Princípios e Métodos de

Determinação de Proteínas
em Alimentos
Nitrogênio Aminoácidos
COOH Aromáticos

H
NNH
3

Cadeia Lateral dos

Ligações Aminoácidos
Peptídicas
Nitrogênio Aminoácidos
COOH Aromáticos

H
NNH 3 Determinação de
R Nitrogênio pelo Johan Gustav Christoffer
Thorsager Kjeldahl
(1849 – 1900)
Método de Kjeldahl

Cadeia Lateral dos

Ligações Aminoácidos
Peptídicas

Johan Kjeldahl on the 1880s Carlsberg Laboratory

working at Carlsberg Laboratory
Método de Kjeldahl:

 Estima o teor de proteínas pela

concentração de nitrogênio na
amostra.

 Compreende três etapas principais :

✓ Digestão
✓ Destilação
✓ Titulação
Esquema geral do método de Kjeldahl

✓ 1ª Etapa: Digestão

 amostra
 catalisador
 H2SO4

380°C
Esquema geral do método de Kjeldahl

✓ 1ª Etapa: Digestão

H2SO4
Mat. Org. SO2 + CO2 + H2O + R-NH2

H2SO4
R- NH2 + H2O R – OH + NH3

2 NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4

 amostra
catalisador
 (NH 4)2SO4
 H2SO4

380°C
Esquema geral do método de Kjeldahl

✓ 2ª Etapa: Destilação

NaOH
Esquema geral do método de Kjeldahl

✓ 2ª Etapa: Destilação

(NH4)2SO4 NaOH 2 NH4OH + Na2SO4

NH4OH NH3 + H2O

NH3 + H3BO3 NH4H2BO3

Esquema geral do método de Kjeldahl

✓ 3ª Etapa: Titulação

HCl

NH4H2BO3 + HCl  H3BO3 + NH4Cl

NH4H2BO3
Anotar o volume
de HCl gasto na
titulação e calcular!
Esquema geral do método de Kjeldahl

✓ Cálculos
mg de N= (V - VBr) . M . 14,007

Onde:
V = volume de ácido gasto na titulação
VBr = volume de ácido gasto na titulação do branco
M = molaridade real do ácido
Até aqui = mg de Nitrogênio na amostra,
E então converte-se com base no fator de conversão:

100 g de proteína------16 g de nitrogênio

X g de proteína ------- 1 g de nitrogênio
então: X = 100/16 = 6,25
mg Proteína = mg N x fator de conversão
% de Proteínas = mg Prot. X 100/mg de amostra
Fórmula completa da determinação pelo de Kjeldahl

% de Proteínas = (V-VBr) . M . 14. 6,25. 100 / mg de amostra

Onde:
V = volume de ácido gasto na titulação
VBr = volume de ácido gasto na titulação do branco
M = molaridade real do ácido

Observar que 6,25 é o fator médio de conversão de Nitrogênio em

Proteínas.
Caso exista um fator específico, devemos utilizá-lo
 CARACTERÍSTICAS
DETERMINAÇÃO INDIRETA

LIMITAÇÕES
• TAMANHO DA AMOSTRA
• DEMORADO
• GRAU DE DIFICULDADE
•VARIAÇÃO ENTRE CLASSES DE
PROTEÍNAS
TABELA – TEOR PROTÉICO DE ALIMENTOS (ERROS NO USO DO FATOR 6,25)

CALCULADO
ALIMENTO % N NA % N NO
PROTEÍNA ALIMENTO N X FATOR N X
6,25 ESPECÍFICO FATOR
TRIGO (ENDOSPERMA) 17,5 1,39 8,7 5,70 7,9
TRIGO (FARELO) 15,8 2,45 15,3 6,31 15,5
TRIGO (GRÃO) 17,2 2,06 12,9 5,83 12,0
AVEIA (GRÃO) 17,2 1,68 10,5 5,83 9,8
MILHO (GRÃO) 16,0 1,54 9,6 6,25 9,6
FARELO DE ALGODÃO 18,9 5,82 36,4 5,30 30,8
FARELO DE LINHO 18,9 5,82 36,4 5,30 30,8
AMENDOIM 18,3 4,13 25,8 5,46 22,5
LEITE 15,8 0,53 3,3 6,38 3,4
OVO, CARNE 16,0 - - 6,25 -
GELATINA 18,0 1,46 91,4 5,55 81,2

CHAMPTON & HARRIS. Apllied Animal Nutrition, 1969, 2ª ed.

Fatores específicos adotados pela TBCA:
 Determinação de
Nitrogênio pelo
Jean Baptiste DUMAS
(1800-1884)
Método de Dumas
Esquema geral do Método de Dumas:

Forno
1050°C

O2

Receptor dos Reação

gases da Catalisador Integrador
combustão (Cobre)
Detector

He
 Determinação de Proteínas por
Métodos Colorimétricos

-interação cobre-ligação peptídica

- complexação com substâncias corantes

Determinação de Proteínas pela
reação do Biureto
Método do Biureto
(Allan G. Gornall, Charles J. Bardawill & Maxima M. David. DETERMINATION OF
SERUM PROTEINS BY MEANS OF THE BIURET REACTION. Journal of
Biological Chemistry, p.751-766, fev 1949.)
Reagente:
- (0,15 %) 1,5 g de CuSO4.5 H2O
- 6,0 g de tartarato duplo de sódio e potássio. 4 H2O + 1,0 g de KI.
- Adicionar 300 ml de NaOH 10% e diluir a 1 litro.

1 ml de amostra + 4 ml de reagente
30 min temperatura ambiente  Leituras Abs = 550 nm
Método do Biureto

0,6
0,5

Abs 595 nm
0,4
0 mg 1 mg 2,5 mg 5 mg 7,5 mg 10 mg 0,3
0,2

Concentração de proteínas 0,1

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Proteínas (mg)
Método de Lowry
Lowry O.H. et al. Protein measurement with the Folin
phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, 1951.

Oliver Howe Lowry

(1910-1996)

Otto Knut Olof Folin

Método de Lowry
Lowry O.H. et al. Protein measurement with the Folin
phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, 1951.
1 - Reagente alcalino:
solução A: Na2CO3 10% em NaOH 0,1 N
solução B: 0,5 % CuSO4 5.H2O + 1 % tartarato duplo de sódio Oliver Howe Lowry
e potássio em H2O 1,0 ml amostra
(1910-1996)
+
solução C: mistura de 1 parte de B e 50 de A.
5,0 ml Reagente C
2 - Reagente de Folin-Ciocalteau (Reagente de Fenol):
100 g de Tungstato de sódio . 2H2O + 25 g Molibdato de sódio . 10 min temp ambiente
2H2O -----> Dissolver em 700 ml de água destilada e adicionar::
50 ml de ácido fosfórico xaroposo a 85% + 100 ml de ácido + 0,5 ml Reagente Folin
clorídrico concentrado -----> Colocar a solução em balão
adaptado com condensador de refluxo e aquecer durante 10 30 min
Otto temp.
Knut Olofambiente
Folin
horas. Esfriar e adicionar:: 150 g de Sulfato de lítio + 50 ml de
água destilada bromada -----> Colocar novamente para ferver
Leitura 750 nm
sem o condensador durante 15 minutos. Esfriar e diluir p/ 1 litro.
 Determinação de Proteínas pela
complexação com corantes

 Proteína se liga a compostos coloridos.

 Determina-se a intensidade de cor
produzida por este composto 
diretamente proporcional a concentração
de proteínas.
Método de Bradford
Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye
binding. Anal. Biochem. 72:248-254. (1976).

Proteína (cadeia lateral de alguns aminoácidos, como Lisina,

Arginina e Histidina

 Coloração
Azul

Corante Leitura em
595nm
 Determinação de Proteínas por
Absorção no Ultravioleta

 Medida direta de absorção de luz ultravioleta

da amostra.

 Compostos aromáticos absorvem luz UV.

 Relação direta Concentração - Absorvância.
 • NÃO DESTRUTIVO
• 280 nm - COEFICIENTE DE ABSORÇÃO
BAIXO
• DISTRIBUIÇÃO DOS AMINOÁCIDOS
• INTERFERENTES - COMO ÁCIDOS
NUCLÉICOS
 MÉTODOS IDEAIS

• ADAPTÁVEIS ÀS DIFERENTES ROTINAS

• RÁPIDOS
• APLICÁVEIS A PEQUENAS QUANTIDADES DE MATERIAL

• OBJETIVOS DA ANÁLISE
COMO ESCOLHER O
• SENSIBILIDADE
MÉTODO ???
• ESPECIFICIDADE

CRITÉRIOS PARA ESCOLHA ?

• TIPO DE MATERIAL (SOL./LIQ.)

• SENSIBILIDADE ?

• VARIABILIDADE ?

• INTERFERENTES ?

• GRAU DE DIFICULDADE E/OU FACILIDADE ?

• CUSTO (EQUIPAMENTO E/OU REAGENTE) ?