misturas de proteínas;  
 6,25 proteínas de soja e de milho;
o Vegetais tem exceção, com tem mais proteína tem outro fator;
 Temos de tomar cuidado, analise sujeita a muito erro, porque tem muitas etapas;
 Análise realizada em duplicata é o mínimo do mínimo;

MÉTODO KJELDAHL
DETERMINAÇÃO ATRAVÉS DO “N” TOTAL
 O nitrogênio da amostra é transformado em amônia, o qual é posteriormente separado
por destilação e finalmente dosado por titulação.
 Ocorre em 3 etapas:
o Digestão, etapa mais demorada;
o Destilação, para separar o nitrogênio;
o Titulação, para quantificar o nitrogênio;

IMPORTÂNCIA DO FATOR DE CONVERSÃO

 Este método determina N orgânico total, isto é, o N proteico e não proteico orgânico.
o Se tiver algum outro constituinte, este é contabilizado;
 Porém, na maioria dos alimentos, o N não proteico representa muito pouco no total.
o Por exemplo, no trigo esta razão é afetada pela variedade, condições de crescimento e
quantidade do tipo de fertilizante utilizado;

DIGESTÃO (1° etapa):

 Uma análise que precisamos de mais cuidados;
 Separação: nitrogênio das proteínas:
 Aquecimento da amostra com ácido sulfúrico para digestão até que o carbono e hidrogênio
sejam oxidados;
o Concentração PA maior que tem, para oxidar todos os componentes;
 O nitrogênio presente de origem orgânica é convertido em amônia;
o Vamos determinar na verdade a amônia no alimento;
 Usa-se um catalisador para acelerar o processo; 
 Temos o suporte, os frascos, tubos Kjeldahl e os chamado blocos digestores;

 Essa análise tem muitas fontes de erro, então é necessário fazer duplicata, triplicata, então por isso
convém usar esse equipamento (blocos digestores), pois dá para fazer maiores quantidades;
 Empresas que trabalham com análise fazem com maiores quantidades, o balão é como se fosse
análise independente e não podemos fazer mais de uma vez;
 Micro kjeldahl quando a amostra é de 10 - 20 mg;
 Macro Kjeldahl quando a amostra é de 1-5 g;
 Amostra com muitas proteínas não posso pegar amostra pequena;
 O nitrogênio da proteína é reduzido e transformado em sulfato de amônia.
 Digestão com H2SO4, K2SO4 e catalisador metálico;
o Degradar, carbonizar toda a amostra para liberar os componentes; 
o Deve haver ácido sulfúrico em excesso, pois se tiver pouco, amônia vai embora (ou seja,
perdemos a amônia);
 Esta é uma fonte de erro!!
 Reações envolvidas na análise;
 Matéria Orgânica → H SO +SO + CO + H O + (NH ) SO
2 4 2 2 2 4 2 4

o O que nos interessa é o sulfato de amônia;

 Compostos vão sendo oxidados e libera amônia;
CATALISADORES
Algumas substâncias não se decompõem à temperatura normal de ebulição do H2SO4;
 A temperatura de ebulição do ácido sulfúrico é 180°C e precisamos de alguns catalisadores para
levar a temperatura de ebulição do ácido sulfúrico;
 Sulfato de potássio ou de sódio (elevação do PE. do H2SO4, de  180°C para 400°C). Mesmo
assim, a oxidação da matéria orgânica ainda é relativamente lenta.
 Catalisadores acabam elevando o ponto de ebulição para 400°C!
 Praticamente todos metais da tabela periódica foram testados na digestão da amostra, porém
mercúrio, cobre e selênio foram os que apresentaram melhores resultados.

ADIÇÃO DE SULFATO DE POTÁSSIO

 O excesso de sulfato de potássio pode causar decomposição por excesso de
aquecimento, com perda da amônia.
o Se perder a amônia, aparece uns cristais e fica seco dentro do tubo;
 A temperatura da digestão deve ficar entre 370ºC e 410ºC.
o Temperatura ótima para não degradar a amônia. 
o Trabalhamos com 380° para segurança. 
 Poderíamos fazer com 300°C, porém ia demorar pra caramba, 410°C é o limite já
pode ter perda de amônia. 
 Não deve ultrapassar essa temperatura, se for menor que isso demora muito a
análise.
 Pode ser acelerada pela adição de agentes catalisadores ou oxidantes. Os sais de cobre
(Cu SO4.H2O) e selênio metálico são os mais comumente usados.
 Esses catalisadores são muito usados até hoje;

COBRE
 É o menos eficiente de três catalisadores e só tem problema de limite de aplicação pela sua
toxicidade.
MERCÚRIO
 É melhor que o cobre como catalisador, porém é necessária uma etapa a mais no método
para separar o complexo de mercúrio-  amônia formado.
o Bem perigoso, pode entrar na corrente sanguínea e não temos mecanismo de remoção;
o Acelerava mais a reação e dava mais trabalho, pois o mercúrio reage com amônia e
formava um complexo mercúrio-amônia e depois precisava fazer a separação desses
componentes, a fonte de erro aumentava.
 Esta separação é feita pela precipitação do mercúrio com tiossulfato de sódio ou de
zinco.
o Acrescentava mais uma etapa, gastando mais reagente, mais tempo, com maior fonte de
erro;
SELÊNIO
 É o mais polêmico dos três catalisadores.
o Questão da toxicidade;
o É necessário em quantidades pequenas;
 Tem efeito mais rápido do que o mercúrio e não necessita de separação após seu
uso.
 Pode haver perda de N se ele for utilizado em excesso ou se a temperatura de
digestão não for cuidadosamente controlada.
o Tomar cuidado pois ele acelera muito a reação, a pro não utiliza em aula, porque se
esquecer de ligar a capela pode matar todo mundo kk, é muito tóxico.
 As condições são mais críticas que para o mercúrio e o cobre.

COMBINAÇÃO DE CATALISADORES
 Promove melhor efeito associativo, do que cada um dos catalisadores separadamente.
 O uso da mistura Hg- Cu ou Cu-Se não acarreta perda de nitrogênio, desde que a
concentração do sulfato seja alta.
 Combinação mais comum:
o 100 partes K2SO4 ou Na2SO4
o 1 parte de CuSO4.H2O
o 0,8 partes de Se metálico (pó)
  Quem trabalha muito com proteína, eles misturam esse pó e vão vendo se dá certo, mas tem
como comprar pronto essas misturas;

 Essas é uma das mais conhecidas, a Missouri é mais adequada para uso escolar porque não é tão
tóxica;

DIGESTÃO
 Dependendo da demanda do laboratório, posso ser um bloco digestor com mais tubos;
 Quando acaba a digestão, fica uma cor verde brilhante;

 Imagem- pesagem da amostra pastosa com o auxílio do papel manteiga; 

o Deixar ele bem no meio para não queimar;
 Geralmente, o sulfato de cobre sempre está junto nestas composições de catalisadores, então a
coloração pode variar a tonalidade de verde;
 
DESTILAÇÃO

 Tem uma caldeira que gera calor. 

o O calor da caldeira passa por um tubo interno, que vai ter contado com o tubo azul;
 O tubo azul é o tubo utilizado na análise.
 Em cima, tem um copo medidor que vai estar preenchido de base;
 Destilador;
 Controlamos temperatura e entrada de água (que enche a caldeira)
o CALDEIRA SEM ÁGUA QUEIMA!
o Sempre consultar o nível da caldeira. PARTE MAIS VALIOSA DO EQUIPAMENTO;
 Conseguimos analisar visualmente o nível da caldeira;
  A água serve para duas coisas: circular pelo destilador e gerar calor;
DESTILAÇÃO SEPARA A AMÔNIA;
 A amostra é transferida para um aparelho de destilação onde acrescenta-se um excesso de
hidróxido de sódio.
 A amônia que quando em meio ácido estava sob a forma de (NH ) SO  (não volátil) passa a
4 2 4

forma de NH3, pode então ser destilada e recolhida em solução ácida.

o Qual a função do hidróxido de sódio?
o O hidróxido de sódio neutraliza o ácido sulfúrico, que concentração seria necessária para
neutralizar o ácido?  
 O hidróxido de sódio PA é sólido, em formato de lentilhas (então não dá para usar ele em PA); 
 Quando fazemos uma titulação ácido base, é uma reação exotérmica (como temos em pequena
quantidade, quase não é perceptível);
o Se adicionássemos o hidróxido de sódio PA, a solução ficaria espirrando, por conta da
reação exotérmica.
 Utilizamos uma concentração de 40%. 
o Ir dosando bem devagar, pois nesta concentração já é bem aparente a reação exotérmica;
o Utilizar EPIs necessários;
 A amônia, quando em contado com meio ácido, ocorre a neutralização e, acaba desaprendendo a
amônia, e como esta estaria volátil, acompanha os valores de água, e vai sair pelo tubo de
destilação;
 No método original, a amônia liberada da amostra é recolhida em ácido padronizado.
o Precisamos fixar para contabilizar;
 Na modificação, o recolhimento é feito em excesso de ácido bórico.
o Recolhemos no excesso do ácido bórico, formando borato de amônia;
 O borato de amônia formado é que vai ser titulado com um ácido padronizado.

Esta modificação é vantajosa no sentido de que será necessário somente uma solução
padronizada.
 Nem a quantidade (cerca de 50 mL), nem a concentração (cerca de 4%) de ácido bórico
necessitam ser precisas.
o Não precisa ser uma quantidade exata.

Reações Envolvidas:
(NH ) SO + 2NaOH → 2 NH OH + Na SO
4 2 4 4 2 4

NH OH → NH + H O
4 3 2

 NH3 é recolhido em um recipiente contendo H3BO3 com indicador (vermelho de metila e

 verde de bromocresol).
NH + H BO → NH H BO (Borato de Amônia)
3 3 3 4 2 3

 Utilizamos 2 indicadores de uma vez!

 O ácido bórico vai reagir com amônia, formando o borato de amônia. 
 Como eu sei que acabou a destilação? 
o Destilar até dobrar o valor no erlen em mais um pouco, ou seja, uns 220 mL;
 Início: vermelho (pH ácido);
 Final: verde (pH alcalino);
 No erlen, colocamos 100 mL de ácido bórico na concentração de 4% (pode ser 2 %, mas
para garantir que não tenha merda, melhor 4%);
o 100 mL dá para reagir com a amônia e sobra!
 O objetivo do ácido bórico é apenas recolher a amônia;
 A haste do destilado deve ficar mergulhada no ácido bórico, para a amônia não se
perder;

TITULAÇÃO - DIRETA
 Usa-se ácido bórico para recolher a amônia.
 Ocorre a formação de borato de amônia.
 A amônia é titulada diretamente por um ácido forte padronizado que desloca a amônia da
molécula de borato.
o Geralmente utiliza-se HCL 0,1 N com fator de correção; 
 REAGENTE PADRONIZADO;
 O cálculo neste caso é direto, sendo o número de equivalentes do ácido consumido igual ao
número de equivalentes da amônia.
  O ácido bórico empregado não é padronizado e seu volume não precisa ser conhecido
exatamente.
o Pois na titulação com HCL, ele dissocia esse sal. Amônia vai para o ambiente e muda a
coloração;
o N início da destilação, a solução estará cm uma coloração vermelha, ao final da destilação,
fica verde. Ao final da titulação, é esperado a cor vermelha de volta, pois o pH fica ácido.
 Vermelho menos intenso;
o Lembrando que no erlen vai ter 220 mL aproximadamente;

Na teoria, se não temos um destilador, podemos criar um!

INDICADOR UTILIZADO
Misturam-se 30 mL de solução alcóolica de verde bromocresol a 0,1% e 20 mL de solução alcoólica de
vermelho de metila a 1%

Manual de instruções- destilador

Componentes do destilador:
1 - Copo medidor- onde vai o hidróxido de sódio;
2 - Torneira dosadora
3 - Piloto de aquecimento- lâmpada que quando o aquecimento ta aquecendo, este acende 
4 - Piloto do nível- da caldeira 
5 - Controle de aquecimento
6 - Ligar o aquecimento- botão para ligar 
7 - Liga o nível- quando a caldeira está com nível baixo (luz apaga), a água é desviada para lá, quando a
caldeira atinge o nível adequado, acende uma luz, e devemos desligar a entrada de água, para não
transbordar;
8 - Liga/desliga geral- ligamos assim que ligamos o equipamento;
9 - Adaptador do tubo -  aqui encaixamos o tubo muito bem para não vazar os vapores 
10 - Janela do nível- consegue visualizar o nível da caldeira de 2 maneiras: pela janela e pela lâmpada
apagada. TOMAR CUIDADO PARA NÃO QUEIMAR A CALDEIRA;
11 - Tubo da amostra- tubo de kjeldahl.
12 -  Macaco suporte
13 - Mesa de destilado 
 Tomada 220V
 Dreno- se a caldeira está suja, conseguimos tirar o pino;
 Preparar a caldeira- quando ligamos a chave geral→ luz acesa- nível da caldeira adequado;

Sempre ler as instruções antes:

Tópico g (inexistente)- no manual, não está escrito que precisamos ligar o aquecimento.
EXERCÍCIO
1. Na determinação de proteína de uma amostra de bolo de chocolate,  obtendo-se os seguintes
valores:
 Volume de HCl 0,1N gasto na titulação = 6,80 mL; 
 Dados: N = 14
 Peso da amostra 1 = 0,2234 g
Qual o teor de proteína?
Vai ficar vermelho rosadinho, depois da titulação fica verde e depois volta a ficar vermelho
Se o exercício não der o fator de correção, colocamos 1!
Como queremos encontrar o nitrogênio;
Neq ácido = Neq base
f. Na.Va=mNPmN
mN- massa de nitrogênio
PmN- peso molecular nitrogênio
PmN= 14 (sempre)
0,1.6,80.10-3= mN/ 14
mN= 0,00952g(no peso de amostra)
mN= 0,00952g ----------> 0,2234g
x---------------> 100g
x=4,26% 
Como transformar essa porcentagem em proteína?
x=4,26%  x  6,25 = 26,63% de proteína

2. Na determinação de proteína de uma amostra, obtendo-se os seguintes valores: Volume de HCl

0,1 N gasto na titulação = 3,7 mL; Dados: N= 14
 Peso da amostra: I= 0,2555 g
 Qual o teor de proteína?
Neq ácido = Neq base
f. Na.Va=mNPmN
mN- massa de nitrogênio
PmN- peso molecular nitrogênio
PmN= 14 (sempre)
0,1.3,70.10-3= mN/ 14
mN= 0,00518g(no peso de amostra)
mN= 0,00518g ----------> 0,2555g
x---------------> 100g
x=2,03% 
Como transformar essa porcentagem em proteína?
x=2,03%  x  6,25 = 12,7% de proteína

Experimento: digestão das proteínas

 Nossa opção é usar o tubo Kjeldahl;
 Colocamos a amostra dentro deste tubo, com o catalisador e ácido sulfúrico;
 Ligamos o bloco digestor (220V);
 A princípio, este bloco digestor foi feito para ficar fora da capela, pois há um encaixe de um caninho
para utilizar a circulação de água.

1. Pesar a amostra;
 Amostra escolhida: farinha de trigo, geralmente tem mais de 10% de proteína;
 Faremos a análise em duplicata;
 Utilizou o micro Kjeldahl;
o Se a amostra tiver pouca proteína tenho de fazer 1 a 5 g (macro Kjeldahl);
 Pesar em balança analítica, anotando todas as casas decimais pois dá muita diferença;
Adição de amostra no tubo:
 Devemos garantir que o tubo esteja bem seco, para que não fique amostra grudada no fundo;
 Na hora da pesagem, podemos utilizar o auxílio do papel manteiga, e colocar junto para realizar a
análise (para amostras pastosas);
o O papel não tem quantidades significativas de nitrogênio, então este se decompõe
completamente no ácido sulfúrico;
2. Adicionamos o ácido sulfúrico dependendo da quantidade de amostras;
 Geralmente 10 a 15 ml de ácido sulfúrico para evitar perda da amostra;
 Quantidade não é tão rígida;
 Dependendo da amostra já esquenta o tubo;
 Ficar de olho na cor;
o Vai escurecendo, ficando um marrom! Sem o catalisador;
o Teria que usar temperaturas abaixo de 180°C sem o catalizador;
3. Adição do catalisador;
 Temos algumas opções;
o Em pastilhas, parece uma bala;
 Aumenta a temperatura do ácido sulfúrico (de ebulição), aumentamos a temperatura e aceleramos
o processo para degradar os componentes;
o Por isso precisamos do excesso de ácido sulfúrico, para reagir totalmente com amônia;
o A temperatura de ebulição é 400°C, mas usamos por volta de 380°C para não ter risco de
perdas;
o O vidro de kjeldahl tem sílica e resistência a essas temperatura, mas devemos ir ligando e
aumentando paulatinamente para não quebrar o vidro;
4. Colocar no bloco digestor e deixar lá.
 Mesmo com o catalisador, geralmente demora mais de um dia;
 Mesmo sendo feito para ficar fora da capela é mais seguro que fique lá dentro;
 Deixar a temperatura constante por mais tempo possível para acelerar o processo;
 Equipamento para controlar a temperatura, sobe gradativamente;
 Vai ficar bem preto. Vai digerindo até a solução ficar totalmente límpida, translúcida;
 Quando está quente a solução fica meio esverdeada e ao esfriar fica levemente azulada por causa
do sulfato de cobre;
 Ela aumentou até 160°C, ela vai chegar até 380°C;
 O vidro é próprio para aquecimento.
  Catalisador- usa uma quantidade bem pequena aumentar o ponto de ebulição de 180° para
400°C, conciliando o aquecimento da amostra com o poder do ácido sulfúrico para reação
com o nitrogênio;
 A imagem da solução preta- proteína foi carbonizada.
 Na imagem do meio, há a fumaça branca, como mencionado acima;
 A imagem da solução verde- proteína foi digerida.

Destilação
 Não podemos esperar muito para destilar, pois pode ocorrer a formação de cristais e perde de
nitrogênio;
 Colocar 2 dedos de água destilada (ir limpando as paredes do tubo);
o Estamos colocando água no ácido, reação vai aquecer!
o Fazemos isso para diluir um pouco o ácido!
 Verificar se a torneirinha do copo dosador está fechada para adicionar o hidróxido de sódio;
o Adicionar mais ou menos na metade do copo;
 Encaixa o tubo no equipamento
 Adicionar Ácido bórico→ 100 mL; 
o Não precisa de um volume específico, deve ser suficiente para a haste ficar submersa; 
 Colocar gotinhas do indicador, verde de bromocresol e vermelho de metila, umas 6/7;
o Por que quando dilui fica muito clarinho (neste caso, o indicador estava muito diluído);
 Abrir a chave para neutralizar a amostra com o ácido;
o Tomar cuidado, pois é uma reação exotérmica;
o Se a reação for muito intensa, pode correr que os vapores sejam direcionados para a
caldeira, e perdemos a amostra;
o Ir abrindo e fechando a torneira, para neutralizar;
o Sabemos que foi totalmente neutralizado quando a solução ficou com coloração preta!
o Como é só uma amostra que vamos fazer, podemos jogar todo o reagente (base) na
solução para neutralizar;
 Devemos limpar o copo dosador com água destilada, pois estamos trabalhando com
uma base forte.
 Essa água cai no tubo.

 Ligar o aquecimento;
 Junto com o vapor de água, vai arrastar a amônia, e esta vai reagir com a solução do erlen.
 Paramos a destilação quando o volume no erlen dobrar;
 Não podemos chegar em um aquecimento muito intenso!
 O vapor é empurrado pelas bolinhas fragmentadoras;
 Abaixar o erlen;
 E depois desligar o aquecimento.
 o Se deixar esfriar com a haste dentro do erlen, pode ocorrer de refluxar (voltar para a
solução no tubo);
 O indicador da prof estava meio zuado, o que fez com que a solução dentro do erlen ficasse
amarelada ao final da destilação. Mas não tem problema! Ela vai corrigir adicionado mais indicador;
 Esperar o tubo esfriar um pouco para desconectar e retirá-lo do destilador;
o A solução deve ser descartada de maneira adequada!

Titulação
 Ácido clorídrico (HCL)- 01 N
o Fator de correção (fa)- 1,0298
 Fazer a titulação com o ácido na bureta!
o Fazer a lavagem na bureta (passar o ácido uma vez para ambientação);
 Foi 25 ml de ácido, e não virou ainda; Adicionou 50 mL e não virou.
 Algum reagente estava estranho.
 O normal era ficar vermelho ao final da titulação (voltar para a cor vermelha inicial):
 Vamos realizar o cálculo inverso, para saber quando gastaríamos de reagente;

Quantidade de proteína na farinha: 

 10g de proteína em 100 g de farinha
Ne ácido = Neq Nitrogênio
Na.Fa.Va=mN/14
Fator de conversão farinha = 5,75
mN.5,75 = 10
mN= 1,7391

Na aula passada, pesamos 0,4503 g de farinha de trigo para realizar a digestão!

1,7391 g ---- 100g
mN ---- 0,4503 g
mN = 0,00783g
0,1.1,0298.Va=0,00783/14
Va= 5,43 x 10³ L
Va = 5,43mL

Sempre que fomos fazer, chamar um técnico e ter manual!