Análise de Proteína

Bromatologia
Prof. Msc Vinicius Rodrigues
Março/2015
Proteínas

Definição São polímeros de alto peso

molecular, cujas unidades básicas são
compostas por moléculas de α-
aminoácidos ligadas através de ligações
peptídicas.
Aminoácidos
 Proteína

 Maiores constituintes de toda a célula viva, cada uma

com uma função associada as atividades vitais;
 Nos alimentos, além da função nutricional, possui
propriedades sensoriais e de textura;
 Podem vir combinadas com lipídeos e carboidratos.
 Proteína

▪ C = 50 a 55%;
▪ H = 6 a 8%;
▪ O = 20 a 24%; Conteúdo das proteínas
▪ N = 15 a 18%;
▪ S = 0,2 a 0,3%.
Considerando que a maioria das proteínas tem 16% de
nitrogênio, o fator geral na transformação de nitrogênio
para proteína é de 6,25.

16 g de N 100 g de proteínas
n g de N x g de proteínas

x = (n. 100)/16 = n. 6,25 g proteínas

O fator de conversão pode gerar erros, quando o conteúdo
de N é muito diferente de 16%. Para isso existem fatores
de conversão especiais:
▪ trigo: 5,70;
▪ leite: 6,38;
▪ gelatina: 5,55.

→ Quanto mais nitrogênio menor o fator de conversão.

 Apesar da complexidade estrutural, as proteínas
podem ser quebradas em aminoácidos pela ação de
enzimas ou fervura com ácidos e álcalis, sob certas
condições.

 Nos alimentos, tendem a decompor à temperatura

ambiente, auxiliada pela ação bacteriana, podem
formar produtos tóxicos para o corpo, necessitando de
uma boa conservação.
 Proteína animal X Proteína vegetal.

 Funções biológicas: catalisadoras, regeneradoras,

imunologia, energia, reguladores, reprodução e etc.
Aminoácidos reagem com:
▪ ninidrila: simples e sensível para pequenas quantidades;
▪ oxidação: produzindo CO2 e amônia;
▪ metais: formando quelatos;
▪ ligações peptídicas: formando peptídeos e proteínas.

As propriedades de uma proteína são determinadas pelo

número e espécie dos resíduos de aminoácido e
sequência.
A degradação da proteína leva a formação de
aminoácidos (importância para as reações que ocorrem
nas determinações).
Algumas proteínas importantes nos alimentos:

▪ proteínas da carne: miosina, actina, colágeno, tripsina;

▪ proteínas do leite: caseína, lactoalbumina, lactoglobulina;

▪ proteínas do ovo: clara (ovalbumina, canalbumina,

glicoproteina) e gema (lipovitelina, fosfovitina, livitina);

▪ proteínas do trigo: prolamina e glutenina → GLÚTEN.

Metodologias para determinação das proteínas

1. Método de Kjeldal

Descoberto em 1883; mais utilizado para a determinação

de proteína.
Determina proteína através do nitrogênio total
- nitrogênio protéico e não protéico
- a quantidade de nitrogênio medido e a proteína estimada
irá depender do tipo de amostra
- cálculo do conteúdo protéico: multiplica-se o conteúdo
de nitrogênio pelo fator arbitrário (5,7: trigo e 6,25 para os
demais alimentos)
Princípio: baseia-se na determinação do
conteúdo de nitrogênio da amostra após o
processo de digestão, onde a matéria orgânica é
decomposta e o nitrogênio existente é finalmente
transformado em amônia para posterior reação
com o ácido bórico e quantificação através da
titulação.
Ocorre em três etapas:
 Digestão
 Destilação
 Titulação
Metodologias para determinação das proteínas

1. Método de Kjeldal

Aquecimento da amostra com H2SO4

Redução do N em sulfato de amônia
Adicionar NaOH concentrado e aquece
Liberação da amônia

Recolhimento da amônia: solução de ácido bórico

Titulação com HCl

Digestão – a amostra é submetida a elevadas
temperaturas com adição de ácido sulfúrico e catalisadores
para digestão de sua matéria orgânica.

Todo o nitrogênio da amostra é transformado em sal

amoniacal.

Proteína + H2SO4 + Catalisador + Aquecimento →

(NH4)2SO4

CuSO4 = catalisador
K2SO4 = aumenta o ponto de ebulição da mistura
Digestor
Destilação – A amônia é liberada do sal amoniacal
pela reação com hidróxido de sódio e recebida
numa solução ácida de volume e concentração
conhecidos.

(NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O

NH3 + H3BO3 → NH4 + H2BO3-
(ac. bórico) (borato)
Destilador
de
Nitrogênio
de
Kjeldahl
Titulação – Determina-se a concentração de N
presente na amostra titulando-se o excesso do
ácido utilizado na destilação.

A quantidade de íon borato é proporcional à

quantidade de nitrogênio.

H2BO3- + H+ → H3BO3
• Transformar o volume de ácido utilizado em nitrogênio (1 mL de
HCl 0,02N = 0,2802 mg de nitrogênio)
• Aplicar o fator de correção para descontar o conteúdo de
nitrogênio não protéico da amostra.
• A porcentagem de proteína é dada pela fórmula:

%P = V x 14 x FN x F x 100 x 0,02
p

Onde:
- V é o volume de ácido utilizado na titulação menos o volume do
branco (em ml)
- FN fator de conversão N  Proteína (varia de acordo com a fonte
protéica, principais valores na tabela abaixo).
- F é o fator de correção do ácido
- p é o peso da amostra (mg)
Fatores de conversão de N total em proteína
Metodologias para determinação das proteínas

1. Método de Kjeldal

Cálculos
No. de miliequivalentes do HCl = No. Miliequivalentes do
nitrogênio mL do ácido x normalidade do ácido = peso N
(g) / meq do N

− Peso N (g) = mL do ácido x normalidade do ácido x

0,014
− Peso N (mg) = mL do ácido x normalidade do ácido x 14
− % N x fator = % proteína total
Metodologias para determinação das proteínas

1. Método de Kjeldal

Variações no método

• Adição de catalisadores
•Mercúrio, cobre, selênio
• Adição de sulfato de potássio
•Ácido bórico
Metodologias para determinação das proteínas

2. Método de Dumas

Determina N total
Combustão da amostra a 700 - 800 º.C
Erros: quantidade de amostra pequena

3. Método por biureto

Substância com duas ou mais ligações peptídicas formam

complexo de coloração roxa com sais de cobre em
soluções
alcalinas
Intensidade da cor: quantidade de proteínas
Metodologias para determinação das proteínas

3. Método por biureto

 vantagens:
não apresenta problemas com interferentes
simples, rápido e barato
determinação de proteína e não de N total

 desvantagens:
curva de calibração de um padrão conhecido
cor formada: não é idêntica para todas as proteínas
Metodologias para determinação das proteínas

4. Método por fenol (Follin – Ciocalteau – Lowry)

Determinação colorimétrica
Fundamento: interação das proteínas com o reagente de
fenol e cobre em soluções alcalinas;
oxidação de aminoácidos por um reagente
heteropolifosfato (fosfotungístico) = coloração azul
 vantagens: mais sensível que o biureto
bastante específico; pouco são os interferentes
 desvantagens: intensidade de cor = variação baseada
na composição de aminoácidos, lento.
Metodologias para determinação das proteínas

4. Métodos turbidimétricos

Turbidez visualizada pela precipitação de proteína

Agentes precipitantes: ácido tricloacético; ferrocianeto de
potássio e ácido sulfosalisílico
 vantagens: rápido e simples para amostrar líquidas
 desvantagens: amostras sólidas: não é recomendado
pode ocorrer precipitação de outras substâncias com as
proteínas
calibração com padrões de proteínas
Metodologias para determinação das proteínas

4. Métodos Dye-Binding

Tratamento da amostra com excesso de corante

(indicador)
Formação de um complexo insolúvel, mas que é separado
por centrifugação ou filtração
Excesso de corante: é medido colorimetricamente
(espectrofotômetro)
Metodologias para determinação das proteínas

4. Métodos Dye-Binding

Quantidade de proteína: obtida indiretamente por

diferença

Alimentos: grão de cereais, sementes oleaginosas,

produtos vegetais e animais e derivados de leite
corantes: laranja G, laranja 12, vermelho A, preto búfalo e
preto amino 10B
Metodologias para determinação das proteínas

4. Métodos Dye-Binding

 Vantagens: simples, rápido, exato e econômico

 Desvantagens: uso de equipamento próprio

5. Métodos físicos
Não muito usados
Metodologias para determinação das proteínas

Espectrofotometria UV

 Vantagens:
simples, rápido, não destrutivo

 Desvantagens:
Dependente da concentração de aminoácidos
aromáticos;
Ácidos nucléicos podem interferir.