Dissertação - Estudo Da Diversidade Microbiana Metanogênica em Reatores Uasb

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM SANEAMENTO,

MEIO AMBIENTE E RECURSOS HDRICOS
ESTUDO DA DIVERSIDADE MICROBIANA

METANOGNICA EM REATORES UASB
TRATANDO ESGOTO SANITRIO
rika Ferreira de Abreu
Belo Horizonte
2007


Dissertao apresentada ao Programa de Ps-graduao

em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hdricos da
Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito
parcial obteno do ttulo de Mestre em Saneamento,
Meio Ambiente e Recursos Hdricos.
rea de concentrao: Saneamento
Linha de pesquisa: Tratamento de guas residurias
Orientador: Dra. Silvana de Queiroz Silva
Co-orientador: Prof. Carlos Augusto de L. Chernicharo
Belo Horizonte
Escola de Engenharia da UFMG
2007
A162e
Abreu, rika Ferreira de

Estudo da diversidade microbiana metanognica em reatores UASB
tratando esgoto sanitrio [manuscrito] / rika Ferreira de Abreu 2007.
93 f., enc. : il.
Orientadora: Silvana de Queiroz Silva.
Co-orientador: Carlos Augusto de Lemos Chernicharo.
Dissertao (mestrado) - Universidade Federal de Minas Gerais,
Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental, Departamento de
Engenharia Hidrulica e Recursos Hdricos.
Inclui bibliografia
1. Saneamento - Teses 2. Microbiologia sanitria Teses 3. guas
residuais Teses 4. Lodo de esgoto Teses 5. Reatores testes de
materiais - Teses 6. Microorganismos - Teses I. Silva, Silvana de Queiroz
II. Chernicharo, Carlos Augusto de Lemos III. Universidade Federal de
Minas Gerais, Departamento de Engenharia Hidrulica e Recursos
Hdricos, Escola de Engenharia IV. Ttulo.
CDU: 628.3 (043)
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me dado a vida e por me ensinar a valoriz-la, desenvolvendo e fortalecendo
em mim Seus maiores dons: a f e o amor;
minha me Altina, meus irmos Karla e Elias e minha av Geralda pelo amor,
compreenso, pacincia, apoio e motivao dedicados a mim durante todos esses anos de vida
estudantil e acadmica. Amo vocs!
minha orientadora, Dra. Silvana de Queiroz Silva, no s pela orientao, mas tambm pela
pessoa humana e sensvel que . Obrigada, Sil, pela sua dedicao e amizade. Agradeo
tambm ao meu co-orientador, Professor Dr. Carlos Augusto de Lemos Chernicharo, pela
oportunidade e por ter acreditado em mim desde o meu ingresso no Mestrado;
Aos meus amigos de f: Patrcia Matias, Sheyla Christina, Patrcia Bragana, Karime Pataro,
Indira, Vanessa Ferreira, Jos Eustquio, Simone Gonalves, Sandra Ambrsio, Graziella
Patrcio, Ana Maria e Norma pela amizade, companheirismo e admirao, compartilhando
comigo momentos de felicidade e de lutas tambm. Vocs so a minha segunda famlia,
mesmo quando estamos distantes... Guardo todos no meu corao!
s minhas amigas e companheiras de laboratrio Adriana, Valria, Juliana Calbria, Fernanda
e Beatriz que foram e so testemunhas do incessante trabalho de biologia molecular. Alm de
tudo, obrigada principalmente pelo carinho, pela amizade e por toda a ajuda. Agradeo
tambm ao Professor Dr. Srgio, Lucilaine e Olvia pelo apoio nas anlises cromatogrficas;
Aos meus amigos e colegas do DESA, especialmente a Slvia, dona Chica, Carla Rubinger,
Maria Eugnia, Paulo Gustavo, lisson Bragana, Fernando Moreira, Wagner Moravia,
Fernando de Paula, Carolina Moreira, Suzy, Betnia Lara, etc., enfim, todos que em alguma
ou em vrias situaes, partilharam momentos de amizade, de estudos, de confraternizao ou
simplesmente me ajudaram quando eu mais precisei. Espero que nos encontremos no futuro;
Aos professores do Programa de Ps-graduao em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos
Hdricos pelo ensino, dedicao e conhecimentos ministrados nas disciplinas do curso;
FAPEMIG, CAPES, CNPq e PROSAB pela bolsa concedida e apoio financeiro ao projeto.
i
Programa de Ps-graduao em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hdricos da UFMG
RESUMO
A diversidade microbiana metanognica do lodo anaerbio de dois reatores UASB
(denominados R1 e R2), tratando esgoto domstico, foi avaliada por meio de tcnicas
moleculares (PCR-DGGE e FISH). Os reatores foram operados com aplicao de diferentes
velocidades ascensionais: fase 1 (0,50m/h), fase 2 (0,71 m/h), fase 3 (1,10 m/h), fase 4 (0,50
m/h) e fase 5 (0,71 m/h). As amostras de lodo foram coletadas ao final de cada fase, em trs
diferentes alturas de cada reator. Os resultados das anlises de PCR-DGGE mostraram que a
comunidade de arquias metanognicas constituda por cerca de 5 populaes distintas, e
que essa diversidade no foi alterada pela imposio de diferentes velocidades ascencionais.
Porm, alteraes foram observadas na intensidade das bandas, o que sugere diminuio na
abundncia destes microrganismos com o aumento da velocidade ascensional. Tambm no
houve diferena na diversidade de arquias entre os dois reatores, sugerindo que a existncia
de uma unidade de peneiramento forado no R2 no alterou os tipos metanognicos presentes
no reator. Anlises de FISH de amostras da fase 5 com a sonda ARC915 revelaram tipos
morfolgicos diferentes: dois similares a metanognicas acetoclsticas tpicas (filamentos do
gnero Methanosaeta e agregados de cocos do gnero Methanosarcina) e outros dois
filamentos, diferentes dos de Methanosaeta, provavelmente relacionados a metanognicas
hidrogenotrficas. As clulas semelhantes a Methanosaeta foram as mais observadas,
chegando a 2,29 x 108 clulas/ mL e compreendendo 63 a 87% do total da comunidade de
arquias. Anlises de FISH de testes de AME (atividade metanognica especfica) com lodo
retirado dos mesmos reatores UASB, cultivado com substratos especficos, mostraram a
predominncia de Methanosaeta em dois substratos testado (acetato e formiato). A remoo
de DQO filtrada foi similar em ambos os reatores, mostrando que a estabilidade da
comunidade microbiana foi seguida pela estabilidade do desempenho dos mesmos. Os
resultados sugerem que ambos os reatores apresentavam uma comunidade de arquias similar,
constituda principalmente por filamentos tpicos de Methanosaeta, confirmando a
importncia e a predominncia deste grupo microbiano na cadeia final de degradao
anaerbia em reatores UASB.
ii
ABSTRACT
The methanogenic microbial diversity of anaerobic sludge in two UASB reactors
(denominated R1 and R2), treating domestic wastewater, was evaluated by molecular
techniques (PCR-DGGE and FISH). The reactors were operated under 5 operational phases,
with application of different upflow velocities: phase 1 (0,50 m/h), phase 2 (0,71 m/h), phase
3 (1,10 m/h), phase 4 (0,50 m/h) and phase 5 (0,71 m/h). The sludge samples were collected
at the end of each phase from three different heights of reactors. The results of PCR-DGGE
analyses for all samples showed that the archaeal community was mainly constituted by 5
distinct populations and that this diversity was not altered by the imposition of different
upflow velocities. However changes were observed in the intensity of the bands, which
suggests that the abundance of these microorganisms decreased with the increase of upflow
velocity. In addition, there was no difference in diversity of Archaea between the two
reactors, indicating that the presence of a forced screening unit preeceding R2 did not alter the
methanogenic types present in the reactor. FISH analyses of samples of phase 5 with ARC915
probe revealed four different morphological types: two were very similar to typical
acetoclastic Archaea (rods or filaments of genus Methanosaeta and cocci aggregated of genus
Methanosarcina) and other two filaments, different from those of Methanosaeta, probably
related to hydrogenotrophic methogens. Methanosaeta-like cells were the most observed
archaea and accounted up to 2,29 x 108 cells/mL, comprising about 63 to 87% of total
archaeal community. FISH analyses of SMA tests (specific methanogenic activity) incubated
with sludge of the same UASB reactors grown with specific substrates showed predominance
of Methanosaeta-like cells in two tested substrates (acetate and formate). The filtered COD
removal of both reactors was similar which indicates that the estability of the microbial
community was followed by estability of reactors performance. The results suggest that both
reactors showed a similar archaeal community, constituted mainly by typical rods of
Methanosaeta, confirming the importance of this microbial group in the final chain of
anaerobic degradation at UASB reactors.
iii
SUMRIO
LISTA DE FIGURAS...........................................................................................................................................VI
LISTA DE TABELAS.........................................................................................................................................VII
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS ..............................................................................VIII
1
INTRODUO............................................................................................................................................ 1
OBJETIVOS................................................................................................................................................. 3
2.1.
2.2.
OBJETIVO GERAL .................................................................................................................................. 3

OBJETIVOS ESPECFICOS ........................................................................................................................ 3
REVISO DA LITERATURA ................................................................................................................... 4

3.1
TRATAMENTO DE ESGOTOS E REATORES UASB .................................................................................... 4
3.2
BIOQUMICA DA DIGESTO ANAERBIA ................................................................................................ 7
3.2.1
Processos de converso bioqumica da matria orgnica .............................................................. 7
3.2.2
Aspectos termodinmicos e fisiolgicos de arquias e bactrias .................................................. 11
3.3
CARACTERSTICAS GERAIS DO DOMNIO ARCHAEA ............................................................................. 12
3.3.1
Aspectos gerais .............................................................................................................................. 12
3.3.2
Classificao taxonmica.............................................................................................................. 13
3.3.3
Fisiologia das arquias metanognicas ........................................................................................ 13
3.4
DISTRIBUIO DAS ARQUIAS METANOGNICAS EM SISTEMAS DE TRATAMENTO ANAERBIO ............ 15
3.4.1
Distribuio espacial em grnulos anaerbios ............................................................................. 15
3.4.2
Variaes populacionais e estabilidade funcional da comunidade metanognica em reatores
tratando efluentes sintticos ........................................................................................................................ 18
3.4.3
Estrutura e composio da comunidade de arquias metanognicas em sistemas anaerbios em
escala plena ................................................................................................................................................. 20
3.4.4
Fatores que controlam a distribuio de metanognicas em reatores anaerbios ....................... 22
3.4.5
Distribuio de arquias nos diversos sistemas de tratamento anaerbio em escalas laboratorial
e plena.......................................................................................................................................................... 27
3.5
TCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR NOS ESTUDOS DE ECOLOGIA MICROBIANA ................................ 34
3.5.1
Reao em cadeia da polimerase (PCR) ....................................................................................... 35
3.5.2
Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE)............................................................... 36
3.5.3
Hibridizao in situ com oligonucleotdeos fluorescentes (FISH) ................................................ 38
METODOLOGIA ...................................................................................................................................... 40
4.1
CARACTERIZAO DOS REATORES E PONTOS DE AMOSTRAGEM.......................................................... 40
4.2
CARACTERIZAO DO INCULO DOS REATORES ................................................................................. 41
4.3
DETERMINAO DA DIVERSIDADE MICROBIANA METANOGNICA ....................................................... 41
4.2.1
Extrao e purificao do DNA genmico .................................................................................... 42
4.2.2
Amplificao dos genes DNAr 16S de arquias por PCR ............................................................. 43
4.2.3
Separao dos produtos de PCR por DGGE................................................................................. 44
4.2.4
Determinao da abundncia relativa e da concentrao de arquias por FISH ........................ 46
4.2.5
Anlise de cidos graxos volteis.................................................................................................. 48
RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................................................... 49

5.1
DETERMINAO DA DIVERSIDADE MICROBIANA METANOGNICA EM REATORES UASB POR MEIO DA

TCNICA DE PCR-DGGE................................................................................................................................... 49
5.1.1
Extrao e purificao do DNA genmico .................................................................................... 49
5.1.2
Amplificao dos genes DNAr 16S de arquias por PCR ............................................................. 51
5.1.3
Separao dos produtos de PCR por DGGE................................................................................. 53
5.1.4
Identificao das principais arquias metanognicas presentes nos reatores por meio de
seqenciamento de DNA .............................................................................................................................. 60
5.2
IDENTIFICAO DE MORFOLOGIAS DE ARQUIAS METANOGNICAS TPICAS E DE INTERESSE PELA
TCNICA DE FISH E DETERMINAO DE SUA ABUNDNCIA RELATIVA .............................................................. 62
5.2.1
Morfotipos observados .................................................................................................................. 62
5.2.2
Amostras dos reatores UASB......................................................................................................... 65
iv
5.2.3
Amostras de lodo de testes de AME............................................................................................... 68
CONCLUSES .......................................................................................................................................... 72
RECOMENDAES ................................................................................................................................ 74
REFERNCIAS .................................................................................................................................................. 76
ANEXOS .............................................................................................................................................................. 82
v
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1 Etapas metablicas e grupo de microrganismos envolvidos na digesto anaerbia
.......................................................... .......................................................................................7
Figura 3.2 Desnaturao e separao de fragmentos de DNA pela tcnica de DGGE .........36
Figura 4.1 A e B: vista dos reatores R1 e R2. C: desenho esquemtico dos pontos (perfis) de
amostragem (cm) ......................................................................................................................40
Figura 4.2 Esquema das etapas de anlise molecular e identificao microbiolgica das
amostras de lodo ........... ...........................................................................................................42
Figura 5.1 Extraes de DNA das amostras dos reatores R1 e R2 coletadas em diferentes
alturas e em diferentes fases operacionais ...............................................................................49
Figura 5.2 Perfis de ST das amostras de lodo dos reatores R1 e R2 ao longo das fases 1 a 4
...................................................................................................................................................50
Figura 5.3 Reao de PCR com amostras da fase 1...............................................................52
Figura 5.4 Produtos de PCR das fases 1 a 4...........................................................................52
Figura 5.5 Imagem negativa de DGGE com as amostras das fases 1 a 4 (gradiente 45 a 65%)
...................................................................................................................................................55
Figura 5.6 Produtos de PCR dos pontos H1 (reator R1) e H2 (reator R2) e comparao de
perfil de bandas de DGGE .......................................................................................................57
Figura 5.7 Concentraes dos principais AGV nos perfis dos reatores R1 e R2 ao longo das
fases operacionais.....................................................................................................................59
Figura 5.8 DGGE das bandas purificadas .............................................................................60
Figura 5.9 Amplificao das bandas ARC (A); purificao e quantificao dos produtos de
PCR (B) ....................................................................................................................................61
Figura 5.10 Principais morfotipos de arquias observados nas amostras dos reatores e em
testes de AME. Visualizao em aumento de 1000 vezes .......................................................64
Figura 5.11 Distribuio relativa dos principais morfotipos de arquias observados em
amostras da fase 5 dos reatores R1 e R2...................................................................................67
Figura 5.12 Comparao entre filamentos de Methanosaeta sp. em contraste de fase (A e B)
e em colorao DAPI, aumento de 1000 vezes ........................................................................69
Figura 5.13 Distribuio relativa dos principais morfotipos de arquias observados em
amostras de testes de AME com diferentes substratos ............................................................70
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1 Comparao energtica de algumas comuns na digesto anaerbia ...................12
Tabela 3.2 Principais grupos de arquias metanognicas encontrados em sistemas de
tratamento anaerbio ..... ................... ......................................................................................13
Tabela 3.3 Vias metablicas da metanognese e arquias associadas ..................................15
Tabela 3.4 Estudos da comunidade microbiana metanognica em reatores anaerbios em
escala laboratorial usando tcnicas moleculares .......... ..........................................................30
Tabela 3.5 Estudos da comunidade microbiana metanognica em reatores anaerbios em
escala plena usando tcnicas moleculares ................................................................................31
Tabela 3.6 Estudos da comunidade microbiana metanognica em reatores UASB usando
tcnicas moleculares ................................................................................................................32
Tabela 4.1 Principais caractersticas dos reatores UASB e condies operacionais ... ........ 41
Tabela 5.1 Nmero de unidades microbianas de arquias observadas em 20 campos
microscpicos nas amostras da fase 5 dos reatores R1 e R2 ....................................................66
Tabela 5.2 Estimativa da abundncia dos principais morfotipos de arquias por mL de
amostra da fase 5 dos reatores R1 e R2 .................................................................................68
Tabela 5.3 Nmero de unidades microbianas de arquias observadas em 20 campos
microscpicos nas amostras de testes de AME com diferentes substratos ..............................70
amostra de testes de AME com diferentes susbtratos.............................................................71
vii
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS

AGV: cidos graxos volteis
ARC: Archaea
ARDRA: amplified ribosomal DNA restriction analysis ou anlise de restrio de DNA
ribossomal amplificado
Bis: N, N-metileno bis acrilamida
BRS: bactrias redutoras de sulfato
BSA: bovine serum albumin ou albumina de soro bovino
DAPI: 4, 6-diamidino-2-fenilindol
DBO5,: demanda bioqumica de oxignio no 5 dia (padro)
ddH2O: gua duplamente destilada
DGGE: desnaturing gradient gel electrophoresis ou eletroforese em gel de gradiente desnaturante
DNAr: DNA (gene) de RNA ribossomal
DQO: demanda qumica de oxignio
EDTA: etileno amino tetraacetato de sdio diidratado [CH2N(CH2.COOH)CH2.COONa]2.2H2O
FISH: fluorescence in situ hibridization ou hibridizao in situ com sonda fluorescente
HPLC: high performance liquid chromatograph ou cromatografia lquida de alto desempenho
HTP: hidroxiapatita
PBS: phosphate buffer saline ou soluo salina tamponada com fosfato
PCR- RT-SSCP: transcriptase reversa single strand conformation polymorphism ou
polimorfismo de conformao de fita nica transcriptase reversa
PCR: polymerase chain reaction ou reao em cadeia da polimerase
PVPP: polivinilpirrolidona
RFLP: restriction fragment length polymorphism ou polimorfismo de comprimento de
fragmentos de restrio
rpm: rotaes por minuto
SDS: dodecil sulfato de sdio
SSCP: single strand conformation polymorphism ou polimorfismo de conformao de fita nica
Taq: Thermoaquaticus
Tris: (hidroximetil) aminometano C4H11NO3
TEMED: N, N, N, N tetrametil etileno diamina
UASB: upflow anaerobic sludge blanket ou reator de manta de lodo de fluxo ascendente
viii
1 INTRODUO
O lanamento de esgotos domsticos e industriais in natura em corpos dgua tem sido um
dos fatores mais importantes e preocupantes de interferncia antrpica no ambiente, causando
impactos extremamente nocivos sade humana e aos ecossistemas, notadamente os
aquticos. Tecnologias avanadas de tratamento tm sido pesquisadas, principalmente nos
pases desenvolvidos, com o intuito adicional de recuperao e reuso dos recursos hdricos.
Nos pases em desenvolvimento como o Brasil, tais pesquisas so essenciais para a mudana
do quadro crtico sanitrio.
Nas guas residurias, especificamente nos esgotos domsticos, h uma enorme variedade de
compostos orgnicos biodegradveis. Desde o final do sculo XIX e incio do sculo XX, tais
guas tm sido tratadas, em ambiente confinado, por meio de processos biolgicos aerbios
e/ou anaerbios. No decorrer dos anos, diversas pesquisas resultaram em avanos importantes
no tratamento biolgico, com destaque a alguns tipos de tecnologias aerbia e anaerbia,
como, respectivamente, sistema de lodos ativados e reatores anaerbios de fluxo ascendente e
manta de lodo, conhecidos como UASB.
Desenvolvidos em 1980 por Lettinga e colaboradores, os reatores UASB foram
primeiramente concebidos para o tratamento de resduos agro-industriais. Atualmente, a
tecnologia anaerbia mais empregada no mundo e muito utilizada no tratamento de esgotos
domsticos, especialmente em regies de clima quente e em muitos pases em
desenvolvimento, como o Brasil. Como vantagens em relao aos processos aerbios, eles
no necessitam de aerao, apresentam reduzida produo de lodo excedente e o gs metano
gerado pode ser reaproveitado como recurso energtico. Entretanto, estes reatores apresentam
eficincia um pouco menor que a dos processos aerbios e seus efluentes, portanto,
necessitam de um sistema de ps-tratamento para remoo de poluentes. Apesar de estarem
amplamente distribudos, os reatores UASB so projetados e monitorados com base em
conhecimentos prticos, sendo pouco conhecida a ecologia microbiana dos processos
biolgicos envolvidos dentro destes ecossistemas.
Durante muitos anos, o conhecimento da microbiologia de processos biolgicos ambientais,
no s os envolvidos na digesto anaerbia, foi e ainda considerado como uma caixapreta, principalmente devido s limitaes de isolamento e cultivo de microrganismos, que
so fastidiosas ou extremamente seletivas, subestimando a diversidade e dificultando a
1
compreenso de processos metablicos envolvidos na degradao da matria orgnica, os

quais so influenciados por processos ecolgicos, tais como simbiose e competio entre
microrganismos. Atualmente, este problema tem sido grandemente diminudo e o
conhecimento da microbiologia ambiental tem se estendido e muito com o uso e avano das
tcnicas de biologia molecular, que so independentes do isolamento e cultivo de
microrganismos e, muitas vezes, permitem o estudo dos mesmos no prprio ambiente.
Aliando-se o conhecimento sobre o processo de digesto anaerbia em diversos sistemas de
tratamento e o conhecimento das principais tcnicas de biologia molecular envolvidas em
estudos de ecologia microbiana, este trabalho buscou meios para se avaliar a diversidade
microbiana metanognica presente em reatores UASB, em escala de demonstrao, tratando
esgotos tipicamente domsticos e submetidos a diferentes condies operacionais. A
observao da estrutura e do comportamento da microbiota frente a estas alteraes poderia
fornecer informaes importantes para o monitoramento e a otimizao das condies de
operao dos reatores.
2
2 OBJETIVOS
2.1.
Objetivo Geral
Caracterizar a comunidade de arquias metanognicas presentes em lodos de reatores UASB

tratando esgoto sanitrio por meio de tcnicas de biologia molecular.
2.2.
Objetivos especficos
Determinar e comparar a diversidade de arquias metanognicas, ao longo do perfil

vertical de dois reatores UASB distintos, por meio de anlise de fragmentos de DNA pelo
mtodo PCR-DGGE;
Determinar e comparar a diversidade de arquias metanognicas nos reatores UASB

submetidos a diferentes condies operacionais (tempo de deteno hidrulico e rea til
do reator) por meio de anlise de fragmentos de DNA pelo mtodo PCR-DGGE;
Determinar a abundncia relativa de arquias metanognicas em amostras de lodo dos

reatores UASB e em ensaios de atividade metanognica pela tcnica de hibridizao in
situ com sondas fluorescentes (FISH).
3
3 REVISO DA LITERATURA
3.1 Tratamento de esgotos e reatores UASB
Desde o final do sculo XX, a sustentabilidade emergiu como um ponto importante a ser
considerado em qualquer interferncia antrpica no ambiente. Muitos centros de pesquisa no
mundo vm desenvolvendo sistemas de tratamento de guas residurias, incluindo o
tratamento de esgoto sanitrio, baseando-se em conceitos de sustentabilidade, que objetivam
tanto a proteo ambiental quanto a recuperao de recursos, com custos acessveis s
populaes beneficiadas.
O tratamento dos esgotos essencial devido ao seu potencial poluidor. Caso no seja dada
destinao adequada aos esgotos, estes acabam poluindo o solo, contaminando guas
superficiais e subterrneas e passam a escoar a cu aberto, constituindo-se em perigosos focos
de disseminao de doenas. Alm disso, existe o risco do impacto ecolgico ao serem
lanados nos corpos receptores. Em alguns casos, o meio aqutico demonstra ter condies de
receber e decompor os contaminantes at um nvel que no cause problemas ou alteraes
acentuadas que prejudiquem o ecossistema. Entretanto, nos casos de sobrecarga orgnica, os
esgotos provocam total degradao do ambiente em decorrncia do consumo excessivo do
oxignio dissolvido por microrganismos hetertrofos aerbios (bactrias principalmente). A
depleo do oxignio resulta na morte dos organismos aquticos. Segundo Campos et al.
(1999), a disposio de esgotos brutos no solo ou em corpos receptores naturais uma
alternativa que foi e ainda empregada de forma muito intensa.
Em 1893 e 1914 foram iniciadas as tecnologias de tratamento de esgotos em ambiente
confinado conhecidas como tanques spticos e lodos ativados, respectivamente. Durante
muito tempo, acreditava-se que os esgotos poderiam ser tratados com alta eficincia somente
por processos aerbios, que exigem fornecimento de oxignio, enquanto que o processo
anaerbio s se aplicava digesto de lodo (CAMPOS et al., 1999). Processos anaerbios,
por sua vez, eram empregados inicialmente como unidades nicas de separao de slidos e
digesto. Mais tarde, passaram a ser utilizados tambm como unidades separadas para
digesto de lodos primrio e secundrio, oriundos de decantadores de estaes baseadas em
tratamento biolgico aerbio, como lodos ativados e filtros biolgicos percoladores.
Recentemente, os processos anaerbios tm sido empregados como unidades principais para
remoo de carbono orgnico de esgotos, especialmente em regies tropicais e subtropicais
(FORESTI et al., 2006).
4
Reatores de fluxo ascendente e manta de lodo, tipicamente conhecidos como UASB, foram
um dos avanos mais importantes na tecnologia de digesto anaerbia. Desenvolvidos por
Lettinga et al. (1980), foram primeiramente empregados no tratamento de resduos agroindustriais. Logo seu potencial para o tratamento de esgotos tornou-se aparente, especialmente
em regies de clima quente. A configurao deste reator tem sido aplicada com sucesso em
estaes de tratamento de esgoto (ETE) em escala plena em muitos pases em
desenvolvimento, tais como Brasil, Colmbia, Mxico, Egito e ndia (VAN HAANDEL et
al., 2006). Segundo Sanz et al. (2005), atualmente, reatores UASB e configuraes baseadas
em seus principais aspectos constituem cerca de 2000 (75%) sistemas de tratamento anaerbio
no mundo.
A ampla difuso desta tecnologia anaerbia no Brasil resultante da demanda crescente por
solues simples e econmicas diante do dficit sanitrio do pas. Embora, nos ltimos anos,
sejam reconhecidas melhorias de alguns indicadores de cobertura da populao por redes
coletoras e por sistemas de tratamento de esgotos, ainda assim os ndices so baixos, com
cerca de 53% dos domiclios particulares urbanos conectados a redes coletoras
(CHERNICHARO, 2007). Em relao ao tratamento de esgotos, pesquisas indicam apenas
31% dos esgotos gerados passam por alguma forma de tratamento. Alm disso, as estaes de
tratamento apresentam eficincias reduzidas e problemas operacionais freqentes. Estes
fatores, aliados ao quadro epidemiolgico e ao perfil scio-econmico das comunidades
brasileiras, vm enfatizar a importncia de se implantar sistemas simplificados de coleta e
tratamento dos esgotos, que conjuguem baixos custos de implantao e operao,
simplicidade operacional, ndices mnimos de mecanizao e sustentabilidade do sistema
como um todo (CHERNICHARO, 2007).
Desde o surgimento e difuso dos reatores anaerbios, entre as dcadas de 1950 e 1980, eles
se tornaram uma opo atrativa por serem compactos e dispensarem gastos com aerao, o
que resultou em baixos custos de investimento. Alm disso, a produo de lodo excedente
bem menor que a dos processos aerbios e o gs metano produzido pode ser utilizado como
fonte energtica, inclusive para aquecimento de reatores em regies de clima frio. Contudo,
efluentes de reatores anaerbios necessitam de ps-tratamento para remoo de poluentes, a
fim de se alcanar os nveis de emisso exigidos pela legislao ambiental na maioria dos
pases. A tendncia a projeo de sistemas de tratamento com o reator anaerbio como
unidade principal, acoplado a unidades de pr e ps-tratamento, no intuito de se promover o
polimento dos efluentes e uma eficiente recuperao dos recursos (FORESTI et al., 2006).
5
Apesar da tecnologia dos reatores UASB estar amplamente difundida, seu projeto e operao
so mais baseados em experincias empricas ou prticas do que no conhecimento
fundamentalmente cientfico do processo biolgico, podendo levar ao super-dimensionamento
dos volumes dos reatores e ao tratamento sub-timo ou instvel (TAGAWA et al., 2000;
HORI et al., 2006; OFLAHERTY et al., 2006). O uso no tratamento de esgoto sanitrio e
domstico ainda menos empregado pelo fato de informaes experimentais serem escassas.
De acordo com Roest et al. (2005), apesar dos processos biolgicos gerais que ocorrem em
sistemas de tratamento anaerbio serem bem conhecidos, a comunidade microbiana envolvida
nas converses bioqumicas freqentemente considerada como uma caixa preta. A
principal dificuldade encontrada tem sido decorrente das limitaes dos mtodos disponveis
para identificao microbiana e avaliao de sua atividade metablica que, at dcada de 90,
eram restritos s tcnicas de isolamento e cultivo em laboratrio. Na literatura, consenso a
falta do conhecimento fundamentalmente biolgico sobre a natureza e a funo dos
consrcios microbianos anaerbios, bem como a formao e o crescimento de biofilmes e
bioagregados metanognicos em sistemas de tratamento em escala plena. Tal dificuldade
tambm devida natureza complexa das guas residurias (OFLAHERTY et al., 2006). A
compreenso detalhada dos fenmenos fsico-qumico-biolgicos que governam o processo
anaerbio permitiria a identificao das causas de eventuais distrbios, suas conseqncias a
mdio e longo prazo, assim como a adoo de medidas corretas de controle e preveno de
tais distrbios (AQUINO e CHERNICHARO, 2005).
6
3.2 Bioqumica da digesto anaerbia

3.2.1 Processos de converso bioqumica da matria orgnica
Nas guas residurias, h uma enorme variedade de compostos orgnicos biodegradveis, o
que resulta na existncia de uma comunidade microbiana muito diversificada, responsvel
pela degradao dos diferentes compostos. Ao contrrio da degradao aerbia, na qual a
matria orgnica carboncea usualmente metabolizada diretamente CO2, a degradao
anaerbia envolve 4 etapas distintas (Figura 3.1). Por se tratar de um material constitudo de
protenas, carboidratos e lipdeos, vrios so os caminhos metablicos possveis durante a
converso dos compostos a metano, realizados principalmente por microrganismos
hetertrofos. Portanto, trata-se de um processo bioqumico complexo, composto de vrias
reaes seqenciais, cada uma com determinadas populaes microbianas.
Polmeros
(compostos orgnicos complexos)
Carboidratos
(*)
Lipdeos
(*)
Protenas
(*)
Bactrias fermentativas
HIDRLISE
Aminocidos
Acares
cidos graxos de cadeia

longa, lcoois (etanol)
Bactrias fermentativas
ACIDOGNESE
ACETOGNESE
cidos orgnicos
valerato, isovalerato,
propionato, butirato
Bactrias acetognicas produtoras de hidrognio

Acetato
Bactrias acetognicas consumidoras de hidrognio
Arquias metanognicas
acetoclsticas
METANOGNESE
Metano e CO2
CO2 + H2
Arquias metanognicas
hidrogenotrficas
Figura 3.1 Etapas metablicas e microrganismos envolvidos na digesto anaerbia

Fonte: adaptado de Mc Carty et al. (1982); Zehnder et al. (1982)
(*) exoenzimas que degradam carboidratos: celulase, hemicelulase, xilanase, amilase;
exoenzimas que degradam protenas: proteases;
exoenzimas que degradam lipdeos: lipase, fosfolipase
7
3.2.1.1 Hidrlise
A hidrlise a primeira etapa na degradao anaerbia de polmeros complexos, tais como
carboidratos, protenas e lipdeos, necessria para reduzir material particulado e dissolvido, a
dimenses menores que 1 nm, que corresponde a pesos moleculares menores que 1.000 Da.
Isso necessrio uma vez que as protenas porinas, presentes na membrana externa de
bactrias Gram-negativas, formam canais de aproximadamente 1 nm que permitem a entrada
e sada da clula de substncias hidroflicas pequenas (MADIGAN et al., 2003). Sendo assim,
a hidrlise do material particulado, bem como de material solvel de maior tamanho, uma
etapa essencial para aumentar a biodisponibilidade, ou seja, o acesso do substrato s clulas
microbianas (AQUINO e CHERNICHARO, 2005).
O material orgnico particulado convertido em compostos dissolvidos de menor peso
molecular por meio de exoenzimas, enzimas que so excretadas por bactrias fermentativas,
tambm denominadas bactrias hidrolticas. As protenas so degradadas em (poli) peptdeos,
os carboidratos em acares solveis (mono e dissacardeos) e os lipdeos, em cidos graxos
de cadeia longa (C15 a C17) e glicerol. Em certas situaes, a alta complexidade do material
orgnico pode resultar em uma baixa velocidade de hidrlise, tornando-a a etapa limitante de
todo o processo de digesto.
Dentre os gneros de bactrias hidrolticas que se destacam no processo anaerbio esto:

Clostridium, Micrococcus e Staphylococcus, que so gneros produtores de lipases para
degradao de lipdeos cidos graxos; Bacteroides, Butyvibrio, Clostridium, Fusobacterium,
Selenomonas, Streptococcus, Proteus, Peptococcus e Bacillus, que so gneros produtores de
proteases para degradao de protenas aminocidos; e Clostridium, Staphyloccoccus,
Acetivibrio, Eubacterium, que so gneros produtores de amilases para degradao de
polissacardeos acares menores. A composio relativa e ativa destes microrganismos ser
refletida pelo tipo de substrato presente no sistema (ANDERSON et al., 2003).
3.2.1.2 Acidognese
Os compostos dissolvidos, gerados no processo de hidrlise, so absorvidos e metabolizados
pelas bactrias fermentativas acidognicas, que, por sua vez, excretam substncias simples,
como cidos graxos volteis (AGV) de cadeia curta, alcois, cido ltico e compostos
inorgnicos (CO2, H2, NH3, H2S, etc.). A acidognese realizada por um grupo diversificado
de bactrias anaerbias obrigatrias em sua maioria. Entretanto, algumas espcies so
8
facultativas e podem metabolizar a matria orgnica por via oxidativa, utilizando oxignio
molecular (O2) como aceptor de eltrons, removendo, eventualmente, resduos de oxignio
dissolvido no sistema e, dessa forma, eliminando qualquer efeito txico aos microrganismos
estritamente anaerbios, dentre eles, as arquias metanognicas.
Dentre os gneros de bactrias acidognicas mais comuns em reatores anaerbios esto
Clostridium, Bacteroides, Ruminococcus, Butyribacterium, Propionibacterium, Eubacterium,
Lactobacillus, Streptococcus, Pseudomonas, Desulfobacter, Micrococcus, Bacillus, e
Escherichia. Estima-se que este grupo ocorra em reatores anaerbios em uma densidade que
varia de 106 a 108 clulas por mL de lodo (ARCHER e KIRSOP, 1990). Os produtos
metablicos gerados pela atividade das bactrias acidognicas so importantes substratos para
as bactrias acetognicas e para as arquias metanognicas.
3.2.1.3 Acetognese
A principal funo das bactrias acetognicas na digesto anaerbia a produo de acetato,
CO2 e H2, substratos que so metabolizados pelas arquias metanognicas. Dois grupos
distintos de acetognicas podem ser distinguidos, baseados em seu metabolismo. O primeiro
grupo de bactrias acetognicas produtoras de hidrognio obrigatrias, tambm chamadas
de acetognicas redutoras de prtons, que produzem cido actico, CO2 e H2 a partir de uma
grande variedade de substratos, dentre eles: cidos graxos intermedirios (propionato e
butirato), lcoois ou outros cidos orgnicos maiores (valerato, isovalerato, palmitato).
Baseados em consideraes termodinmicas, especificamente da energia livre (G) resultante
da oxidao dos cidos graxos, previsto que estas bactrias sejam capazes de crescer apenas
em ambientes sob baixas presses de hidrognio. Esta condio alcanada quando
microrganismos consumidores de hidrognio esto presentes no sistema, tais como arquias
metanognicas hidrogenotrficas ou bactrias redutoras de sulfato (BRS). A maioria dos
ambientes metanognicos mantm uma concentrao de H2 baixa (abaixo de 10-4 atm), que
suficiente para estimular o crescimento destas bactrias acetognicas, evitando-se o acmulo
de cidos (AQUINO e CHERNICHARO, 2005). A esta relao de dependncia dado o
nome de sintrofia, e sabe-se que a presena de microrganismos sintrficos essencial para um
eficiente desempenho da digesto anaerbia. Poucos microrganismos deste grupo tm sido
isolados de lodos anaerbios, sendo os gneros Syntrophomonas, Syntrophobacter e alguns
gneros de BRS os mais conhecidos.
9
O segundo grupo de bactrias acetognicas so as homoacetognicas, que so estritamente

anaerbias, catalisando a formao de acetato a partir de CO2 e H2. Os gneros mais
conhecidos
de
bactrias
homoacetognicas
so
Acetobacterium,
Acetoanaerobium,
Acetogenium, Butribacterium, Clostridium e Pelobacter. A atividade metablica destas

bactrias independe das relaes sintrficas mencionada acima, e por isso so mais facilmente
isoladas de amostras de lodo anaerbio. Assim como as metanognicas, estas bactrias podem
tambm contribuir para a manuteno de um ambiente com baixa presso de H2. Uma
estimativa destas bactrias em reatores anaerbios sugere uma concentrao de
aproximadamente 105 clulas por mL de lodo (ARCHER e KIRSOP, 1990).
3.2.1.4 Metanognese
O metano produzido pelas arquias metanognicas por duas vias metablicas principais:
hidrogenotrfica e acetotrfica (ou acetoclstica). As arquias hidrogentroficas so
auttrofas, reduzindo CO2 a metano e usando H2 como doador de eltrons, liberando H2O. As
arquias acetoclsticas so hetertrofas, produzindo o metano e CO2 a partir da reduo do
acetato (fermentao). Estas ltimas tm grande importncia em reatores anaerbios, uma vez
que conhecido que cerca de 70% do metano produzido nestes sistemas resultante da
degradao de acetato (JETTEN et al., 1992; CHERNICHARO, 2007; YU et al., 2005).
Maiores detalhes do processo de metnognese sero descritos frente.
3.2.1.5 Outros processos biolgicos envolvidos na digesto anaerbia
Alm dos processos acima descritos que levam produo de biogs, outros podem ocorrer
nos reatores anaerbios. Oxidantes alternativos ao O2, como nitrato (NO3-) e sulfato (SO4-),
podem permitir o desenvolvimento de outras bactrias que usam catabolismo oxidativo. O
nitrato pode ser reduzido a nitrognio molecular (N2) por bactrias desnitrificantes, enquanto
que o sulfato pode ser reduzido a sulfeto (H2S) por BRS. O ltimo processo mais
importante, na prtica, pelo fato do sulfato estar presente em concentraes considerveis nos
esgotos sanitrios. No entanto, a reduo de sulfato pode ser um processo indesejvel, caso o
objetivo seja a otimizao da produo de metano, pois as BRS competem com as arquias
metanognicas pelo consumo de acetato, H2 e CO2, e o sulfeto formado, alm de ser
corrosivo, confere odor muito desagradvel tanto fase lquida quanto ao biogs, podendo ser
txico para a metanognese (FORESTI et al., 1999).
10
3.2.2 Aspectos termodinmicos e fisiolgicos de arquias e bactrias

Os aspectos termodinmicos e cinticos so cruciais na compreenso ecolgica da complexa
comunidade microbiana envolvida no processo de degradao anaerbia. Os microrganismos
envolvidos na acidognese crescem rapidamente pelo fato das reaes de fermentao terem
rendimentos energticos superiores aos das reaes de formao do metano (Tabela 3.1).
Segundo Rittmann et al. (2001), a partida e operao bem-sucedidas de um sistema anaerbio
requerem um balano apropriado entre microrganismos hidrolticos/fermentativos e
metanognicos. Mais ainda, Casserly et al. (2003) afirmaram que a capacidade de assimilao
orgnica deste tipo de sistema depende da quantidade de biomassa ativa retida no reator,
diretamente relacionada com a razo entre arquias metanognicas e bactrias acidognicas
metabolicamente ativas, necessria para a degradao anaerbia de substratos biodegradveis.
Valores de constantes de cinticas de Monod, com culturas anaerbias, obtidos por Henze e
Harremes em 1983 (apud FORESTI et al., 1999), mostraram que a taxa mxima de
crescimento ( max) de bactrias acidognicas 2,0 d-1, enquanto que a de arquias
metanognicas em torno de 0,4 d-1. Pelo fato da taxa mdia de crescimento das arquias ser
muito mais baixa que a de bactrias, a taxa global do processo controlada pela
metanognese. Respostas instveis do sistema anaerbio podem ser decorrentes de uma baixa
atividade metanognica em relao de bactrias fermentativas, com reduzido uso de acetato,
H2 e CO2, causando acmulo de AGV e acentuada diminuio do pH (CASSERLY et al.,
2003).
As equaes dos processos bioqumicos envolvidos na digesto anaerbia so mostradas na
Tabela 3.1. AGV de cadeia curta so importantes intermedirios no processo de degradao
anaerbia. A oxidao de propionato e butirato a acetato, CO2, H2 e formiato so
energeticamente desfavorveis, sendo necessria a interao sintrfica entre arquias
metanognicas e BRS (ou outros microrganismos consumidores de acetato e H2). As BRS
constituem um grupo polifiltico de bactrias fisiologicamente versteis, no restritas
reduo de sulfato. A degradao de propionato e butirato pelas bactrias acetognicas, por
sua vez, fortemente influenciada pela presena ou ausncia de sulfato. Na ausncia de
sulfato, a converso destes compostos termodinamicamente possvel somente sob baixa
presso parcial de hidrognio e concentrao de formiato, caractersticas de consrcio
sintrfico. Na presena de sulfato, propionato e butirato podem ser convertidos CO2 pelas
BRS sem a participao de metanognicas (ROEST et al., 2005).
11
Tabela 3.1 Comparao energtica de algumas reaes comuns na digesto anaerbia

Acidognese
Go
(kJ/mol)
-206,0
-358,0
-255,0
C6H12O6 + 2H2O 2CH3COO- + 2CO2 + 2H+ + 4H2

C6H12O6 + 2H2 2CH3CH2COO- + 2H2O + 2H+
C6H12O6 CH3CH2CH2COO- + 2CO2 + H+ + 2H22
Acetognese
bicarbonato acetato 2HCO3- + 4H2 CHCOO- + 4H2O
-104,6
propionato acetato
CH3CH2COO- + 3H2O CH3COO- + H+ + HCO3- + 3H2
+76,1
+72,2
propionato acetato
CH3CH2COO- + 2HCO3 CH3COO- + H+ + 3HCOO+
+48,1
butirato acetato
CH3CH2CH2COO + 2H2O 2CH3COO + H + 2H2
etanol acetato
CH3CH2OH + H2O CH3COO- + H+ + 2H2
+9,6
lactato acetato
CH3CHOHCOO- + 2H2O CH3COO- + H+ + HCO3- + 2H2
-4,2
Metanognese
acetato metano
CH3COO- + H2O HCO3- + CH4
-31,0
hidrognio metano
H2 + HCO3- + H+ CH4 + H2O
- 33,9
-32,6
formiato metano
HCOO- + H2O + H+ CH4 + HCO3-3
-135,6
bicarbonato metano HCO3- + 4H2 + H+ CH4 + 3H2O
Sulfetognese
sulfato sulfeto
SO42- + 4H2 + H+ HS + 4H2O
-151,9
Fonte: adaptado de Foresti (1994), Lettinga et al. (1994) e Aquino e Chernicharo (2005)
glicose acetato
glicose propionato
glicose butirato
3.3 Caractersticas gerais do domnio Archaea

3.3.1 Aspectos gerais
A descrio do Domnio Archaea iniciou-se na dcada de 1970, quando Woese et al.
investigavam caractersticas genticas e bioqumicas de vrios microrganismos, inclusive dos
metanognicos. Os pesquisadores descobriram que os metanognicos apresentavam
diferenas na constituio qumica da parede celular e da membrana plasmtica, alm de
possurem RNA polimerases (enzimas responsveis pela sntese de protenas) mais complexas
e vias metablicas incomuns s demais bactrias. Inicialmente, estes microrganimos foram
reunidos no grupo Arqueobactria para distingir das Eubactrias (bactrias verdadeiras).
Atualmente, sabe-se que as caractersticas genticas e celulares de arquias so mais
semelhantes s de organismos eucariticos do que s de bactrias comuns. A reclassificao
filogentica, elaborada por Woese e colaboradores, incluiu as arquias em um Domnio
parte, denominado de Archaea.
As arquias so, portanto, unicelulares e procariticas, anaerbias, apresentando uma ampla
diversidade metablica, atributos bioqumicos e estruturais nicos, os quais as adaptaram a
viver em hbitats considerados inspitos aos demais seres vivos, tais como: fontes geotermais
(hipertermfilos), hbitats com elevada salinidade (hiperhalfilos), solos e sistemas aquticos
altamente cidos ou alcalinos (VAZOLLER et al., 1999). Desde ento, investigaes tm sido
12
feitas sobre sua importncia funcional nestes ecossistemas e sobre a atuao de tais
microrganismos nos processos biogeoqumicos em ambientes no-extremos.
3.3.2 Classificao taxonmica
Conforme classificao taxonmica do NCBI (National Center for Biotechnology
Information), atualmente o domnio Archaea compreende 4 filos: Crenarchaeota,
Korarchaeota, Nanoarchaeota e Euryarchaeota. Segundo Vazoller et al. (1999), o filo
Crenarchaeota compreende microrganismos capazes de crescer em temperaturas extremas
(com ponto timo acima de 80C), conhecidos como hipertermfilos. Foram inicialmente
observados em amostras de solos e guas geotermais contendo enxofre elementar e sulfetos;
posteriormente, em fendas termais vulcnicas no leito ocenico, sob temperaturas a 100C. O
filo Korarchaeota engloba organismos hipertermfilos pouco conhecidos, identificados a
partir de seqncias de DNAr 16S isoladas de fontes termais terrestres, porm ainda no
cultivados em laboratrio. O filo Nanoarchaeota tambm engloba arquias hipertermfilas
pouco conhecidas, de cerca de 400 nm de dimetro, encontradas em associao com outras
arquias do gnero Ignicoccus, isoladas de fendas submarinas (HUBER et al., 2002). Dentro
do filo Euryarchaeota, os principais representantes so as arquias metanognicas. O filo
inclui tambm um grupo distinto de organismos termo-acidfilos associados ao gnero
Thermoplasma, que so caracterizados pela ausncia de parede celular (VAZOLLER et al.,
1999).
Embora sejam microrganismos habitualmente encontrados em ambientes extremos, clones
filogeneticamente mais prximos ao filo Crenarchaeota e ao gnero Thermoplasma tm sido
detectados em diversos sistemas de tratamento anaerbio, tais como digestor de resduos da
destilao de vinho (vinhaa) (GODON et al., 1997), reator UASB tratando efluente de
fbrica de papel (ROEST et al., 2005), aterro sanitrio (CARPENTIER et al., 2006) e digestor
de lodo (CHOUARI et al., 2006). Porm o papel destes microrganismos no processo de
digesto anaerbia permanece desconhecido, uma vez que ainda no foram isolados e /ou
cultivados.
3.3.3 Fisiologia das arquias metanognicas
As arquias metanognicas so os principais representantes do filo Euryarchaeota,
compreendendo
quatro
classes:
Methanobacteria,
Methanococci,
Methanopyri
Methanomicrobia com suas respectivas ordens: Methanobacteriales, Methanococcales,

13
Methanopyrales, Methanomicrobiales e Methanosarcinales, sendo as duas ltimas

pertencentes classe Methanomicrobia. So as espcies de arquias mais conhecidas e
estudadas. Esto amplamente distribudas em ambientes anxicos naturais, como sedimentos
aquticos profundos, pntanos, trato digestivo de ruminantes, animais endotrmicos e alguns
insetos, digestores anaerbios de tratamento de resduos e de efluentes e aterros sanitrios
(VAZOLLER et al., 1999). Na Tabela 3.2, so apresentados alguns grupos de arquias
encontrados em sistemas de tratamento anaerbio, citados na literatura, bem como a
morfologia tpica de cada grupo.
Tabela 3.2 Principais grupos de arquias metanognicas encontrados em
sistemas de tratamento anaerbio
Ordem
Methanosarcinales
Famlia
Methanosaetaceae
Gnero
Methanosaeta
Methanosarcina
Methanosarcinaceae
Methanomethylovorans
Methanobacteriales
Methanobacteriaceae
Methanomicrobiaceae
Methanomicrobiales
Methanospirillaceae
Methanocorpusculaceae
Methanobacterium
Methanobrevibacter
Methanosphaera
Methanomicrobium
Methanogenium
Methanoplanus
Methanoculleus
Methanospirillum
Methanocorpusculum
Morfologia (*)
Filamentos longos e finos
Agregados de cocos
irregulares
Dois ou quatro cocos
irregulares, formando
agregados
Filamentos curtos ou longos
Filamentos curtos
Cocos
Filamentos curtos
Cocos irregulares
Clulas formam placas finas
Cocos irregulares
Espirilos
Cocos irregulares
Fonte: (*) Whitman et al. (1992); Madigan et al. (2003)
De acordo com o tipo de substrato para o crescimento e formao de metano, as arquias

metanognicas podem ser classificadas, conforme mostrado na Tabela 3.3, em trs grupos
fisiolgicos: metanognicas metilotrficas, que utilizam compostos metilados como
metilaminas, metanol e metanotiol; metanognicas hidrogenotrficas (maioria das espcies),
que utilizam o gs carbnico e o hidrognio, formiato ou alguns lcoois; metanognicas
acetotrficas ou acetoclsticas, que utilizam acetato (WHITMAN et al., 1992).
14
Tabela 3.3 Vias metablicas da metanognese e arquias associadas

Via metablica
Ordem
Methanosarcinales
(Methanosaeta,
Methanosarcina)
Methanosarcinales
(Methanosarcina)
Methanobacteriales
Hidrogenotrfica
Methanococcales
Methanomicrobiales
Methanopyrales
Methanosarcinales
Metilotrfica
(Methanosarcina)
Acetoclstica
Go (kJ/mol
de CH4)
Reao
CH3COOH CH4 + CO2
-31,0
4H2 + CO2 CH4 + 2H2O

4HCOOH CH4 + 3CO2 + 2H2O
-135,6
-130,1
4CH3OH 3CH4 + CO2 + 2H2O

4CH3NH2 + 2H2O 3CH4 + CO2 +4NH3
-104,9
-75,9
Fonte: Carpentier et al. (2006)
Dentre as cinco ordens, somente a Methanosarcinales inclui os nicos dois gneros

conhecidos de arquias acetoclsticas: Methanosaeta e Methanosarcina. O primeiro, nico da
famlia Methanosaetaceae, constitudo por espcies que formam filamentos longos e finos,
importantes na formao da trama microbiana presente nos grnulos de reatores anaerbios.
especialista, tendo uma alta afinidade pelo acetato, mas uma taxa de crescimento especfico
relativamente baixa (tempo de duplicao celular de 3,5 a 9 dias) (JETTEN et al., 1992). Os
membros do gnero Methanosarcina, pertencente famlia Methanosarcinaceae, formam
cocos que se agregam, formando pacotes, e so generalistas (seus membros podem
apresentar os trs tipos de metabolismo). Tm uma taxa de crescimento especfico maior (24
horas de tempo de duplicao celular), quando comparada ao da Methanosaeta, entretanto,
apresenta uma baixa afinidade pelo acetato (JETTEN et al., 1992).
3.4 Distribuio das arquias

tratamento anaerbio
metanognicas
em
sistemas
de
3.4.1 Distribuio espacial em grnulos anaerbios

A biogranulao envolve interaes clula-clula que incluem os fenmenos fsico-qumicobiolgicos. Os grnulos constituem-se de densos consrcios microbianos com diferentes
espcies. So capazes de alta reteno de biomassa, tipicamente contendo milhes de
organismos por grama e podem tratar efluentes com alta carga orgnica ou resistir a eventuais
choques de carga no tratamento de outros tipos de guas residurias (LIU et al., 2004).
A composio microbiana dos grnulos metanognicos tem sido extensamente estudada no
que diz respeito sua estrutura interna e distribuio espacial dos microrganismos por vrios
15
grupos de pesquisadores (SEKIGUCHI et al., 1998; TAGAWA et al, 2000; CHAN et al.,
2001; LIU et al., 2002; BATSTONE et al., 2004; LIU et al., 2004; DAZ et al., 2006). O
modelo de distribuio de microrganismos em grnulos mostra que microrganismos
metanognicos localizam-se no interior, enquanto que as bactrias predominam na regio
perifrica do grnulo (SEKIGUCHI et al., 1998). Esta separao espacial dos microrganismos
parece estar relacionada disponibilidade de substrato, ou seja, substratos orgnicos so
degradados a medida que penetram no grnulo o que faz com que substratos precursores de
metano estejam disponveis apenas no interior do grnulo.
De acordo com Batstone et al. (2004), um timo desempenho de reatores UASB depende de
um lodo granular bem desenvolvido. Certas propriedades, tais como alta resistncia a choques
fsicos e a toxinas e alta velocidade de sedimentao, so desejveis nos grnulos e devem ser
fortemente influenciados por suas estruturas microbiana e fsica. Os estudos realizados em
microscopia eletrnica e FISH por esses pesquisadores sobre a estrutura e composio
microbiana de grnulos de quatro tipos de reatores UASB, em escala plena, revelaram
resultados interessantes. Um dos reatores tratava efluente de fbrica de conservas (rico em
sacardeos solveis), o segundo reator tratava efluente de matadouro (rico em protenas
solveis, protenas e cidos graxos particulados) e os dois ltimos tratavam efluentes de
cervejarias. A diversidade microbiana foi maior nos grnulos de protenas, enquanto que nos
outros, foram vistos apenas 3 a 4 grupos principais. Os grnulos que tratavam efluente rico em
protenas se caracterizavam por uma baixa densidade de microrganismos, apesar da maior
diversidade, e pela ausncia de uma estrutura interna em camadas, como vista comumente nos
outros tipos de grnulos. A razo pode ser a natureza particulada do efluente que, com baixa
carga orgnica disponvel, oferece uma hidrlise limitada dos substratos. H indcios de que
os grnulos desse tipo so mais densos e crescem 50% menos do que os outros.
Segundo Daz et al. (2006), em vrios estudos, tanto com reatores em escala plena, quanto em
escala laboratorial, freqentemente observam-se grnulos com diferentes tamanhos (de
centenas de micrmetros a poucos milmetros) e com diferentes cores. Em seus estudos de
caracterizao de grnulos de um reator UASB tratando efluente de cervejaria, diferentes
tcnicas de biologia molecular (FISH, DGGE e clonagem), alm de microscopia eletrnica,
foram combinadas para elucidar a relao de estrutura-funo nos diferentes grnulos. Seus
resultados mostraram grnulos com diferentes tamanhos e taxas de sedimentao, com cores
que variavam de preto, cinza e marrom. Na visualizao por microscopia eletrnica,
verificou-se que os grnulos pretos eram pequenos e compactos, os marrons, menos
16
compactos e porosos e os cinzas, compostos por vrias camadas definidas e concntricas de

microrganismos.
No estudo conduzido por Diaz et al. (2006), a localizao de bactrias e arquias nos grnulos
anaerbios foi feita por meio de FISH. Nos grnulos pretos, as bactrias apareciam na parte
externa, enquanto que as arquias formavam densos agrupamentos dentro dos grnulos,
entretanto, com baixa atividade. Bactrias Gram-negativas eram as bactrias mais abundantes
em grnulos pretos e cinzas, porm, ausentes em grnulos marrons. Com respeito ao domnio
Archaea, em todos os trs tipos de grnulos, o gnero Methanosaeta foi predominante (75 a
96% do total de clulas de arquias). As bandas mais intensas do DGGE de arquias foram
excisadas, analisadas por meio de clonagem e seqenciadas, estando mais prximas
filogeneticamente de Methanosaeta concilii, Methanosarcina mazei e Methanospirillum
hungatei. Segundo os autores, os resultados so indicaes de que os diferentes tipos de
grnulos refletiriam diferentes passos no desenvolvimento do lodo e na degradao
metanognica e, recentemente, tem sido proposto um modelo para explicar esse fenmeno
(PICIOREANU et al., 2005).
Grnulos pretos seriam grnulos jovens e que bactrias Gram-negativas (principalmente proteobactria) e arquias dos gneros Methanosarcina e Methanospirillum seriam os
microrganismos pioneiros. Como conseqncia dos problemas de difuso e da perda de
nutrientes, o crescimento ocorreria principalmente na periferia do grnulo, formando
multicamadas. Bactrias metabolicamente ativas colonizariam a superfcie dos grnulos,
enquanto que compostos no meio so ativamente degradados e arquias metanognicas
desenvolveriam-se no interior dos grnulos, formando grandes colnias. provvel que
relaes sintrficas sejam estabelecidas entre bactrias acetognicas redutoras de prtons e
arquias consumidoras de hidrognio. Os grnulos cinzas tm uma forma esfrica ou elipside
e correspondem maioria dos grnulos presentes no lodo. Os microrganismos predominantes
nestes grnulos foram as bactrias Gram-positivas e as arquias do gnero Methanosaeta. Os
grnulos marrons seriam os grnulos velhos, relativamente grandes, que possuem uma
estrutura leve e fofa, cheia de reas e canais entre as camadas e no interior do grnulo, que
teriam surgido devido a problemas de difuso. Hibridizao com sondas fluorescentes
mostrou que a parte interna de grnulos marrons e cinzas exibe pouca ou nenhuma atividade
microbiana. Somente os grnulos pretos parecem abrigar microrganismos ativos no seu
interior (DAZ et al., 2006).
17
3.4.2 Variaes populacionais e estabilidade funcional da comunidade metanognica

em reatores tratando efluentes sintticos
Pelo fato da decomposio anaerbia se tratar de um processo biolgico lento e complexo,
susceptvel a vrias interferncias externas ou ambientais, grande parte dos experimentos so
conduzidos com efluentes sintticos sob condies controladas, durante vrios meses ou anos.
Reatores em escala laboratorial so relativamente pequenos, com pouca capacidade (1,4 a 16
L) e com controle de parmetros tais como pH (7,0 7,2), alcalinidade, DQO afluente.
Geralmente, so mantidos sob agitao contnua e em temperatura mesoflica (35C). Alguns
estudos so conduzidos em temperatura termoflica (55C).
Um dos primeiros estudos de caracterizao microbiana de sistemas anaerbios foi o de
Raskin et al. (1994) usando a tcnica de hibridizao em membrana com RNAr. Em seus
estudos com 2 frascos de cultivo anaerbio, submetidos a alimentao com glicose (8 e 11
meses) e, depois, com acetato (10 e 7 meses), como nica fonte de carbono, mostraram que,
em ambas as situaes, verificou-se uma reduo significativa da porcentagem de bactrias
(3,4% e 3,0% do RNAr total) e aumento na porcentagem de arquias (86% e 96%). Anlises
de FISH mostraram um predomnio de agregados multicelulares de Methanosarcina (famlia
Methanosarcinaceae) enquanto filamentos de Methanosaeta foram virtualmente ausentes. O
predomnio de membros de Methanosarcina pode ter sido favorecido por causa das
concentraes relativamente altas de acetato presentes nos frascos (100 a 200 mg/L).
Resultados foram encontrados por Fernndez et al. (2000) e Hashsham et al. (2000), que
mostraram que nem sempre uma alta diversidade de microrganismos significa maior
estabilidade do sistema diante de condies perturbadoras ou desequilbrios no meio. O
aparato experimental de ambos os estudos constitua-se de oito reatores anaerbios
mesoflicos, alimentados com soluo de glicose enriquecida e tamponada. Quatro reatores
foram submetidos ao suprimento de glicose durante 200 dias e os outros quatro, por 60 dias.
Anlise microbiana feita por microscpopia de contraste de fase e biologia molecular indicou
que os reatores operados por mais tempo continham uma elevada abundncia de
microrganismos, porm com baixa diversidade, com alta quantidade de espiroquetas,
denominado de high-spirochete (HS), enquanto que os reatores operados em menos tempo
(mais jovem) continham uma biomassa mais diversa, porm menos abundante, com menor
quantidade de espiroquetas, chamados low-spirochete (LS). Apesar desta significativa
diferena em termos de abundncia e diversidade microbiana, ambos os reatores apresentaram
18
a mesma eficincia de remoo, indicando que a estabilidade funcional pode no depender de

uma estabilidade na estrutura microbiana.
No estudo de Fernndez et al. (2000) foram detectados baixos nveis de RNAr de bactrias (2
a 4%), semelhantes aos encontrados por Raskin et al. (1994). Apesar de restrita e pequena, a
comunidade de bactrias era mais diversa e sofreu maiores alteraes que a de arquias frente
ao choque orgnico. O fato da comunidade de bactrias ser consideravelmente mais diversa e
estar sujeita a maiores variaes populacionais que a de arquias uma informao consenso
em diversos trabalhos descritos na literatura (FERNNDEZ et al., 1999; CASSERLY et al.,
2003; LECLERC et al., 2004; ZHANG et al., 2005a; BUZZINI et al., 2006; HORI et al.,
2006). Hori et al. (2006) chegam a inferir que a comunidade de arquias seria mais
influenciada pela concentrao de AGV e a de bactrias, pela variao de pH e,
provavelmente, no tipo de efluente a ser tratado.
Nos estudos de Fernndez et al. (2000) e Hashsham et al. (2000), embora com uma baixa
variabilidade de arquias, houve uma notvel diferena entre o predomnio de populaes
desta comunidade em cada conjunto de reatores. Nos reatores HS, onde houve acmulo de
cidos
orgnicos,
membros
de
arquias
acetoclsticas,
pertencentes
ao
gnero
Methanosarcina, foram predominantes (mais de 61% do RNAr total de arquias), seguidos de

Methanomicrobiales (menos de 20%), Methanosaeta (11 a 19%), Methanobacteriales (6 a
12%). Em contraste, nos reatores LS, houve o predomnio de arquias hidrogenotrficas da
ordem Methanomicrobiales (mais de 60%); seguidas de Methanosaeta (20 a 38%);
Methanosarcina (cerca de 1%), Methanobacteriales (menos de 1%).
Provavelmente, as diferenas observadas nas populaes de arquias no estudo de Fernndez
et al. (2000) e Hashsham et al. (2000) foram diretamente influenciadas pela comunidade de
bactrias, uma vez que estas so as que produzem os substratos precursores metanognicos.
Isto foi comprovado nos experimentos conduzidos por Sanz et al. (2005) com reatores
anaerbios (UASB) submetidos a vrios tipos de efluentes sintticos, previamente inoculados
com lodo de outro reator UASB que tratava efluente de cervejaria. Os pesquisadores
observaram que a porcentagem de arquias em relao ao nmero de procariontes era em
torno de 58 a 59% em grnulos tratando substratos complexos, atingindo mais de 90% em
grnulos tratando efluentes ricos em AGV, como acetato e propionato, e at 100%, no
tratamento de formiato. O gnero Methanosarcina e membros de Methanobacteriales eram
maioria em grnulos cultivados em altas concentraes de acetato e formiato,
19
respectivamente, enquanto que o gnero Methanosaeta predominou na presena de substratos

complexos ou em baixas concentraes de acetato.
Outra informao importante obtida nos estudos de Fernndez et al. (2000), que, mesmo
aps o choque orgnico, o desempenho dos reatores foi uniforme, (remoo de DQO em torno
de 93%), apesar da variao observada na estrutura da comunidade microbiana, indicando que
houve uma replicao da funo, sem, no entanto, a replicao da estrutura da comunidade,
ou seja, outros grupos microbianos estavam presentes, desenvolvendo as mesmas funes
metablicas. Resultados das anlises microbiolgicas e qumicas indicaram que o reatores HS
consumiram a glicose de modo paralelo (glicose a acetato, glicose a butirato, etc) em 10
horas, enquanto que os reatores LS consumiram a glicose de modo serial (glicose a lactato;
lactato a butirato; butirato a acetato) em 20 horas. Isto resultou numa recuperao do conjunto
HS (16 a 24 dias) ao estado constante (steady-state), similar quele antes do choque, mais
rpida do que a do conjunto LS (cerca de 40 dias).
Fernandez et al. (2000) e Hashsham et al. (2000) concluram que as funes ecolgicas de
comunidades microbianas similares so replicveis dentro de sistemas complexos. Entretanto,
a estabilidade de um sistema ecolgico pode estar mais ligada a uma comunidade mais
flexvel quanto sua capacidade de deslocar, de maneira eficiente, vias metablicas
alternativas do que propriamente a uma maior diversidade de microrganismos. Dependendo
das populaes microbianas envolvidas, a presena de um grupo menor, mas importante, pode
definir essas vias metablicas. Alm disso, reduo na diversidade no significou,
necessariamente, reduo na estabilidade do sistema; em outras palavras, estabilidade
funcional no implicou em estabilidade na estrutura da comunidade microbiana envolvida.
3.4.3 Estrutura e composio da comunidade de arquias metanognicas em sistemas
anaerbios em escala plena
Leclerc et al. (2004) avaliaram a diversidade de arquias em 44 sistemas anaerbios, em
escala laboratorial ou plena, localizados em diferentes pases (Frana, Espanha, Austrlia,
Mxico, Canad, Irlanda, Alemanha e Reino Unido), de diferentes configuraes (reator de
filme fixo, reator de leito fluidizado, tanque de mistura completa, reator seqencial em
batelada, reator UASB e lagoa anaerbia), tratando resduos slidos municipais e efluentes de
agricultura, de indstrias de processamento de alimento, de petroqumica, de fbrica de polpa
de papel, de cervejarias e de matadouros. Por meio de anlise de PCR-SSCP, eles
encontraram 4 a 6 picos distintos de arquias em cada tipo de reator. Todas as seqncias
20
genticas foram relacionadas ao filo Euryarchaeota, sendo que as mais freqentes estavam
mais prximas espcie Methanosaeta concilli e ao gnero Methanobacterium (freqncia de
84% e 73%, respectivamente). O estudo mostrou tambm outras seqncias, prximas aos
gneros Methanobrevibacter, Methanoculleus, Methanospirillum, Methanocorpusculum,
Methanosarcina e Methanomethylovorans. Um grande nmero de seqencias, entretanto, foi
relacionado a clones com propriedades fisiolgicas ainda desconhecidas, que tm sido obtidas
de ecossistemas diferentes de reatores anaerbios (CASSERLY et al., 2003; CHOUARI et al.
2005; ROEST et al., 2005; KEYSER et al., 2006). Nos estudos de Chouari et al. (2005), a
maioria dos clones de arquias encontrados (66,6%) foi reunida em um grupo ainda no
identificado.
Leclerc et al. (2004) afirmaram que, alm de parmetros ambientais, a origem do inculo e a
configurao dos reatores podem influenciar na ocorrncia e na distribuio das espcies de
arquias. Os reatores em escala laboratorial apresentaram uma diversidade ligeiramente
menor que a dos reatores em escala plena. Dentre os tipos de reatores, os de mistura completa
parecem abrigar uma diversidade considervel, com grande freqncia de clones ainda
desconhecidos, significando que os outros reatores devem impor maior presso seletiva. Outro
aspecto que a freqncia de Methanosarcina frisus parece ser mais alta nos reatores de filme
fixo e de mistura completa, enquanto que ausente ou muito baixa em reatores UASB.
Methanosarcina frisus foi freqentemente isolada de reatores onde Methanosaeta concilli no
era predominante, o que sugeriu uma excluso mtua entre as espcies, confirmando assim a
competio entre as mesmas. Os reatores UASB parecem favorecer a presena do gnero
Methanosaeta, o que pode refletir sua grande importncia na estabilizao dos grnulos.
Resultados de Casserly et al. (2003) mostraram uma brusca alterao funcional da
comunidade microbiana, provavelmente, em resposta adaptao ao efluente, caracterizada
pelo aumento da atividade de arquias em relao de bactrias, com o conseqente
deslocamento de uma populao sintrfica, constituda por microrganismos oxidadores de
acetato e arquias hidrogenotrficas para o predomnio de uma populao de arquias
acetoclsticas. Estes resultados corroboram com os de Delbs et al. (2001) e Leclerc et al.
(2001) que monitoraram um reator anaerbio, em escala de bancada, alimentado com glicose.
Roest et al. (2005) avaliaram a diversidade microbiana de um reator UASB mesoflico,
estvel, tratando efluente de fbrica de papel na Holanda. Perfis de DGGE foram feitos em
vrios momentos e comparados, no sendo verificada nenhuma mudana significativa na
21
diversidade microbiana, somente leves flutuaes populacionais. Por meio de clonagem e

seqenciamento de fragmentos obtidos de DGGE, os autores determinaram que a microbiota
do reator consistia de mltiplas espcies e gneros de microrganismos com propriedades
fisiolgicas similares e que a estabilidade temporal da comunidade sugeria que um equilbrio
funcional havia sido alcanado, uma redundncia funcional que refora a elasticidade do
grnulo mesoflico. Tal hiptese corrobora com alguns estudos feitos em reatores, em escala
de bancada, tratando efluentes sintticos (FERNNDEZ et al., 2000; HASHSHAM et
al.,2000).
3.4.4 Fatores que controlam a distribuio de metanognicas em reatores anaerbios
Em todos os sistemas biolgicos de tratamento de efluentes, a remoo efetiva de poluentes
depende no apenas do potencial metablico dos microrganismos, mas tambm de condies
ambientais
apropriadas
para
tais
atividades.
As
caractersticas
fisiolgicas
dos
microrganismos metanognicos, tais como o baixo crescimento inerente e a alta

susceptibilidade a variaes nas condies externas (pH, temperatura ou substratos qumicos),
tornam o processo de tratamento anaerbio sensvel a mudanas ambientais. Estes
desequilbrios podem levar ao acmulo de cidos graxos volteis (AGV), com reduzida
produo de metano no biogs, levando a uma reduo na eficincia dos reatores, causando
colapso no processo ou, pelo menos, longos perodos para sua recuperao (DELBS et al.,
2001; AQUINO e CHERNICHARO, 2005; HORI et al.,2006,).
Fatores como composio e concentrao de nutrientes, temperatura, pH, intensidade de
mistura, toxicidade tm sido amplamente investigados. Em particular, a eficincia de reatores
UASB est relacionada a vrios fatores ambientais e operacionais incluindo o TDH, a
velocidade ascensional, a carga orgnica aplicada, a DQO afluente, a temperatura de
operao, a presena de inibidores e de compostos xenobiticos, bem como a configurao do
reator (LETTINGA, 1995).
Anlises minuciosas da estrutura e da atividade da comunidade microbiana envolvida na
digesto anaerbia em situaes de estresse, desequilbrio ou estabilidade dos reatores, sob
diferentes condies operacionais, tm sido intensivamente realizadas, no intuito de se
compreender o processo biolgico e, conseqentemente, o desempenho de reatores anaerbios
em escala plena. Na literatura, h vrios estudos de caracterizao da estrutura da comunidade
microbiana e monitoramento de suas dinmicas populacionais em reatores, em escala
laboratorial, tratando efluentes sintticos constitudos de substratos prontamente utilizveis,
22
tais como glicose e acetato, alm de nutrientes (RASKIN et al. 1994; SEKIGUCHI et al.,
1998; FERNNDEZ et al., 2000; HASHSHAM et al., 2000; DELBS et al., 2001;
LECLERC et al., 2001; SANZ et al. 2005; HORI et al., 2006).
Segundo Leito et al. (2006), em reatores UASB as variaes na carga hidrulica afetam
especificamente a dinmica da manta de lodo, devido sua expanso ou contrao,
determinados pelo equilbrio entre a velocidade ascensional e a velocidade de sedimentao
do lodo. Dessa forma o aumento da carga hidrulica aplicada pode resultar em um aumento na
concentrao de slidos suspensos no efluente devido ao arraste de biomassa mais leve,
reduo na capacidade de filtragem da manta de lodo em altas velocidades ascensionais, e
desintegrao dos grnulos ou flocos (YANG e ANDERSON, 1993; LEITO et al., 2006).
Alm desses efeitos fsicos, o aumento na velocidade ascensional (devido ao aumento da
vazo) causar um aumento da carga orgnica aplicada, o que pode resultar, a depender da
ecologia microbiana presente no reator antes do choque de carga, em acmulo de cidos
graxos volteis. O acmulo de AGV associado ao aumento da produo de CO2 pelas
bactrias acidognicas, consumir alcalinidade do meio e pode levar reduo do pH a
depender da capacidade de tamponamento do sistema. A queda no pH e o acmulo de AGV
contribuem para inibies de ordem termodinmica e cintica dentro dos reatores anaerbios,
resultando em queda na produo de metano e falha do sistema de tratamento como um todo.
Essa srie de eventos est intimamente relacionada s espcies microbianas predominantes
nos reatores, e por isso importante se estudar a dinmica de populao em reatores UASB
submetidos a choques de carga orgnica e hidrulica. Segundo Fernndez et al. (1999) a
estabilidade funcional de um reator no necessariamente implica em estabilidade na
comunidade microbiana, uma vez que uma comunidade dinmica pode ser desenvolvida no
ecossistema. Tambm suposto que a instabilidade de um sistema e a queda na sua eficincia
estejam intrinsecamente relacionadas a flutuaes na comunidade microbiana e
predominncia de determinados grupos. Portanto, mais investigaes envolvendo a estrutura e
dinmica de populaes durante a operao de reatores, principalmente em sistemas reais de
tratamento, associadas caracterizao qumica detalhada, devem ser realizadas para que os
processos de degradao biolgica da matria orgnica em reatores sejam melhor
compreendidos.
Leito et al. (2006) observaram que a inibio da metanognese, acarretada pelo aumento da
carga aplicada (aumento da vazo), foi relacionada uma mudana na comunidade
23
microbiana do grnulo, de uma biomassa predominantemente metanognica para uma

biomassa no-metanognica constituda principalmente for longos filamentos.
O grau e o tipo de mistura tambm afetam a taxa de crescimento e a distribuio dos
microrganismos na manta de lodo, alm de ditarem a disponibilidade de substrato e as taxas
de sua utilizao, influenciam na granulao e na produo de biogs. Em reatores do tipo
UASB, uma mistura adequada entre lodo e a gua residuria alcanada principalmente pelo
sistema de distribuio do afluente associado a uma velocidade ascensional mnima
(LETTINGA, 1995). Segundo este autor, uma mistura inadequada causada por altos valores
de TDH, levaria a um elevado tempo de contato entre o substrato e a biomassa, em particular
dos cidos graxos produzidos, os quais podem inibir a atividade microbiana dependendo da
sua concentrao. Por outro lado, a reduo excessiva do TDH pode resultar em diminuio
da eficincia de tratamento devido a no converso de substrato afluente, que vai depender
dos parmetros cinticos vigentes.
De acordo com Speece (1996) muitas substncias inibidoras podem entrar em contato com a
biomassa ou por estarem presentes no afluente do reator, ou porque so produzidas durante o
metabolismo microbiano. Tais substncias inibidoras, que podem diminuir a taxa da digesto
ou levar a uma falha no tratamento, incluem metais pesados, AGV, oxignio, amnia, e
sulfeto. Em particular, a inibio por AGV ocorre por questes termodinmicas, pela
conseqente reduo do pH do meio, e tambm pela toxicidade direta dos cidos, que na
forma protonada (no ionizada) tem maior facilidade de atravessar a membrana plasmtica
das clulas (HAJARNIS e RANADE, 1994).
O efeito da temperatura no desempenho geral do reator depende no s do seu valor absoluto,
mas tambm da durao do choque, ou seja, no tempo em que o reator ser operado fora da
faixa de temperatura ideal. Alm disso, o efeito causado pela mudana na temperatura de
operao depender das caractersticas do lodo bem como da dinmica de populao que pode
suceder quela mudana ambiental. Em temperaturas que excedam a taxa mxima de
crescimento microbiano, a taxa de decaimento celular exceder a taxa de crescimento
microbiano e conseqentemente ocorrer um decrscimo na atividade especfica do lodo e a
eficincia do reator (VAN LIER et al., 1990). Geralmente o efeito de um choque de
temperatura gera um desbalano na digesto anaerbia devido a diferentes respostas dos
vrios grupos metablicos de microrganismos. Um exemplo direto do efeito da temperatura
na estrutura da comunidade microbiana com relao s bactrias oxidadoras de propionato,
24
que geralmente so os microrganismos mais sensveis ao aumento da temperatura, assim uma

diminuio de sua atividade metablica poderia levar a um acmulo de propionato no sistema.
As arquias metanognicas so mais sensveis s mudanas na temperatura do que as
bactrias acidognicas. Dessa forma a mudana de temperatura pode comprometer a
eficincia do sistema de tratamento pelo aumento indireto na presso de hidrognio no
ambiente (VAN LIER et al., 1990). Entretanto, se a mudana de temperatura permanecer por
um longo tempo, uma nova populao ativa de microrganismos adaptados condio imposta
ir ser formada, e uma boa eficincia do tratamento poder ser alcanada.
A partida ainda um passo crtico na operao da digesto anaerbia. Vrios fatores so
considerados importantes, como quantidade de inculo, fonte de microrganismos, tipo de
efluente, suporte e fixao da biomassa. Os dois principais estgios limitantes do processo
so: o estgio inicial de hidrlise de compostos complexos e recalcitrantes e a metanognese.
Com o objetivo de investigar a composio e a dinmica de atividade metablica da
comunidade de arquias e bactrias durante a partida de um reator e ao longo de sua operao,
especialmente em situao de excesso de carga orgnica, Delbs et al. (2001) e Leclerc et al.
(2001) monitoraram um digestor anaerbio mesoflico durante 497 dias, alimentado com
glicose. O inculo foi obtido de lodos coletados de uma lagoa anaerbia e dois digestores em
escala industrial, todos tratando resduos de destilaria. Anlises da diversidade e da atividade
microbiana, por meio de PCR-RT-SSCP, mostraram que a seqncia gentica da arquia
predominante era mais prxima a Methanosaeta concilli, indicando que o inculo abrigava
arquias acetoclsticas como espcies dominantes. A microbiota de arquias inclua tambm
seqncias isoladas de outros ambientes, tais como digestores termoflicos, e outros grupos
fisiolgicos, como hidrogenotrficos e consumidores de formiato, relacionadas a
Methanocorpusculum parvum, Methanoculleus palmeoli, Methanocalculus halotolerans e um
clone prximo a Methanobacterium.
O reator apresentou desempenho variado durante o estudo, apresentando alteraes
populacionais em decorrncia da concentrao de substratos intermedirios. A carga orgnica
foi aumentada de 0,5 a 2,0 g de DQO/ L.d durante a partida. A produo de metano aumentou
at 55% nos primeiros 20 dias, com rpido consumo de glicose at o dia 40. Houve um
perodo (compreendido entre os dias 55 e 80) marcado pelo acmulo de AGV (70% de acetato
e 18% de propionato). Isso significa que a degradao de acetato no acompanhou a produo
de tal substrato, uma vez que a taxa de crescimento das arquias acetoclsticas muito menor
em comparao com a taxa de bactrias. Anlises da diversidade e da atividade microbiana,
25
por meio de PCR-RT-SSCP, mostraram a predominncia de arquias hidrogenotrficas mais

prximas a Methanobacterium formicium. No dia 70, a alimentao do reator foi interrompida
e suplementos (FeCl3, MgSO4 e extrato de levedura) foram adicionados para favorecer a
degradao do acetato, o que levou ao aumento de metano no biogs (73%). A maior crise
ocorreu entre os dias 170 e 250, nos quais a concentrao de acetato excedeu 1500 mg/ L com
acmulo de pequenas quantidades de propionato (300 mg/ L). O dia 245 marcou o incio de
uma importante mudana fisiolgica no digestor, perodo de degradao do acetato, quando
ocorreu um notvel deslocamento populacional de arquias hidrogenotrficas para
acetoclsticas, com predomnio de Methanosaeta concilii. No dia 271, um novo ecossistema
foi restabelecido, com o predomnio de arquias acetoclsticas e bactrias espiroquetas.
Em situaes nas quais a concentrao de acetato alta, especialmente durante partida de
reatores, seria de se esperar a presena de Methanosarcina como espcie acetoclstica
predominante. H a sugesto de que outros fatores poderiam influenciar na competio entre
Methanosarcina e Methanosaeta, tais como diferenas no rendimento de ATP e requisitos
nutricionais (RASKIN et al., 1994; LECLERC et al., 2001). Diante dos resultados, Leclerc et
al. (2001) concluram que o funcionamento estvel de um biorreator parece estar ligado a uma
microbiota mnima metanognica, constituda por arquias hidrogenotrficas e acetoclsticas.
Tal observao consenso em outros estudos (FERNNDEZ et al., 1999; LECLERC et al.,
2004).
Resultados diferentes dos de Leclerc et al. (2001) foram obtidos por Hori et al. (2006), que
analisaram amostras de um reator termoflico inoculado com lodo de um processo termoflico
de tratamento de resduo slido, tambm alimentado com glicose, durante 90 dias. A taxa de
produo de biogs e concentrao de AGV foram constantemente monitorados. O pH foi
mantido a 7,1 com adio de NaOH a partir do 45 para recuperao da condio deteriorativa
induzida pela acidificao. A concentrao de AGV aumentou e a taxa de produo de biogs
diminuiu nos 6 dias subseqentes. Nos dias 51 a 56, perodo marcado pela degradao do
acetato acumulado, os pesquisadores verificaram, por anlise de PCR-SSCP, que arquias
acetoclsticas mais prximas a Methanosarcina thermophila eram predominantes.
Methanoculleus thermophilicus predominou ou cresceu favoravelmente em baixas
concentraes de acetato (menor que 1 mM ou 59 mg/L) nos primeiros 30 dias, no dia 90 e
nos dias 56 a 78. Methanothermobacter thermoautotrophicus tornou-se a metanognica
hidrogenotrfica predominante durante o acmulo de propionato (maior que 1,4 mM). O
26
crescimento de Methanoculleus spp. conhecido ser prefervel a Methanothermobacter spp.

em baixas concentraes de hidrognio.
3.4.5 Distribuio de arquias nos diversos sistemas de tratamento anaerbio em
escalas laboratorial e plena
Na maioria dos estudos com digesto anaerbia, que se encontram apresentados nas Tabelas
3.4, 3.5 e 3.6, independente da configurao do reator, da temperatura, do efluente ou resduo
tratado e da tcnica de anlise molecular escolhida, as arquias predominantes em reatores em
escala plena e laboratorial so as metanognicas acetoclsticas, mais relacionadas famlia
Methanosaetaceae ou ao gnero Methanosaeta, sendo mais comumente prximas
filogeneticamente a Methanosaeta concilii. Microrganismos deste gnero chegam a constituir
mais de 50% da atividade metablica ou da densidade de arquias nos mais diferentes
ecossistemas. O segundo grupo predominante o de arquias hidrogenotrficas. Dentre estas,
duas ordens so intensamente detectadas: Methanobacteriales e Methanomicrobiales, porm
com indicaes de que so competidoras entre si. Dentro da ordem Methanobacteriales,
clones mais prximos a Methanobacterium formicium so os mais freqentemente
identificados.
Entretanto, a composio qumica dos resduos tratados um fator importante na definio da
biodiversidade microbiana como um todo. Durante a partida e evoluo dos reatores, observase que a composio e a diversidade da microbiota do lodo variam intensamente de acordo
com a gua residuria ou resduo que est sendo tratado. O lodo utilizado como inculo,
geralmente, obtido de ecossistemas complexos (lagoas anaerbias, reatores anaerbios em
escala plena), onde h presena de vrias fontes de carbono polimricas. Reatores em escala
de bancada so operados, normalmente, em condies estreis, com glicose ou acetato como
nica fonte de carbono, ou uma mistura de AGV de cadeia curta constituindo o efluente a ser
tratado. A abundncia de bactrias diminui em reatores tratando efluentes simples, enquanto
que a de arquias sofre alteraes populacionais bruscas, podendo chegar a constituir mais de
90% da atividade metablica ou das clulas microbianas (RASKIN et al., 1994; SANZ et al.
2005). Na maioria dos casos, h coexistncia de arquias acetoclsticas e hidrogenotrficas,
contudo a prevalncia de um dos grupos parece depender da concentrao de AGV,
principalmente de acetato.
27
Em contrapartida, em alguns sistemas de tratamento anaerbio em escala plena (Tabela 3.5),

cujas condies no so totalmente controladas, tais como digestores de lodo e aterros
sanitrios, anlises moleculares indicam que a atividade ou a diversidade de arquias menor
que a de bactrias (menos de 10% da atividade microbiana ou menos de 20% da diversidade
microbiana total, respectivamente). Entretanto, em outros sistemas em escala plena, por
exemplo, reatores UASB tratando efluente de cervejaria (Tabela 3.6), a comunidade de
arquias bastante expressiva, chegando a constituir mais de 78% da comunidade microbiana
(DAZ et al. 2006). Isto pode ser devido ao fato de que reatores UASB em escala industrial ou
laboratorial so, usualmente, submetidos ao monitoramento constante de pH, de alcalinidade e
ao controle da entrada de carga orgnica, evitando-se o colapso do sistema e mantendo-se
estvel seu funcionamento, com altas eficincias de remoo de DQO (variando de 75 a
90%).
H indcios de que as arquias hidrogenotrficas se proliferam em situaes de sobrecarga
orgnica ou durante a partida de reatores anaerbios, quando ocorre acmulo de substratos da
fase acidognica, resultantes da intensa atividade de bactrias fermentativas (AGV, H2, CO2,
formiato). Outro fator que pode influir na comunidade metanognica a concentrao de
nitrognio amoniacal, uma das substncias txicas mais comuns encontradas no tratamento
anaerbio de resduos contendo protenas, tais como o lixiviado. Dentre outros efeitos, sua
influncia principal est na fase metanognica. Dentre as arquias, parece que as
acetoclsticas so mais sensveis a elevados nveis de amnia livre que as hidrogenotrficas.
Em alguns estudos, verificou-se que os nveis inibitrios esto em torno de 700 e 1200 mg/L
de amnia livre para acetoclsticas e hidrogenotrficas respectivamente. Dentre as
acetoclsticas, membros de Methanosaeta so mais sensveis que os de Methanosarcina
(CALLI et al., 2005).
Aps a partida de reatores anaerbios e alcance de desempenho estvel e satisfatrio, a
tendncia uma adaptao do inculo, com diminuio da diversidade de arquias e aumento
da abundncia relativa de determinados grupos, com transio de uma populao
hidrogenotrfica para uma populao essencialmente acetoclstica. Em reatores bemoperados, predominam arquias acetoclsticas do gnero Methanosaeta. Arquias
acetoclsticas da famla Methanosaetaceae ou do gnero Methanosaeta predominam em
situaes estveis e com baixa concentrao de AGV, casos observados no tratamento em
escala plena de lodo ou esgoto sanitrio (YU et al. 2005; ZHANG et al. 2005b).
28
O fato de a diversidade microbiana ser alterada nos sistemas anaerbios nem sempre quer
dizer alterao na eficincia de tais sistemas. Uma comunidade microbiana muito diversa
pressupe a existncia de vrias espcies ou gneros que desempenhem funes ecolgicas
semelhantes. A depleo de um ou mais grupos poderia ser suprida por outros
metabolicamente semelhantes, sem prejuzo do funcionamento do sistema. Entretanto, h
populaes que so essenciais, mesmo que em menor nmero, que poderiam, inclusive,
definir a rota metablica principal num ecossistema, como o caso das populaes de
arquias metanognicas.
29
Tabela 3.4 Estudos da comunidade microbiana metanognica em reatores anaerbios em escala laboratorial usando tcnicas moleculares
Alimento do reator
Efluente sinttico com
glicose e, depois, acetato
Resduo slido municipal
em soluo tamponada
Resduos de destilaria de
vinho
mistura de AGV (acetato,
propionato, butirato)
Efluente rico em melado
glicose e peptona como
fontes de carbono
glicose e solventes
(efluente farmacutico)
propionato,
butirato,
metanol e etanol
soro
e
extrato
de
levedura
soro e NH4Cl
Lixiviado suplementado
com cido fosfrico
Lixiviado com substratos
metanignicos, com e sem
extrato de levedura
Configurao do
reator
Frascos de cultivo
anaerbio
2 reatores de mistura
completa, um
mesoflico e outro
termoflico
Reator de leito
fluidizado, mesoflico
% arquias em
relao ao
total de clulas
> 86% do RNA
total
Remoo
de DQO
Tcnica (s)
molecular(es)
Hibridizao
dot blot
Hibridizao
dot blot
Ordem Methanobacteriales;
gneros Methanosaeta e Methanosarcina em
baixssimos nveis
PCR
clonagem
14% do total de
clones
Methanosarcina barkeri, Methanosarcina frisus e

Methanobacterium formicium
Reator hbrido
mesoflico
PCR
clonagem
Reator de mistura
completa
> 90%
DGGE
Reator de mistura
completa e fluxo
contnuo
Godon et al.
(1997)
McHugh et
al. (2003)
Methanosaeta concilii;
Akarsubasi
et al. (2005)
PCR em
tempo real
Ordem Methanosarcinales, principalmente

famlia Methanosarcinaceae
Yu et al.
(2005)
75 a 95%
PCR DGGE;
FISH
Gnero Methanosaeta
Calli et al.
(2006b)
FISH
Gnero Methanosarcina e ordem

Methanomicrobiales
Carpentier
et al. (2006)
UASB, filtro anaerbio
Frascos de cultivo
anaerbio
Raskin et al.
(1994)
Methanosaeta (51,5%); Methanobacteriales

(45,5%); Methanosarcina (3,0%)
Methanosaeta (72,5%); Methanobacteriales
(17,5%); Methanomicrobiales (5,0%);
Methanosarcina (2,5%); Methanococcus (2,5%)
Reator hbrido
psicroflico
e reator de leito
hbrido, mesoflicos
Ordem Methanobacteriales e gnero

Methanosarcina
Referncia
Methanosaeta (56,7% dos clones de arquias),

Methanococcus (43,3%)
> 90%
Reator hbrido
termoflico
Grupos de arquias detectados
30
Tabela 3.5 Estudos da comunidade microbiana metanognica em reatores anaerbios em escala plena usando tcnicas moleculares
Alimento do reator
Configurao
do reator
Remoo
de DQO
Tcnica (s)
molecular(es)
Digestores de lodo
fase nica
Resduos de lodos
ativados
Efluente de
processamento de leite
(lactose, protenas e
lipdeos)
Efluente de processamento de batata (rico
em amido)
8 a 12%
Ordem Methanosarcinales (*)

(38 a 68%), principalmente
gnero Methanosaeta
Primeira fase:
nveis bem
baixos;
Segunda fase:
8,2%
Ordens Methanosarcinales (*) (principalmente

Methanosarcina), Methanomicrobiales e
Methanobacteriales
Hibridizao
dot blot
Hibridizao
dot blot l
15 a 20%
Gneros Methanosaeta e Methanogenium
PCR em
tempo real
Ordem Methanosarcinales (60%),

principalmente famlia Methanosaetaceae
Digestores de lodo
de duas fases
Digestores de lodo
Efluente de produo de
cido ctrico e melado
% arquias em
relao ao
total de clulas
Raskin et al.
(1995)
Raskin et al.
(1994)
Yu et al.
(2005)

Methanobacteriales (39,4%),
Methanosarcina (6,1%),
Reator de leito
preenchido
Filtro anaerbio de
fluxo descendente
Referncia
> 90%
PCR
clonagem
Reator de
recirculao interna

Methanobacteriales (27,0%),
Methanosarcina (21,6%)
McHugh et
al. (2003)

Methanobacteriales (11,2%)
(*) Famlia Methanosarcinaceae (classificao antiga). Atualmente, a famlia cresceu em nvel de ordem. O que era famlia Methanosarcinaceae
ordem Methanosarcinales.
31
Tabela 3.6 Estudos da comunidade microbiana metanognica em reatores UASB usando tcnicas moleculares
Alimento do reator
Caractersticas
do reator
Remoo
de DQO
Tcnica (s)
molecular(es)
% arquias em
relao ao
total de clulas
Referncia
Zhang et al.
(2005b)
Calli et al.
(2005)
Esgoto sanitrio bruto

Efluente sinttico
Efluente
com
AGV,
extrato de levedura e
altos nveis de amnia

glicose, AGV e peptona
ou extrato de levedura
Escala laboratorial
PCR - DGGE
Methanosaeta concilii
1 clone de arquia no-cultivada e
desconhecida
5 reatores
em escala
laboratorial
mesoflicos
77 a 96%;
PCR
DGGE, FISH;
clonagem
Gneros Methanosarcina, Methanobacterium e

Methanospirillum
PCR
clonagem;
FISH
19% do total de
clones;
37% das clulas
microbianas
(FISH)
22% do total de
clones;
42% das clulas
microbianas
(FISH)
Escala laboratorial
mesoflico (13 L)
90-97%
Escala laboratorial
termoflico (13 L)
Escala laboratorial
(2,8 L)
Efluente
escuro
de
fbrica de polpa de papel
kraft
adicionado
de
extrato de levedura e
etanol
Escala laboratorial
mesoflico (15 L)
80 a 86%;
75 a 78%
(com
recirculao
do efluente)
Lixiviado suplementado
com cido fosfrico
Escala laboratorial
mesoflico
75 a 95%
Efluente contendo fenol
PCR
clonagem;
FISH
Microscopia
eletrnica e
de contraste
de fase;
DGGE
PCR
DGGE;
FISH
Ordem Methanobacteriales
Sekiguchi et
al. (1998)
Methanosaeta thermophila;
Ordem Methanobacteriales
74% do total de
clones
Famlia Methanosaetaceae (54%); ordens

Methanomicrobiales (14%) e
Methanobacteriales (3%)
Zhang et al.
(2005a)
59,5% (anlise
de FISH do
inculo)
Gneros Methanosarcina e Methanosaeta
Buzzini et
al. (2006)
Gnero Methanosaeta
Calli et al.
(2006b)
32
Alimento do reator
Efluente de cervejaria
Caractersticas
do reator
Remoo
de DQO
Tcnica (s)
molecular(es)
Escala plena
mesoflico
Hibridizao
dot blot; FISH
80%
FISH; PCR
DGGE;
clonagem;
microscopia
eletrnica
Referncia
Ordens Methanosarcinales (*) (Methanosaeta,

34,2%), Methanobacteriales,
Methanomicrobiales e Methanococcales
Liu et al.
(2002)
51 a 78% das
clulas
microbianas
(FISH)
Ordens Methanosarcinales (Methanosaeta: 75 a

96%), Methanobacteriales, Methanococcales e
Methanomicrobiales
Daz et al.
(2006)
PCR DGGE
Methanosaeta concilli, Methanosaeta

thermophila, Methanobacterium formicium,
2 clones de arquias no-cultivadas e
desconhecidas
Keyser et
al. (2006)
95%
Hibridizao
dot blot
Partida: 24,1%
do RNA total
Aps 9 meses:
46,7% do total
de RNA
Partida: ordem Methanococcales

Aps 9 meses: famlia Methanosarcinaceae (*),
principalmente Methanosarcina, e ordem
Methanobacteriales
Casserly et
al. (2003)
Escala plena
mesoflico
Hibridizao
dot blot
63% do RNA
total
2 reatores em escala
plena mesoflicos
55 e 90%
PCR DGGE
Escala plena
mesoflico
Escala plena
mesoflico
Efluente de fbrica de
queijos
papel, rico em
carboidratos (amido) e
AGV
Efluente de destilaria de
lcool
Efluente de vincola
pssego em conserva
% arquias em
relao ao
total de clulas
62,9% do RNA
total
(hibridizao
dot blot)
Escala plena
mesoflico
Escala plena
mesoflico
PCR DGGE
Gnero Methanosaeta (> 40%),

Methanobacterium formicium, alguns clones de
arquias no-cultivadas e desconhecidas,
filo Crenarchaeota
Methanosaeta soehngenii;
Methanosaeta concilli,
Methanosarcina mazei,
clone de arquia no-cultivada e desconhecida
3 clones de arquias no-cultivadas e
desconhecidas
Roest et al.
(2005)
Akarsubasi
et al. (2006)
Keyser et
al. (2006)
Keyser et
al. (2006)
(*) Ordem Methanomicrobiales inclua a Famlia Methanosarcinaceae (classificao antiga). Atualmente, existem as Ordens Methanomicrobiales e
Methanosarcinales.
33
3.5 Tcnicas de biologia molecular nos estudos de ecologia microbiana

Por muitos anos, investigaes microbiolgicas em diversos ambientes foram feitas
exclusivamente por microscopia e tcnicas de cultivo em meios de cultura enriquecidos. No
entanto, essas tcnicas convencionais oferecem limitaes quanto a anlise da diversidade
microbiana de um ecossistema, pois podem falhar ao simular as condies ambientais naturais
que os microrganismos exigem para proliferao. Alm disso, muitos microrganismos no so
detectveis por microscopia convencional por permanecerem ligados a partculas de
sedimentos (MUYZER et al, 1993), e muitos no so cultivveis por exigirem condies
ambientais difceis de serem mantidas em laboratrios. Amann et al. (1995) estimaram que
aproximadamente 99% dos microrganismos no podem ser isolados de seus habitats naturais
em culturas puras.
Desde meados de 1980, tem sido possvel o estudo da diversidade e ecologia de
microrganismos em ambientes naturais por meio de tcnicas de biologia molecular,
alcanando-se, assim, novas oportunidades para a anlise da estrutura e da composio de
espcies de comunidades microbianas nos mais diversos ecossistemas (HEAD et al.,1998).
Um dos mtodos moleculares aplicados com sucesso o uso de biomarcadores, molculas
que possuem regies altamente conservadas entre os diferentes organismos e regies
variveis, especficas de cada um. As regies variveis podem ser consideradas a impresso
digital de um organismo (PACE et al., 1986 ). Um biomarcador comumente utilizado para
inferir identidade de organismos a molcula de RNA ribossomal, biomarcador denominado
RNAr. O RNAr parte integrante do ribossomo, uma estrutura celular responsvel pela
sntese de protenas que est presente em todas as clulas e, por isso, considerado um
biomarcador ideal. A regio 16S compe a subunidade menor dos ribossomos presentes em
organismos procariontes (bactrias e arquias). A variao gentica do RNAr 16S tem sido
bem explorada para inferir relaes filogenticas entre os microrganismos e para desenhar
sondas nucleotdicas especficas para a deteco de grupos microbianos individuais em
habitats naturais. Estas tcnicas so aplicveis tambm para se determinar a diversidade
gentica de comunidades microbianas e identificar mesmo os microrganismos no-cultivveis
(MUYZER et al, 1993).
Por questes de manipulao laboratorial, trabalha-se mais freqentemente com a seqncia
do DNA que codifica a regio 16S do RNAr (DNAr 16S). Isto porque o DNA uma molcula
mais estvel e mais fcil de se manipular do que o RNA. A amplificao e anlise do gene
34
DNAr, portanto, tm sido utilizadas comumente para investigar a biodiversidade e a estrutura

da comunidade microbiana de diversos ambientes, inclusive de reatores anaerbios.
Dentre as vrias tcnicas utilizadas nos estudos de ecologia microbiana, destacam-se algumas
de carter qualitativo e semi-quantitativo: PCR-RFLP, PCR-SSCP, PCR-ARDRA, nas quais
fragmentos de DNAr 16S da comunidade microbiana em estudo so amplificados por PCR e
os produtos so digeridos em locais especficos por enzimas de restrio. Aps, segue-se a
etapa de clonagem dos fragmentos para posterior isolamento e seqenciamento dos
fragmentos. Soma-se a estes a tcnica de PCR-DGGE, descrita em detalhes frente. O uso
combinado das tcnicas de biologia molecular PCR-DGGE tem sido bastante aplicado para
avaliar a diversidade microbiana em vrios ambientes (MUYZER, 1999), inclusive na anlise
de grnulos de reatores UASB tratando esgoto municipal ou industrial, (CHAN et al, 2001;
LIU et al, 2002; PASSIG et al, 2005).
As tcnicas de hibridizao so de carter quantitativo e podem ser teis na avaliao da
atividade metablica de determinados microrganismos no ambiente. Existem dois tipos:
hibridizao em membrana, mais comumente conhecida como dot blot, que requer a extrao
total do RNA microbiano da amostra. O RNA extrado e purificado aplicado em membranas
de nylon e hibridizado com sondas de oligonucleotdeos especficos marcadas com
32
P; o
segundo tipo a hibridizao em clula inteira ou FISH que ser descrito posteriormente.
Apesar dos resultados das anlises genticas no gerarem informaes fisiolgicas dos
microrganismos, as similaridades das espcies detectadas com espcies fisiologicamente
conhecidas, permite fazer inferncias sobre o papel ecolgico e funcional de um
microrganismo especfico durante o tratamento dos esgotos sanitrios.
3.5.1 Reao em cadeia da polimerase (PCR)
Para investigao da diversidade microbiana de um ambiente utilizando a maioria das tcnicas
descritas acima, necessria a obteno de um grande nmero de molculas de DNA dos
diferentes microrganismos presentes na amostra. Para isso, realiza-se a amplificao da regio
do DNA de interesse, como por exemplo, o DNAr 16S por meio de uma reao enzimtica
chamada de PCR. A regio do DNA a ser amplificado determinada pelo par de primers ou
iniciadores, que so pequenas seqncias de nucleotdeos (oligonucleotdeos) de DNA,
construdas artificialmente, complementares e especficas a duas regies distintas no DNA
microbiano de interesse.
35
Cada ciclo de replicao in vitro de DNA envolve trs etapas bsicas: desnaturao,
anelamento e extenso. Na desnaturao (normalmente a 94 C) ocorre a separao da duplafita de DNA para exposio dos stios-alvo. Na segunda etapa, com a diminuio da
temperatura (por exemplo, a 55 C) ocorre o anelamento dos primers em regies especficas
de cada fita de DNA separada, que serve como molde, delimitando, assim, a regio inicial e a
regio final da seqncia gentica a ser amplificada. Finalmente, na etapa de extenso, ocorre
a sntese de DNA complementar fita-molde e; geralmente, feita em uma temperatura em
torno de 72C. Em 25 a 40 ciclos, possvel produzir em poucas horas milhes de cpias
especficas de DNA, at mesmo quando a amostra de partida contm apenas uma nica
seqncia alvo original (WALKER et al., 1999).
3.5.2 Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE)
A eletroforese em gel de gradiente desnaturante ou DGGE, desenvolvida por Muyzer et al
(1993), uma tcnica que permite a separao de fragmentos amplificados de DNA de
mesmo tamanho, mas que tm diferenas na sua constituio qumica. Seu princpio baseia-se
na diferena de estabilidade das fitas duplas de DNA, que depende principalmente do
contedo das bases nitrogenadas guanina (G) e citosina (C) dentro de um gradiente de
desnaturao. A migrao diferenciada dos produtos de PCR amplificados gera um perfil de
bandas (Figura 3.2). Geralmente cada banda separada interpretada como sendo de um
organismo presente no ambiente estudado. Por ter carter qualitativo e semi-quantitativo, esta
tcnica particularmente til para examinar sries temporais e dinmicas populacionais,
comparando partida e evoluo de sistemas de tratamento.
Desnaturao
Bandas
dos fragmentos
resultantes
de DNA
Concentrao de desnaturante
Figura 3.2 Desnaturao e separao de fragmentos de DNA pela tcnica de DGGE
36
A tcnica de DGGE tem sido intensamente utilizada, em vrios estudos, para investigar
biodiversidade microbiana nos mais variados ambientes, tais como aqferos contaminados,
campos de plantio de arroz, sedimentos de lagos, reatores anaerbios e aterros sanitrios
(CASAMAYOR et al., 2000; CASSERLY et al., 2003; AKARSUBASI et al., 2005 e 2006;
CALLI et al., 2005, 2006a e b; WATANABE et al., 2004; KLEIKEMPER et al., 2005;
ROEST et al., 2005; BUZZINI et al., 2006; DEARMAN et al., 2006; DAZ et al., 2006;
KEYSER et al., 2006; SASAKI et al., 2006).
Segundo Head et al. (1998), a principal limitao dos mtodos moleculares a quantidade de
cidos nucleicos recuperada das amostras ambientais, sendo difcil assegurar uma eficiente
recuperao por qualquer tcnica de extrao. H sempre perdas de cidos nuclicos durante o
processo e, alm disso, alguns microrganismos apresentam estrutura celular difcil de ser
rompida (esporos, clulas Gram-positivas, por exemplo). Para minimizar tais problemas
necessrio utilizar um mtodo de extrao de DNA eficiente para todos os tipos de clulas
presentes na amostra, bem como realizar vrias extraes de uma mesma amostra para
garantir a homogeneidade do DNA extrado.
A amplificao por PCR de genes de RNAr uma outra fonte de erros que podem afetar os
resultados de avaliao da diversidade por outras tcnicas moleculares subseqentes. Por
causa de sua alta sensibilidade, a tcnica de PCR pode apresentar falhas ou efeitos
indesejveis se houver DNA em excesso na amostra de partida ou qualquer contaminao
cruzada com outra amostra, gerando resultados falso-positivos (WALKER et al., 1999). Desta
forma fundamental que a manipulao das amostras seja feita sob cuidado e em locais livres
de contaminao.
Dentre os estudos pesquisados na literatura, algumas limitaes foram observadas na tcnica
de DGGE. Por exemplo, mais de uma banda presente no gel pode estar relacionada a um
mesmo microrganismo; como uma tcnica semi-quantitativa, bandas pouco visveis so
mais difceis de serem detectadas, sendo somente possvel a identificao das bandas mais
intensas, o que corresponderia aos microrganismos mais freqentes na comunidade em
estudo.
Apesar das desvantagens mencionadas acima, tcnicas de biologia molecular ainda so as
melhores ferramentas disponveis para estudo da diversidade microbiana em amostras naturais
e em biorreatores.
37
3.5.3 Hibridizao in situ com oligonucleotdeos fluorescentes (FISH)

Informaes morfolgicas sobre os microrganismos, abundncia relativa ou distribuio
espacial no ambiente no podem ser fornecidas pelas tcnicas descritas acima. Tais
informaes tm sido obtidas por meio de tcnicas de hibridizao com sondas fluorescentes
de oligonucleotdeos, pequenas seqncias de cidos nuclicos, que so especficas e
complementares a molculas-alvo, como DNA e RNA.
Para a realizao da hibridizao in situ com oligonucleotdeos fluorescentes ou FISH, o RNA
no extrado, mas permanece dentro das clulas microbianas. Estas so fixadas em soluo
de paraformaldedo para preservao e formao de poros para penetrao da sonda
fluorescente. As clulas so, ento, tratadas com tampo contendo formamida e NaCl e
incubadas numa temperatura entre 45 a 48C para hibridizao da sonda em regies
especficas do RNAr 16S. A sonda de oligonucleotdeo marcada com cromforo que
fluoresce quando excitada por uma luz de um determinado comprimento de onda
(normalmente, luz ultravioleta). A deteco feita por microscopia de fluorescncia, na qual a
amostra hibridizada iluminada com a luz excitante e a luz emitida observada com o auxlio
de filtros especficos. A emisso de sinal diretamente proporcional quantidade de
ribossomos do microrganismo, indicando sua atividade metablica potencial no ecossistema
estudado. Pelo fato das clulas no serem destrudas, esta tcnica permite a visualizao
morfolgica, a contagem e estimativa da abundncia, a localizao e a distribuio espacial
dos microrganismos na amostra (AMANN et al. 1995).
A tcnica de FISH outra ferramenta molecular que tem sido extensivamente utilizada em
estudos de investigao e avaliao de microrganismos especficos, fornecendo informaes
valiosas sobre sua ocorrncia, abundncia e importncia fisiolgica nos mais variados
ambientes e no monitoramento de sistemas de tratamento anaerbio como reatores UASB
(LIU et al., 2002; BATSTONE et al., 2004; CALLI et al., 2005 e 2006b; SANZ et al., 2005;
DAZ et al., 2006), digestores de resduos slidos (CHOUARI et al., 2005; HORI et al.,
2006) e aterros sanitrios (CALLI et al., 2006a; CARPENTIER et al., 2006).
Quanto tcnica de FISH, problemas esto associados permeabilidade das clulas
microbianas, acessibilidade, especificidade e sensibilidade da sonda nucleotdica ao stio-alvo
do RNAr. A permeabilizao das clulas essencial para que seja garantida a entrada e
hibridizao da sonda nucleotdica. Algumas clulas microbianas (esporos, clulas Grampositivas) necessitam de tratamento adicionais para eficiente permeabilizao da parede
38
celular. Alm disso, a acessibilidade da sonda ao stio-alvo depende da posio deste no

RNAr, que pode apresentar interaes com estruturas secundrias, dificultando a hibridizao.
A sensibilidade da sonda est relacionada emisso do sinal fluorescente, que s ser forte se
as clulas microbianas, no momento da coleta e fixao, estiverem metabolicamente ativas,
com grande nmero de ribossomos. Para resolver este problema, em alguns estudos
empregam-se mais de uma sonda para se intensificar a emisso do sinal. Por causa das regies
variveis no RNAr diferirem em poucas posies nucleotdicas dentre os grupos taxonmicos,
possvel a hibridizao com clulas no-relaciondas sonda, gerando falsos-positivos. Para
superar tais problemas, comum utilizar-se mltiplas sondas especficas com stios-alvo
diferentes na molcula de RNAr com diferentes fluorocromos (HEAD et al., 1998).
39
4 METODOLOGIA
4.1 Caracterizao dos reatores e pontos de amostragem
Neste estudo, foram utilizados dois reatores UASB, R1 e R2 (Figura 4.1), que esto
localizados no Centro de Pesquisa e Treinamento em Saneamento (CePTS) UFMG/COPASA,
implantado junto ETE Arrudas, em Belo Horizonte.. Ambos os reatores eram idnticos e
estavam em escala de demonstrao, porm o R2 era precedido de uma unidade de
peneiramento forado, que impedia a entrada de slidos com dimenses maiores que 1 mm.
Os reatores foram objetos de estudo de um mestrado e um doutorado, envolvidos
especificamente na operacionalidade e comparao da eficincia de remoo de diversos
poluentes, bem como na efeito do peneiramento forado no processo de digesto anaerbia.
R2
R1
R2
H6
H5
H4
H3
H2
H1
(B)
(A)
(C)
Figura 4.1 A e B: vista dos reatores R1 e R2. C: desenho esquemtico dos pontos (perfis)
de amostragem (cm). Legenda: R1: perfis H1, H2 e H3; R2: perfis H4, H5 e H6
40
As principais caractersticas dos reatores, bem como as condies operacionais a

que foram submetidas nas 5 fases operacionais esto descritas na Tabela 4.1.
Tabela 4.1 Principais caractersticas dos reatores UASB e condies operacionais
Fase
Durao
operacional
(dias)
1
70
2
64
3
53
4
77
5
91
Fonte: Teixeira (2007)
Seo
transversal
(m)
Vazo
(m3/h)
1,75 x 1,75
1,75 x 1,75
1,75 x 1,75
1,50 x 1,50
1,50 x 1,50
1,53
2,19
3,37
1,13
1,61
Altura
(m)
4,5
5,0
5,5
4,5
5,0
Caractersticas do reator
TDH
Velocidade
(h)
ascensional (m/h)
9,0
7,0
5,0
9,0
7,0
0,50
0,71
1,10
0,50
0,71
4.2 Caracterizao do inculo dos reatores

Ambos os reatores foram inoculados, na partida do sistema, com lodo proveniente de reatores
UASB do CePTS UFMG/COPASA, j adaptado ao tratamento de esgotos domsticos. Ao
trmino de cada fase, todo o lodo era retirado de cada reator e estocado separadamente em
leitos de secagem, forrados e cobertos por lonas plsticas para proteo das intempries e
possvel secagem do lodo. Conforme descrito por Teixeira (2007), alteraes fsicas nos
reatores eram, ento, realizadas para modificaes das condies operacionais (TDH, vazo e
velocidade ascensional), como esto mostradas na Tabela 4.1. O lodo reservado era
reintroduzido nos reatores e a quantidade inoculada era estimada com base na carga biolgica
mnima, segundo descrio de De Paula (2007).
4.3 Determinao da diversidade microbiana metanognica

Amostras de lodo foram coletadas ao final de cada fase operacional (Tabela 4.1) e em trs
diferentes alturas do compartimento de digesto dos reatores, chamadas de perfis, conforme
mostrado na Figura 4.1. Aproximadamente 300 mL de amostras de lodo das fases 1 a 4 foram
coletados e levados ao laboratrio. Para as anlises de PCR-DGGE, alquotas de 50mL de
cada amostra foram inicialmente centrifugadas a 4.000 rpm por 10 minutos para separao da
frao lquida. O material sedimentado (biomassa) foi lavado soluo de fosfato de sdio
dibsico (Na2HPO4 120mM, pH 8,0 Anexo 2.1.2) para remoo de cidos nucleicos
extracelulares, aliquotado em pores de 3 g, e armazenadas a 20C para posterior anlise.
A frao lquida obtida foi tambm armazenada a 20 C para futuras anlises de AGV.
41
As amostras de lodo das fases 1 a 4 foram submetidas aos processos de anlise molecular
(com exceo do FISH) esquematizadas na Figura 4.2. A amostras da fase 5 foram
submetidas somente anlise de FISH.
Amostras
da Fase 5
FISH
Amostras das
Fases 1 a 4
Extrao e
purificao
PCR
DNA da comunidade
microbiana total
Amostra
de lodo
Identificao das arquias
metanognicas
Amplificao de DNAr
(genes de RNAr 16S)
de arquias
DGGE
Base de
dados
Seqenciamento
Separao e purificao
das seqncias de DNAr
Figura 4.2. Esquema das etapas de anlise molecular e

identificao microbiolgica das amostras de lodo
4.2.1 Extrao e purificao do DNA genmico

Para cada amostra de lodo congelada (fases 1 a 4), foram feitas trs extraes a fim de se
garantir uma quantidade suficiente de DNA que fosse representativa da comunidade
microbiana presente na amostra. As amostras foram, ento, submetidas ao processo de
extrao do DNA microbiano total, segundo protocolo descrito por Purdy et al. (1996). Numa
primeira etapa, 0,5 g de lodo foi adicionado a um tubo contendo prolas de vidro de 0,1 mm
de dimetro, 700L de soluo de Na2HPO4 (120 mM, pH 8,0) com 1% de
polivinilpirrolidona (PVPP) (Anexo 2.1.3), 500 L de fenol equilibrado com tampo Tris (pH
8,0) (Sigma) e 50 L de soluo de SDS 20% (Anexo 2.1.8).
As clulas microbianas foram lisadas (rompidas) por agitao mecnica em um
microdesmembrador ou mini-beadbeater (Biospec Products) a 2.500 rpm por 30 segundos e
mantidas no banho de gelo por mais 30 segundos. Esta operao foi realizada trs vezes.
Cerca de 700 L do lisado de clulas foi, ento, adicionado a uma coluna constituda de
42
hidroxiapatita (HTP Anexo 1.1.1), uma matriz de coluna cromatogrfica, que separa cidos
nucleicos de protenas. A coluna de HTP, com a amostra, foi centrifugada a 700 rpm por 4
minutos. A operao foi repetida at terminar todo o volume da amostra. A coluna de HTP foi
lavada 4 vezes com 600 L de soluo de Na2HPO4 (120mM, pH 7,2 Anexo 2.1.5) e
centrifugada a 700 rpm (3 vezes por 4 minutos e 1 vez por 7 minutos). Finalmente, a amostra
foi eluda da coluna com 400 L de soluo fosfato de potssio dibsico (K2HPO4 500 mM,
pH 7,2 Anexo 2.1.7) a 700 rpm durante 7 minutos. Para dessalinizao dos cidos nuclicos,
o material eludo foi pipetado no centro de uma coluna de Sephadex G-75 pr-condicionada
(Anexo 1.1.2) que, por sua vez, foi centrifugada a 2.700 rpm por 17 min. O eluente foi
recolhido em um microtubo estril e mantido sob banho de gelo.
Aps passagem pela coluna de Sephadex G-75, o material eludo (cerca de 400 L) foi
purificado e concentrado com 800L de etanol absoluto gelado e 40 L de soluo de acetato
de sdio (C2H3O2Na 3M Anexo 2.1.4). Para cada volume de amostra, utilizou-se 2 volumes
de etanol absoluto gelado e 0,1 volume de acetato de sdio, deixando-se a soluo a -20C
durante 30 minutos ou 24 horas. A soluo foi submetida centrifugao (13.400 rpm por 10
minutos); o sobrenadante foi descartado, sem tocar no pellet. Adicionou-se 100 L de etanol
gelado (70%) para ressuspenso do pellet e novamente a soluo foi centrifugada (13.400 rpm
por 3 minutos). Removeu-se o sobrenadante e deixou-se o pellet secar temperatura ambiente
durante aproximadamente 50 minutos. O pellet contendo cidos nuclicos foi ressuspendido
em 40 L de soluo TE (Anexo 2.1.9) ou ddH2O estril.
Alquotas de 5,0 L de cada amostra extrada foram submetidas a eletroforese em gel de
agarose 1,0% (Anexos 2.2.1 e 2.2.13) a 75 V por 40 minutos ou 85 V por 34 minutos. O gel
foi corado em soluo de brometo de etdio (Anexo 2.2.2) e visualizado sob luz ultravioleta
para verificao da extrao do DNA microbiano total (acima de 10.000 pares de bases) das
amostras. O extrato total de cada amostra foi adicionado em gis de agarose 0,8%, submetidos
a eletroforese (75 V por 50 minutos) e o DNA total presente no gel foi purificado utilizandose o kit Wizard DNA Clean-Up System (Promega), de acordo com as instrues do fabricante.
4.2.2 Amplificao dos genes DNAr 16S de arquias por PCR
Aps a extrao de DNA, as amostras foram submetidas amplificao especfica dos genes
que codificam a regio 16S do RNA ribossomal (DNAr 16S) de arquias. Para a
amplificao, foram utilizados o par de iniciadores ou primers: primer foward ARC 344 (5
43
ACG GGG YGC AGC AGG CGC GA 3) com cauda GC (5 CGC CCG CCG CGC CCC
GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G 3) e o primer reverse ARC 915 (5 GTG
CTC CCC CGC CAA TTC CT 3), descritos por Casamayor et al. (2000). O programa de
amplificao adotado para produtos de DGGE, descritos no artigo, foi modificado vrias
vezes. As condies que ofereceram melhores resultados de amplificao consistiam das
seguintes etapas: 5 minutos a 94C (desnaturao inicial); 35 ciclos de 1 minuto a 94
(desnaturao), 30 segundos a 56C (anelamento) e 1 minuto a 72C (extenso); e, finalmente,
30 minutos a 72 (extenso final). A extenso final para minimizar rastros no DGGE
(JANSE et al., 2004). A reao ocorreu em volumes de 50 L, contendo 32,5 L de H2O
ultra-pura (Milli-Q), 5,0 L de tampo da PCR 10X (IO, Phoneutria), 1,75 L MgCl2 (50
mM, Phoneutria), 1,25 L de cada primer (10pmol/L, Invitrogen), 1,0 L de dNTP (25
mM, Fermentas), 6,0 L de albumina de soro bovino (BSA 2,5 mg/L, Sigma), 0,25 L de
enzima Taq polimerase (5,0 u/L, Phoneutria) e 1,0 L de amostra de DNA extrado e
purificado (diluda ou no). As reaes de PCR foram desenvolvidas em termociclador
Mastercycler Gradient Eppendorf. Para a observao dos amplicons (fragmentos de DNA
amplificados) e verificao do seu tamanho, foi feita eletroforese em gel de agarose 1,0% com
marcador de peso molecular de 1 kb (Fermentas).
4.2.3 Separao dos produtos de PCR por DGGE
Os produtos de PCR obtidos a partir das amostras foram submetidos eletroforese vertical em
gel de gradiente desnaturante. A soluo do gel foi feita segundo protocolo de Muyzer et al.
(1996). Alguns testes foram feitos a fim de se obter um gradiente que oferecesse a melhor
separao dos fragmentos de DNA contidos nos produtos de PCR (entre 40 a 80%). Para
formao de 14 mL de gel, utilizaram-se duas solues denominadas de low (com baixa
porcentagem de desnaturante) e high (com alta porcentagem de desnaturante). Para a
formao de cada soluo, outras duas solues eram misturadas: uma denominada de 100%,
que continha formamida e uria (agentes desnaturantes) e outra sem tais substncias,
denominada de 0%. As solues 100% e 0% e a tabela de gradientes para o preparo das
solues low e high esto descritas no Anexo 2.2.
Antes das solues low e high serem misturadas e de ser confeccionado o gel com o gradiente
desnaturante desejado, eram adicionados, em cada soluo, 156 L de tampo TAE 50X, 67,8
L de soluo de persulfato de amnio 10% (Anexo 2.2.7) e 5,4 L de TEMED (Bio Agency).
Os dois ltimos reagentes so catalisadores, importantes na polimerizao do gel. O gel foi
44
montado conforme instrues contidas no Anexo 2.2.14, utilizando-se o aparato DCodeTM

System Bio Rad. No presente trabalho, o gradiente escolhido para a confeco dos gis de
DGGE foi o de 45 a 65%. Desta forma, a soluo low tinha 45% de desnaturante (7,6 mL de
soluo 0% e 6,4 mL de soluo 100%), enquanto que a soluo high tinha 65% de
desnaturante (4,8 mL de soluo 0% e 9,2 mL de soluo 100%)
Um pouco da soluo 0% foi utilizada na formao dos poos ou canaletas para aplicao
dos produtos de PCR (a esta camada d-se o nome de stacking gel Anexo 2.2.12). Foram
aplicados 10 a 30L de produto de PCR das amostras, dependendo da concentrao da
amostra. A corrida ao longo do gel se processou a 60C e 80 V, em cerca de 7 L de tampo
TAE 0,5X (Anexo 2.2.5) durante aproximadamente 17 horas.
Ao final da eletroforese, o gel foi corado de 15 a 40 minutos em soluo de brometo de etdio
e visualizado sob luz ultravioleta. Imagens do gel foram documentadas usando um sistema de
captura digital de imagem (Launch Doc ITLS UVP, verso 5.0). As bandas de interesse
foram excisadas e introduzidas em tubos de rosca contendo prolas de vidro e 500 L de
ddH2O, que foram agitados em microdesmembrador a 4.800 rpm durante 3 minutos e
armazenados a 4 C (overnigth). Aps este perodo, os tubos foram centrifugados a 2.800 rpm
por 3 minutos e o sobrenadante, contendo os fragmentos de DNA, foi coletado e armazenado
em microtubos a 20 C.
Testes preliminares de PCR foram realizados com alquotas variadas dos fragmentos extrados
do gel (1 a 10 L), diludos ou no, no intuito de se obter uma amplificao intensa, mas sem
rastros (bandas inespecficas). Novos produtos de PCR foram corridos em DGGE para
verificao da pureza das bandas. Algumas tiveram que ser novamente submetidas exciso e
purificao.
4.2.3.1 Preparao dos amostras para seqenciamento
As bandas purificadas dos gis de DGGE foram reamplificadas com o mesmo par de primers
citado anteriormente, porm sem a cauda GC. O programa de ciclos de PCR adotado foi
semelhante, com exceo da etapa de extenso final, que foi reduzida para 5 minutos. Cerca
de 90 L de produtos de PCR de cada banda extrada foram novamente purificados
utilizando-se o kit Wizard DNA Clean-Up System (Promega). Alquotas de 2,0 L foram
aplicadas em gel de agarose 2%, juntamente com low mass ladder (Invitrogen) a fim de se
determinar sua massa molecular. Este ladder consiste de uma mistura de fragmentos de DNA
45
de 100 a 2000 pb com massa conhecida. A eletroforese de 2,0 L deste ladder resulta em 6
bandas contendo 100, 60, 40, 20, 10 e 5 ng de DNA, respectivamente, que so utilizadas
como um padro comparativo para estimar a quantidade e a concentrao de DNA de uma
amostra extrada ou de um produto de PCR.
Os produtos de PCR das bandas, uma vez purificados e quantificados, foram enviados ao
Setor de Seqenciamento de DNA do Centro de Estudos do Genoma Humano (USP) para
seqenciamento (www.genoma.ib.usp.br). As reaes de seqenciamento foram realizadas de
acordo com o protocolo para o Mega BACE 1000, utilizando o DYEnamic ET Dye Terminator
Kit (com Thermo Sequenase II DNA Polimerase) cdigo US81090. As sequncias foram
analisadas pelo software Sequence Analyser utilizando o Base Caller Cimarron 3.12.
4.2.4 Determinao da abundncia relativa e da concentrao de arquias por FISH
Dois tipos de amostras foram analisados pela tcnica FISH: amostras de lodo coletadas nos
reatores UASB acima descritos durante a fase operacional 5 (Tabela 4.1) e amostras de lodo
presentes em testes de AME (atividade metanognica especfica) realizados para a
determinao da atividade metanognica do lodo dos reatores UASB na presena de acetato,
formiato, glicose e sem substrato (ensaio realizados por Souto, 2007).
As amostras da fase 5 e de testes de AME foram preservadas segundo o protocolo de fixao
de amostras para FISH descrito por Amann et al. (1990). Um volume de 375 L de cada
amostra foi transferido em microtubos de 1,5 mL, onde foram adicionados 1.125 L de
tampo de fixao (paraformaldedo 4% Anexo 2.3.5), preparada at 4 dias antes do uso, e
mantida a 4C por 4 a 16 horas. A mistura foi centrifugada a 7.600 rpm por 5 minutos, o
sobrenadante foi descartado e o pellet (sedimento), lavado em 375 L de soluo salina
tamponada com fosfato (PBS 1X Anexo 2.3.4) por duas vezes. O pellet foi ressuspendido
em 300 L de PBS 1X e 300 L de etanol absoluto (100%) e mantido a -20C.
As amostras fixadas foram submetidas a agitao em microdesmembrador com prolas de
vidro (4.800 rpm por 10 segundos) para desintegrao dos grnulos do lodo. Foi necessria a
diluio de 5 ou 10 vezes das amostras da fase 5. Aplicou-se, ento, 1,0 L de cada amostra
em lminas de teflon contendo 10 pocinhos de 8 mm de dimetro (MP Biomedicals). As
lminas foram secadas a 45C por 20 minutos e desidratadas por imerso serial em solues
de etanol 50, 80 e 100% (3 minutos cada). Aps a secagem das lminas temperatura
46
ambiente, 9,0 L de tampo de hibridizao com 20% de formamida (Anexo 2.3.8) e 1,0 L
de sonda ARC915, marcada com o cromforo Cy3, foram aplicados e homogeneizados em
cada pocinho.
As lminas foram incubadas em cmara mida a 46C por duas horas. Posteriormente, foram
mergulhadas em tampo de lavagem (Anexo 2.3.9) a 48C durante 20 minutos e, rapidamente,
em ddH2O para remoo de sais e SDS. Aps a secagem das lminas no escuro e
temperatura ambiente, foram aplicados e misturados 9,0 L de ddH2O e 1,0 L de soluo de
DAPI (Sigma) a 0,001% nos pocinhos. As lminas foram incubadas durante 5 a 10 minutos no
escuro. As lminas foram novamente lavadas em ddH2O e secas no escuro. Aplicou-se sobre
cada amostra, antes de se colocar a lamnula, 8,0 L de soluo contendo 80% de glicerol e
20% de PBS 1X (v/v). As lminas foram mantidas no escuro a 4C.
As lminas foram observadas em microscpio Olympus BX-50 no aumento de 1.000 vezes
sob epifluorescncia e contraste de fase. Primeiramente, a microscopia de contraste de fase foi
utilizada para ajustar o foco da imagem, antes da aplicao da luz ultravioleta. Foram
utilizados filtros especficos com espectro de absoro entre 510 a 550 nm e de 330 a 385 nm
para captao de emisses de fluorescncia da sonda, marcada com Cy3, e do DAPI
respectivamente. As imagens visualizadas foram registradas em filme fotogrfico ISO 400
(Kodak, Fujifilm, AGR), sendo a maioria de contraste de fase e de DAPI, pois as imagens
observadas com a sonda resultavam em fotos pouco ntidas. Vinte campos microscpicos
foram analisados, sendo que apenas os microrganismos que se hibridizaram com a sonda
ARC915, ou seja, as arquias, foram contados.
Para a contagem dos filamentos semelhantes aos do gnero Methanosaeta (Figura 5.10A), um
fragmento contendo 2 a 4 clulas foi considerado como uma unidade. Fragmentos maiores
foram considerados como 2, 3 ou 4 unidades dependendo do seu comprimento. Os agregados
de cocos semelhantes ao gnero Methanosarcina (Figura 5.10B) foram contados da seguinte
maneira: uma unidade correspondendo a cerca de 4 clulas; agregados maiores foram
considerados como 2, 3 ou 4 unidades. Os morfotipos 3 (Figura 5.10C) e 4 (Figura 5.11D)
eram filamentos bem mais finos que os de Methanosaeta, curvos ou levemente curvos; cada
filamento foi contado como uma unidade.
Para cada amostra, foi feita uma estimativa da abundncia unidades de arquias por mL de
lodo. Esta estimativa foi baseada na contagem de unidades de arquias obtida de 20 campos
47
microscpicos. Para isso, foi necessrio calcular a rea do campo microscpico (ou campo de
viso), cujo dimetro determinado da seguinte forma:
nmero de campo da ocular = 22
ampliao da objetiva
= 0,22 mm
100
Sabendo-se que o dimetro, a olho nu, de cada pocinho de cerca de 8 mm, a partir destes
valores, foi possvel determinar a rea do campo microscpico (0,038 mm2) e a rea de cada
pocinho (50,24 mm2). Atravs de regra de trs simples, determinou-se o nmero de arquias
na rea total do poo, portanto, em 1 L de amostra. Os resultados encontrados levaram em
considerao o fator de diluio 103 (para transformar os valores de L para mL) e esto
expressos na Tabela 5.3.
4.2.5 Anlise de cidos graxos volteis
Aproximadamente 15 mL do sobrenadante de cada amostra coletada foram filtrados em
membrana de fibra de vidro (Scheleicher & Schuell) de 0,45 m de porosidade. Uma alquota
de cada amostra (cerca de 2 mL), sem diluio, foi analisada em cromatografia lquida de alto
desempenho (HPLC Perkin Elmer Series 200), equipada em coluna Aminex HPX 87H
(300 x 7,8 mm) e conectada a um detector de absorbncia de UV/ VIS a 210 nm. A fase
mvel utilizada foi uma soluo de 0,01M de H2SO4, em um fluxo de 0,8mL/ min a 50C. A
soluo de lavagem da coluna continha 0,005M de H2SO4 e 5% de acetonitrila, sendo
aplicada durante 2 minutos aps anlise cromatogrfica de cada amostra. Os AGV presentes
nas amostras foram identificados pelos seus respectivos tempos de reteno, comparados com
aqueles obtidos em curvas-padro. Para desenvolvimento das curvas-padro, foram utilizadas
solues sintticas de cidos frmico, actico, propinico, butrico, isobutrico, valrico e
isovalrico em diferentes concentraes. A faixa de concentrao de cada cido foi de 5 a 75
mg/ L.
48
5 RESULTADOS E DISCUSSO
5.1 Determinao da diversidade microbiana metanognica em reatores
UASB por meio da tcnica de PCR-DGGE
5.1.1 Extrao e purificao do DNA genmico
Amostras de lodo foram coletadas ao final de cada fase operacional e nas trs diferentes
alturas do compartimento de digesto dos reatores chamadas de perfis. O inculo foi
denominado como In e coletado apenas nas fases 1 e 2. Nas fases 3 e 4 s foi possvel coleta
de lodo nos pontos H1, H2 e H4; em virtude do aumento da velocidade ascensional durante a
fase 3, que provocou o arraste de slidos. Dessa forma, no houve biomassa suficiente para
anlise nos pontos H3, H5 e H6.
As extraes de DNA, que representam o DNA genmico de todos os microrganismos
presentes nas amostras, foram realizadas com sucesso nas amostras de lodo coletado em
diferentes alturas do reator e ao final de cada fase operacional. As triplicatas obtidas para cada
amostra foram individualmente misturadas e purificadas, gerando uma nica amostra para
cada ponto de amostragem como mostrado na Figura 5.1. O DNA genmico caracterizado
por bandas maiores que 10.000 pares de bases, conforme mostrado pelo marcador de tamanho
molecular (ladder). Muitas amostras apresentaram rastros, que podem ser sais ou outros
contaminantes que sobraram durante o processo de extrao.
In H1 H2 H3 H4 H5 H6
ladder
10000
pb
H1 H2 H4 H1 H2 H4
Fase 3
Fase 4
250/ 253 pb
(B) Fase 2
(C) Fases 3 e 4
(A) Fase 1
Figura 5.1 Extraes de DNA das amostras dos reatores R1 e R2 coletadas
em diferentes alturas e em diferentes fases operacionais.
Legenda das amostras descritas na Figura 4.1
Com o objetivo de se compreender melhor o desenvolvimento da biomassa e o desempenho

dos reatores UASB em estudo, dados de anlises de perfil de slidos totais (ST) (Figura 5.2),
obtidos por De Paula et al. (2007), foram comparados com os resultados de extrao de DNA.
As anlises de ST mostraram que, durante o perodo de coleta das amostras e em todos os
49
perfis, houve a predominncia de slidos totais volteis (STV) em relao aos slidos totais
fixos (STF), o que significa que no lodo havia predominncia de frao orgnica, representada
principalmente pela biomassa. Alm disso, os perfis mais baixos (H1 e H4) apresentaram
maior concentrao de STV em relao aos outros pontos (H2 e H3 no reator R1 e H5 e H6
no reator R2), especialmente nas fases 3 e 4, quando os reatores tiveram concentraes muito
baixas ou quase nulas de ST nos pontos superiores. Os perfis H1 e H4 correspondem,
respectivamente, aos pontos de amostragem mais baixos do reator R1 e do reator R2. Seria
coerente que amostras retiradas dos perfis mais baixos apresentassem maior concentrao de
DNA, uma vez que, em cada da fase operacional, so os pontos que apresentam maior
concentrao de STF e de STV.
90
Fase 1
80
Fase 2
Fase 3
Fase 4
70
ST (g/L)
60
50
40
30
20
10
0
H1
H2
H3
H1
H2
H3
H1
H2
H3
H1
H2
H3
Perfil do Reator R1
STF
90
Fase 1
80
STV
Fase 2
Fase 3
Fase 4
70
ST (g/L)
60
50
40
30
20
10
0
H4
H5
H6
H4
H5
H6
H4
H5
H6
H4
H5
H6
Perfil do Reator R2
STF
STV
Figura 5.2 Perfis de ST das amostras de lodo dos

reatores R1 e R2 ao longo das fases 1 a 4
50
Uma elevada concentrao de DNA (entendida pela intensidade do brilho das bandas) foi
recuperada na maioria das amostras, como pode ser visto na Figura 5.1. Entretanto, no ponto
H4 da fase 4, a concentrao foi bem mais fraca, num perodo em que este ponto apresentou
uma das maiores concentraes de SV durante todas as fases operacionais. Como o volume
total de amostra analisada, para todos os pontos, foi o mesmo (50 mL), provvel que perdas
de DNA tenham ocorrido durante o processo de extrao e purificao das amostras, como,
por exemplo, reteno de DNA nas colunas cromatogrficas (HTP, Sephadex G-75), o que
explicaria tal fato. Segundo Head et al. (1998), uma das principais dificuldades e limitaes
de qualquer tcnica de extrao assegurar uma eficiente recuperao de DNA de amostras
ambientais por no se saber a priori a quantidade total de DNA microbiano ou, talvez, por no
se conseguir uma lise eficaz de todas as clulas presentes nas amostras. Pesquisar mtodos
alternativos ou complementares para extrao de DNA de amostras importante para que se
possa potencializar a ruptura das clulas, evitando-se as perdas e aumentando-se o rendimento
de cidos nucleicos.
5.1.2 Amplificao dos genes DNAr 16S de arquias por PCR
Aps extrao e purificao de DNA das amostras, procedeu-se a etapa de amplificao dos
genes DNAr 16S, primeiramente, com o par de primers ARC915 e ARC344 com a cauda
GC. Para verificao da especificidade dos primers de arquias, utilizou-se como controle
negativo amostra de DNA extrada de uma cultura Escherichia coli, amostra de referncia da
ATCC 25922, cedida gentilmente pelo laboratrio de Microbiologia Oral e Anaerbios do
ICB/ UFMG. O resultado da amplificao foi negativo, o que significou que os primers no se
anelaram ao DNA bacteriano, confirmando a sua especificidade.
Testes iniciais foram feitos com o programa de PCR sugerido por Casamayor et al. (2000),
sem se obter, no entanto, sucesso nos resultados. Os produtos de PCR apresentavam rastros,
conforme mostrado na Figura 5.3, alm da banda de interesse. Isso significa que havia
amplificao inespecfica de DNA, gerando fragmentos maiores que o de interesse (de 571
pares de bases).
51
H5
H5 branco
(1:10) (1:100)
H1
H3
E.coli
branco
(sem diluio)
500 pb
Figura 5.3 Reao de PCR com amostras da fase 1.

Legenda das amostras descritas na Figura 4.1
Como mencionado na metodologia, foram necessrias vrias modificaes no programa e no

protocolo com o objetivo de se conseguir melhores resultados de amplificao dos genes
presentes nas amostras. A melhoria da qualidade dos produtos de PCR foi alcanada nas
condies descritas na metodologia, resultando em produtos similares aos da Figura 5.4. Os
fatores que foram importantes na minimizao das bandas inespecficas foram as alteraes
no programa de ciclos de temperatura, a concentrao de reagentes e a quantidade de DNA
template ou DNA-molde. Para se alcanar as concentraes ideais de DNA-molde, testes
empricos foram feitos, utilizando-se 1,0L de alquota de amostra de DNA extrado, diluda
10 ou 100 vezes. Algumas amostras apresentaram boa amplificao na diluio de 100 vezes.
Na maioria das amostras, a diluio empregada foi a de 10 vezes. Os resultados da PCR eram
diretamente influenciados pela concentrao de alquota empregada; tais diferenas de
concentrao nas amostras podem estar relacionadas com a quantidade de DNA recuperada
em cada uma. Alm disso, observou-se que, em algumas amostras, aps sucessivos
descongelamentos e congelamentos, foi necessrio aplicar mais de 1,0L para se obter um
bom produto de PCR, mostrando que fatores externos, como a prpria preservao ou o
manejo freqente das amostras, podem provocar perdas de DNA.
H1 H2 H4 H1 H2 H4
(fase 3)
(A) Fase 1
(B) Fase 2
(fase 4)
(C) Fases 3 e 4
Figura 5.4 Produtos de PCR das fases 1 a 4
52
5.1.3 Separao dos produtos de PCR por DGGE

Na busca de se obter resultados que pudessem mostrar um perfil representativo da diversidade
e possveis flutuaes populacionais das arquias presentes nas diferentes alturas e fases
operacionais dos reatores, alguns testes de DGGE foram realizados em diferentes gradientes
de desnaturao. Os melhores perfis de bandas foram obtidos no gradiente de 45 a 65% e
esto apresentados nas figuras abaixo (gel de poliacrilamida 6%: Figuras 5.5A, B e D;
poliacrilamida 8%: Figura 5.5C).
Algumas bandas, localizadas nas extremidades superior e inferior dos gis, delimitadas por
uma elipse (Figura 5.5), foram observadas ocasionalmente. Janse et al. (2004) relatam que
bandas duplas ou rastros so problemas comuns, inerentes tcnica de PCR-DGGE,
freqentemente discutidos entre os pesquisadores. Em seus experimentos de PCR, um maior
tempo de incubao na etapa de extenso final (30 minutos) foi o suficiente para remover as
bandas adicionais. A mesma medida foi tomada para os experimentos de PCR-DGGE do
presente trabalho aps alguns testes iniciais, promovendo uma melhora nos resultados
(resultados no mostrados).
Os fragmentos contidos nos produtos de PCR tinham aproximadamente 570 pares de bases.
Cinco bandas foram observadas e relacionadas diversidade microbiana, das quais somente
duas bandas eram de visualizao bem ntida. O tamanho dos fragmentos pode ter prejudicado
a mobilidade e separao das bandas dentro do gel de gradiente desnaturante, o que levou a
um resultado de difcil visualizao. Watanabe et al. (2004) tambm encontraram resultados
similares com o par de primers ARC915 + ARC357 com cauda GC e acreditam que a
dificuldade de separao entre as bandas seja devido ao longo comprimento dos fragmentos
amplificados (prximos a 600 pb). Outra hiptese para explicar a difcil visualizao seria
uma alta similaridade na composio nucleotdica das bandas de DNA (o que significa uma
alta proximidade filogentica entre as arquias presentes nos reatores), o que permitiria que as
bandas ficassem muito prximas, com uma separao bem restrita mesmo em um gradiente de
45-65%.
A presena de apenas cinco bandas visveis revelou que a diversidade de arquias era pequena
em relao de bactrias (dados do domnio Bacteria no-mostrados). Tais bandas foram
nomeadas como ARC1, ARC2, ARC3, ARC4 e ARC5 e esto indicadas na Figura 5.5. De
fato, tal resultado corrobora com os de diversos estudos na literatura com lodo granular obtido
de reatores UASB tratando diversos tipos de efluentes. Os pesquisadores encontraram de 3 a 7
53
bandas visveis ou predominantes nos perfis de gis de DGGE da comunidade microbiana

metanognica (CHAN et al., 2001; BUZZINI et al., 2005; PASSIG et al., 2005; ROEST et
al., 2005; AKARSUBASY et al., 2006; CALLI et al., 2006b; DAZ et al., 2006; KEYSER et
al., 2006). Na maioria destes estudos, Methanosaeta foi o gnero de arquia predominante,
especialmente M. concilii. Dentre outros gneros detectados, freqentemente so descritos
Methanosarcina
outros
de
arquias
hidrogenotrficas:
Methanobacterium,
Methanocospusculum, Methanospirillum. Entretanto, tanto nos estudos com amostras de lodo

de reatores quanto com amostras ambientais, comum a ocorrncia de vrias seqncias de
DNA no relacionadas ou com baixa similaridade com espcies conhecidas, correspondendo a
microrganismos ainda no-cultivados e, portanto, desconhecidos.
Em outros estudos com amostras ambientais, a diversidade varivel. Casamayor et al.
(2000) encontraram 3 bandas ao analisarem amostras de sedimento de lagos sulfurosos na
Espanha. Dentre as arquias identificadas, metanognicas e no-metanognicas (gnero
Thermoplasma e filo Crenarchaeota). Em estudos com amostras de aqfero contaminado com
petrleo, Kleikemper et al. (2005) detectaram 15 a 20 bandas nos perfis de DGGE, sendo que
duas foram identificadas e relacionadas a gneros de arquias metanognicas conhecidas
(Methanosaeta e Methanospirillum), enquanto que outras trs foram relacionadas a clones de
arquias ambientais no-cultivadas. Watanabe et al. (2004) encontraram uma diversidade
significativa de arquias em amostras de sedimento obtidas de reas alagadas de cultivo de
arroz no Japo. Os pesquisadores testaram trs pares de primers diferentes para verificar qual
deles gerava um melhor perfil de DGGE. Ao todo, eles excisaram e seqenciaram 41
fragmentos de DNA. Em cada amostra, foram encontradas mais de 7 bandas de DNA. Os
fragmentos analisados foram identificados como de arquias metanognicas, sendo afiliados a
membros da ordem Methanosarcinales, especialmente Methanosaeta concilii, e da ordem
Methanomicrobiales (arquias hidrogenotrficas).
Os resultados apresentados na figura 5.5A e 5.5B indicaram que os inculos abrigavam outros
grupos de arquias que s surgiram aps um perodo de adaptao dos mesmos s condies
operacionais e dinmicas dos reatores. Isto pode ser comprovado pela melhor visualizao de
bandas (ARC2, ARC3 e ARC4) nas amostras retiradas dos perfis ao final de cada fase,
especialmente H1, H3, H4 e H5 (fases 1 e 2). Nos vrios testes de DGGE realizados, algumas
bandas, ARC5 especialmente, apareciam com intensidades bem diferentes, sendo muitas
vezes de difcil visualizao.
54
H1 H2 H4
H1 H2 H4
(C) Fase 3
(D) Fase 4
rastros ou bandas duplas
-4
1-
35-
-2
rastros ou bandas duplas
(A) Fase 1
(B) Fase 2
Figura 5.5 Imagem negativa de DGGE com as amostras das fases 1 a 4

(gradiente 45 a 65%)
A banda ARC1 nitidamente ocorreu em todas as amostras, sendo a mais evidente nos
inculos. Isso pode significar que, no momento da partida dos reatores, a arquia representada
pela banda ARC1 seria a predominante nos inculos analisados das fases 1 e 2. A banda
ARC2 tambm foi bem freqente nas amostras, contudo com menos intensidade na fase 1.
Ambas as bandas, ARC1 e ARC2, so as mais evidentes e se destacam das outras,
principalmente durante as fases 3 e 4, como pode ser verificado nas Figuras 5.5C e D. A
maior intensidade destas duas bandas poderia indicar uma possvel prevalncia de
determinada(s) populao(es) na maioria dos perodos amostrados.
Conforme mostrado na Figura 5.2, a concentrao de slidos foi diferente entre os perfis ou
alturas em cada reator. A concentrao de slidos poderia influenciar no desenvolvimento
microbiano, uma vez que maior quantidade de substrato estaria disponvel nos perfis mais
baixos. Visualizando a Figura 5.5, entretanto, verifica-se no houve diferena significativa na
diversidade de arquias entre os perfis de cada reator (H1, H2 e H3 no reator R1; H4, H5, H6
no reator R2), sugerindo que os mesmos microrganismos metanognicos estavam presentes
nos diferentes perfis dos dois reatores.
55
Quanto converso biolgica em cada reator, era esperado que o peneiramento forado
favorecesse a etapa de hidrlise, facilitando a degradao dos substratos complexos e
otimizando as etapas seguintes de converso biolgica, resultando em maior produo de
acetato e num maior desenvolvimento de microrganismos metanognicos. Para confirmar esta
hiptese dois pontos foram escolhidos para comparao do perfil de bandas entre as fases.
Tais pontos correspondiam ao leito de lodo dos reatores (H1 no reator R1 e H4 no reator R2).
Conforme mostrado na Figura 5.6, no se pode afirmar com certeza que houve alteraes nos
perfis populacionais de arquias, uma vez que os perfis de bandas foram muito similares em
cada fase operacional. Embora fosse observada uma tendncia de bandas menos intensas
durante as fases 3 e 4, que poderiam indicar leves flutuaes populacionais, seria necessria
uma padronizao da quantidade de DNA aplicada nos gis de DGGE para permitir tal
comparao. Como cada amostra apresentava diferentes rendimentos de fragmentos de DNA
(mostrados pela intensidade da banda do produto quando corridos em gis de agarose Figura
5.4), possvel que as variaes no perfil de bandas sejam decorrentes da qualidade dos
produtos de PCR e no, necessariamente, da diversidade de arquias presentes em cada ponto
amostrado dos reatores. Para verificar tal hiptese, mais experimentos de PCR-DGGE seriam
necessrios, padronizando-se a quantidade de DNA amplificado de cada amostra nos gis.
Anlises de DQO dos afluentes e efluentes dos reatores, realizadas por De Paula (2007),
mostraram que os mesmos apresentaram queda de eficincia de remoo de DQO total
durante a transio entre as fases 2 e 3 de 67% (R1) e 63% (R2) para 31 e 36%,
respectivamente, com perda de biomassa em decorrncia do aumento da velocidade
ascensional. Nas fases 4 e 5, esse valor aumentou para 51 a 58%. Entretanto, a remoo de
DQO filtrada se manteve estvel, apresentando em todas as fases valores em torno de 71 a
82% em ambos os reatores. Foi verificado tambm aumento da atividade metanognica
especfica na fase 3. Isto significa que os reatores mantiveram-se estveis em termos de
remoo biolgica. Tais resultados corroboram com os perfis de DGGE, que mostraram uma
tendncia de bandas menos intensas nesta fase. A prevalncia das bandas ARC1 e ARC2, bem
como o aumento de sua intensidade, sugerem que estas arquias eram as mais ativas na fase 3.
56
F1 F2 F3 F4
Reator R1
(H1)
(Reator R1)
Reator R2
(H4)
(A) Ponto H1
F1 F2 F3 F4
(Reator R2)
F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4
V. A. 0,5 0,7 1,1 0,5 0,5 0,7 1,1 0,5
(m/h)
TDH 9,0 7,0 5,0 9,0 9,0 7,0 5,0 9,0

(h)
(B) Ponto H4
(C)
Figura 5.6 Produtos de PCR dos pontos H1 (reator R1) e H4 (reator R2) e
comparao do perfil de bandas de DGGE ao longo das fases.
F1: fase 1; F2: fase 2; F3: fase 3; F4: fase 4; V. A.: velocidade ascensional
Era esperado um colapso dos reatores durante a fase 3 em face grande perda de biomassa,
porm isso no foi observado. Os resultados do monitoramento dos reatores mostraram que
houve apenas uma pequena queda na eficincia, enquanto que os resultados moleculares
mostraram que os mesmos tipos de arquias permaneceram no sistema. Todavia, alguns
trabalhos na literatura, citados por Liu et al. (2004), reportam que uma alta velocidade
ascensional do lquido e um curto TDH exerceriam uma presso seletiva sobre a comunidade
microbiana, induzindo granulao e removendo os microrganismos que no so
competentes a tal processo. Isto aumentaria a eficincia biolgica dos reatores. Apesar de no
ter sido observada a ocorrncia de granulao nos reatores R1 e R2, devido ao curto perodo
de tempo a que foram submetidos ao estresse hidrulico, possvel que a abundncia de
arquias dos dois reatores tenha sido levemente alterada , como mostrado nos perfis de DGGE
das fases 3 e 4. Porm esta biomassa aparentemente menos abundante apresentou uma alta
atividade biolgica mantendo uma boa eficincia de remoo de DQO.
Durante a fase 3, caracterizada pelo aumento da carga biolgica, os reatores mantiveram-se
estveis, mesmo com baixa quantidade de lodo conforme mostrado na Figura 5.2. Segundo
57
Liu et al. (2004), uma alta taxa de carga orgnica mantm o crescimento microbiano, sem que
ocorra inanio, sendo um dos fatores mais importantes a serem considerados durante a
partida de reatores. Entretanto, se a taxa de carga orgnica for muito alta durante a partida, a
taxa de produo de biogs aumenta a ponto de causar turbulncia hidrodinmica, lavando o
lodo do reator. No caso dos reatores em estudo, parece que o aumento da carga biolgica na
fase 3 favoreceu o desenvolvimento da biomassa durante a fase 4. Nesta fase, as perdas
biomassa no efluente foram reduzidas, uma vez que as condies operacionais (velocidade
ascensional e TDH) retornaram quelas da fase 1 (Figura 5.2).
Os resultados das anlises de AGV no lodo mostraram tambm que as maiores concentraes
foram detectadas durante as fases 3 e 4, notadamente nos perfis mais baixos H1 e H4 (Figura
5.7). As concentraes no excederam a 80 mg/L no reator R1 e 140 mg/L no reator R2. Tais
concentraes foram consideradas baixas, como esperado, uma vez que os esgotos so guas
residurias diludas, com baixa concentrao de matria orgnica. Isto comprova que a
degradao biolgica se processou de maneira eficiente, ao longo das fases, sem acmulo de
substratos intermedirios.
Em ambos os reatores, na maioria dos perfis, acetato estava presente, mas em concentraes
em que no excediam a 50 mg/L. Em ambientes onde a concentrao de acetato inferior a 1
mM (59 mg/L), o desenvolvimento de arquias acetoclsticas do gnero Methanosaeta
favorecido, pelo fato destas terem maior afinidade por acetato que as do gnero
Methanosarcina. Membros deste ltimo gnero s apresentam vantagem competitiva em
situaes onde a concentrao de acetato maior que 59 mg/ L (JETTEN et al., 1992;
ANDERSON et al., 2003; BUZZINI et al. 2006; HORI et al. 2006).
58
Concentrao de AGV (mg/L)
140,0
Fase 2
120,0
Fase 3
Fase 4
Fase 5
100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
Inculo H1
Fase 1
H2
H3
H1
H2
H3
H1
H2
H1
H2
H3
Perfil do Reator R1
formiato
acetato
propionato
isobutirato
Concentrao de AGV (mg/L)
(A)
Fase 4
140,0
Fase 2
120,0
Fase 3
Fase 5
100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
Inculo
Fase 1
H4
H5
H4
H6
H4
H4
H5
H6
Perfil do Reator 2
formiato
acetato
propionato
isobutirato
(B)
Figura 5.7 Concentraes dos principais AGV nos perfis dos reatores R1 e R2
ao longo das fases operacionais
Destaca-se a diferena de concentrao de AGV entre os perfis em cada reator. Nos perfis
mais baixos, onde h a entrada de esgoto bruto, esperado que haja vrios tipos de AGV,
resultante das etapas de hidrlise, acidognese e acetognese. medida que se sobe no perfil,
a matria orgnica contida na gua degradada, de tal forma que nos perfis mais altos h
menor concentrao de AGV (efluente ou esgoto tratado). As maiores concentraes de AGV
foram detectadas na fase 4. Os perfis H1 e H4 nas fases 3 e 4 foram os que apresentaram
maior concentrao de slidos e de biomassa tambm (STV), conforme verificado na Figura
5.2. Entretanto, tais diferenas de concentrao de AGV, especialmente de acetato e formiato,
59
no foram suficientes para alterar a comunidade de arquias, como mostrado nos padres de
bandas de DGGE.
5.1.4 Identificao das principais arquias metanognicas presentes nos reatores por
meio de seqenciamento de DNA
5.1.4.1 Purificao de bandas de DGGE amplificadas e seqenciamento
Aps anlise e observao cuidadosa dos gis, as bandas ARC1, ARC2, ARC3, ARC4 e
ARC5 foram excisadas, purificadas do gel de poliacrilamida e vrios testes de PCR foram
feitos para melhoria das condies da reao de amplificao das bandas. Para amplificao,
foi utilizado o par de primers ARC 915 + ARC 344 com cauda GC, cujos produtos foram
novamente corridos em DGGE com o objetivo de se verificar a pureza das bandas como
mostrado na Figura 5.8.
ARC ARC ARC ARC ARC

1
2
3
4
5
Figura 5.8 DGGE das bandas purificadas
Uma vez verificado que as bandas estavam isoladas, novos produtos de PCR foram gerados a
partir do uso do par de primers ARC915 + ARC344 sem a cauda GC para anlise de
seqenciamento. A Figura 5.9A mostra uma das reaes de amplificao das bandas. Foram
feitas vrias reaes de PCR com cada banda, cujos respectivos produtos foram submetidos
60
purificao de DNA para remoo de reagentes residuais (enzima, nucleotdeos, tampo, etc.).
Alquotas de 2 L dos produtos purificados de cada banda foram submetidas a eletroforese
em gel de agarose (2%), juntamente com 2 L de mass ladder (Figura 5.9B).
ARC ARC ARC ARC ARC
2
3
4
5
ladder 1
10000 pb
ARC ARC ARC ARC ARC

2
3
4
5
mass 1
ladder
100 ng
60 ng
40 ng
20 ng
10 ng
250/ 253 pb
5 ng
(A)
(B)
Figura 5.9 Amplificao das bandas ARC (A);

purificao e quantificao dos produtos de PCR (B)
Anlise comparativa com o perfil de bandas geradas pelo mass ladder, feita para estimar a
quantidade de DNA presente nos produto de PCR de cada banda extrada, mostrou um
rendimento de cerca de 20 ng (10 ng/L) para as bandas ARC1, ARC3 e ARC4 e 30 ng (15
ng/ L) para as bandas ARC2 e ARC5.
As bandas purificadas foram encaminhadas ao Setor de Seqenciamento de DNA do Centro
de Estudos do Genoma Humano (USP). Os resultados do seqenciamento, porm, no foram
satisfatrios, e indicaram incertezas na composio de nucleotdeos nas fitas de DNA. Isto
indica que, possivelmente, cada banda de DGGE no continha apenas seqncias de um nico
tipo, mas talvez fosse formada por diferentes seqncias. Muitos estudos que envolveram
PCRDGGE incluram etapas experimentais posteriores de clonagem das bandas excisadas e,
somente aps esta etapa, foi que se processou o seqenciamento (ROEST et al., 2005; CALLI
et al., 2005 e 2006b; KLEIKEMPER et al., 2005; DAZ et al., 2006). A etapa de clonagem
permite um melhor isolamento das diferentes seqncias que podem, eventualmente, estar
constitudas em uma nica banda. Porm esta etapa experimental requer o uso de reagentes de
alto custo, no previsto no oramento do projeto do qual este estudo fez parte e, por isso, no
foi realizado.
61
5.2 Identificao de morfologias de arquias metanognicas tpicas e de

interesse pela tcnica de FISH e determinao de sua abundncia
relativa
5.2.1 Morfotipos observados
Todas as arquias detectadas pela sonda ARC915 foram consideradas metanognicas,
partindo-se do pressuposto de que as condies ambientais dos reatores e digestores
anaerbios no favorecem o crescimento de outras que no sejam metanognicas (RASKIN et
al., 1994). Entretanto, como mostrado na reviso bibliogrfica, diversos estudos atualmente
tm detectado a presena de arquias no-metanognicas, prximas ao gnero Thermoplasma
e ao filo Crenarchaeota, por outras tcnicas moleculares em ambientes anaerbios (GODON
et al., 1997; ROEST et al., 2005; CARPENTIER et al., 2006; HOUARI et al., 2006).
A sonda, bem como o controle negativo (-proteobactria: Bulkholderia cepacia) utilizados
neste estudo foram doados gentilmente pelo Laboratrio de Microbiologia do Instituto de
Cincias Biomdicas da USP. A amostra bacteriana foi submetida anlise de FISH com a
sonda ARC915 e no emitiu sinais de fluorescncia, indicando resultado negativo,
confirmando a especificidade da sonda para o domnio Archaea.
Testes preliminares de FISH com as amostras da fase 5 mostraram que os filamentos do
gnero Methanosaeta (Figura 5.10 A) foram a nica morfologia de arquias observadas e que,
devido natureza floculenta das amostras, havia a necessidade de um tratamento prvio para
rompimento dos grnulos. Em todas as amostras, foi encontrada alta densidade de clulas,
tornando-se necessrias diluies de 5 ou 10 vezes. Alguns trabalhos na literatura sugerem a
sonicao das amostras para desintegrao dos grnulos e separao das clulas microbianas
(RASKIN et al., 1994; PLUMB et al., 2001; DAZ et al., 2006).
Aps o tratamento das amostras com prolas de vidro e subseqente diluio, outros testes
foram realizados e indicaram a presena de mais 3 morfotipos que se hibridizaram com a
sonda, dentre eles, agregados de cocos semelhantes ao gnero Methanosarcina, todos
mostrados na Figura 5.10. Nos testes preliminares, tais microrganismos permaneciam dentro
dos grnulos associados a outros, o que dificultava sua visualizao.
Devido morfologia extremamente variada e a dificuldade de visualizao de clulas
individuais, especialmente quelas relacionadas ao gnero Methanosaeta, as arquias foram
62
classificadas em morfotipos. Filamentos de Methanosaeta (Figura 5.10A) so constitudos por

um conjunto de vrias clulas enfileiradas, onde cada uma circuncidada por uma bainha nas
extremidades, semelhantes a um bambu. Freqentemente, estes filamentos so encontrados
formando uma trama dentro dos grnulos. Com o rompimento dos grnulos, foram
observados centenas de fragmentos destes filamentos, de tamanhos variados.
Segundo Whitman et al. (1992), os agregados de Methanosarcina (Figura 5.10B)
freqentemente so formados por cocos irregulares, envolvidos por uma membrana ou
parnquima; dentro desta, as clulas parecem possuir uma protena na parede celular,
adjacente membrana plasmtica, que permite a comunicao entre elas.
Os outros morfotipos identificados eram bem definidos em sua morfologia, embora fossem de
difcil visualizao. Tais filamentos eram bem mais finos que os de Methanosaeta, difceis de
serem observados na colorao de DAPI, denominados de morfotipos 3 e 4 (Figuras 5.10C e
D). Destaca-se que o cromforo DAPI um composto que cora o DNA microbiano, enquanto
que a sonda fluorescente se hibridiza no RNA ribossomal. Provavelmente, esse DNA
permanece condensado em algumas regies da clula, enquanto que o RNA ribossomal
encontra-se espalhado em toda a sua extenso. Isso talvez explique porque a visualizao da
morfologia da clula dos microrganismos melhor na captao de luz emitida pela sonda do
que pelo DAPI. O morfotipo 3 era um filamento curvo, em forma de arco. O morfotipo 4
eram filamentos finos, em forma de S ou levemente curvos. Muitos destes filamentos foram
observados com freqncia dentro de fragmentos de grnulos e o seu nmero pode ter sido
subestimado. Ambos morfotipos podem estar relacionados a gneros de arquias
hidrogenotrficas. Estes gneros so mais facilmente detectados, na maioria dos trabalhos,
por anlise de PCR-DGGE. Plumb et al. (2001) descreveram os microrganismos do gnero
Methanospirillum como filamentos finos simples e curtos.
63
contraste de fase
colorao com DAPI
contraste de fase
colorao com DAPI
colorao com a sonda ARC915
(A) Morfotipo 1: clulas semelhantes a Methanosaeta sp.
contraste de fase
colorao com DAPI
(B) Morfotipo 2: clulas semelhantes a Methanosarcina sp.
contraste de fase
(C) Morfotipo 3
contraste de fase
colorao com DAPI
(D) Morfotipo 4
Figura 5.10 Principais morfotipos de arquias observados nas amostras dos

64
reatores e em testes de AME. Visualizao em aumento de 1000 vezes
Calli et al. (2005) observaram que os sinais de hibridizao emitidos pelos gneros
Methanospirillum e Methanobacterium eram escassos e fracos, mesmo com sondas
especficas (MB1174 e MG1200) para tais grupos. Para se aumentar a intensidade de emisso
de sinal, diversos estudos descritos na literatura utilizaram dois tipos de sonda para
hibridizao (ARC915 e outra especfica do grupo de arquea em estudo). Sondas especficas
para deteco Methanosaeta e Methanosarcina so muito utilizadas, provavelmente, pela
importncia destes dois gneros na produo de metano a partir do acetato. No uso da sonda
universal ARC915, as morfologias destes gneros foram as mais freqentemente
identificadas. Methanosaeta tm sido a mais encontrada nos reatores anaerbios, sendo a sua
predominncia confirmada por outras anlises moleculares (PLUMB et al., 2001;
KLEIKEMPER et al., 2005; CALLI et al., 2006; DAZ et al., 2006). Daz et al. (2006)
comentam que este gnero constitua cerca de 75 a 96% do total de clulas de arquias. Os
autores relatam tambm que o gnero Methanosarcina no foi detectado por FISH em um dos
tipos de grnulos, somente por anlise de DGGE e clonagem.
5.2.2 Amostras dos reatores UASB
A Tabela 5.1 apresenta um nmero estimado dos principais morfotipos de arquias
observados nas amostras dos reatores da fase 5, que se hibridizaram com a sonda e foram
contados em 20 campos microscpicos. Os resultados evidenciaram uma alta quantidade de
arquias nas amostras. Considerando que todas as amostras foram processadas de forma
idntica (volumes amostrados e analisados) pde-se realizar uma comparao entre os
resultados. Interessante mostrar que a quantidade destes microrganismos foi maior,
praticamente o dobro, nos perfis mais baixos de ambos os reatores (pontos H1 e H4).
Certamente, estes pontos compreendem o leito de lodo mais denso, em termos de biomassa,
em relao ao lodo menos denso, representada pelos pontos H2 e H3 (reator R1), H5 e H6
(reator R2). Estes resultados indicam que uma maior quantidade de arquias, e possivelmente
tambm de bactrias, esto presentes no leito do reator. nesta regio do reator que
concentra-se uma maior disponibilidade de substratos precursores de metano, como mostrado
nas Figuras 5.2 (concentrao de slidos) e 5.7 (concentrao de AGV), o que justifica,
portanto, o elevado nmero de clulas de arquias contadas nas amostras H1 e H4.
65
Tabela 5.1 Nmero de unidades microbianas de arquias observadas

em 20 campos microscpicos nas amostras da fase 5 dos reatores R1 e R2
Amostra
H1
H2
H3
H4
H5
H6
Gnero
Methanosaeta
Morfotipo1
(unidades)
3470
1790
1510
3225
1625
1500
Gnero
Methanosarcina
Morfotipo 2
(unidades)
95
85
15
60
25
40
Arquias
hidrogenotrficas
Morfotipo 3 Morfotipo 4
(unidades) (unidades)
575
110
310
40
160
50
735
80
420
40
725
110
Total de
arquias
(unidades)
4250
2225
1735
4100
2110
2375
Por se tratar de um estudo de carter exploratrio, o presente trabalho objetivou apenas

estimar a abundncia relativa dos morfotipos de arquias observados, sem se preocupar com a
contagem total de microrganismos (bactrias inclusive). Os resultados da contagem de
arquias so mostrados na Tabela 5.1. O nmero de clulas encontrado nos 20 campos
microscpicos foi muito alto, mesmo aps as diluies. Alguns trabalhos na literatura
recomendam a contagem de 10 campos microscpicos que contenham 500 a 1000 clulas
totais coradas com DAPI (SANZ et al., 2005; DAZ et al., 2006). Em estudos de FISH com
lodo anaerbio de reatores UASB, Daz et al. (2006) recomendam a diluio de 50 vezes para
a amostra de lodo j preservada e fixada para contagem do total de microrganismos
(colorao com DAPI) e 5 vezes para contagem de microrganismos especficos (colorao
com sonda).
Os resultados da distribuio relativa das arquias observadas esto apresentados na Figura
5.11. O morfotipo 1 foi o predominante em ambos os reatores, constituindo cerca de 63 a 87%
da comunidade de arquias. Estes resultados corroboram com os de Daz et al. (2006), que
encontraram uma grande predominncia de membros de Methanosaeta (em torno de 75 a 96%
do nmero total de clulas de arquias detectadas tambm com a sonda ARC915) em grnulos
de reatores UASB tratando efluente de cervejaria.
66
Morfotipos hibridizados
com a sonda ARC 915 (%)
100%
2,6
13,5%
2,2%
80%
2,9%
9,2%
0,9%
1,8
13,9%
3,8%
1,9
17,9
1,9%
19,9%
1,5%
1,2%
4,6%
30,5%
1,7%
60%
81,7%
40%
80,5%
87,0%
77,0%
78,7%
63,2
20%
0%
H1
H2
H3
Reator R1
Morfotipo 1
Morfotipo 2
H4
H5
H6
Reator R2
Morfotipo 3
Morfotipo 4
Figura 5.11 Distribuio relativa dos principais morfotipos de arquias observados

em amostras da fase 5 dos reatores R1 e R2
A Tabela 5.3 apresenta uma estimativa da abundncia de arquias, que se situou entre 1,15 e
2,81 x 108 clulas por mL de lodo. At o momento, h poucos trabalhos na literatura com
resultados quantitativos de microrganismos presentes em lodo anaerbio de reatores UASB.
Sanz et al. (2005) quantificaram, por meio de FISH e utilizando a sonda ARC915, bactrias e
arquias presentes em grnulos de reatores UASB tratando diversos efluentes sintticos. Neste
estudo a quantidade de arquias variou de 4,81 x 109 a 1,91 x 1010 clulas por grama de lodo
anaerbio. Daz et al. (2006) tambm encontraram, pela mesma tcnica e utilizando o mesmo
tipo de sonda, uma alta densidade de arquias (8,8 x 109 a 1,9 x 1010 clulas/ grama de lodo)
em grnulos de reatores UASB tratando efluente de cervejaria. Comparando os resultados
apresentados na literatura com os do presente trabalho, verifica-se que os nmeros esto
acima dos encontrados nos reatores R1 e R2 (10 a 100 vezes maiores). Isto porque neste
trabalho, no foram contadas as clulas microbianas individuais, mas sim pequenos grupos,
que continham cerca de 2 a 4 clulas.
67

amostras da fase 5 dos reatores R1 e R2
Amostra
Gnero
Methanosaeta
Arquias
hidrogenotrficas
(unidades/ mL)
(unidades/ mL)
(unidades/mL)
(unidades/mL)
Total
de
arquias
(unidades/
mL)
2,29 x 108
1,18 x 108
1,00 x 108
2,13 x 108
1,00 x 108
1,00 x 108
6,28 x 106
5,62 x 106
1,0 x 106
3,97 x 106
1,65 x 106
2,64 x 106
3,80 x 107
2,05 x 107
1,06 x 107
4,86 x 107
2,78 x 107
4,79 x 107
7,27 x 106
2,64 x 106
3,31 x 106
5,29 x 106
2,64 x 106
7,27 x 106
2,81 x 108
1,47 x 108
1,15 x 108
2,71 x 108
1,39 x 108
1,57 x 108
Morfotipo 1
H1
H2
H3
H4
H5
H6
Gnero
Methanosarcina
Morfotipo 2
Morfotipo 3
Morfotipo 4
Concen
trao
de
acetato
(mg/L)
Concen
trao
de
formiato
(mg/L)
6,5
1,0
0,0
4,5
2,7
3,5
1,2
0,8
0,0
2,6
1,6
0,5
A predominncia do gnero Methanosaeta em diversos sistemas anaerbios, descritos na

literatura, aliada aos resultados de concentrao de AGV (acetato e formiato) das amostras
analisadas neste trabalho, mostrados na Tabela 5.3, cujas concentraes foram bem inferiores
a 59 mg/L, confirmam a hiptese de que morfotipo 1 seja uma arquia acetoclstica
pertencente a este gnero. Membros de Methanosaeta so bastante detectados por meio de
PCR-DGGE. Alguns trabalhos na literatura identificaram uma ou mais bandas pertencentes ao
gnero, ou a uma mesma espcie, freqentemente, Methanosaeta concilii (CHAN et al. 2001;
WATANABE et al. 2004; AKARSUBASI et al. 2005; KLEIKEMPER et al. 2005; ROEST et
al. 2005; AKARSUBASI et al. 2006; CALLI et al. 2006; DAZ et al. 2006; KEYSER et al.
2006). Provavelmente, este gnero esteja relacionado tambm a uma das bandas mais
freqentemente encontradas ARC1 ou ARC2 nos padres de DGGE.
5.2.3 Amostras de lodo de testes de AME
Os testes de AME foram realizados por Souto (2007) com lodos anaerbios provenientes de
cada um dos reatores e alguns resultados so mostrados no Anexo 4. Segundo Chernicharo
(2007), na prtica, o teste de AME consiste em se avaliar a capacidade das arquias
metanognicas em converter o substrato orgnico em metano e gs carbnico. A partir das
quantidades conhecidas de biomassa (g de STV) e de substrato (g de DQO), e sob condies
estabelecidas e controladas, avalia-se a produo de metano ao longo do perodo dos testes (g
de DQOCH4/d) com substratos especficos.
Os mesmos princpios para a anlise e contagem dos morfotipos de arquias observados nas
amostras dos reatores foram utilizados nos estudos das amostras de lodo de testes de AME
68
com diferentes substratos. Os resultados indicaram que as amostras dos testes de AME
apresentaram uma baixa densidade de microrganismos, especialmente no cultivo com
formiato, alm de sinais de endogenia, como pode ser verificado na Figura 5.12, na qual
filamentos de Methanosaeta apresentam espaos vazios e parcialmente desintegrados, bem
diferentes dos filamentos encontrados nas amostras dos reatores.
(A) Amostra dos reatores
(B) Amostras aps teste de AME
(C) Amostra dos reatores
(D) Amostra aps teste de AME
Figura 5.12 Comparao entre filamentos de Methanosaeta sp. em contraste de fase

(A e B) e em colorao DAPI (C e D), aumento de 1000 vezes
A Tabela 5.3 apresenta a abundncia dos principais morfotipos identificados nos testes de
AME. A Figura 5.13 apresenta uma comparao da abundncia relativa dos quatro morfotipos
encontrados nas amostras. Analisando-se os resultados de FISH (grfico da Figura 5.13) com
aqueles obtidos nos testes de AME (grficos do Anexo 4), verifica-se que os cultivos com
acetato e com formiato foram os que apresentaram as maiores eficincias de produo de
metano, como esperado. O morfotipo 1, semelhante ao gnero Methanosaeta, foi encontrado
em todos os cultivos, sendo predominante no cultivo com acetato e com formiato. O morfotipo
2, semelhante a Methanosarcina, foi detectado apenas no cultivo com formiato, estando
ausente na maioria das amostras.
69
Tabela 5.3 Nmero de unidades microbianas de arquias observadas

em 20 campos microscpicos de amostras de testes de AME com diferentes substratos
Substrato
Morfotipos hibridizados
com a sonda ARC 915 (%)
Acetato
Formiato
Glicose
Branco
Gnero
Methanosaeta
Morfotipo1
(unidades)
133
75
29
34
100%
80%
Arquias
hidrogenotrficas
Morfotipo Morfotipo
3
4
14
10
6
2
102
35
81
8
Gnero
Methanosarcina
Morfotipo 2
(unidades)
0
3
0
0
6,1%
9,2%
1,9%
7,4%
3,7%
84,7%
87,0%
Total de
arquias
(unidades)
157
86
166
123
6,5%
21,2%
60%
61,5%
40%
66,2%
20%
27,3%
17,3%
0%
Acetato
Morfotipo1
Formiato
Morfotipo 2
Glicose
Morfotipo 3
Branco
Morfotipo 4
Figura 5.13 Distribuio relativa dos principais morfotipos de

arquias observados em amostras de testes de AME com diferentes substratos
A predominncia de filamentos de Methanosaeta j era esperada no cultivo com acetato, o que

foi confirmado com as anlises de FISH. No cultivo com formiato, porm, era esperada a
predominncia de arquias hidrogenotrficas, uma vez que estas utilizam CO2 e H2 como
precursores metanognicos. Diferentemente do esperado, filamentos de Methanosaeta tambm
foram predominantes no cultivo com formiato, que foi o que apresentou menor quantidade de
microrganismos, mais baixa inclusive que o branco (cultivo de lodo sem substrato). Isto
poderia ser explicado pelo fato de tais filamentos j estarem presentes em alta quantidade no
inculo e seu crescimento pode ter sido propiciado pela presena de acetato eventualmente
produzido por bactrias homoacetognicas, que utilizam como substrato compostos
constitudos por um s carbono, tais como o formiato. Segundo Sanz et al. (2005), lodos
crescidos em formiato so casos extremos, nos quais bactrias ativas esto praticamente
ausentes, uma vez que tal composto degradado predominantemente por arquias que
apresentam metabolismo hidrogenotrfico ou generalista (gnero Methanosarcina).
70
A Tabela 5.4 que apresenta uma estimativa da abundncia de arquias por mL de amostra dos
testes de AME, comparando-se tambm a produo de metano acumulada no perodo e a
eficincia de produo. Os cultivos com acetato e com formiato foram os que apresentaram
maiores eficincias de produo (70%), enquanto que o cultivo com glicose apresentou baixa
eficincia (19%). Neste caso, o baixo pH, resultante da atividade acidognica, pode ter sido o
fator responsvel pelo baixo desevolvimento das arquias acetoclsticas.
Tabela 5.4 Estimativa da abundncia dos principais morfotipos
de arquias por mL de amostra de testes de AME com diferentes substratos
Substrato
Gnero
Methanosaeta
(unidades/ mL)
(unidades/ mL)
Morfotipo 3
(unidades/
Morfotipo 4
Total
de
arquias
(unidades/
(unidades/ mL)
mL)
8,79 x 106
4,96 x 106
1,92 x 106
2,25 x 106
0
2,60 x 105
0
0
9,25 x 105
3,97 x 105
6,74 x 106
5,35 x 106
6,61 x 105
1,32 x 105
2,31 x 106
5,29x 105
1,04 x 107
5,68 x 106
1,10 x 107
8,13 x 106
Morfotipo 1
Acetato
Formiato
Glicose
Branco
Gnero
Methanosarcina
Morfotipo 2
Arquias
hidrogenotrficas
mL)
Eficincia
Volume
de
acumulaproduo
do de CH4
de CH4
(mL)
(%)
122
40
33
70
70
19
12
Obs.: valores de volume acumulado de CH4 e eficincia de produo foram obtidos por
Souto (2007) e esto no Anexo 4.
O cultivo com glicose apresentou a predominncia dos morfotipos 3 e 4. O baixo pH,

resultante da atividade acidognica, pode ter sido o fator responsvel pelo baixo
desevolvimento das arquias acetoclsticas. Nesta amostra, foi observada tambm uma alta
quantidade de bacilos ou diplococos, que no se hibridizaram com a sonda ARC915 e que
poderiam representar bactrias fermentativas. Tais microrganismos foram observados tambm
nas amostras dos reatores, mas com uma freqncia muito menor. Outro fato observado foi
que os morfotipos 3 e 4 apresentavam-se muito maiores, provavelmente devido ao
favorecimento de suas condies de crescimento. Em estudos de Fernndez et al. (1999) com
reator anaerbio alimentado com glicose, os pesquisadores observaram a dominncia de
arquias hidrogenotrficas prximas a Methanobacterium formicium durantes vrios meses.
Em outros estudos de Fernndez et al. (2000) com dois tipos de reatores anaerbios tambm
alimentados com glicose, foi verificada alta prevalncia de arquias hidrogenotrficas da
ordem Methanomicrobiales em um dos tipos de reatores e do gnero Methanosarcina no
outro, constatando uma menor freqncia do gnero Methanosaeta.
71
6 CONCLUSES
Com base no objetivo geral e nos objetivos especficos desta pesquisa, foi possvel
caracterizar a diversidade microbiana metanognica de ambos os reatores UASB, concluindose que:
Ambas as tcnicas PCR-DGGE e FISH indicaram que a diversidade de arquias restrita,
constituda por 4 ou 5 populaes. Morfologias tpicas foram encontradas, semelhantes a
gneros de arquias metanognicas acetoclsticas: intensos filamentos de Methanosaeta e
agregados de cocos de Methanosarcina. As outras duas morfologias filamentosas
observadas podem estar relacionadas a arquias hidrogenotrficas;
Pela anlise de PCR-DGGE, conclui-se que a diversidade de arquias similar ao longo do
perfil vertical de cada um dos reatores, ou seja, as mesmas populaes estavam presentes
em todas as alturas dos reatores. Entre reatores tambm no houve diferenas na
diversidade, o que significa que o peneiramento forado do esgoto no reator R2 no
interferiu aparentemente no desenvolvimento da comunidade de arquias quando
comparado com o reator controle (R1). Isto pode ser confirmado indiretamente pelas
anlise fsico-qumicas, que mostraram uma manuteno da converso biolgica (remoo
de DQO filtrada) e, portanto, desempenho estvel dos reatores, demonstrando que a
microbiota metanognica foi capaz suportar as condies operacionais impostas;
Ainda pela anlise de PCR-DGGE, verificou-se que a diversidade de arquias no sofreu
alteraes bruscas ao longo das fases operacionais (1 a 4), o que siginifica que as mesmas
populaes estavam presentes em todo o perodo de monitoramento dos reatores.
Entretanto, h indcios de que algumas populaes podem ter predominado durante a fase
3, quando ocorreu o aumento da carga biolgica, e tambm durante a fase 4.
Quanto anlise de FISH, realizadas durante a fase 5, observou-se diferenas na
quantidade de microrganismos detectados entre os perfis de cada reator. Nos perfis mais
baixos dos reatores (H1 e H4), onde se encontra o leito de lodo mais denso, foi encontrado
um nmero muito maior de microrganismos. A concentrao de arquias foi estimada em
torno de 2,81 x 108 morfotipos/ mL de lodo para o perfil H1 e 2,71 x 108 morfotipos/ mL
para perfil H4, quase o dobro de arquias encontradas nos outros perfis.
A comunidade microbiana metanognica foi dominada, durante a fase 5, por arquias
filamentosas semelhantes aos do gnero Methanosaeta (63 a 87%), em ambos reatores,
com concentraes que variavam de 1,0 x 108 a 2,3 x 108 morfotipos/ mL de lodo.
72
Provavelmente, a banda mais intensa detectada nas fases anteriores, por meio de PCRDGGE, est relacionada ao gnero, corroborando com muitos estudos descritos na
literatura..
Ainda pela anlise de FISH, nos testes de AME com lodo dos reatores, o cultivo com
acetato foi o que apresentou maior desenvolvimento de arquias do gnero Methanosaeta
(em torno de 85%: 8,8 x 106 morfotipos/ mL de lodo) e maior acmulo de metano (122
mL), como esperado. O cultivo com glicose apresentou uma produo bem menor de
metano (33 mL) e baixo desenvolvimento de arquias (1,10 x 107 morfotipos/ mL),
principalmente as acetoclsticas (cerca de 17%: 1,9 x 106 morfotipos/ mL), provavelmente
devido ao baixo pH (5,13) resultante da fase acidognica. No cultivo com formiato,
esperava-se
predomnio
de arquias
hidrogenotrficas; ao contrrio, houve
predominncia de filamentos de Methanosaeta (4,96 x 106 morfotipos/ mL), sugerindo

associao sintrfica com bactrias homoacetognicas, que so consumidoras de formiato
e produtoras de acetato.
73
7 RECOMENDAES
As recomendaes apresentadas descritas abaixo se referem a aspectos metodolgicos.
Em todos os testes moleculares, recomendvel a utilizao de amostras de referncia

de arquias mais comumente encontradas em reatores, tais como Methanosaeta
concilii, Methanobacterium formicium (ordem Methanobacteriales), Methanosarcina
sp. e Methanospirillum sp (ordem Methanomicrobiales) como controles-positivos. Na
impossibilidade de aquisio de todas as amostras, obter, pelo menos, uma de arquia
acetoclstica relacionada ao gnero Methanosaeta e outra de arquia hidrogenotrfica,
relacionada ao gnero Methanobacterium. Estas amostras podero dar um suporte mais
confivel, principalmente nas anlises de DGGE e FISH, uma vez que estes
microrganismos tm sido os tipos de arquias mais freqeentemente encontrados em
sistemas de tratamento anaerbio;
Quanto aos aspectos metodolgicos, apresentados no item 4, sugere-se que novos

testes sejam feitos com outro par de primers que produza fragmentos menores para
melhor separao dos mesmos nos gis de DGGE, bem como utilizar outros mtodos
de colorao dos gis, que so mais sensveis e so freqentemente referidos na
literatura, tais como nitrato de prata, Syber Green ou Vista Green. Alm disso, inserir
uma etapa de clonagem das bandas excisadas dos gis para facilitar tanto a separao
dos fragmentos de DNA quanto a posterior anlise de seqenciamento;
Nas anlises de FISH, recomenda-se a utilizao de sondas fluorescentes especficas

(em nvel de ordem, famlia ou gnero) para grupos de arquias metanognicas,
permitindo uma identificao mais precisa;
Em virtude da morfologia extremamente variada das arquias, necessria uma

padronizao de contagem de clulas, principalmente dos filamentos de Methanosaeta
por serem os predominantes. Pr-tratamento do lodo (sonicao, por exemplo) antes
ou depois da etapa de preservao das amostras para FISH para desintegrao dos
grnulos. Maiores diluies tambm so necessrias para facilitar a contagem de
microrganismos. Alguns estudos com lodo anaerbio de reatores UASB (SANZ et al.,
2005; DAZ et al., 2006) recomendam a contagem de apenas 10 campos
microscpicos que contenham 500 a 1000 clulas microbianas totais coradas com
74
DAPI e maiores diluies (50 vezes) das amostras de lodo j preservadas e fixadas
para contagem no DAPI;
Meios digitais de captao de imagens para a tcnica de FISH so necessrios, pois

so rpidos, evitando a perda excessiva de fluorescncia pelos microrganismos
hibridizados, e possibilitam o armazenamento dos dados para posterior contagem, o
que oferece uma quantificao mais precisa dos microrganismos;
Finalmente, quando possvel, submeter as amostras a ambas tcnicas moleculares, uma

vez que seus resultados fornecem informaes complementares, facilitando a
interpretao de resultados fsico-qumicos e, conseqentemente a compreenso do
funcionamento dos reatores.
75
REFERNCIAS
AKARSUBASI, A. T.; INCE, O.; KIRDAR, B. OZ, N. A.; ORHON, D.; CURTIS, T.
P.;HEAD, I. M.; INCE, B. K. Effect of wastewater composition on archaeal population
diversity. Water Research, v. 39, p. 1576-1584, 2005.
AKARSUBASI, A. T.; INCE, O.; OZ, N. A.; KIRDAR, B.; INCE, B. K. Evaluation of
perfomance, acetoclastic methanogenic activity and archaeal composition of full-scale UASB
reactors treating alcohol distillery wastewaters. Process Biochemistry, v. 41, p. 28-35, 2006.
AMANN, R. I.; KRUMHOLZ, L.; STAHL, D. A. Fluorescent-oligonucleotide probing of
whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental studies in microbiology.
Journal of Bacteriology, v. 172, n.2, p.762-770, 1990.
AMANN, R. I.; LUDWING, W.; SCHLEIFER, K. H. Phylogenetic identification an in situ
detection of individual cells without cultivation. Microbial Reviews, v. 59, n.1, p.143-169,
1995.
ANDERSON, K., SALLIS, P., UYANIK, S. Anaerobic treatment processes. In: MARA, D.;
HORAN, N. (Ed.) The handbook of water and wastewater microbiology. Academic Press. p.
391-396, 2003.
AQUINO, S.F.; CHERNICHARO, C.A. L. Acmulo de cidos graxos volteis (AGV) em
reatores anaerbios sob estresse: causas e estratgias de controle. Revista de Engenharia
Sanitria e Ambiental. 10:152-161, 2005.
ARCHER, D.B.; KIRSOP, B.H. The microbiology and control of anaerobic digestion. In:
WHETLEY, A. (Ed.). Anaerobic digestion: a waste treatment technology, pp. 43-91, 1990
BATSTONE, D. J.; KELLER, J.; BLACKALL, L. L. The influence of substrate kinetics on
the microbial community structure in granule anaerobic biomass. Water Research, v. 38, p.
1390-1404, 2004.
BUZZINI, A. P.; SAKAMOTO, I. K.; VARESCHE, M. B., PIRES, E. C. Evaluation of the
microbial diversity in an UASB reactor treating wastewater from an unbleached pulp plant.
Process Biochemistry, v. 41, p. 168-176, 2006.
CALLI, B.; MERTOGLU, B.; INANC, B.; YENIGUN, O. Methanogenic diversity in
anaerobic bioreactors under extremely high ammonia levels. Enzyme and Microbial
Technology, v. 37, p. 448-455, 2005.
CALLI, B.; DURMAZ, S.; MERTOGLU, B. Identification of prevalent microbial
communities in an municipal solid waste landfill. Water Science Technology, v. 53, p., n. 8,
139-147, 2006a.
CALLI, B.; MERTOGLU, B.; ROEST, K.; INANC, B. Comparison of long-term
performances and final microbial compositions of anaerobic reactors treating landfill leachate.
Bioresource Technology, v. 97, p. 641-647, 2006b.
CAMPOS, J. R. (coordenador) Tratamento de esgotos sanitrios por processo anaerbio e
disposio controlada no solo. Programa de Pesquisa em Saneamento Bsico. 435 p. 1999.
CARPENTIER, W. L.; LI, T.; VIGNERON, V.; MAZAS, L.; BOUCHEZ, T. Methanogenic
diversity and activity in municipal solid waste landfill leachates. Antonie van Leuwenhoek, v.
89, p. 423-434, 2006.
CASAMAYOR, E. O.; SHFER, H.; BAERAS, L.; PEDRS-ALI, C; MUYZER, G.
Identification of and spatio-temporal differences between microbial assemblages from two
76
neighboring sulfurous lakes: comparison by microscopy and denaturing gradient gel

electrophoresis. Applied and Environmental Microbiology, v. 66, n. 2, p. 499-508, 2000.
CASSERLY, C.; ERIJMAN, L. Molecular monitoring of microbial diversity in an UASB
reactor. International Biodeterioration & Biodegradation, v. 52, p. 7-12, 2003.
CHAN, O. C.; LIU, W. T.; FANG, H. H. P. Study of microbial community of brewerytreating granular sludge by denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rRNA gene. Water
Science Technology, v.43, n.1, p. 77-82, 2001.
CHERNICHARO, C. A. L. Princpio do tratamento biolgico de guas residurias
Reatores anaerbios, v. 5, 2 edio, Belo Horizonte: Ed. UFMG, 380 p., 2007.
CHOUARI, R.; PASLIER, D. L.; DAEGELEN, P.; GINESTET, P.; WESSENBACH, J.;
SGHIR, A. Novel predominant archaeal and bacterial groups revealed by molecular analysis
of an anaerobic sludge digester. Environmental Microbiolgy, v. 7, n. 8, p. 1104-1115, 2005.
DE PAULA, F. S. Influncia dos aspectos hidrulicos na otimizao de parmetros de
projeto de reatores UASB tratando esgotos domsticos. Dissertao (Mestrado em
Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hdricos) Escola de Engenharia, Universidade
Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2007.
DEARMAN, B.; MARSCHNER, P.; BENTHAN, R. H. Methane production and microbial
community structure in single-stage batch and sequential batch systems anaerobically codigesting food waste and biosolids. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 69; p. 589596, 2006.
DELBS, C.; MOLETTA, R.; GODON, J. J. Bacterial and archaeal 16S rRNA dynamics
during an acetate crisis in an anaerobic digestor ecosystem. FEMS Microbiology Ecology,
v.35, p. 19-26, 2001.
DAZ, E. E.; STAMS, A. J. M.; AMILS, R.; SANZ, J. L. Phenotypic properties and microbial
diversity of methanogenic granules from a full-scale upflow anaerobic sludge bed reactor
treating brewery wastewater. Applied and Environmental Microbiology, v.72, n. 7, p. 49424949, 2006.
FERNNDEZ, A.; HUANG, S.; SESTON, S.; XING, J.; HICKEY, R.; CRIDDLE, C.;
TIEDJE, J. How stable is stable? Function versus community composition. Applied and
Environmental Microbiology, v.65, n. 8, p.3697-3704, 1999.
FERNNDEZ,; HASHSHAM, S. A.; DOLLHOPF, S. L.; RASKIN, L.; GLAGOLEVA, O.;
DAZZO, F. B.; HICKEY, R. F.; CRIDDLE, C. S.; TIEDJE, J. M. Flexible community
structure correlates with stable community function in methanogenic bioreactor communities
perturbed by glucose. Applied and Environmental Microbiology, v.66, n. 9, p.4058-4067,
2000.
FORESTI, E.; FLORNCIO, L.; HAANDEL, A. V.; ZAIAT, M.; CAVALCANTI, F. F.
Fundamentos do tratamento anaerbio. In: CAMPOS, J. R. (coordenador). Tratamento de
esgotos sanitrios por processo anaerbio e disposio controlada no solo. Rio de Janeiro:
PROSAB, p. 29-52, 1999.
FORESTI, E.; ZAIAT, M. VALLERO, M. Anaerobic processes as the core technology for
sustainable domestic wastewater treatment: consolidated applications, new trends,
perspectives, and challenges. Reviews in Environmental Science and Biotechnology, 5:3-19,
2006.
GODON, J. J.; ZUMSTEIN, E.; DABERT, P.; HABOUZIT, F.; MOLETTA, R. Molecular
microbial diversity of an anaerobic digestor as determined by small-subunit rDNA sequence
analysis. Applied and Environmental Microbiology, v.63, n. 7, p.2802-2813, 1997.
77
HAHN D.; AMANN, R. I.; LUDWIG, W.; AKKERMANS, A. D. L; SCHLEIFER, K. H.

Detection of microorganisms in soil after in situ hybridization with rRNA-targeted,
fluorescently labelled oligonucleotides. J. Gen. Microbiol., v. 138, p. 879-887, 1992.
HAJARNIS, S.R., RANADE, D. R. Effext of propionate toxicity on some methanogens at
different pH values and in combination with butyrate. Proceeding of 7th International
Symposium on Aerobic Digestion, Cape Town, South Africa, 1994.
HASHSHAM, S. A.; FERNNDEZ, A. S.; DOLLHOPF, S. L.; DAZZO, F. B.; HICKEY, R.
F.; TIEDJE, J. M.; CRIDDLE, C. S. Parallel processing of substrate correlates with greater
functional stability in methanogenic bioreactor communities perturbed by glucose. Applied
and Environmental Microbiology, v.66, n. 9, p.4050-4057, 2000.
HEAD, I. M.; SAUNDERS, J. R.; PICKUP, R. W. Microbial evolution, diversity, and
ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganisms. Microbial
Ecology, 35, p. 1-21, 1998.
HORI, T.; HARUTA, S.; UENO, Y.; ISHII, M.; IGARASHI, Y. Dynamic transition of a
methanogenic population in response to the concentration of volatile fatty acids in a
themophilic anaerobic digester. Applied and Environmental Microbiology, v. 72, n. 2, p.16231630, 2006.
HUANG, L. N.; CHEN, Y. Q.; ZHOU, H.; LUO, S.; LAN, C. Y.; QU, L. H. Characterization
of methanogenic Archaea in the leachate of a closed municipal solid waste landfill. FEMS
Microbiology Ecology, v.46, p. 171-177, 2003.
HUBER, H.; HOHN, M. J.; RACHEL, R; FUCHS, T. A new phylum of Archaea represented
by a nanosized hyperthermophilic symbiont. Nature, v. 417, p. 63-67, 2002.
JANSE, I.; BOK, J.; ZWART, G. A simple remedy against artifactual double bands in
denaturing gradient gel electrophoresis. Journal of Microbiological Methods, v. 57, p. 279281, 2004.
JETTEN, M. S. M.; STAMS, A. J. M.; ZEHNDER, A. J. B. Methanogenesis from acetate: a
comparison of the acetate metabolism in Methanothrix soehngenii and Methanosarcina spp.
FEMS Microbiology Reviews, 88, p. 181-198, 1992.
KEYSER, M.; WITTHUHN, R. C.; LAMPRECHT, C.; COETZEE, M. P. A.; BRITZ, T. J.
PCR-based DGGE fingerprinting and identification of methanogens detected in three
different types of UASB granules. Systematic and Applied Microbiology, v. 29, p. 77-84,
2006.
KLEYKEMPER, J.; POMBO, S. A.; SCHROTH, M. H.; SIGLER, W. V.; PESARO, M.;
ZEYER, J. Activity and diversity of methanogens in a petroleum hydrocarbon-contamined
aquifer. Applied and Environmental Microbiology, v.71, n. 1, p.149-158, 2005.
LECLERC, M.; DELBES, C.; MOLETTA, R.; GODON, J. J. Single strand conformation
polymorphism monitoring of 16S rDNA Archaea during start-up of an anaerobic digester.
FEMS Microbiology Ecology, v. 34, p. 213-220, 2001.
LECLERC, M.; DELGNES, JP.; GODON, JJ. Diversity of the archaeal community in 44
anaerobic digesters as determined by single strand conformation polymorphism analysis and
16S rDNA sequencing. Environmental Microbiology, v. 6, n.8, p. 809-819, 2004
LEITO, R. C.; HANDEL, A. C.; ZEEMAN, G.; LETTINGA, G. The effects of operational
and environmental variations on anaerobic wastewater treatment systems: a rewiew.
Bioresource Technology, v. 97, p. 1105-1118, 2006.
78
LETTINGA, G. Anaerobic digestion and wastewater treatment systems. Antonie van

Leeuwenhoek. v. 67, p. 3-28, 1995.
LIU, W. T.; CHAN, O. C.; FANG, H. H. P. Characterization of microbial community in
granular sludge treating brewery wastewater. Water Research, v. 36, p. 1767-1775, 2002.
LIU, Y.; TAY, J. H. State of the art of biogranulation technology for wastewater treatment.
Biotechnology Advances, v. 22, p. 533-563, 2004.
MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Brock Biology of microrganisms. 10
edio, 1078 p., 2003.
MC CARTY, P. L. One hundred years of anaerobic treatment. In: SECOND
INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON ANAEROBIC DIGESTION (6-11 september 1981,
Travemnde, Germany), Edited by Hughes et al. Elsevier Biomedical Press B. V.,
Amsterdam, The Netherlands, 1982.
MC HUGH, S.; CARTON, M.; MAHONY, T.; OFLAHERTY, V. Methanogenic population
structure in a variety of anaerobic bioreactors. FEMS Microbiology Letters, v. 219, p. 297304, 2003.
MUYZER, G.; WALL, E. C.; UITTERLINDEN, A. G. Profiling of complex microbial
populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reactionamplified genes coding for 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology, v. 59, n. 3,
p. 695-700, 1993.
MUYZER, G.; HOTTENTRAGER, S.; TESKE, A.; WAWER, CATHRIN. Denaturing
gradient gel electrophoresis of PCR-amplified 16S rDNA A new molecular approach to
analyse the genetic diversity of mixed microbial communities. Molecular Microbial Ecology
Manual, v. 3.44, Kluwer Academic Publishers, The Netherlands, 1996.
OFLAHERTY, V.; COLLINS, G.; MAHONY, T. The microbiology and biochemistry of
anaerobic bioreactors with relevance to domestic sewage treatment. Rewiews in
Environmental Science and Bio/Technology, v. 5, p. 39-55, 2006.
PACE, N. R.; STAHL, D. A.; LANE, D. J.; OLSEN, G. J. The analysis of natural microbial
populations by ribosomal RNA sequences. Adv. Microb. Ecol., 9:1-55, 1986.
PASSIG, F. H.; SAKAMOTO, I. K.; VARESHE, M. B. A.; CAMPOS, J. R. Aspectos
microbiolgicos do reator UASB, utilizado no tratamento de esgoto sanitrio. In: SIMPSIO
NACIONAL DE FERMENTAO, 2005.
PICIOREANU, C.; D. J. BATSTONE, VAN LOOSDRRECHT, M. C. M. Multidimensional
modelling of anaerobic granules. Water Science Technology, v. 52, n. 1-2, p. 501-507, 2005.
PLUMB, J. J.; BELL, J.; STUCKEY, C. Microbial populations associated with treatment of
an industrial dye effluent in an anaerobic baffled reactor. Applied and Environmental
Microbiology, v. 67, n. 7, p. 3226-3235, 2000.
PURDY, K. J.; EMBLEY, T. M.;TAKII,S.; NEDWELL,D.B. Rapid extraction of DNA and
rRNA from sediments by a novel hydroxyapatite spin-column method. Applied and
Environmental Microbiology, v. 62, n. 10, p. 3905-3907, 1996.
RASKIN, L.; POULSEN, L. K.; NOGUERA, D. R.; RITTMANN, B. E.; STAHL, D.
Quantification of methanogenic groups in anaerobic biological reactors by oligonucleotide
probe hybridization. Applied and Environmental Microbiology, v. 60, n. 4, p. 1241-1248,
1994.
79
RASKIN, L.; ZHENG, D.; GRIFFIN, M. E.; STROOT, P. G.; MISTA, P. Characterization of
microbial communities in anaerobic bioreactors using molecular probes. Antonie van
Leuwenhoek, v. 68, p. 297-308, 1995.
RITTMANN, B. E.; McCARTY, P. P. Environmental biotechnology: principles e
applications. Mc Graw-Hill International Editions, 754 p., 2001.
ROEST, K.; HELIG, H. G. H. J.; SMIDT, H.; VOS, W. M.; STAMS, A. J. M.;
AKKERMANS, A. D. L. Community analysis of a full-scale anaerobic bioreactor treating
paper mill wastewater. Systematic and Applied Microbiology, v. 28, p. 175-185, 2005.
SAMBROOK, J. ; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2nd edition, New York, United
States, 1989.
SANZ. J.L.; DIAZ E.; AMILS R. Molecular ecology of anaerobic granular sludge grown at
different conditions. In: SIMPSIO NACIONAL DE BIOPROCESSOS, 2005.
SASAKI, K.; HARUTA, S.; UENO, Y.; ISHII, M.; IGARASHI, Y. Archaeal population on
supporting material in methanogenic packed-bed reactor. Journal of Bioscience and
Bioengineering, v. 102, n. 3, p. 244-246, 2006.
SEKIGUCHI, Y.; KAMAGATA, Y.; SYUTSUBO, K.; OHASHI, A.; HARADA, H.;
NAKAMURA, K. Phylogenetic diversity of mesophilic and thermophilic granular sludges
determined by 16S rRNA gene analysis. Microbiology, v. 144; p. 2655-2665, 1998.
SOUTO, T. F. F. Influncia das condies de incubao no teste de atividade metanognica
especfica (AME) de lodos anaerbios. Dissertao (Mestrado em Saneamento, Meio
Ambiente e Recursos Hdricos, Escola de Engenharia) Universidade Federal de Minas
Gerais, Belo Horizonte, 2007.
SPEECE, R. E. (1996). Anaerobic biotechnology for industrial wastewaters, Academic Press.
TEIXEIRA, A. R. Influncia da alterao da distribuio do tamanho de partculas no
desempenho de reatores UASB tratando esgotos domsticos. Tese (Doutorado em
Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hdricos) Escola de Engenharia, Universidade
Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2007.
TAGAWA, T.; SYUTSUBO, K.; SEKIGUCHI, Y.; OHASHI, A.; HARADA, H.
Quantification of methanogen cell density in anaerobic granular sludge consortia by
fluorescence in situ hybridization. Water Science Technology, v. 42, n. 3-4, p. 77-82, 2000.
VAN HAANDEL, A. C., LETTINGA, G. Anaerobic sewage treatment. A practical guide for
regions with a hot climate, John Willey & Sons, New York, 1994.
VAN LIER, J.B., RINTALA, J., SANZ MARTIN, J.L., LETTINGA, G. Effect of short-term
temperature increase on the performance of a mesophilic UASB reactor. Water Science and
Technolog, v. 22, p. 183190, 1990.
VAZOLLER, R. F.; MANFIO, G. P.; CANHOS, V. P. Domnio Archaea: Reinos
Crenarcheota, Euryarcheota e Korarcheota. In: CANHOS, V. P.; VAZOLLER, R. F. (Ed.)
Srie biodiversidade do estado de So Paulo microrganismos e vrus. So Paulo, v. 1, 1999.
WALKER, M.; RAPLEY, R. (traduo Fernando Salvador Moreneo) Guia de rotas na
tecnologia do gene. Editora: Ateneu, So Paulo, 1999.
WATANABE, T.; ASAKAWA, S.; NAKAMURA, A.; NAGAOKA, K.; KIMURA, M.
DGGE method for analyzing 16S rDNA of methanogenic archaeal community in paddy field
soil. FEMS Microbiology Letters, v. 232, p. 153-163, 2004.
80
WHITMAN,W. B.; BOWEN, T, L.; BOONE, D. R. The methanogenic bacteria. In: The
Prokariotes: a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, identification,
application. H. G. T. A. Balows, M. Dworkin, W. Harder, K. H. Schleifer. NY, SpringerVerlag, p. 719-767, 1992.
WOESE, C. R. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51:221-271, 1987.
WU, X. L.; CHIN, K. J.; STUBNER, S.; CONRAD, R. Functional patterns and temperature
response of cellulose-fermenting microbial cultures containing different methanogenic
communities. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 56; p. 212-219, 2001.
YANG, G., ANDERSON, G.K. Effects of wastewater composition on stability of UASB.
Journal of Environmental Engineering, v. 119, p. 958977, 1993.
YU, Y.; LEE, C.; HWANG, S. Analysis of community structures in anaerobic processes using
a quantitative real-time PCR method. Water Science and Technology, v. 52, n.1-2, p. 85-91,
2005.
ZEHNDER, A. J. B.; INGVORSEN, K.; MARTI, T. Microbiology of methane bacteria. In
SECOND INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON ANAEROBIC DIGESTION (6-11
september 1981, Travemnde, Germany), Edited by Hughes et al. Elsevier Biomedical, Press
B. V., Amsterdam, The Netherlands, 1982.
ZHANG, T.; KE, S. Z.; LIU, Y.; FANG, H. P. Microbial characteristics of a methanogenic
phenol-degrading sludge. Water Science Technology, v. 52, n. 1-2, p. 73-78, 2005a.
ZHANG, Y; AIYUK, S.; XU, H.; CHEN, G. X.; VERSTRAETE, W. Study of microbial
community structures in UASB sludge treating municipal wastewater by denaturing gradient
gel electrophoresis of 16S rDNA. Science in China Series C Life Sciences, v. 48, p. 128135. Suppl.1, 2005b.
81
ANEXOS
ANEXO 1: Solues utilizadas nas anlises de biologia molecular
1.1
Preparao das colunas cromatogrficas utilizadas no procedimento de extrao

de DNA (PURDY et al., 1996)
Inserir cada seringa em tubos de 50 ml (tipo Falcon) com abertura na tampa. Colocar um
microtubo estril de 1,5 mL no fundo do tubo Falcon sempre quando o material a ser eluido
da coluna for de interesse.
1.1.1 Colunas de HTP
Preparo da coluna
Soluo de Hidroxiapatita
Com o auxlio de uma pina de metal
1 parte de HTP (Bio Agency)
estril, colocar l de vidro no fundo de
6 partes de ddH2O
Misturar bem, esperar decantar o p e
descartar
sobrenadante.
Repetir
operao. Acrescentar gua o suficiente

para cobrir o p. Esterilizar em autoclave
por 30 minutos. Armazenar a 4C.
seringas de 1,0 mL. Adicionar, s seringas,

cerca de 1,0 mL da soluo de HTP e
centrifug-las a 700 rpm por 2 a 4 minutos.
Repetir
operao
at
conseguir,
aproximadamente, 700 L de coluna

empacotada.
1.1.2 Colunas de Sephadex G-75
Preparo da coluna
Soluo de Sephadex G-75
Com o auxlio de uma pina de metal
8 g de Sephadex G-75 (Sigma)
estril, colocar l de vidro no fundo de
250 mL de ddH2O
seringas de 2,0 mL. Adicionar s seringas
Misturar bem e esperar decantar o gel.
soluo de Sephadex G-75 at que o gel
Retirar o excesso de gua e deixar apenas
ocupe toda a coluna e centrifug-las a 700
uma pequena camada acima do gel.
rpm por 2 a 4 minutos. Repetir a operao

at conseguir, aproximadamente, 2,0 mL
de coluna empacotada. Pr-condicionar as
colunas com 400 L de ddH2O estril e
centrifug-las a 2.700 rpm por 8 minutos.
Realizar esta operao trs vezes.
82
2.1
Solues utilizadas no protocolo de extrao de DNA (SAMBROOK et al., 1989;

PURDY et al., 1996)
2.1.1 Soluo-estoque
de
fosfato
de
sdio dibsico 0,4 M, pH 8,0
2.1.4 Soluo de acetato de sdio 3M

4,92 g de C2H3O2Na (Sigma)
28,39 g de Na2HPO4 (Sigma)
20 mL de ddH2O
500 mL de ddH2O
Misturar,
Misturar e esterilizar a soluo em
autoclave por 30 minutos e armazenar
temperatura ambiente.
esterilizar
soluo
em
2.1.5 Soluo
2.1.2 Soluo
de
fosfato
de
sdio
dibsico 120 mM, pH 8,0
de
fosfato
de
sdio

60 mL de soluo de Na2HPO4 0,4 M
200 mL de ddH2O q.s.p.
Ajustar o pH com soluo de HCl 0,1N.
Misturar,
esterilizar
soluo
em
Misturar,
esterilizar
soluo
em
2.1.3 Soluo
de
fosfato
de
sdio
dibsico 120 mM, pH 8,0 com 1%
em

potssio dibsico 1M, pH 7,2
Misturar,
soluo
de
Ajustar o pH com soluo de HCl 0,1N.
1 g de PVPP (Sigma) lavado em cido

a
fosfato
200 mL de ddH2O
esterilizar
de
45,65 g de K2HPO4 triidratado (Sigma)
de PVPP (PURDY et al., 1996)
Misturar,
2.1.6 Soluo-estoque
esterilizar
soluo
em

2.1.7 Soluo de fosfato de potssio
15 mL de soluo de K2HPO4 1 M
Misturar,
esterilizar
soluo
em

83
2.1.8 Soluo de SDS 20%, pH 7,2
2.1.10 Tampo Tris HCl 1 M, pH 8,0
2g de dodecil sulfato de sdio (BioAgency)
12,11 g Tris (C4H11NO3) (Bio Agency)
10 mL de ddH2O estril
100 mL ddH2O estril q.s.p.
Misturar e aquecer a 68C, se necessrio,
Misturar e ajustar o pH com cerca de
para dissolver o SDS. Ajustar o pH com
42mL de HCl concentrado.
gotas de HCl concentrado. Armazenar em

2.1.11
2.1.9 Tampo TE (Tris 10mM e de
18,6 g de EDTA (Na2EDTA)(Bio Agency)
EDTA 1 mM), pH 8,0
[CH2N(CH2.COOH)CH2.COONa]2.2H2O)
100 mL de ddH2O
1 mL da soluo de Tris 1M
Ajustar o pH com vrias prolas de NaOH
0,2 mL da soluo de EDTA 0,5 M
e,
100 mL de ddH2O estril q.s.p.

Misturar,
esterilizar
Soluo de EDTA 0,5 M, pH 8,0
soluo
em
autoclave por 30 minutos e armazenar em
depois,
com
HCl
concentrado.
Esterilizar em autoclave por 30 minutos e

armazenar em temperatura ambiente.
2.2
Solues para eletroforese e preparo de gis de agarose e de DGGE (SAMBROOK

et al., 1989; MUYZER et al., 1996)
2.2.1 Soluo de agarose 1,0%
2.2.2 Soluo de brometo de etdio
2,0 g de agarose (Bioline)
1 gota de brometo de etdio (Bio Agency)
200 mL de ddH2O
Aquecer e misturar at o lquido ficar
Misturar e utilizar a soluo para colorao
totalmente transparente. Armazenar em
de gis de agarose e de poliacrilamida.
temperatura ambiente. Obs.: Para se fazer
Pode ser reutilizada algumas vezes. O
as solues de agarose 0,8 e 2%, seguem-
brometo de etdio altamente txico,
se os mesmos procedimentos, variando-se
devendo-se ter o cuidado de se descartar
apenas a quantidade de agarose.
luvas e resduos de gis corados em lixo

separado.
84
2.2.3 Tampo-estoque TAE (Tris, cido
2.2.7 Soluo de persulfato de amnio
actico glacial,EDTA) 50X, pH 7,5
10%
121 g de Tris
0,1 g de persulfato de amnio (Bio Agency)
28.55 mL de cido actico glacial (F.
Pesar o persulfato de amnio em um
Maia)
microtubo. Dissolver em 1 mL de ddH2O
50 mL de EDTA 0,5M
estril e manter a -20C por at 30 dias.
Completar o volume para 300 mL com

ddH2O. Ajustar pH com aproximadamente
2.2.8 Soluo com desnaturante (100%)
100 mL de HCl concentrado e completar o

volume
da
soluo
para
500
mL.
Esterilizar em autoclave por 30 minutos e

armazenar temperatura ambiente.
acrilamida 6%
20 mL de soluo de acrilamida 30%
42 g de uria (CH4N2O) (Vetec)
40 mL de formamida deionizada (Sigma)
Dissolver a uria na acrilamida em placa
2.2.4 Tampo TAE 1X
aquecedora (aproximadamente 40C) sob
20 mL de tampo TAE 50X
agitao constante. Aps a dissoluo da
uria, adicionar a formamida. Armazenar a
Misturar e armazenar a soluo em
4C protegido da luz. Esta soluo
necessita ser ressolubilizada antes do uso,

tendo-se o cuidado de no aquec-la muito.
2.2.5 Tampo TAE 0,5X

2.2.9
70 mL de tampo TAE 50X
Soluo com desnaturante (100%)

acrilamida 8%
6930 mL de ddH2O
27 mL soluo de acrilamida 30%
42 g de uria
40 mL de formamida deionizada
Seguir as mesmas instrues de preparo e
2.2.6 Soluo de bis-acrilamida 30%
armazenamento da soluo anterior.
29,22 g de acrilamida ultratransparente

(CH2CHCONH2) (Bio Agency)
2.2.10
0,78 g de bis (Bio Agency)

Dissolver em 100 mL de dd H2O estril.
Filtrar
em
membrana
Armazenar a 4C.
de
0,45
m.
Soluo sem desnaturante (0%)

acrilamida 6%

85
Misturar e armazenar a soluo a 4C

protegida da luz.
2.2.12
Soluo stacking gel
3,0 mL de soluo sem desnaturante (0%)

30 L de tampo TAE 50X
2.2.11
Soluo sem desnaturante (0%)

acrilamida 8%
30 L de soluo de persulfato de amnio

10%
3,0 L de TEMED
Misturar os reagentes e, com a ajuda de
Misturar e armazenar a soluo a 4C
uma seringa com agulha, cobrir lentamente
protegida da luz.
superfcie
do
gel
de
DGGE
polimerizado.
2.2.13
Montagem de gis de agarose (cuba de eletroforese horizontal Bio Rad)
1- Lacrar bem as laterais do suporte de acrlico para o gel com fita crepe.
2- Aps fundir a soluo de agarose, verter de 25 a 30 mL em um tubo Falcon (no caso de
gis para purificao de DNA, aps a extrao, utilizar 50 mL de soluo de agarose). Esperar
esfriar at a uma temperatura de cerca de 45C e verter no suporte de acrlico lacrado.
2- Imeditamente, colocar o pente para a formao das canaletas.
3- Esperar esfriar para a solidificao do gel.
2.2.14
Montagem de gis de DGGE (aparato DCodeTM System Bio Rad)
1- Limpar os vidros, removendo-se as manchas com um leno de papel; se estiverem muito

sujos ou engordurados, lav-los com soluo dillida de detergente Extran e enxagu-los
abundantemente com gua destilada. Ateno: no usar lcool para limpar.
2- Montar os sanduches apropriadamente, colocando-se os espaadores entre as duas
placas de vidro, travando-as com as presilhas (a placa menor sobre a placa maior, e as setas
apontadas para os vidros). Os espaadores devem ser colocados de maneira que a abertura dos
sulcos fique face aos grampos do sanduche, prximos poro superior das placas.
3- Posicionar as placas na canaleta de alinhamento do suporte (um sanduche por vez);
alinhar as placas com o carto de alinhamento; retirar as placas e verificar se os espaadores
esto alinhados tambm na parte de baixo.
4- Posicionar os sanduches no suporte sob a base de espuma, travando-os com a presilha
externa.
5- Preparar as seringas e o sistema de distribuio das solues low e high na bancada. Deixar
86
um bquer com gua destilada para lavagem das seringas. Verificar se o volume de ajuste do
sistema est corretamente selecionado.
6- Colocar aproximadamente 6,5 litros de TAE 0,5X no tanque de eletroforese e ligar o
sistema para iniciar o aquecimento (60C).
7- Preparar as solues low e high nas seringas especficas sob banho de gelo (consultar a
Tabela 1.1 deste Anexo). Adicionar tampo TAE 50X e posteriormente as solues 0% e
100% de desnaturante, seguidas das solues de persulfato de amnio 10% e de TEMED.
Ateno, todas as solues, exceto o tampo TAE, devem ser manipuladas na capela. As
solues low e high devem ser preparadas dentro de 10 a 15 minutos antes de serem
distribudas em suas respectivas seringas.
8- Misturar delicadamente e transferir as solues para as seringas especficas, uma de cada
vez; removendo as bolhas de ar.
9- Verificar se o sistema de distribuio est totalmente para trs. Posicionar as seringas em
seus respectivos lugares (sistema top filling soluo low na frente e high atrs) e a poro
terminal da mangueira entre as placas de vidro (utilizar uma ponteira para ajudar na
distribuio e uma fita adesiva para prend-la ao vidro).
10- Iniciar o processo de distribuio, girando o sistema de forma lenta e constante,
utilizando-se as duas mos para que o gradiente seja corretamente formado.
11- Ao final da distribuio, retirar as seringas e lav-las imediatamente com gua destilada
para que a soluo no se polimerize dentro das mangueiras.
12- Repita os passos 7-11 para a produo do segundo gel (se for o caso).
13- Aguardar a polimerizao da acrilamida por aproximadamente 1 hora.
14- Aps a solidificao, preparar o stacking gel e, com a ajuda de uma seringa com agulha,
cobrir lentamente a
superfcie do gel polimerizado com a soluo. Ao final, encaixar o pente de forma inclinada
para evitar bolhas, e
centraliz-lo no gel. Aguardar a polimerizao (aproximadamente 30 minutos).
15- Remover os pentes lentamente e posicionar os dois sanduches no suporte interno (core)
cuidadosamente, com a placa de vidro menor voltada para o core. Adicionar um pouco de
tampo TAE 0,5X na cuba superior e verificar se h vazamentos; em caso positivo, remover e
colocar novamente os sanduches no suporte interno..
16- Mergulhar o suporte interno no tanque com tampo TAE 0,5X e lavar as canaletas para
remover vestgios de poliacrilamida. Adicionar tampo at atingir o nvel mximo, fechar o
sistema e esperar at que a temperatura de 60C seja atingida.
87
17- Desligar o sistema e adicionar as amostras de forma rpida e precisa, para que no haja
um esfriamento excessivo do tampo e no caia amostra em canaletas vizinhas.
18- Ligar o sistema e aguardar a temperatura atingir 60C. Conectar a fonte eltrica (80 V) e
deixar a eletroforese correr por aproximadamente 15 horas.
19- Desmontar o sistema e retirar o gel cuidadosamente, procedendo-se em seguida tcnica
de colorao.
20- Mergulhar as placas e presilhas em soluo diluda de Extran, esfregando-se
cuidadosamente. Enxaguar bem em gua destilada, deixando-se deixe secar livremente sem
contato com pano ou papel.
2.2.14
Tabela de gradiente para o preparo das solues low e high (DGGE)
Volume final da soluo: 14 mL (espaadores 0,75mm)

Volume de ajuste da seringa: 12,3 mL
Gradiente
desnaturante (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Soluo 0%
(mL)
14,0
13,2
12,6
11,8
11,2
10,4
9,8
9,0
8,4
7,6
7,0
6,2
5,6
4,8
4,2
3,4
2,8
2,0
1,4
0,6
0
Soluo 100%
(mL)
0
0,8
1,4
2,2
2,8
3,6
4,2
5,0
5,6
6,4
7,0
7,8
8,4
9,2
9,8
10,6
11,2
12,0
12,6
13,4
14,0
88
2.3
Solues para anlises de FISH (AMANN et al., 1990)
2.3.1 Soluo-estoque de NaCl 5M
2.3.5 Tampo de fixao (4% de
73,05 g de NaCl
paraformaldedo)
250 mL de ddH2O
2 g de paraformaldedo (Vetec)
Dissolver o sal na gua (processo lento).
150 L de soluo de NaOH 1N
Esterilizar em autoclave por 30 minutos.
5 mL de PBS 10X
2.3.2 Soluo de NaOH 1N
Aquecer 40 mL de ddH2O at 55 65.
2 g de NaOH
Adicionar a soluo de NaOH 1N e o
50 mL de ddH2O
paraformaldedo. Misturar e adicionar o
PBS 10X. Ajustar o pH para 7,2 7,4 com
1 gota de HCl concentrado. Ajustar o

volume final da soluo para 50 mL.
Estocar a 4C e utilizar em at 4 dias.
2.3.3 Soluo salina tamponada com

fosfato (PBS) 10X (NaCl 1,3 M,
2.3.6 Tampo-estoque de hibridizao
Na2HPO4 70 mM, NaH2PO4 30
(NaCl 0,9M, Na2EDTA 5 mM,
mM, pH 7,2)
TrisHCl 20mM, pH 7,2)
1,66 g de NaH2PO4 (Cintica)

3,97 g de Na2HPO4 (Sigma)
90 mL de soluo de NaCl 5M
104 mL de soluo de NaCl 5M
5 mL de soluo de Na2EDTA 0,5 M
10 mL de soluo de Tris HCl 1M
temperatura
ambiente.
Esterilizar
em
autoclave por 30 minutos.
2.3.4 Soluo PBS 1X
2.3.7 Tampo-estoque de lavagem
100 mL de PBS 10X

(Na2EDTA 5 mM, Tris HCl

20mM, pH7,2)
5 mL de Na2EDTA 0,5 M
10 mL de soluo de Tris HCl 1M
89
2.3.8 Tampo de hibridizao com 20%

de formamida e 0,1% de SDS
(sonda ARC 915)
10 mL de formamida
250 L de soluo de SDS 20%
40 mL de tampo-estoque de hibridizao
q.s.p.
2.3.9 Tampo de lavagem com 225 mM
de NaCl e 0,1% de SDS
(sonda ARC 915)
2150 L de soluo de NaCl 5M
250 L de soluo de SDS 20%
50mL de tampo-estoque de lavagem q.s.p.
90
ANEXO 2: Imagens em preto e branco dos gis de DGGE

3-
1-
-2
5-
(A) Fase 1
(B) Fase 2
H1 H2 H4
H1 H2 H4
(C) Fase 3
(D) Fase 4
-4
Figura 2.1 DGGE com as amostras das fases 1 a 4 (gradiente de 45 a 65%)

F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4
reator R1
reator R2
(H1)
(H4)
Figura 2.2 Comparao de perfil de

bandas de DGGE entre os reatores
(pontos H1 e H4) ao longo das fases
ARC ARC ARC ARC ARC

1
2
3
4
5
Figura 2.3 DGGE das bandas ARC 1 a 5
91
ANEXO 3: Eficincias de remoo de DQO dos reatores R1 e R2

(DE PAULA, 2007; TEIXEIRA, 2007)
Tabela 3.1 Eficincias de remoo de DQO dos reatores R1 e R2

Fase
Perodo
1
2
3
4
5
12-10-04 a 21-12-04
14-01-05 a 18-03-05
12-04-05 a 31-05-05
01-07-05 a 15-09-05
07-10-05 a 05-01-06
Eficincias de remoo de DQO

Total
Filtrada
R1
60
67
31
53
59
R2
61
63
36
51
58
R1
73
81
72
79
74
R2
77
82
71
79
77
Volume acumulado de metano (mL)
ANEXO 4: Testes de AME com diferentes substratos (Souto, 2007)
140
120
100
80
60
40
20
0
0
2
Glicose
Dias (d)
Acetato
5
Formiato
9
Branco
Figura 4.1 Produo acumulada de metano na etapa

que avaliou a influncia do tipo de substrato
92
100
90
160
80
Ef=70%
Ef=70%
140
70
120
100
60
50
80
40
60
30
Ef=19%
40
20
20
10
Eficincia de produo de
metano (%)
Volume acumulado de metano

(mL)
200
180
Glicose
Acetato
CH4-Produzido
Formiato
CH4-Terico
Branco
Eficincia
Figura 4.2 Eficincia na produo de metano na etapa

que avaliou a influncia do tipo de substrato
8.06
7.12
pH (UpH)
7.10
7.41
7.14
7.13
6.78
5.13
Glicose
Acetato
Inicial
Final
Formiato
pH=6,5*
Branco
pH=8,2*
Figura 4.3 Monitoramento do pH na etapa que avaliou a

influncia do tipo de substrato* Speece, 1996
93

Dissertação - Estudo Da Diversidade Microbiana Metanogênica em Reatores Uasb

Enviado por

Dados do documento

Título original

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Dissertação - Estudo Da Diversidade Microbiana Metanogênica em Reatores Uasb

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM SANEAMENTO,

ESTUDO DA DIVERSIDADE MICROBIANA

rika Ferreira de Abreu

ESTUDO DA DIVERSIDADE MICROBIANA

rika Ferreira de Abreu

rika Ferreira de Abreu

ESTUDO DA DIVERSIDADE MICROBIANA

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-graduao

Abreu, rika Ferreira de

OBJETIVO GERAL .................................................................................................................................. 3

REVISO DA LITERATURA ................................................................................................................... 4

RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................................................... 49

DETERMINAO DA DIVERSIDADE MICROBIANA METANOGNICA EM REATORES UASB POR MEIO DA

Amostras de lodo de testes de AME............................................................................................... 68

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS

compreenso de processos metablicos envolvidos na degradao da matria orgnica, os

Caracterizar a comunidade de arquias metanognicas presentes em lodos de reatores UASB

Determinar e comparar a diversidade de arquias metanognicas, ao longo do perfil

Determinar e comparar a diversidade de arquias metanognicas nos reatores UASB

Determinar a abundncia relativa de arquias metanognicas em amostras de lodo dos

3.2 Bioqumica da digesto anaerbia

cidos graxos de cadeia

Bactrias acetognicas produtoras de hidrognio

Bactrias acetognicas consumidoras de hidrognio

Figura 3.1 Etapas metablicas e microrganismos envolvidos na digesto anaerbia

Dentre os gneros de bactrias hidrolticas que se destacam no processo anaerbio esto:

O segundo grupo de bactrias acetognicas so as homoacetognicas, que so estritamente

Acetogenium, Butribacterium, Clostridium e Pelobacter. A atividade metablica destas

3.2.2 Aspectos termodinmicos e fisiolgicos de arquias e bactrias

Tabela 3.1 Comparao energtica de algumas reaes comuns na digesto anaerbia

C6H12O6 + 2H2O 2CH3COO- + 2CO2 + 2H+ + 4H2

3.3 Caractersticas gerais do domnio Archaea

Methanomicrobia com suas respectivas ordens: Methanobacteriales, Methanococcales,

Methanopyrales, Methanomicrobiales e Methanosarcinales, sendo as duas ltimas

Fonte: (*) Whitman et al. (1992); Madigan et al. (2003)

De acordo com o tipo de substrato para o crescimento e formao de metano, as arquias

Tabela 3.3 Vias metablicas da metanognese e arquias associadas

4H2 + CO2 CH4 + 2H2O

4CH3OH 3CH4 + CO2 + 2H2O

Fonte: Carpentier et al. (2006)

Dentre as cinco ordens, somente a Methanosarcinales inclui os nicos dois gneros

3.4 Distribuio das arquias

3.4.1 Distribuio espacial em grnulos anaerbios

compactos e porosos e os cinzas, compostos por vrias camadas definidas e concntricas de

3.4.2 Variaes populacionais e estabilidade funcional da comunidade metanognica

a mesma eficincia de remoo, indicando que a estabilidade funcional pode no depender de

Methanosarcina, foram predominantes (mais de 61% do RNAr total de arquias), seguidos de

respectivamente, enquanto que o gnero Methanosaeta predominou na presena de substratos

diversidade microbiana, somente leves flutuaes populacionais. Por meio de clonagem e

microrganismos metanognicos, tais como o baixo crescimento inerente e a alta

microbiana do grnulo, de uma biomassa predominantemente metanognica para uma

que geralmente so os microrganismos mais sensveis ao aumento da temperatura, assim uma

por meio de PCR-RT-SSCP, mostraram a predominncia de arquias hidrogenotrficas mais

crescimento de Methanoculleus spp. conhecido ser prefervel a Methanothermobacter spp.

Em contrapartida, em alguns sistemas de tratamento anaerbio em escala plena (Tabela 3.5),

Methanosarcina barkeri, Methanosarcina frisus e

Ordem Methanosarcinales, principalmente

Gnero Methanosarcina e ordem

UASB, filtro anaerbio

Methanosaeta (51,5%); Methanobacteriales

Ordem Methanobacteriales e gnero

Methanosaeta (56,7% dos clones de arquias),