UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAIBA

CENTRO DE CIÊNCIAS HUMANAS, SOCIAIS E

AGRÁRIAS
CURSO DE BACHARELADO EM AGROINDÚSTRIA

DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS

DISCIPLINA: ANALISE FISICO-QUIMICA DOS ALIMENTOS

PROFESSORA: AMANDA SANT’ANA

Bananeiras, PB
 PROTEÍNAS

São os maiores constituintes de toda célula viva,

e cada uma, de acordo com sua estrutura
molecular, tem uma função biológica associada
às atividades vitais
 PROTEÍNA
Função biológica
▪ Elementos estruturais (colágeno) e sistemas contráteis;
▪ Armazenamento (ferritina);
▪ Veículo de transporte (hemoglobina);
▪ Hormônio;
▪ Enzimática;
▪ Nutricional;
▪ Agentes protetores (imunidade).
PROTEÍNA
Quantidade e qualidade →
proteína de alto valor
biológico
 PROTEÍNA
Teor de proteína em alguns alimentos usuais e sua classificação como fonte
de aminoácidos essenciais para a nutrição humana.
Proteína (%) Classificação Alimento
30-44 incompleta Soja
20 – 25 incompleta Feijão
6 – 10 incompleta Arroz
8 – 11 incompleta Milho
8 – 15 incompleta Trigo
3,5 completa Leite de Vaca
12 completa Ovos de Galinha
15 – 25 completa Carne de Mamífero
18 – 20 completa Carne de Galinha
20 – 35 incompleta Amendoim
20 – 24 completa Crustáceos e Peixes
 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM
ALIMENTOS
-‐Determinação de um elemento químico (C, N);
-‐Determinação de grupo específico da proteína (aminoácido,
ligação peptídica).
A conversão para conteúdo de proteína é feita através de um
fator.
 ANÁLISES ELEMENTARES

DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS
EM ALIMENTOS
• ANÁLISE DE NITROGÊNIO: determinação mais utilizada

• Mais usual: método de Kjeldahl (1883), alta aplicabilidade e

reprodutibilidade;

• Determina Nitrogênio orgânico total (Nitrogênio proteico +

aproteico);

• Maior parte do Nitrogênio do alimento: na forma de aminoácidos,

formando proteínas. Entram no total: Nitrogênio da fração
aproteica, Nitrogênio proveniente de aminoácidos não proteicos,
ácidos nucléicos, lipídios, pigmentos e carboidratos nitrogenados.
 ANÁLISES ELEMENTARES

DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS
EM ALIMENTOS

Análise de nitrogênio

•Considera que as proteínas tem 16% de nitrogênio em média;

•Fator geral na transformação de nitrogênio para proteína é de
6,25, se levarmos em conta apenas o N das ligações peptídicas

Este fator de conversão gera erros quando o conteúdo em N de algum alimento é

muito diferente de 16%. Nestes casos, existem os fatores de conversão específicos
para cada alimento.
 ANÁLISES ELEMENTARES

DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS
EM ALIMENTOS
Análise de Nitrogênio
▪ O Fator geral na transformação de nitrogênio para proteína é de
6.25.
16g N -------- 100 g proteínas
ng N -------- X g proteínas
16 X = n x 100
X = n x 100/16
X g de proteínas = n x 6,25 g proteínas
▪ O teor de proteína bruta de um alimento é obtido pela
multiplicação do teor de N - total pelo fator de conversão (6,25).
▪ Erros – Conteúdo em N muito diferente de 16%
▪ Fatores de conversão específicos:
➢ Trigo: 5,70
➢ Leite: 6,38
➢ Gelatina: 5,55
 ANÁLISES ELEMENTARES

DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ALIMENTOS

Fatores de conversão (FAO/WHO, 1973) (Tabela de composição -USP e legislação)
Produtos animais Fator Produtos vegetais Fator
Carne e peixe 6,25 Trigo: inteiro 5,83
Gelatina 5,55 farelo 6,31
Leite e derivados 6,38 germe 5,80
Caseína 6,40 endosperma 5,70
Leite humano 6,37 Arroz e farinha de arroz 5,95
Ovos: inteiro 6,25 Centeio e farinha de centeio 5,83
clara 6,32 Cevada e farinha de cevada 5,83
gema 6,12 Aveia 5,83
Milheto 6,31
Milho 6,25
Feijão 6,25
Soja 5,71
Amêndoa 5,18
Amendoim 5,46
 ANÁLISES ELEMENTARES

MÉTODO DE KJELDAHL

Desenvolveu em 1883 o processo básico para

determinação de nitrogênio orgânico total. Os
passos incluem:

Johann Kjeldahl •Digestão: H2SO4 (conc.) a 350-400oC + catalisador

(1849-1900)
•Neutralização e Destilação
•Titulação

•Conversão do teor de N total para

teor de proteína
 ANÁLISES ELEMENTARES

MÉTODO DE KJELDAHL
• Determina: N orgânico total:
▪ N proteico e não-proteico orgânico

Muito pouco no
1849-1900
total

▪ N medido/Proteína estimada – depende do tipo da amostra e

outros fatores;
 ANÁLISES ELEMENTARES

DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ALIMENTOS

• Princípio: Nitrogênio é transformado em amônia,

separado por destilação e dosado por titulação.

• Para conversão do valor para proteína considera-se

média do teor de Nitrogênio (ver Tabela);

• Quando não é dado valor específico, considera-se 16%

de Nitrogênio na composição da proteína;
 ANÁLISES ELEMENTARES

MÉTODO DE KJELDAHL
• Metodologia Kjeldahl: digestão, destilação e titulação.

1 ETAPA - Digestão:
• Amostra + ácido sulfúrico concentrado e catalisador (cobre é o mais
usado);

• Aquecimento em chapa elétrica até aproximadamente 400ºC até a

decomposição da substância orgânica: amostra: límpida e esverdeada;

• Tempo: muito variável dependendo do tipo e quantidade de amostra;

• T: início ± 150ºC ou menos e aumenta gradativamente para não perder

amostra (até entre 370ºC e 410ºC);
 ANÁLISES ELEMENTARES

MÉTODO DE KJELDAHL
Digestão → BLOCO DIGESTOR
 ANÁLISES ELEMENTARES

MÉTODO DE KJELDAHL
H2SO4 (conc.) + K2SO4
Proteína (NH4)2SO4
Sulfato de Amônia
Δ + catalisador

Sulfato de potássio - K2SO4 : Aumenta o Ponto de Ebulição do H2SO4 (de 337 para mais
de 400oC)

Digestão mais eficiente

Sulfato de cobre - CuSO4 : Catalisador. Acelera o processo de oxidação da matéria
orgânica

Mistura catalítica:
• 0,45 g Selênio (1);
• 4,5 g CuSO4(10);
• 45 g K2SO4 (100).
Amostra ANTES da
digestão

Amostra DEPOIS da
digestão
 MÉTODO DE KJELDAHL

2 ETAPA: Neutralização e Destilação

Hidróxido de Sódio Libera Amônia

(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O

Sulfato de Amônia Sulfato de Sódio e água

NH3 + H3BO3 NH4H2BO3

Ácido bórico
Borato de amônia

O sulfato de amônia em meio alcalino libera a amônia

que vai ser retida na solução de espera de ácido bórico,
formando borato de amônia.
 MÉTODO DE KJELDAHL
A titulação é realizada com ácido clorídrico 0,1 N,
que reage por equivalência com o borato de amônia
ETAPA 3 Titulação até coloração rósea ou avermelhada.

Ácido – até o ponto de viragem

Borato de Amônio

NH4H2BO3

H3BO3+NH4Cl
Borato Cloreto de Amônio
 ANÁLISES ELEMENTARES

Método de Kjeldahl
3 ETAPA - Titulação Neutralização

NH4H2BO3 + HCl H3BO3 + NH4Cl

Borato de Amônia Ácido Clorídrico Borato Cloreto de Amônio

Titular solução destilada com ácido forte padronizado (HCl ; H2SO4 ) até a
viragem do indicador. Calcular o teor de proteína bruta (usando fator) e
expressar os resultados em porcentagem.
 ANÁLISES ELEMENTARES

Método de Kjeldahl
PROCEDIMENTOS

•Pesar 1 g da amostra e colocar no tubo de KJEDAHL;

•Colocar o tubo de KJEDAHL numa estante de madeira
•Adicionar um pouco (equivalente à quantidade de uma espátula rasa) de
mistura catalítica
•Adicionar 10 mL de ácido sulfúrico com auxílio de uma pepita volumétrica;
adiciona 2-3 pedaços de porcelana
•Colocar no digestor aumentando a temperatura gradativamente (iniciando com
50 °C até atingir 350 °C) OBS: Com o exaustor ligado
•Quando totalmente digerido, a amostra vai estar na cor verde ou azul bem
claro e transparente
•Deixar esfriar
•Levar ao destilador de nitrogênio
 ANÁLISES ELEMENTARES

Método de Kjeldahl
PROCEDIMENTOS

• Ligar o destilador
• Verificar o nível de água e se necessário repor
• Adicionar indicador (fenolftaleína) ao tubo e acoplar o tubo no destilador
• Adicionar NaOH ao copo dosador do destilador de nitrogênio
• Ao entrar em ebulição, abrir a válvula vagarosamente, liberando NaOH (aos
poucos)
• Observar a viragem (quando muda a coloração)
• Colocar o erlenmeyer com aproximadamente 10mL de acido bórico a 5%
• Coletar a amônia até alcançar a mudança de coloração (ficará verde).
• Retirar o Erlenmeyer do destilador e levar para titulação
 ANÁLISES ELEMENTARES

Método de Kjeldahl

PROCEDIMENTOS

• Completar a bureta com acido clorídrico

• Abrir a torneira e deixar cair aos poucos no erlenmeyer contendo o borato de
amônia até o momento da viragem (quando passa da coloração verde para
rosa ou vermelho)
• Anotar o volume gasto na titulação e fazer os cálculos
 ANÁLISES ELEMENTARES

MÉTODO DE KJELDAHL
CÁLCULOS

% DE PROTEÍNAS TOTAIS (g/100g) = V x f x F x 0,14

P

V = Volume de HCl gasto na titulação

f = fator de correção da solução de HCl
F = fator de conversão da amostra
P = peso da amostra
 ANÁLISES ELEMENTARES

Amostra 1 Amostra 2
P 1,0043 1,0039
V 27,5 26,7
f 1,9804 0,9804
F 6,25 6,25
 ANÁLISES ELEMENTARES

• N não proteico: precipitar o N não proteico com TCA (ácido

tricloroacético), fazer a determinação;

• KJELDAHL AUTOMATIZADO:

Sistemas de segurança: porta (se não fechar não começa

destilação, nível de solvente, etc); Digestão mais rápida;
Tabletes de catalisador; automatizado na alimentação e
descarte dos tubos.
 ANÁLISES POR GRUPOS

ANÁLISES POR GRUPOS

Método por biureto

• Para ligações peptídicas: determina proteína;

• Espectrofotométrico: complexo de cor roxa com sais de cobre em
soluções alcalinas;
• Simples, barato, rápido
• Curva de calibração: feita com referência de outro método (Kjeldahl)
ou com proteína conhecida.
 ANÁLISES POR GRUPOS

MÉTODO DE BIURETO

▪ Substâncias contendo duas ou mais

ligações peptídicas formam um
complexo de cor roxa com sais de cobre
em soluções alcalinas.

▪ A intensidade da cor formada é

proporcional à quantidade de proteína
- espectrofotômetro ou colorímetro
 ANÁLISES POR GRUPOS

MÉTODO DE BIURETO

✓ Vantagens:
• Específico por não apresentar problemas de interferentes.
• É simples, rápido e barato.
• Determinação direta de proteínas
✓ Desvantagens:
• A necessidade de uma curva de calibração tomada com um padrão
conhecido de proteína - determinada por Kjeldahl;
• A cor formada no complexo não é idêntica para todas as proteínas,
porém os desvios causados são menores do que em outros métodos
colorimétricos.
 ANÁLISES POR GRUPOS

MÉTODO DE BIURETO

✓ Princípio:
• Sais de Cobre em soluções alcalinas produzem cor
violeta ou roxa quando interagem com ligações
peptídicas;
•Medida feita em espectrofotômetro ou colorímetro;
• Leitura da absorbância a 540 nm
•Determina proteína total e não só grupos.
 ANÁLISES POR GRUPOS

MÉTODO DE BIURETO
A cor formada depende de cada proteína e a intensidade da cor
é proporcional à quantidade.
 ANÁLISES POR GRUPOS

MÉTODO DE BIURETO
Pipetas

Proveta
Banho-
Balança analítica maria

Espectrofotômetro
Tubos de ensaio Balão volumétrico
 ANÁLISES POR GRUPOS

MÉTODO DE BIURETO
 ANÁLISES POR GRUPOS

MÉTODO DE BIURETO
A partir da solução padrão de albumina 10 mg/mL

Pesar 10 mg de albumina
Adicionar 1 mL de água destilada

Preparar soluções diluídas de

concentração de 2,4,5 e 8 mg/mL
Em paralelo, o branco e a amostra
 ANÁLISES POR GRUPOS

MÉTODO DE BIURETO
 ANÁLISES POR GRUPOS
Método por biureto

Adicionar a Em seguida, adicionar água destilada e o

solução padrão reativo de biureto nos tubos
de albumina
 ANÁLISES POR GRUPOS

MÉTODO DE BIURETO
Os tubos são identificados e adicionados das respectivas
quantidades de substâncias, de acordo com a curva padrão
 ANÁLISES POR GRUPOS

MÉTODO DE BIURETO

Os tubos devem ser incubados por 15 minutos

em banho maria a 37 ºC
 ANÁLISES POR GRUPOS
Método por biureto
Transferir uma alíquota de cada tubo para a
cubeta do espectrofotômetro

Ajustar o comprimento de
onda para 540 nm

Calibrar com o
branco
 ANÁLISES POR GRUPOS

MÉTODO DE BIURETO

Ler as absorbâncias
de todos os tubos

Em seguida, construir um
gráfico Absorbância x
concentração de albumina
 ANÁLISES POR GRUPOS

MÉTODO DE FENOL
Método por fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)
▪ Interação das proteínas com o reagente fenol e
cobre em condições alcalinas – colorimétrico;
 ANÁLISES POR GRUPOS

MÉTODO DE FENOL
Método por fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)
• Espectrofotométrico: interação de proteínas com reagente
fenol folin ciocalteau e cobre em condições alcalinas:
oxidação de aa (tirosina, triptofano e cisteína) por reativo
de Folin (tungstato/ molibdato de sódio) desenvolvendo
cor azul (leitura entre 500-750 nm - geralmente 660nm);
 ANÁLISES POR GRUPOS

MÉTODO DE FENOL
Método por fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)
✓ Vantagens:
•10x mais sensível que a determinação por UV, 100x mais sensível que o método
por biureto;
•Bastante específico (poucas substâncias interferentes – sacarose).

✓ Desvantagens:
• Variação da cor: composição da proteína analisada em aminoácidos, condições
analíticas;
• Lento, destrói amostra, operações múltiplas;
• Necessita de período de incubação entre a adição dos reagentes;
• Necessita de curva padrão com proteína conhecida.
 ANÁLISES POR GRUPOS
Método por Espectrofotometria Ultravioleta
▪ As proteínas possuem absorção UV em 280 nm devido à
presença de tirosina, triptofano e fenilalanina - aminoácidos
aromáticos - duplas ligações conjugadas. Usar esse método
quando as amostras forem ricas nesses aminoácidos.

✓ Vantagens:
• Rápido;
• Simples;
• Não-destrutivo.
 ANÁLISES POR GRUPOS
Método por Espectrofotometria Ultravioleta

✓ Desvantagens:
• Os resultados não são muito precisos porque eles vão depender
da concentração dos três aminoácidos na composição da
proteína.
• Não tem interferência com sais de amônia, mas os ácidos
nucléicos podem dar interferência na análise.
• Preparação da amostra para a leitura espectrofotométrica é
muito longa e exige muitas etapas: homogeneização, extração
por solventes, centrifugação, filtração.
 ANÁLISES POR GRUPOS
Método por Espectrofotometria Ultravioleta

✓ Desvantagens:
• Medida da fluorescência UV devido principalmente ao
triptofano.
•É necessário que as proteínas estejam diluídas em soluções
transparente e não contenham substâncias que absorvam no
mesmo comprimento de onda que as proteínas.

▪ Aplicação: Leite e produtos lácteos, produtos cárneos e outros

produtos agrícolas.
 ANÁLISES POR GRUPOS
Método turbidimétricos

Turbidez causada pela proteína precipitada por algum agente

precipitante (ácido tricloroacético, ferrocianeto de potássio e
ácido sulfossalicílico.

✓ Vantagens:

• Rápido;

• Simples para amostras líquidas (proteínas em solução);

 ANÁLISES POR GRUPOS
Método turbidimétricos
✓ Desvantagens:

• Não compensa ser utilizado para amostras sólidas, nas quais a

proteína deve ser extraída para uma solução;

• Pode haver precipitação de outras substâncias com as proteínas,

causando interferência no método;

• Depende da calibração com padrões conhecidos de proteínas

determinados por outros métodos.
 ANÁLISES POR GRUPOS
Método físicos

Índice de refração;
Densidade específica;
Viscosidade;
Tensão superficial;
Condutividade;
Polarização. Não são
muito
utilizados!!
 DÚVIDAS

DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS

DISCIPLINA: ANALISE FISICO-QUIMICA DOS ALIMENTOS