RAFAEL SILVEIRA PORTO

CONYZA CANADENSIS: DETERMINAO DE COMPOSTOS BIOATIVOS E

AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIFNGICA

CAMPINAS
2015
i

ii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUMICA

RAFAEL SILVEIRA PORTO

CONYZA CANADENSIS: DETERMINAO DE COMPOSTOS BIOATIVOS E

AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIFNGICA

ORIENTADORA: PROFA. DRA. SUSANNE RATH

COORIENTADORA: DRA. SONIA CLAUDIA DO NASCIMENTO
DE QUEIROZ

DISSERTAO DE MESTRADO APRESENTADA

AO INSTITUTO DE QUMICA DA UNICAMP PARA
OBTENO DO TTULO DE MESTRE EM QUMICA NA
REA DE QUMICA ANALTICA.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE VERSO FINAL DA DISSERTAO DEFENDIDA

POR RAFAEL SILVEIRA PORTO, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. SUSANNE RATH.

_______________________
Assinatura da Orientadora

CAMPINAS
2015
iii

iv

vi

(...)Two roads diverged in a wood, and I

I took the one less traveled by,
And that has made all the difference.
The Road Not Taken Robert Frost (1916)

vii

viii

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, ao meu pai, Eduardo, e minha me, Ana Lucia, pelo apoio
incondicional e pelo incomensurvel esforo em criar as melhores condies
possveis para que eu pudesse chegar onde cheguei. A eles, devo tudo.
professora Dr. Susanne Rath pela brilhante orientao, pela incansvel
pacincia e pela confiana em mim depositada. No fosse seu imprescindvel
auxlio, meu mestrado no teria nem sequer comeado.
Dr. Sonia Queiroz, coorientadora deste projeto, pela sua inabalvel
empolgao com nossa pesquisa, combustvel essencial para o sucesso dessa
empreitada.
Aos meus amigos Eduardo, Sabrina e Amilcar, que to de perto
acompanharam minhas angstias e meus sucessos, sempre dispostos a ajudar no
que fosse preciso.
Aos meus amigos do laboratrio, Fabrcio e Andreza, que no pouparam
esforos para me auxiliar no projeto, oferecendo no s apoio tcnico, mas tambm
muitas risadas.
toda equipe do Laboratrio de Bioanaltica Paracelsus, tanto do primeiro
quanto do segundo lote, pelo companheirismo e pelas boas horas que passamos
juntos.
equipe da Embrapa Meio Ambiente, em especial Dr Suikinai Nobre, ao
Dr. Daniel Terao e ao meu amigo Rodrigo Castanha, idealizadores dos ensaios
microbiolgicos e apoio constante nessa rea outrora desconhecida por mim.
equipe do Laboratrio de Sntese de Produtos Naturais e Frmacos,
especialmente ao prof. Dr. Fernando Coelho e ao Bruno. equipe do Laboratrio
de Cromatografia Gasosa, especialmente ao prof. Dr. Fbio Augusto e Gaby.
professora Dr. Regina Buffon e ao Renan. Agradeo pelo uso dos equipamentos
de seu laboratrio e pela enorme prestatividade com que me auxiliaram nas
atividades.
Ao CNPq e FAPESP pelo apoio financeiro.

ix

CURRICULUM VITAE
Currculo Lattes: http://lattes.cnpq.br/1886425603184398

DADOS PESSOAIS
Nome: Rafael Silveira Porto
Data de Nascimento: 06/01/1989
Estado Civil: solteiro
E-mail: rafaelsporto@gmail.com

Telefone: (19) 9-8197-5230

FORMAO ACADMICA
2013 2015

Mestrado em Qumica Analtica. IQ/UNICAMP, Campinas/SP,

Brasil
Ttulo: Conyza canadensis: determinao de compostos,
bioativos e avaliao da atividade antifngica.
Orientadora: Profa. Dra. Susanne Rath

2007 2012

Bacharelado em Qumica (com atribuies tecnolgicas).

IQ/UNICAMP, Campinas/SP, Brasil.

ATUAO PROFISSIONAL
2011 2012

DuPont do Brasil S/A. Paulnia/SP, Brasil.

Cargo: Estagirio (analista de laboratrio)

2010

Iniciao Cientfica em Qumica Analtica. IQ/UNICAMP,

Campinas/SP, Brasil
Cargo:
Projeto:

Bolsista SAE/UNICAMP
Controle de qualidade de medicamentos de uso
veterinrio base de penicilinas associadas a
anestsicos e antimicrobianos

Orientadora: Profa. Dra. Susanne Rath

xi

2009-2010

Iniciao Cientfica em Qumica Analtica. IQ/UNICAMP,

Campinas/SP, Brasil
Cargo:
Projeto:

Bolsista CNPq
Controle de qualidade de medicamentos de uso
veterinrio: penicilina G e penicilina G procana

Orientadora: Profa. Dra. Susanne Rath

2008-2009

Iniciao Cientfica
Campinas/SP, Brasil
Cargo:
Projeto:

em

Fsico-Qumica.

IQ/UNICAMP,

Bolsista CNPq
Ataque cido a argamassas de cimento com agente
impermeabilizante PVAOH + silicato de sdio.

Orientadora: Profa. Dra. Ines Joekes (in memoriam)

MONITORIAS
2 sem/2014

Programa de Estgio Docente (PED C). IQ/UNICAMP,

Campinas/SP, Brasil
Disciplina: QA582 Qumica Analtica Instrumental I

1 sem/2014

Programa de Estgio Docente (PED C). IQ/UNICAMP,

Campinas/SP, Brasil
Disciplina: QA316 Qumica Analtica III

APRESENTAO DE TRABALHO EM EVENTOS CIENTFICOS

05/2014

PORTO, R. S.; RATH, S.; QUEIROZ, S. C. N. Isolamento e

caracterizao de substncias fungicidas da planta Conyza
canandensis. In: 37 Reunio Anual da Sociedade Brasileira
de Qumica (RASBQ). Natal/RN, Brasil

xii

RESUMO
CONYZA CANADENSIS: DETERMINAO DE COMPOSTOS
BIOATIVOS E AVALIO DA ATIVIDADE ANTIFNGICA
O Brasil um dos maiores produtores de frutas do mundo, no entanto, estima-se
que doenas ps-colheita possam gerar perdas de at 50% em sua produo. A
forma mais comum de tratamento para essas doenas envolve a aplicao de
fungicidas sintticos. Contudo, nos ltimos anos, a demanda por tratamentos
alternativos tem crescido, com destaque para o uso de biopesticidas, produtos
desenvolvidos a partir de plantas, microrganismos e insetos. Este trabalho teve
como objetivo investigar a presena dos compostos bioativos (4Z)-lachnophyllum
lactona, (4Z,8Z)-matricaria lactona e (2Z,8Z)-matricaria ester nos espcimes
brasileiros da planta Conyza canadensis, bem como avaliar a atividade antifngica
dessas substncias isoladas contra diversos fungos associados a doenas pscolheita de frutas. Por cromatografia flash preparativa foi possvel isolar a
(4Z)-lachnophyllum lactona e a (4Z,8Z)-matricaria lactona a partir de extratos da
planta obtidos com diclorometano. Os compostos foram caracterizados por
GC-MS/MS, NMR 1H e 13C, 1H-1H COSY e 1H-13C HSQC. Foram realizados ensaios
de difuso em disco com 10 fungos filamentosos causadores de doenas pscolheita em frutas. Os fungos Aspergillus niger, Cladosporium spp. e Penicillium
digitatum se mostraram susceptveis ao tratamento e, para eles, a concentrao
mnima inibitria dos compostos variou de 32 a 64 g mL -1. Tambm foi
desenvolvido um mtodo de extrao empregando gua quente pressurizada, no
qual foram otimizados os parmetros de temperatura (100 C), tempo de ciclo
(1 min) e nmero de ciclos (quatro). Com essa tcnica foi possvel obter um
rendimento de 1,46 mg g-1 e 0,24 mg g-1 para a (4Z)-lachnophyllum lactona e a
(4Z,8Z)-matricaria lactona, respectivamente. O extrato aquoso da Conyza
canadensis pode ser aplicado diretamente nos frutos com a vantagem de no conter
resduos de solventes orgnicos txicos.

xiii

xiv

ABSTRACT
CONYZA CANADENSIS: DETERMINATION OF BIOACTIVE
COMPOUNDS AND EVALUATION OF ANTIFUNGAL ACTIVITY
Brazil is one of the largest fruit producers in the world. Nevertheless, it is estimated
that postharvest diseases can lead to losses of up to 50% in its production. The most
common treatment for these diseases involves the application of synthetic
fungicides. Nonetheless, in recent years, the demand for alternative treatments has
increased, especially for the use of biopesticides, products developed from plants,
microorganisms and insects. This study aimed to investigate the presence of the
bioactive compounds (4Z)-lachnophyllum lactone, (4Z,8Z)-matricaria lactone and
(2Z,8Z)-matricaria ester in Brazilian specimens of the weed Conyza canadensis, as
well as to evaluate the antifungal activity of these isolated substances against
several fungi associated with postharvest diseases of fruits. With the use of
preparative flash chromatography it was possible to isolate (4Z)-lachnophyllum
lactone and (4Z,8Z)-matricaria lactone from plant extracts obtained with
dichloromethane. The compounds were characterized by GC-MS/MS, NMR 1H e
13

C, 1H-1H COSY and 1H-13C HSQC. Disk diffusion assays were performed in order

to investigate the activity of the isolated compounds against 10 filamentous fungi

regarded as common postharvest pathogens of fruits. Aspergillus niger,
Cladosporium spp. and Penicillium digitatum proved susceptible to the treatment
and, for them, the minimum inhibitory concentration of the compounds varied from
32 to 64 g mL-1. An extraction method using pressurized hot water was also
developed, in which the parameters of temperature (100 C), cycle time (1 min) and
number of cycles (four) were optimized. By using this technique, it was possible to
obtain a yield of 1.46 mg g-1 and 0.24 mg g-1 for the (4Z)-lachnophyllum lactone and
(4Z,8Z)-matricaria lactone, respectively. The aqueous extract of Conyza canadensis
can be applied directly on fruits with the advantage of not containing residues of toxic
organic solvents.

xv

xvi

Sumrio
LISTA DE TABELAS ................................................................................................................. xix
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. xxi
INTRODUO ..................................................................................................................... 1

I.

I.1.

DOENAS PS-COLHEITA ...................................................................................... 3

I.2.

TRATAMENTOS ALTERNATIVOS ............................................................................ 6

I.2.1.

Controle Biolgico ................................................................................................ 7

I.2.2.

Indutores de resistncia....................................................................................... 8

I.2.3.

Pesticidas Bioqumicos ........................................................................................ 8

I.2.4.

Biopesticidas e o Mercado .................................................................................. 9

A PLANTA Conyza canadensis ................................................................................ 10

I.3.

I.3.1.

Descrio ............................................................................................................ 10

I.3.2.

Efeitos alelopticos ............................................................................................ 11

I.3.3.

Ao antifngica ................................................................................................. 13

I.3.4.

Bioativos de interesse do trabalho .................................................................... 14

TCNICAS DE EXTRAO ..................................................................................... 16

I.4.

I.4.1.

Tcnicas convencionais..................................................................................... 17

i.

Macerao .............................................................................................................. 17

ii.

Extrao em aparelho de Soxhlet ........................................................................ 18

iii.

Hidrodestilao....................................................................................................... 19

I.4.2.

Tcnicas no-convencionais ............................................................................. 20

i.

Extrao com fluido supercrtico (SFE)................................................................ 20

ii.

Extrao assistida por ultrassom (UAE) .............................................................. 21

iii.

Extrao assistida por micro-ondas (MAE) ......................................................... 22

iv.
Extrao com lquido pressurizado (PLE) e extrao com gua quente
pressurizada (PHWE).................................................................................................... 23
I.5.

IMPORTNCIA DO PRESENTE TRABALHO ........................................................ 26

II.

OBJETIVOS ....................................................................................................................... 29

III.

PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................................. 33

III.1.

EQUIPAMENTOS ...................................................................................................... 35

III.2.

REAGENTES E SOLVENTES.................................................................................. 35

III.3.

PADRES ANALTICOS E COMPOSTOS ISOLADOS ........................................ 36

III.4.

PROCEDIMENTOS ................................................................................................... 36
xvii

III.4.1.

Coleta de plantas. .............................................................................................. 36

III.4.2.

Extrao e isolamento das substncias puras a partir dos extratos. ............ 36

III.4.3.

Caracterizao das substncias puras isoladas. ............................................ 38

III.4.4.

Teste preliminar: extrao dos analitos de interesse da planta por PHWE. . 39

III.4.5.

Otimizao da extrao via PHWE................................................................... 39

III.4.5.1.

Temperatura................................................................................................ 40

III.4.5.2.

Tempo de ciclo............................................................................................ 40

III.4.5.3.

Nmero de ciclos ........................................................................................ 40

III.4.5.4.

Repetitividade do procedimento de extrao ........................................... 41

III.4.6.

Determinao dos analitos de interesse nos extratos purificados ................. 41

III.4.7.

Bioensaios .......................................................................................................... 43

III.4.7.1.

Ensaios de difuso em disco ..................................................................... 44

III.4.7.2.

Concentrao Mnima Inibitria ................................................................. 45

RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................... 47

IV.

IV.1.

Coleta das plantas ................................................................................................. 49

IV.2.

Extrao e isolamento das substncias puras a partir dos extratos ................. 50

IV.3.

Caracterizao das Substncias Puras Isoladas ................................................ 51

IV.3.1.

Anlises por GC-MS e GC-MS/MS................................................................... 51

IV.3.2.

Anlises por NMR de 1H e 13C .......................................................................... 55

IV.3.3.

Anlises por NMR 1H-13C HSQC e 1H-1H COSY ............................................. 59

IV.4.

Teste preliminar para a extrao dos bioativos da planta por PHWE ............... 64

IV.5.

Curvas analticas .................................................................................................... 65

IV.6.

Otimizao da extrao via PHWE ...................................................................... 67

IV.6.1.

Temperatura ....................................................................................................... 67

IV.6.2.

Tempo de ciclo ................................................................................................... 69

IV.6.3.

Nmero de ciclos................................................................................................ 71
Bioensaios .............................................................................................................. 74

IV.7.
IV.7.1.

Ensaio de difuso em disco .............................................................................. 74

IV.7.2.

Concentrao Mnima Inibitria ........................................................................ 75

CONCLUSES E PERSPECTIVAS FUTURAS............................................................. 79

V.

V.1.

Concluses ................................................................................................................. 81

V.2.

Perspectivas Futuras ................................................................................................. 82

VI.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................ 85

xviii

LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Concentraes em que cada extrato obtido foi analisado por GC-FID.43
Tabela 2 - Fungos utilizados nos bioensaios para avaliao da atividade antifngica
dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML. ....................................................................... 44
Tabela 3 - Deslocamentos qumicos dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML nos ensaios
de NMR de 1H e 13C. ............................................................................................ 55
Tabela 4 - Parmetros da regresso linear referente s curvas analticas obtidas e
seus respectivos desvios....................................................................................... 66
Tabela 5 - Massas dos extratos secos obtidos em diferentes temperaturas e
rendimento global da extrao comparado massa inicial de planta (5,0 g). ....... 68
Tabela 6 - Massas dos extratos secos obtidos em diferentes tempos de ciclo e
rendimento global da extrao comparado massa inicial de planta (5,0 g). ....... 70
Tabela 7 - Valores de CV intra e inter-ensaio para 4Z-LL e 4Z,8Z-ML ................. 74
Tabela 8 - Resumo das atividades dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML contra
diferentes fungos associados a doenas ps colheita em frutas. .......................... 75
Tabela 9 - Atividade antifngica (MIC) dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML obtida pelo
mtodo de microdiluio em caldo. ....................................................................... 76

xix

xx

LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Exemplos de doenas ps-colheita quiescentes. Podrido cinzenta
(Botrytis cinerea) em morangos (esq.) (adaptado de REIS; COSTA, 2011) e
antracnose (Colletotrichum spp.) em manga (dir.) (adaptado BATISTA, 2010). ..... 5
Figura 2 - Exemplos de doenas ps-colheita. Podrido mole (Rhizopus stolonifer)
em pssegos (esq.) (adaptado de BAGGIO, 2012) e podrido azul e verde
(Penicillium spp.), respectivamente, em limes (dir.) (adaptado de HOLMES,
2009). ...................................................................................................................... 5
Figura 3 - Espcime de Conyza canadensis ........................................................ 11
Figura 4 Compostos obtidos a partir dos extratos da Conyza canadensis ........ 15
Figura 5 - Esquema de equipamento para PHWE no modo dinmico (adaptado de
TEO et al., 2010). .................................................................................................. 24
Figura 6 - Variao da constante dieltrica da gua com a temperatura em
diferentes presses: 33 bar; 129 bar; 322 bar (adaptado de SMITH, 2002) 25
Figura 7 - Disposio do inculo e dos discos de celulose na placa de Petri para o
ensaio de difuso em disco. .................................................................................. 45
Figura 8 - Teste de microdiluio em caldo para a determinao de MIC. ........... 46
Figura 9 - Cromatograma (TIC) obtido para o composto 4Z-LL (acima) e seu
respectivo espectro de massas (abaixo). Coluna HP-5 (30 m x 250 m x 0,25 m).
Programa de temperatura de 120-240 C (8 C min-1). Temperatura do injetor 240
C, temperatura da transferline 200 C, temperatura da fonte 230 C e temperatura
do quadrupolo 150 C. Volume de injeo 1 L, split 1:100, vazo do gs de
arraste 1 mL min-1 e concentrao da amostra 200 g mL-1. ................................ 52
Figura 10 - Cromatograma (TIC) obtido para o composto 4Z,8Z-ML (acima) e seu
respectivo espectro de massas (abaixo). Coluna HP-5 (30 m x 250 m x 0,25 m).
Programa de temperatura de 120-240 C (8 C min-1). Temperatura do injetor 240
C, temperatura da transferline 200 C, temperatura da fonte 230 C e temperatura
do quadrupolo 150 C. Volume de injeo 1 L, split 1:100, vazo do gs de
arraste 1 mL min-1 e concentrao da amostra 200 g mL-1. ................................ 53
Figura 11 - Espectro MS2 do on [M+] em m/z 162 (composto 4Z-LL). ................. 54
xxi

Figura 12 - Espectro MS2 do on [M+] em m/z 160 (composto 4Z,8Z-ML). .......... 55

Figura 13 - Espectro de NMR 1H a 400 MHz em CDCl3 para o composto 4Z-LL. 56
Figura 14 - Espectro de NMR 13C a 100 MHz em CDCl3 para o composto 4Z-LL.56
Figura 15 Espectro de NMR 1H a 500 MHz em CDCl3 para o composto 4Z,8ZML. ........................................................................................................................ 57
Figura 16 Espectro de NMR 13C 125 MHz em CDCl3 para o composto 4Z,8Z-ML.
.............................................................................................................................. 58
Figura 17 - Espectro de NMR 1H-13C HSQC para o composto 4Z-LL. ................. 60
Figura 18 - Espectro de NMR 1H-13C HSQC para o composto 4Z,8Z-ML. ........... 61
Figura 19 - Espectro de NMR 1H-1H COSY para o composto 4Z-LL. ................... 63
Figura 20 -Espectro de NMR 1H-1H COSY para o composto 4Z,8Z-ML. .............. 64
Figura 21 Cromatograma (TIC) obtido em anlise de GC-MS de um extrato feito
via PHWE. Coluna HP-5 (30 m x 250 m x 0,25 m). Programa de temperatura de
90-150 C (3 C min-1), 150-280 C (20 C min-1) e 280 C por 5 minutos.
Temperatura do injetor 240 C, temperatura da transferline 200 C e temperatura
do quadrupolo 150 C. Volume de injeo 1 L, split 1:100, vazo do gs de
arraste 1 ml min-1 e concentrao da amostra 1,0 mg mL-1. ................................. 65
Figura 22 - Cromatograma obtido em anlise de GC-FID de um extrato feito via
PHWE (100 C, 3 ciclos de 20 minutos). Coluna HP-5 (30 m x 320 m x 0,25 m).
Programa de temperatura de 115 C (19 minutos), 115-200 C (20 C min-1.
Temperatura do injetor 200 C e temperatura do detector 300 C. Volume de
injeo 1 L, split 1:50, vazo do gs de arraste 2 mL min -1. Concentrao da
amostra 1,0 mg mL-1, concentrao do padro interno (cumarina) 15 g mL -1 ..... 67
Figura 23 Mdia (n=2) e desvio mdio do teor dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML
nos extratos purificados em cada uma das temperaturas avaliadas (70, 90, 100,
110 e 130 C). Teor dado em miligramas de composto por grama de planta. ...... 69
Figura 24 Mdia (n=2) e desvio mdio do teor dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML
nos extratos purificados em cada um dos tempos de ciclo avaliados (1, 5, 10, 20 e
30 min). Teor dado em miligramas de composto por grama de planta. ................ 71
Figura 25 Proporo, em porcentagem, do composto 4Z-LL em cada ciclo
avaliado. ................................................................................................................ 72
xxii

Figura 26 - Proporo, em porcentagem, do composto 4Z,8Z-ML em cada ciclo

avaliado. ................................................................................................................ 73
Figura 27 Ensaios de difuso em disco mostrando um exemplo no qual o
composto no apresentou atividade antifngica (fig. 27A) e um exemplo no qual o
composto apresentou atividade antifngica (fig. 27B). .......................................... 75

xxiii

xxiv

I. INTRODUO

I.1. DOENAS PS-COLHEITA

O Brasil o terceiro maior produtor de frutas do mundo, com uma produo que,
em 2010, foi estimada em quase 39 milhes de toneladas, ficando atrs apenas da
China e da ndia (FAO, 2013). Dessa produo, cerca de 760 mil toneladas foram
exportadas no mesmo ano (IBRAF, 2011). No entanto, parte desta produo
ameaada pelas doenas ps-colheita, que ocasionam perdas quantitativas e
qualitativas (TERAO et al., 2008) em diversas etapas do processamento das frutas,
tais como: colheita, transporte, armazenagem e venda (COATES; JOHNSON, 1997;
PRUSKY, 2011). A porcentagem de perdas devido a doenas ps-colheita em frutas
difcil de ser estimada, devido escassez de dados, tanto para o Brasil quanto
para o mundo. Os poucos dados que existem fazem referncia s perdas totais,
incluindo os descartes promovidos por consumidores e fornecedores e no
discriminam as perdas provocadas apenas por doenas ps-colheita. Estima-se
que, em pases em desenvolvimento, essas perdas atinjam 50% da produo. J
em pases desenvolvidos, essa estimativa no ultrapassa os 23% (KADER, 2005;
PRUSKY, 2011), valor ainda alto, considerando-se que a produo de frutas
medida em milhes de toneladas nos pases com maior produo (FAO, 2013).
Sabe-se, no entanto, que as doenas ps-colheita so uma das principais
responsveis pela perda de frutas ao longo da cadeia produtiva (PRUSKY, 2011;
SIVAKUMAR; BAUTISTA-BAOS, 2014).
Uma diferena relevante entre pases desenvolvidos e em desenvolvimento
que, nos primeiros, as perdas ocorrem mais significativamente junto aos
revendedores e consumidores, principalmente devido exigncia dos compradores
por frutas esteticamente perfeitas. J nos ltimos, as perdas ocorrem nas fases de
colheita, ps-colheita e processamento, principalmente devido falta de estrutura,
tecnologia e investimentos adequados (PRUSKY, 2011). As condies inadequadas
de armazenagem e de transporte podem ocasionar leses nas frutas e permitir a
entrada de elementos patognicos. Na maior parte dos casos, as perdas advm de
doenas provocadas por fungos que se manifestam em condies propcias: baixo
pH, grande quantidade de gua e nutrientes e debilidade do mecanismo de defesa
da fruta colhida (NUNES, 2012).
3

O impacto das doenas ps-colheita vai alm da reduo nos lucros das vendas
internas e das exportaes. Com o crescimento populacional e o consequente
aumento da demanda global por alimentos, uma reduo nas perdas provocadas
por essas doenas poderia diminuir a necessidade de se intensificar a produo de
frutas no futuro. Alm disso, as perdas na ps-colheita representam no s um
desperdcio das frutas em si, mas tambm do solo utilizado no cultivo, da gua
utilizada na irrigao, da mo-de-obra no campo e de insumos agrcolas como
fertilizantes, defensivos e maquinrio. Sendo assim, a reduo das perdas na fase
de ps-colheita garante no s o lucro dos produtores e a maior disponibilidade de
alimentos, mas tambm o uso mais sustentvel e eficiente dos recursos naturais
(PRUSKY, 2011). Alm dos fatores econmicos e ambientais, as doenas pscolheita podem se mostrar um grande problema para a sade humana, pois
determinados fungos, como aqueles dos gneros Fusarium, Alternaria e Penicillium,
podem secretar micotoxinas, que so nocivas ao ser humano e podem apresentar
propriedades carcinognicas (COATES; JOHNSON, 1997; LIU et al., 2013).
Doenas ps-colheita em frutas so causadas, geralmente, por fungos e
bactrias. Entretanto, o baixo pH da maioria das frutas inibe grande parte das
espcies de bactrias causadoras de podrides, tornando as doenas bacterianas
menos relevantes nesse campo. As doenas ps-colheita podem ser classificadas
de acordo com a forma com que se desenvolvem na fruta. Existem as doenas
quiescentes, nas quais o patgeno se instala na fruta antes da colheita, mas
permanece num estado de dormncia at que os tecidos do hospedeiro passem por
uma mudana fisiolgica que propicie a reativao da infeco. Essa mudana pode
ser provocada, por exemplo, pelo processo de amadurecimento do fruto aps a
colheita. Exemplos desse tipo de doena so a podrido cinzenta, causada pelo
fungo Botrytis cinerea e a antracnose, causada por fungos do gnero Colletotrichum
em frutas tropicais (Figura 1) (COATES; JOHNSON, 1997; SIVAKUMAR;
BAUTISTA-BAOS, 2014).

Figura 1 - Exemplos de doenas ps-colheita quiescentes. Podrido cinzenta (Botrytis cinerea) em

morangos (esq.) (adaptado de REIS; COSTA, 2011) e antracnose (Colletotrichum spp.) em manga
(dir.) (adaptado de BATISTA, 2010).

Por outro lado, existem aquelas doenas que se instalam durante e aps a
colheita, infectando o fruto a partir de leses provocadas por choques mecnicos
ou por insetos. Os choques mecnicos ocorrem comumente na fase de colheita e
se apresentam na forma de cortes, abrases e danos por presso ou impacto. Como
exemplos desse tipo de doena, podemos citar a podrido (transit rot) causada pelo
fungo Rhizopus stolonifer e a podrido azul e verde provocada por fungos do gnero
Penicillium (Figura 2) (COATES; JOHNSON, 1997).

Figura 2 - Exemplos de doenas ps-colheita. Podrido mole (Rhizopus stolonifer) em pssegos

(esq.) (adaptado de BAGGIO, 2012) e podrido azul e verde (Penicillium spp.), respectivamente,
em limes (dir.) (adaptado de HOLMES, 2009).

Uma das formas mais comuns de controle das doenas ps-colheita a

aplicao de fungicidas sintticos. Essa aplicao pode ocorrer tanto na fase de
pr-colheita quanto na fase de ps-colheita e o que determina o intervalo e o tempo
5

das aplicaes o tipo de infeco que se deseja combater. Normalmente, para as

infeces que se estabelecem nas frutas antes de elas serem colhidas, so
necessrias aplicaes de sprays fungicidas j na fase de crescimento, aliadas a
aplicaes regulares ao longo do desenvolvimento da fruta. Contra aquelas
infeces que se manifestam na fase de ps-colheita ou para os patgenos
quiescentes, a aplicao se d, em geral, por imerso ou asperso de solues
fungicidas sobre a fruta j colhida (COATES; JOHNSON, 1997; SIVAKUMAR;
BAUTISTA-BAOS, 2014).
Durante os ltimos 25 anos, esforos vm sendo realizados no sentido de
reduzir o uso de fungicidas sintticos, tanto para atender crescente demanda do
mercado consumidor por produtos verdes, quanto para cumprir com as normas
cada vez mais rigorosas dos pases importadores. Desde 1987, a ONU vem
demonstrando preocupaes com relao ao uso de produtos qumicos sintticos
em alimentos, devido ao seu impacto negativo na sade humana e no ambiente
(DROBY et al., 2009; LIU et al., 2013). Com o uso contnuo e indiscriminado dos
fungicidas sintticos, o surgimento de cepas de fungos resistentes a esses
tratamentos convencionais so outra fonte de preocupao (NUNES, 2012), bem
como os danos ao ambiente causados pelo descarte das formulaes fungicidas,
que podem atingir o solo e os corpos aquticos (SIVAKUMAR; BAUTISTA-BAOS,
2014). Assim, existe grande necessidade de se substituir os fungicidas sintticos
por mtodos alternativos de controle das doenas ps-colheita.

I.2. TRATAMENTOS ALTERNATIVOS

Existem diversos tratamentos alternativos para as doenas ps-colheita que
podem substituir completa ou parcialmente o uso de fungicidas sintticos ou,
simplesmente, complementar sua ao. O controle do ambiente de armazenagem
(temperatura, umidade e porcentagem de O 2) e as boas prticas de higiene ao longo
de todo o processo so fundamentais para a minimizao das infeces nas frutas.
No entanto, esses tratamentos alternativos atuam somente retardando o
desenvolvimento das infeces, sem, de fato, eliminar os patgenos. J os
6

tratamentos com calor e com radiao ionizante podem, eventualmente, mat-los,

mas, muitas vezes, os nveis de radiao e/ou calor exigidos para tal, so
prejudiciais s frutas, depreciando sua qualidade (COATES; JOHNSON, 1997).
Tratamentos mais sofisticados envolvem o uso de microrganismos antagonistas
(controle biolgico), tcnicas de induo de resistncia e aplicao de pesticidas
bioqumicos (COATES; JOHNSON, 1997; COPPING; MENN, 2000; DUKE et al.,
2002; LIU et al., 2013; NUNES, 2012; SEIBER et al., 2014).

I.2.1. Controle Biolgico

Os microrganismos antagonistas utilizados no chamado controle biolgico de
doenas ps-colheita podem ser bactrias, leveduras ou at mesmo outros fungos
filamentosos, isolados a partir das mais diversas fontes (COATES; JOHNSON,
1997). A grande maioria dos agentes de controle biolgico so, no entanto,
leveduras (DROBY et al., 2009). Elas so isoladas, principalmente, a partir da
superfcie de frutas e vegetais, contudo, tambm podem ser obtidas a partir de
razes, solos e gua do mar (LIU et al., 2013). Seu mecanismo de ao envolve,
normalmente, competio por nutrientes e espao com o fungo causador da doena
ps-colheita, todavia sabido que outros mecanismos podem estar envolvidos,
como por exemplo, secreo de substncias antimicrobianas e de enzimas,
parasitismo direto e induo de resistncia na fruta. Ainda hoje, no entanto, o uso
de microrganismos antagonistas como forma de controle biolgico para as doenas
ps-colheita restrito, devido inconsistncia na eficcia dos produtos em
condies comerciais, dificuldades na produo em escala industrial, problemas no
registro junto s agncias reguladoras e desafios na manuteno da viabilidade
celular (DROBY et al., 2009; LIU et al., 2013; NUNES, 2012; SHARMA; SINGH;
SINGH, 2009).

I.2.2. Indutores de resistncia

Muitas vezes, as prprias plantas tm a capacidade de se defenderem contra
os elementos patognicos, tanto por mecanismos j presentes em seu metabolismo
(resistncia constitutiva), quanto por mecanismos ativados em resposta s
infeces (resistncia induzida). Contudo, conforme o fruto amadurece, em geral, a
concentrao dos compostos com ao antifngica produzidos pelo metabolismo
da planta tende a decair, passando a nveis abaixo da concentrao letal. As
tcnicas de induo de resistncia operam no sentido de estimular a produo
dessas substncias antifngicas atravs do emprego de indutores qumicos
(quitosana, cido saliclico), biolgicos (antagonistas microbianos) e fsicos (calor,
radiao UV). Essas tcnicas, entretanto, podem produzir frutas menos palatveis
e saudveis, imprprias para o consumo devido s elevadas concentraes de
compostos antifngicos. A induo tambm est associada a riscos ecolgicos,
podendo afetar insetos polinizadores e micrbios benficos presentes nas plantas,
alm de reduzir a capacidade das plantas de competir por recursos ou responder a
ataques de herbvoros (CIPOLLINI; HEIL, 2010; COATES; JOHNSON, 1997;
TERRY; JOYCE, 2004).

I.2.3. Pesticidas Bioqumicos

Os pesticidas bioqumicos se destacam como uma das mais importantes e
promissoras alternativas para o tratamento de doenas ps-colheita. Eles so
substncias de ocorrncia natural, desenvolvidos a partir de compostos bioativos
obtidos em plantas, microrganismos e insetos, podendo ser utilizados para o
controle de pragas de diversas naturezas, atuando como fungicidas, algicidas,
herbicidas, entre outros (COPPING; MENN, 2000). Os compostos bioativos
presentes em plantas so, normalmente, metablitos secundrios, ou seja,
substncias que no possuem funo reconhecida na manuteno dos processos
vitais da planta (crescimento, reproduo, etc.), mas so utilizados por ela como
estratgia de defesa natural contra diversas pragas (AZMIR et al., 2013;
MIRESMAILLI; ISMAN, 2014; ZHONG, 2011).
8

Muitas vezes, os pesticidas bioqumicos apresentam mecanismos de ao

diferentes dos pesticidas convencionais. A elucidao desses mecanismos torna
possvel o surgimento de novos tratamentos fitossanitrios, uma vez que comum
que a estrutura molecular de um produto natural sirva de base para o
desenvolvimento de novas molculas com ao pesticida. O uso de produtos
naturais contribui, ainda, para minimizar o desenvolvimento de pragas resistentes
aos tratamentos convencionais, sendo possvel sua aplicao em regimes de
tratamento alternados com os pesticidas sintticos. Como outras vantagens, os
pesticidas bioqumicos apresentam uma alta especificidade contra os organismos
alvo e um perodo de carncia mais curto do que os agrotxicos convencionais, o
que torna sua aplicao mais sustentvel e amigvel ao ambiente e menos
agressiva aos organismos no alvo (COPPING; MENN, 2000; DUKE et al., 2002;
SEIBER et al., 2014).

I.2.4. Biopesticidas e o Mercado

A Agncia de Proteo Ambiental dos EUA (US EPA) divide o termo
biopesticida em trs principais categorias: i) pesticidas bioqumicos, ii) pesticidas
microbianos (controle biolgico) e iii) protetores incorporados planta (PIP). As
duas primeiras categorias foram abordadas acima e, quando o termo biopesticida
for empregado neste trabalho, sero a elas e, principalmente aos pesticidas
bioqumicos, que estaremos nos referindo. J os PIP, que so substncias
pesticidas que uma planta passa a produzir a partir de material gentico incorporado
a ela, no so considerados biopesticidas pela maioria das outras agncias
regulatrias do mundo e, por isso, foram excludos dessa discusso (SEIBER et al.,
2014). No Brasil, no foi encontrada definio oficial para o termo biopesticida no
site das principais agncias regulatrias MAPA, ANVISA e IBAMA.
Economicamente, os biopesticidas acompanham a tendncia cada vez maior de
se produzir alimentos orgnicos, cujas vendas vm crescendo mundialmente,
principalmente em pases mais desenvolvidos. Alm disso, esses compostos
oferecem aos pases emergentes uma oportunidade para que eles desenvolvam
9

seus prprios pesticidas, com a vantagem de que, normalmente, produtos naturais

no possuem normas to rigorosas quanto os compostos sintticos para seu uso e
registro (COPPING; MENN, 2000; DUKE et al., 2002; SEIBER et al., 2014).
Atualmente, o mercado de biopesticidas no Brasil est se expandindo. O pas
o maior consumidor de agrotxicos do mundo, mas o interesse dos produtores e
consumidores em tecnologias mais amigveis ao meio ambiente vem crescendo.
Em 2012, os biopesticidas foram responsveis por 1% do faturamento no setor de
defensivos agrcolas, o que corresponde a um valor de 97 milhes de reais. No
entanto, a estimativa da Associao Brasileira das Empresas de Controle Biolgico
(ABCBio) de que essa fatia chegue a 15% nos prximos 15 anos, principalmente
agora que grandes empresas, como a Monsanto, Bayer CropScience, Syngenta e
BASF esto apostando em investimentos no setor (RAMOS, 2013). Atualmente, no
pas, segundo dados do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
(MAPA), esto registrados somente 22 produtos fitossanitrios com uso aprovado
para agricultura orgnica (MAPA, 2014). Todos eles so constitudos por
microrganismos antagonistas, nenhum com ao fungicida, demonstrando que os
biopesticidas para esse fim so um nicho ainda inexplorado no mercado de
tratamentos alternativos para doenas ps-colheita, com muitas oportunidades de
crescimento.

I.3. A PLANTA Conyza canadensis

I.3.1. Descrio
Tendo em vista a importncia do desenvolvimento de novos biopesticidas,
bem como a investigao do seu espectro de ao, uma pesquisa recente realizada
pela Embrapa Meio Ambiente e o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos
(USDA) apontou resultados promissores com a planta aleloptica Conyza
canadensis (L.) Cronquist (QUEIROZ et al., 2012). Esta planta (Figura 3),
pertencente famlia Asteraceae (ou Compositae), originria da Amrica do Norte,
mas

amplamente

distribuda

pelo

mundo,

sendo

encontrada

no

Brasil

principalmente nas regies Sul, Sudeste e Centro-Oeste. Ela foi descrita pela
10

primeira vez por C. Linnaeus em 1753, na sua obra Species Plantarum, ento com
o nome de Erigeron canadense. Conhecida popularmente como buva, infestante
caracterstica da entressafra, com seu desenvolvimento ocorrendo em reas de
pouca cobertura vegetal ou pouca palhada. Dissemina-se por intermdio de
sementes de tamanho muito pequeno que so produzidas em grandes quantidades
e carregadas com facilidade pelo vento. Estima-se que uma nica planta possa
produzir entre 100 mil a 200 mil sementes. C. canadensis infesta pomares, vinhas,
culturas de campo, tais como soja, milho e algodo, principalmente em culturas
resistentes a herbicidas, onde sistemas de plantio direto so empregados
(LAZAROTO; FLECK; VIDAL, 2008).

Figura 3 - Espcime de Conyza canadensis

I.3.2. Efeitos alelopticos

Por ser uma planta aleloptica, ou seja, por liberar substncias conhecidas
como aleloqumicos que podem inibir o crescimento de plantas vizinhas (DEL
FABBRO; PRATI, 2015), a Conyza canandensis uma fonte potencial de
compostos bioativos (DUKE et al., 2002). Suas propriedades alelopticas tm sido
reportadas por estudos que, em geral, testam seus extratos aquosos (obtidos a frio)
contra outras plantas, verificando se ocorrem inibies na germinao da semente
e/ou no crescimento da plntula (broto).

11

Kobayashi et al. (1980), at onde sabemos, foram os primeiros a estudar o

potencial aleloptico da C. canadensis. Estes pesquisadores estudaram os efeitos
inibitrios da frao hexnica oriunda da partio de extratos da planta obtidos com
metanol e verificaram que compostos acetilnicos, um dos quais presentes neste
trabalho, inibiram o crescimento de plntulas de arroz.
Shaukat, Munir e Siddiqui (2003) reportaram atividades inibitrias
provocadas pelo extrato aquoso da planta na germinao e no crescimento de
plntulas de tomate, rabanete, trigo, milho, milheto e feijo-da-china.
Gao et al. (2009) verificaram que os extratos aquosos provocaram os
mesmos efeitos em ensaios com pepino (Cucumis sativus), nabo (Brassica
campestres), capim-colcho (Digitaria sanguinalis), capim-arroz (Echinochloa
crusgalli) e bredo (Amaranthus retroflexus).
Marinov-Serafimov (2010) tambm reportou que esse mesmo tipo de extrato
apresentou efeitos inibitrios na germinao e no crescimento da plntula nas
espcies Glycine max (soja), Pisum sativum (ervilha) e Vicia sativa.
Hu e Zhang (2013), tambm realizando ensaios com os extratos aquosos da
planta, dessa vez obtidos tanto da parte area quanto da raiz, reportaram que houve
atividade inibitria na germinao, bem como reduo no tamanho do broto, nas
seguintes espcies de ervas daninhas nativas: Plantago asiatica, Digitaria
sanguinalis e Youngia japnica. Houve inibio em todas as concentraes de
extrato testadas, no entanto no foram observados efeitos inibitrios significativos
na germinao ou no tamanho do broto quando os extratos foram testados contra a
prpria C. canadensis, demonstrando que a planta no possui efeito autotxico.
Uma tendncia geral nestes trabalhos a ausncia de interesse em isolar e
identificar os compostos fitotxicos. Apenas Kobayashi et al. (1980) identificaram
alguns compostos acetilnicos que apresentaram efeitos inibitrios. Mais
simplificadamente, Shaukat, Munir e Siddiqui (2003) consideraram que os efeitos
alelopticos da C. canandensis estariam sendo causados, provavelmente, por
compostos fenlicos presentes no extrato aquoso (cido vanlico, cido glico, cido
sirngico e catecol). Eles no descartaram, contudo, a possibilidade de que outros

12

compostos no-fenlicos estariam contribuindo para os efeitos inibitrios

observados.

I.3.3. Ao antifngica
Compostos bioativos tambm podem apresentar, alm de efeitos fitotxicos,
efeitos fungitxicos (DUKE et al., 2002). Assim, tambm existem estudos que
aplicam os extratos de C. canandensis em ensaios contra diversos tipos de fungos.
Curini et al. (2003) reportaram que o leo essencial da planta C. canadensis
inibiu o crescimento dos fungos fitopatognicos Rhizoctonia solani, Fusarium solani
e Colletotrichum lindemuthianum em concentraes que variavam de 400 a 1600
mg/kg. Os ensaios antifngicos foram realizados mediante incorporao do leo
essencial em meio de cultura semifundente e comparao do dimetro das culturas
neste meio e no meio de controle aps determinados dias de incubao. Neste
trabalho, a composio do leo essencial tambm foi determinada, evidenciandose o limoneno como composto majoritrio, contudo, a atividade antifngica no foi
atribuda a nenhum composto em especfico.
Franzener et al. (2007) avaliaram a atividade antifngica do hidrolato (fase
aquosa obtida na hidrodestilao da planta) contra o fungo Alternaria brassicae, que
causa doenas em plantas do gnero Brassica (couve, nabo, etc.). Para os ensaios,
o hidrolato foi incorporado em meio de cultura semifundente e foi avaliada a sua
capacidade de inibir a germinao de esporos do fungo. Neste teste, o hidrolato
demonstrou uma capacidade significativa na reduo do tamanho dos tubos
germinativos, evidenciando a presena de compostos antifngicos em sua
composio.
Mais recentemente, Veres et al. (2012) reportaram que leos essenciais,
tanto da parte area quanto da raiz, da planta C. canadensis, obtidos por
hidrodestilao, apresentaram atividade contra diversos fungos patognicos, entre
esses, Candida albicans, Candida glabrata, Candida kefyr, Candida parapsilosis,
Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans, Rhodotorula glutinis e Trichophyton
interdigitalis. Neste trabalho, o mtodo de difuso em disco foi empregado para a
obteno de dados semi-quantitativos (halo de inibio) acerca dos efeitos
13

antifngicos dos leos essenciais. J para a quantificao desse efeito, a

concentrao mnima inibitria (MIC) dos leos foi determinada pelo mtodo de
microdiluio em caldo, utilizando placa de Elisa. Os valores de MIC variaram de
1,25 a 20,00 g mL-1.
Novamente, nos trabalhos abordados nesta reviso, no houve interesse em
investigar quais seriam os compostos com ao antifngica presentes nos diversos
extratos avaliados. nesse contexto que o trabalho de Queiroz et al. (2012) se
insere. Estes pesquisadores se ocuparam no s da investigao da ao
antifngica de extratos da planta C. canadensis, como tambm da determinao de
quais substncias estariam causando esse efeito. Os compostos identificados
constituem os bioativos de interesse do presente trabalho.

I.3.4. Bioativos de interesse do trabalho

No trabalho de Queiroz et al. (2012), foi realizado um fracionamento
sistemtico guiado por bioensaio nos extratos da planta C. canadensis para
identificar os compostos fitotxicos e fungitxicos da sua parte area. Trs
substncias fungitxicas, cujas estruturas esto mostradas na Figura 4, foram
identificadas: (4Z)-lachnophyllum lactona (4Z-LL), (4Z,8Z)-matricaria lactona
(4Z,8Z-ML) e (2Z,8Z)-matricaria ster (2Z,8Z-ME). Aps terem sido isolados,
4Z-LL e 4Z,8Z-ML foram submetidos a ensaios contra os seguintes fungos
fitopatognicos: Colletotrichum acutatum, Colletotrichum fragariae e Colletotrichum
gloeosporioides. Os resultados obtidos foram positivos.

No estudo de dose-

resposta contra seis fungos fitopatognicos, 4Z-LL foi mais ativo do que o fungicida
comercial contendo azoxistrobina contra os fungos Col. acutatum, Col. fragariae e
Col. gloeosporioides e com atividade prxima do fungicida comercial Captan contra
Col. gloeosporioides, enquanto que 4Z,8Z-ML foi menos ativo nessas situaes
(QUEIROZ et al., 2012). O composto 2Z,8Z-ME j possua atividade fungicida
reportada na literatura contra os fungos citados (MEEPAGALA et al., 2002).
Interessante ressaltar que as substncias 4Z-LL, 4Z,8Z-ML e 2Z,8Z-ME j
foram reportadas nos leos essenciais, tanto das razes quanto da parte area da
C. canadensis e tambm nos extratos obtidos a partir de solventes orgnicos
14

(HRUTFIORD; HATHEWAY; SMITH, 1988; LIS; GRA, 2000; LIS; PIGGOTT;

GRA, 2003; TZAKOU et al., 2005; VERES et al., 2012; XIE; GAO; JIA, 2007), o
que demonstra a possibilidade de que esses compostos possam ser um dos
responsveis pelas atividades antifngicas observadas no leo essencial e no
hidrolato obtidos a partir da planta (CURINI et al., 2003; FRANZENER et al., 2007;
VERES et al., 2012).
4Z-LL

4Z,8Z-ML

2Z,8Z-ME

Figura 4 Compostos obtidos a partir dos extratos da Conyza canadensis.

O composto 2Z,8Z-ME foi reportado pela primeira vez na planta C.

canadensis nos trabalhos de Srensen e Stavholt (1950). Nessa mesma dcada,
ele foi encontrado em 29 espcies do gnero Erigeron (classificao a qual
pertencia a C. canadensis anteriormente) (HOLME; SRENSEN, 1954).
Entretanto, sua estrutura era conhecida desde 1941, quando foi isolado pela
primeira vez a partir da planta Matricaria indora L. (SRENSEN; STENE, 1941).
O composto 4Z,8Z-ML foi encontrado pela primeira vez nas partes areas da
planta Matricaria caucasica em 1967 (BOHLMANN; MNCH; BLASZKIEWICZ,
1967). Sua estrutura foi desvendada a partir da estrutura de seu ismero (4E-8Z),
descoberto em 1957 (BOHLMANN; BURKHARDT; ZDERO, 1973). At onde
sabemos, esse composto foi encontrado em extratos de C. canadensis pela primeira
vez em 1988, reportado nos trabalhos de Hrutfiord, Hatheway e Smith (1988).
O composto 4Z-LL foi reportado e isolado pela primeira vez em 1970, a partir
de extratos da parte area da prpria planta C. canadensis (BOHLMANN;
BURKHARDT; ZDERO, 1973; BOHLMANN; ZDERO, 1970).
Mais recentemente, alguns dos compostos foram descritos em trabalhos
como o de Veres et al. (2012), em que os leos essenciais da parte area e da raiz
da planta C. canadensis foram separados em coluna DB-5ms (30 m x 0,25 mm x
15

0,25 m) e analisados por cromatografia a gs associada espectrometria de

massas (GC-MS). No leo obtido das partes areas da planta foram identificados
34 compostos, sendo o limoneno de teor majoritrio (79,2%). Foi identificada a
presena do composto 2Z,8Z-ME (2,1%) e traos de 4Z,8Z-ML. J o leo obtido da
raiz apresentou, como componente majoritrio, o composto 2Z,8Z-ME, com um teor
mdio de 91,1%. Nesse leo, a 4Z,8Z-ML estava presente com um teor mdio de
2,4%.

I.4. TCNICAS DE EXTRAO

A eficincia na obteno de molculas bioativas a partir de plantas est
intimamente relacionada com a etapa de extrao (AZMIR et al., 2013).
Considerada uma parte crucial da etapa de preparo de amostra, a extrao pode
ser vista como a etapa inicial do processo de separao, possuindo baixa
seletividade, porm alta capacidade. A escolha da tcnica de extrao mais
apropriada tem grande influncia na qualidade da anlise e pode ser um fator
determinante na identificao e quantificao cromatogrfica (SMITH, 2003). Desse
modo, pode-se dizer que a correta separao e caracterizao de um composto
bioativo s podem ser atingidas mediante o emprego de um mtodo de extrao
adequado (AZMIR et al., 2013).
O objetivo das tcnicas de extrao, de uma maneira geral, separar o
analito de interesse da sua matriz, utilizando, para tanto, um solvente que
proporcione o maior rendimento e seletividade possveis. necessrio empregar
um mtodo que minimize a presena de interferentes, independa de variaes na
matriz, sendo robusto e reprodutvel e concentre os analitos de interesse,
aumentando a sensibilidade do ensaio. A extrao de produtos naturais pode ser
obtida por diversas tcnicas, algumas delas convencionais, empregadas h mais de
100 anos, outras mais contemporneas (AZMIR et al., 2013; SMITH, 2003).

16

I.4.1. Tcnicas convencionais

As tcnicas convencionais de extrao normalmente envolvem o emprego de
calor e/ou agitao aliadas ao poder extrator de um determinado solvente. As
tcnicas mais comuns so: macerao, extrao em aparelho de Soxhlet e
hidrodestilao (AZMIR et al., 2013).

i.

Macerao
A macerao envolve, primeiramente, a moagem da matria-prima vegetal,

com o intuito de aumentar a superfcie de contato entre a matriz e o solvente. O

material modo , ento, posto em contato com o solvente extrator, podendo haver
ou no o emprego de agitao (macerao dinmica), aquecimento (digesto) e
renovao do solvente (remacerao) (AZMIR et al., 2013; SONAGLIO et al., 1999).
Conforme citado anteriormente, essa tcnica foi empregada por diversos
trabalhos recentes com o intuito de investigar a presena de compostos alelopticos
em extratos aquosos da planta C. canadensis (GAO et al., 2009; HU; ZHANG, 2013;
MARINOV-SERAFIMOV, 2010; SHAUKAT; MUNIR; SIDDIQUI, 2003). Alm da
gua, solventes orgnicos tambm so empregados na macerao. Por exemplo,
nos estudos pioneiros acerca da alelopatia da planta C. canadensis realizados por
Kobayashi et al. (1980), a extrao da planta macerada foi realizada com metanol
e, mais recentemente, Queiroz et al. (2012) obteve compostos bioativos dessa
mesma planta a partir de extraes realizadas com diclorometano.
A macerao uma tcnica de extrao de baixo custo (AZMIR et al., 2013),
no entanto, diversos trabalhos buscam substitu-la devido ao seu elevado tempo de
extrao (CHAN et al., 2011). Por exemplo, no trabalho de Jacques et al. (2007), a
extrao de compostos da planta Ilex paraguarienses por macerao foi comparada
com a tcnica de extrao assistida por ultrassom (UAE). O trabalho mostrou que a
tcnica de macerao obteve rendimento semelhante UAE quando metanol foi
empregado (14,4 e 12,6% (m/m), respectivamente). Contudo, enquanto a extrao
por UAE foi realizada em apenas 180 min, a macerao requereu 10 dias para obter

17

os mesmos resultados, o que demonstra sua desvantagem com relao ao tempo

de extrao.

ii.

Extrao em aparelho de Soxhlet

A extrao em aparelho de Soxhlet foi proposta pelo qumico alemo Franz

Ritter von Soxhlet em 1879, primariamente com o intuito de extrair lipdeos. Hoje em
dia, utilizada para extrair diversos compostos naturais presentes em matrizes
slidas com o emprego de solventes volteis. Nesta tcnica, o solvente extrator
aquecido no frasco de destilao e condensado sobre o cartucho poroso contendo
a matriz slida. Quando o solvente atinge a altura do sifo, ele sifonado de volta
para o frasco de destilao carregando consigo os solutos extrados, e o processo
recomea. Como o solvente reciclado continuamente, a amostra est sempre em
contato com solvente renovado, possibilitando uma extrao altamente eficiente
utilizando-se uma quantidade reduzida de solvente. A extrao via Soxhlet
comumente empregada como modelo de comparao para avaliao da eficincia
de outros mtodos de extrao (AZMIR et al., 2013; FALKENBERG; SANTOS;
SIMES, 1999; SMITH, 2003).
Apesar de no terem sido encontrados exemplos na literatura da aplicao
desta tcnica na obteno de extratos da planta C. canadensis, possvel encontrar
diversos trabalhos comparando o uso do aparelho de Soxhlet a outros mtodos de
extrao na obteno de compostos bioativos a partir de plantas (AZMIR et al.,
2013). Exemplo disso o trabalho de Herzi et al. (2013), que reportou o rendimento,
o tempo de extrao e a composio de extratos das folhas de Tetraclinis articulata
obtidos por extrao via Soxhlet com etanol ou hexano. Estes extratos foram
comparados com aqueles obtidos por hidrodestilao e extrao com fluido
supercrtico (SFE). Foi demonstrado que a extrao por Soxhlet levou aos maiores
rendimentos (21,2 40,4 g kg-1) quando comparada hidrodestilao (0,6 g kg-1) e
SFE (0,6 g kg-1). No entanto, seu tempo de extrao foi o mais longo de todos,
durando 480 minutos contra 180 minutos da hidrodestilao e 30 minutos da SFE.
Foi tambm o processo menos seletivo, extraindo no s componentes volteis,
mas tambm compostos de maior massa molecular, o que explica o seu maior
18

rendimento. Outras desvantagens apontadas foram a presena de solvente residual

nos extratos obtidos por Soxhlet e uma possvel degradao dos compostos de
interesse (antioxidantes) pela temperatura empregada na extrao.

iii.

Hidrodestilao
A hidrodestilao uma tcnica de extrao empregada na obteno do leo

essencial de plantas. Normalmente, esses leos so ricos em compostos bioativos

que apresentam atividade antimicrobiana, aleloptica, antifngica e antioxidante,
atuando como defensivos naturais dos vegetais. Em escala laboratorial, utiliza-se
um aparato denominado Clevenger, no qual partes da planta (folhas e/ou razes),
usualmente frescas, so aquecidas em um frasco de destilao juntamente com
gua at a temperatura de ebulio. Os leos volteis da planta so arrastados pelo
vapor dgua e coletados em um separador, aps sua passagem pelo condensador.
Em contrapartida simplicidade da tcnica, a temperatura elevada pode degradar
determinados compostos termolbeis e ocasionar a perda de substncias mais
volteis (AZMIR et al., 2013; HERZI et al., 2013; MUSTAFA; TURNER, 2011;
SIMES; SPITZER, 1999; SIVAKUMAR; BAUTISTA-BAOS, 2014).
Esta tcnica foi empregada em estudos avaliando a atividade antifngica de
compostos bioativos da planta C. canandensis. Conforme citado anteriormente,
Curini et al. (2003) e Veres et al. (2012) obtiveram o leo essencial da planta,
submetendo-o a bioensaios contra diversos fungos patognicos e fitopatognicos.
J Franzener et al. (2007) empregou o hidrolato, frao rica em compostos
hidroflicos da planta, em ensaios com a mesma finalidade.
Apesar do uso recorrente de leos essenciais da parte area da planta em
bioensaios contra fungos, o baixo rendimento normalmente obtido pela tcnica de
hidrodestilao (COSTA et al., 2012; HERZI et al., 2013; JERKOVIC et al., 2007)
aliado s baixas concentraes encontradas para os compostos de interesse deste
trabalho nos leos essenciais (< 3,0%) (HRUTFIORD; HATHEWAY; SMITH, 1988;
LIS; GRA, 2000; LIS; PIGGOTT; GRA, 2003; VERES et al., 2012) torna a
escolha da tcnica desvantajosa para a aplicao desejada neste trabalho.

19

I.4.2. Tcnicas no-convencionais

As tcnicas convencionais abordadas anteriormente possuem desvantagens
como o uso excessivo de solventes, a baixa seletividade e o tempo de extrao
prolongado. Para superar essas dificuldades, tcnicas mais sofisticadas tm sido
desenvolvidas e aplicadas, destacando-se a extrao por fluido supercrtico (SFE),
a extrao assistida por ultrassom (UAE), a extrao assistida por micro-ondas
(MAE) e a extrao com lquido pressurizado (PLE), da qual deriva a tcnica de
extrao com gua quente pressurizada (PHWE) (AZMIR et al., 2013; HENG et al.,
2013).

i.

Extrao com fluido supercrtico (SFE)

A SFE emprega um fluido supercrtico, usualmente CO2, como solvente

extrator. A viscosidade e tenso superficial baixas e o alto coeficiente de difuso

dos fluidos supercrticos facilitam sua penetrao na matriz, aumentando,
consequentemente, a transferncia de massa e a eficincia da extrao. A
capacidade de extrao do fluido supercrtico pode ser modificada por alteraes
na presso e na temperatura de operao e o sistema pode trabalhar, inclusive, a
temperaturas ambientes, permitindo extrao de compostos termolbeis. Outra
vantagem a facilidade no descarte do CO2, que no gera impactos ao ambiente e
sade humana, podendo ser reciclado no processo. As desvantagens da tcnica
so o alto custo dos equipamentos de alta presso e a baixa eficincia na extrao
de compostos mais polares, mesmo com a adio de modificadores, como o
diclorometano, ao CO2 (AZMIR et al., 2013; HENG et al., 2013).
Costa et al. (2012) investigaram o perfil qumico de extratos das folhas de
Lavandula viridis obtidos por SFE com CO2, comparando-o com o do leo essencial
obtido por hidrodestilao. Ambos os extratos se mostraram ricos em monoterpenos
oxigenados, mas o rendimento global das extraes via SFE foi maior, variando de
3,41 a 9,27% (m/m), enquanto o da hidrodestilao foi de apenas 0,53% (m/m).
Contudo, foi observado que uma variedade maior de compostos estava presente
nos leos essenciais obtidos por hidrodestilao.
20

Conforme citado anteriormente, no trabalho de Herzi et al. (2013), o extrato

das folhas de T. articulata obtido por SFE apresentou um dos menores rendimentos
globais (1,6 g/kg). Contudo, foi o extrato com a maior atividade antioxidante,
indicando alta seletividade para compostos com tal ao. A SFE foi, ainda, o
processo de extrao mais rpido (30 min) em comparao com Soxhlet (480 min)
e hidrodestilao (180 min).
Ambos os trabalhos reforam uma caracterstica marcante da SFE, que a
seletividade, uma vez que o poder de solvatao do fluido supercrtico pode ser
ajustado facilmente por mudanas na temperatura e na presso do processo
(AZMIR et al., 2013).

ii.

Extrao assistida por ultrassom (UAE)

A UAE faz uso do fenmeno de cavitao provocado pelas ondas de

ultrassom para aumentar a eficincia da extrao com solvente. Quando a onda

passa pelo meio lquido, ela cria pontos de expanso e compresso que levam
formao, crescimento e colapso de bolhas. Desse processo, surgem foras de
cisalhamento que, associadas a efeitos mecnicos e trmicos, atuam destruindo
paredes celulares e reduzindo o tamanho das partculas da matriz, aumentando a
transferncia de massa e a eficincia do processo de extrao. As vantagens dessa
tcnica esto relacionadas com a reduo no tempo e na temperatura de extrao
e tambm no uso de solventes. No entanto, a eficincia da tcnica tem se mostrado
varivel, ficando abaixo da dos mtodos convencionais em algumas matrizes. Outro
problema envolvendo a UAE est na formao de radicais livres pelos efeitos da
cavitao, o que pode ocasionar a degradao dos analitos de interesse (AZMIR et
al., 2013; HENG et al., 2013; VILKHU et al., 2008; ZHANG et al., 2015).
No trabalho de Both, Chemat e Strube (2014), o emprego de UAE na extrao
de polifenis a partir de ch preto (Camellia sinensis) aumentou em 15% a
quantidade desses analitos no extrato, quando comparado com a tcnica de
macerao convencional. Tambm foi detectado uma reduo no tamanho das
partculas, o que pode ter favorecido a extrao devido ao aumento da superfcie
21

de contato entre o solvente e a matriz. J no trabalho de Hossain et al. (2012), foi

reportado que, aps otimizao, a UAE aumentou significativamente os
rendimentos de diversos compostos antioxidantes extrados de manjerona
(Origanum majorana) quando comparada macerao tradicional.
No entanto, no trabalho de Yan et al. (2010), a UAE foi menos eficiente na
extrao de compostos bioativos das razes de Astragalus membranaceus que a
extrao da raiz macerada feita sob refluxo com o mesmo solvente etanol:gua
(80:20 v/v).

iii.

Extrao assistida por micro-ondas (MAE)

As micro-ondas geram o calor necessrio para a extrao ao interagirem com

os componentes polares da matriz atravs de mecanismos de conduo inica e

rotao de dipolos. Com a temperatura elevada, os solutos so separados da matriz
e, em seguida, se difundem e so liberados para o solvente. Os principais fatores a
serem controlados para garantir a eficincia da extrao so a temperatura e o tipo
de solvente empregado, no entanto a frequncia e a durao da radiao tambm
devem ser considerados. Na extrao de compostos bioativos, a MAE apresenta
maior rendimento, seletividade e rapidez quando comparada s tcnicas de
extrao convencionais e at mesmo s no-convencionais, podendo ser utilizada
tanto com gua quanto com solventes orgnicos. Seu custo moderado, sendo
consideravelmente mais baixo, por exemplo, que a tcnica de SFE. As
desvantagens da tcnica esto relacionadas com a limitao da polaridade do
solvente a ser empregado, j que solventes muito apolares so menos afetados
pela radiao. Alm disso, a tcnica apresenta baixa seletividade e, por isso, etapas
posteriores, como a extrao lquido-lquido (LLE), podem ser necessrias para a
purificao de seus extratos (AZMIR et al., 2013; CHAN et al., 2011; HENG et al.,
2013).
Martino et al. (2006) reportaram que, na extrao de cumarina e compostos
correlatos das flores de Melilotus officinalis, a MAE apresentou ganhos no s em
tempo, mas tambm em eficincia com relao s extraes realizadas por UAE e
por Soxhlet. Para a cumarina, por exemplo, a MAE levou a um rendimento de
22

3,98 mg g-1 em 10 minutos de extrao, enquanto a UAE levou a 3,57 mg g-1 em

60 minutos e Soxhlet 2,16 mg g-1 em 8 horas.
Dahmoune et al. (2015) realizaram extrao de cido glico e outros
polifenis em folhas de Myrtus communis. A extrao por MAE, empregando uma
mistura de etanol e gua, foi otimizada e comparada com os rendimentos obtidos
em extraes feitas por UAE e por macerao sob aquecimento. A MAE levou aos
maiores rendimentos tanto na extrao de fenis totais, quanto na de taninos
condensados e flavonoides. Tambm houve ganho de tempo, uma vez que a
extrao por MAE foi executa em 1 minuto, comparada com a UAE e a macerao,
que levaram 15 e 120 minutos, respectivamente.

iv.

Extrao com lquido pressurizado (PLE) e extrao com gua quente

pressurizada (PHWE)
A PLE, introduzida pela Dionex Corporation em 1995, uma tcnica que se

utiliza de solventes a altas temperaturas e presses com o intuito de aumentar a

transferncia de massa e a solubilidade dos analitos, obtendo maiores rendimentos
do que as tcnicas de extrao em condies ambientes. No caso da gua ser o
solvente extrator, a tcnica denominada PHWE (do ingls, Pressurized Hot Water
Extraction). A tcnica opera em duas modalidades: dinmica ou esttica. No modo
dinmico, bombas de alta presso promovem a passagem constante do solvente
atravs da cela de extrao aquecida, que contm a amostra. So comumente
empregadas vazes entre 1,0 e 1,5 mL min-1 durante 20-30 minutos, com presses
variando de 10 a 50 bar. No modo esttico, a presso pode ser utilizada numa faixa
maior, de 35 a 200 bar e a extrao feita em ciclos (5-15 minutos), com renovao
do solvente a cada ciclo. Ao final, purga-se a cela com algum gs inerte (e.g. N 2),
para remover o solvente remanescente e evitar perdas. Em geral, nas extraes via
PLE e PHWE, a temperatura varia entre 25 e 200C, mas valores maiores podem
ser empregados (AZMIR et al., 2013; HENG et al., 2013; MUSTAFA; TURNER,
2011; TEO et al., 2010).

23

Existem equipamentos de PLE/PHWE disponveis comercialmente, no

entanto possvel mont-los em laboratrio (TEO et al., 2010). A Figura 5 mostra o
esquema de um equipamento de PHWE para extrao em modo dinmico.

Figura 5 - Esquema de equipamento para PHWE no modo dinmico (adaptado de TEO et al.,
2010).

Em linhas gerais, a eficincia da PHWE est associada ao uso de

temperaturas elevadas na extrao, o que diminui substancialmente a constante
dieltrica () da gua (Figura 6), reduzindo sua polaridade. Isso faz com que a gua
se torne capaz de solubilizar compostos com carter mais apolar. Alm disso, o
aumento na temperatura da gua diminui a sua viscosidade, facilitando a
penetrao do solvente na matriz e melhorando a remoo dos analitos. Ocorre
tambm uma diminuio na tenso superficial da gua, facilitando a formao de
cavidades de solvente dentro da matriz e permitindo que os analitos se solubilizem
mais rapidamente. Outro fator que influencia a eficincia da tcnica, porm em
menor extenso que a temperatura, a aplicao de presses elevadas. A presso
mantem o solvente em seu estado lquido, auxilia na penetrao do solvente no
poro da matriz e reduz a formao de bolhas (MUSTAFA; TURNER, 2011; TEO et
al., 2010).
A PHWE apresenta como vantagem a reduo no uso de solventes
orgnicos, principalmente os clorados, atendendo crescente demanda em busca
de tcnicas mais sustentveis e menos prejudiciais ao ambiente. A gua um
solvente de baixo custo, atxico, altamente disponvel e de descarte simples e
24

pouco impactante ao ambiente, o que torna a PHWE uma tcnica de extrao

atrativa e eficiente para matrizes como solos, alimentos e plantas. Outras vantagens
so a possibilidade de automao, a reprodutibilidade superior e a reduo no
tempo e na quantidade de solvente necessrios para a extrao (AZMIR et al., 2013;

Constante dieltrica

TEO et al., 2010).

Temperatura (C)
Figura 6 - Variao da constante dieltrica da gua com a temperatura em diferentes presses:
33 bar; 129 bar; 322 bar (adaptado de SMITH, 2002)

As desvantagens da tcnica so, principalmente, o alto custo do

equipamento devido s altas presses necessrias, a degradao dos analitos pela
temperatura, e a eventual necessidade de empregar a extrao lquido-lquido como
forma de purificar os extratos. Com relao ao custo, possvel mitig-lo utilizandose equipamentos construdos no prprio laboratrio (HENG et al., 2013; MUSTAFA;
TURNER, 2011; TEO et al., 2010). A degradao dos analitos pode ser contornada
empregando-se uma temperatura mais branda, ou at mesmo temperatura
ambiente na extrao, como fizeram ONG et al. (2007), na extrao de gastrodina
e lcool vanlico da planta Gastrodia elata em um equipamento de PLE dinmico.
Aplicaes recentes da tcnica podem ser vistas, por exemplo, no trabalho
de Prez et al. (2013), no qual foram analisados poluentes polialogenados em
diferentes plantas utilizando como tcnicas de extrao a PLE (com clean-up) e
UAE (com e sem clean-up). Para PLE, foram otimizadas a temperatura (60 C), o
25

agente de clean-up (Florisil + carbono grafitizado), o solvente (hexano:acetato de

etila 80:20 v/v) e o nmero de ciclos empregados (2 ciclos de 10 minutos). Quando
comparado a ambas as modalidades de UAE, a PLE apresentou melhores valores
de recuperao para os analitos avaliados em amostras de planta fortificadas e foi
a tcnica escolhida para anlise de amostras nas quais alguns dos poluentes foram,
de fato, encontrados.
J no trabalho de del Valle et al. (2005), folhas de boldo-do-Chile (Peumus
boldus) foram submetidas a extrao por PHWE, Soxhlet (metanol) e SFE. A
extrao por PHWE levou ao maior rendimento (51,4% m/m) comparado s outras
tcnicas avaliadas (Soxhlet com 36,6 % e SFE com mdia de 4,3% m/m). Uma
maior atividade antioxidante tambm foi encontrada nos extratos obtidos com
PHWE.
Outro exemplo de aplicao est no trabalho de Herrero et al. (2010), em que
a PLE (com etanol) e a PHWE foram empregadas em diversas temperaturas para
a extrao de compostos bioativos da planta Rosmarinus officinalis. A eficincia da
tcnica foi comparada com a extrao por SFE e, a 200 C, tanto a PLE quanto a
PHWE levaram aos maiores rendimentos (38,6 e 37,9% m/m, respectivamente),
quando comparados com o rendimento da SFE que foi de 6,5% m/m em sua melhor
condio. A atividade antioxidante dos extratos obtidos tambm foi avaliada, bem
como a quantidade de fenis totais e os maiores valores determinados foram,
novamente, para os extratos da PHWE.

I.5. IMPORTNCIA DO PRESENTE TRABALHO

A importncia desse trabalho reside na busca de conhecimentos acerca da
atividade fungitxica de substncias produzidas pela C. canadensis, o que pode
levar obteno de um produto vivel para aplicaes agrcolas e que apresente
melhorias com relao aos produtos comercialmente disponveis, principalmente no
que se refere sua eficcia e sua toxicidade. Mais especificamente, embora seja
conhecida a atividade antifngica dos compostos 4Z-LL, 4Z,8Z-ML e 2Z,8Z-ME,
presentes na C. canadensis contra os fungos C. acutatum, C. fragariae e C.
26

gloeosporioides, ainda no se conhece a atividade contra os fungos Alternaria

alternata, Aspergillus niger, Botryosphaeria dothidea, Cladosporium sp., Fusarium
pallidoroseum, Lasiodiplodia theobromae e Penicillium digitatum. O controle destes
fungos de grande importncia na ps-colheita de vrios tipos de frutas, tais como
uva, manga, melo, laranja, dentre outros (CAMARGO et al., 2011; TERAO et al.,
2008).
Este trabalho objetivou dar continuidade aos estudos de Queiroz et al. (2012)
com a C. canadensis utilizando, para tanto, espcimes da planta coletados no Brasil.
O foco foi estudar a viabilidade dos compostos bioativos puros e dos extratos
aquosos da planta como fungicidas naturais na agricultura. O uso do extrato possui
como vantagens: a maior facilidade de obteno a partir das plantas, uma menor
probabilidade de danos sade humana e ao ambiente e um menor risco de
desenvolvimento de novos mecanismos de resistncia devido ao uso contnuo, uma
vez que o extrato pode possuir diversos princpios ativos com efeito sinergtico
(BAKKALI et al., 2008; BURT, 2004).
De modo a se obter extratos da planta que fossem viveis para futuras
aplicaes em frutas ps-colheita, optou-se pela tcnica de PHWE para se realizar
as extraes, uma vez que os extratos gerados seriam aquosos e isso eliminaria a
presena de solventes txicos. Como a PHWE tem sido extensivamente empregada
na extrao de compostos bioativos em plantas e tambm na obteno de seus
leos essenciais volteis, apresentando uma eficincia semelhante ou maior das
outras tcnicas aqui abordadas (HENG et al., 2013; MUSTAFA; TURNER, 2011;
TEO et al., 2010), esta tcnica se mostra ideal para a aplicao desejada neste
trabalho. Este pensamento reforado, ainda, pelo grande interesse em se
substituir a extrao por macerao, empregada em Queiroz et al. (2012), dado ser
este um mtodo que consome tempo e envolve um maior nmero de etapas de
purificao, consumindo grandes volumes de solventes orgnicos txicos
(SIQUEIRA et al., 2011).

27

28

II. OBJETIVOS

29

30

O objetivo geral deste trabalho foi investigar a presena dos princpios ativos
descritos por Queiroz et al. (2012) nos espcimes brasileiros de C. canadensis, bem
como avaliar a atividade antifngica dessas substncias isoladas contra diversos
fungos associados doenas ps-colheita de frutas.
Como objetivos especficos, pretendeu-se:
i.

Isolar e identificar os compostos fungicidas presentes nos espcimes de C.

canadensis coletados no Estado de So Paulo.

ii.

Desenvolver e otimizar um mtodo para a extrao dos princpios ativos com

a utilizao da tcnica de PHWE em um sistema de extrao acelerada por
solvente (ASE Dionex)

iii.

Estabelecer um mtodo analtico baseado em cromatografia a gs com

deteco por ionizao em chama (GC-FID), a fim de determinar o teor dos
princpios ativos nos extratos das plantas coletadas.

iv.

Submeter os princpios ativos puros a bioensaios para averiguao de sua

atividade antifngica contra diversos fungos associados a doenas pscolheita em frutas.

v.

Avaliar a concentrao mnima inibitria dos princpios ativos para os fungos

que se mostraram susceptveis ao tratamento.

31

32

III. PARTE
EXPERIMENTAL

33

34

III.1.

EQUIPAMENTOS

o Banho de ultrassom Ultracleaner 700 (Unique, Brasil);

o Bomba de diafragma Vario MZ 2C NT (Vacuubrand, Alemanha);
o Cmara de germinao BF2 CGFP 275 (Biofoco, Brasil);
o Concentrador rotativo a vcuo RVC 2-25 CD plus (Martin Christ, Alemanha);
o Armadilha fria para solventes do tipo Cooling trap CT 02-50 SR (Martin
Christ, Alemanha);
o Espectrmetro de Ressonncia Magntica Nuclear Avance III 400 MHz
(Bruker, Alemanha);
o Cabine de segurana biolgica Pa420 Classe II, tipo A1 (Pachane, Brasil);
o Cromatgrafo a gs modelo 3900 com detector ion trap modelo Saturn
2100T (Varian, EUA);
o Cromatgrafo a gs modelo 7890A com detector quadrupolo modelo 5975C
inert XL MSD (Agilent, EUA);
o Cromatgrafo a gs modelo 7890A com detector por ionizao em chama
(Agilent, EUA);
o Cromatgrafo a gs modelo GC-2010 Plus com detector triplo quadrupolo
modelo TQ8040 (Shimadzu, Japo);
o Microscpio ptico Leitz Dialux 22 (Leica, EUA);
o Moinho de facas TE 340 (Marconi, Brasil).
o Purificador de gua Milli-Q Academic (Millipore, EUA);
o Rotaevaporador RII (Bchi, Alemanha);
o Sistema de extrao acelerada por solvente ASE Dionex 350 (Thermo
Scientific, EUA);
o Sistema de cromatografia flash Isolera Four (Biotage, Sucia);

III.2.

REAGENTES E SOLVENTES

o Acetato de etila, grau HPLC (Tedia, EUA);

o Clorofrmio (Carlo Erba, Itlia);
o Cloreto de sdio (Synth, Brasil);
35

o Diclorometano (Carlo Erba, Itlia);

o Dimetilsulfxido (Sigma-Aldrich, EUA);
o Hexano (Mallinckrodt, EUA);
o Metanol (Synth, Brasil);
o Sulfato de magnsio seco (MgSO4) (Vetec Qumica Fina, Brasil).
o Meio de cultura em p BDA (Himedia, ndia)

III.3.

PADRES ANALTICOS E COMPOSTOS ISOLADOS

o 4Z-Lachnophyllum lactona (isolada a partir da planta C. canadensis);

o 4Z,8Z-Matricaria lactona (isolada a partir da planta C. canadensis);
o Cumarina (pureza 99,9%) (Synth, Brasil)
o Nistatina (potncia 4400 U.USP/mg) (Sigma-Aldrich, EUA)

III.4.

PROCEDIMENTOS

III.4.1.

Coleta de plantas.

As plantas foram coletadas no municpio de Casa Branca/SP (junho/2013) e

no campo experimental da Embrapa Meio Ambiente, em Jaguarina/SP
(agosto/2013). As exsicatas foram depositadas no herbrio do Instituto de Biologia
da Unicamp (UEC) sob os nmeros 179014 e 179015, respectivamente.

III.4.2.

Extrao e isolamento das substncias puras a partir dos

extratos.
i)

Extrao: a parte area (caule, folhas e flores) das plantas coletadas foi seca
em estufa a 40 C durante o perodo de uma semana. As plantas secas foram
modas em um moinho de facas. Posteriormente, 250 g de planta moda
foram transferidos para um erlenmeyer e foi realizada uma extrao com
solvente sob agitao magntica. Foram empregados 500 mL de
36

diclorometano (DCM) em 3 ciclos de 24 h a temperatura ambiente. A cada

ciclo, foi efetuada a renovao do solvente. Ao final, o solvente de cada ciclo
foi combinado e removido em rotaevaporador (40 C).
ii) Partio do extrato: o extrato seco obtido com DCM foi dissolvido em 150 mL
de uma mistura metanol:gua (90:10, v/v) usando banho de ultrassom. Em
seguida, o extrato foi particionado com 3 x 200 mL de hexano e a frao
hexnica foi reservada. Na frao metanlica remanescente, uma quantidade
de gua foi adicionada a fim de que a proporo metanol:gua passasse a
ser 70:30, v/v. Em seguida, a frao metanlica foi particionada com 3 x 200
mL de clorofrmio. A frao clorofrmica obtida foi seca com MgSO 4 e o
solvente foi removido em rotaevaporador (40 C).
iii) Anlises por GC-MS: as fraes hexnica e clorofrmica obtidas na partio
foram analisadas por GC-MS. Foi utilizado um cromatgrafo a gs com
detector de massas do tipo ion trap e ionizao por eltrons. A separao
dos compostos foi realizada com uma coluna Restek Rxi-5ms (30 m x 0,250
mm x 0,25 m). A programao de temperatura foi 60-240 C (3 C min-1) e
240 C por 5 minutos. A temperatura do injetor foi 240 C, a temperatura da
transferline foi de 250 C e a temperatura do ion trap foi de 180 C. O volume
de injeo utilizado foi de 1 L (modo splitless), a vazo do gs de arraste foi
de 1 mL min-1 e a concentrao dos extratos foi de 1 mg mL-1 em
diclorometano.
iv) Isolamento dos compostos por cromatografia preparativa tipo flash: o extrato
clorofrmico foi submetido a uma separao no sistema de cromatografia
flash utilizando-se um cartucho SNAP KP-Sil 100 g (39157 mm, 40-50 m,)
com 132 mL de volume de coluna (CV), uma vazo de 25 mL min 1, uma fase
mvel composta por hexano:acetato de etila (A:B) com eluio por gradiente:
2% B por 2 CV, 2 20% B por 10 CV e 20% B por 2 CV. As fraes do
nmero 70 ao 90, que apresentaram sinais no detector UV do equipamento
(254 e 280 nm), foram conduzidas para a anlise em GC-MS, a fim de se
avaliar sua composio. Baseado nos cromatogramas obtidos, seis fraes
37

foram agrupadas e identificadas como sendo o composto 4Z-LL e outras seis

fraes como sendo o composto 4Z,8Z-ML. Nove fraes intermedirias
foram agrupadas para uma posterior purificao, j que apresentaram
impurezas ou eram misturas dos dois compostos obtidos.

III.4.3.
i)

Caracterizao das substncias puras isoladas.

Anlises por GC-MS: as substncias purificadas pela cromatografia flash

preparativa foram analisadas por GC-MS. Foi utilizado um cromatgrafo a
gs com detector de massas do tipo quadrupolo e ionizao por eltrons
(70 eV). A separao foi realizada com uma coluna Agilent HP-5ms (30 m x
0,250 mm x 0,25 m). A programao de temperatura foi 120-240 C (8 C
min-1). A temperatura do injetor foi 240 C, a temperatura da transferline foi
de 200 C, a temperatura da fonte foi de 230 C e a temperatura do
quadrupolo foi de 150 C. O volume de injeo utilizado foi de 1 L, com split
1:100, a vazo do gs de arraste foi de 1 mL min -1 e a concentrao das
substncias foi de 200 g mL-1 em acetato de etila.

ii) Anlises por GC-MS/MS: a identidade das molculas foi confirmada, ainda,
por anlise por GC-MS/MS. Foi utilizado um cromatgrafo a gs com detector
de massas triplo quadrupolo e ionizao por eltrons (70 eV). A separao
foi realizada com uma coluna Restek Rtx-5MS (30 m x 0,250 mm x 0,25 m).
Foi empregada uma corrida isotrmica a 115 C por 19 minutos. A
temperatura do injetor foi 240 C, a temperatura da transferline foi de 200 C
e a temperatura da fonte de ons 230 C. O volume de injeo utilizado foi de
2 L (modo splitless), a vazo do gs de arraste (nitrognio) foi 2 mL min-1 e
a concentrao das substncias foi de 50 g mL-1 em acetato de etila. O
sistema foi operado no modo SIM/Scan com energia de coliso de 12 V e
argnio como gs de coliso. Para cada composto o on precursor foi seu
prprio on molecular: m/z 162 (4Z-LL) e m/z 160 (4Z,8Z-ML).
iii) Anlises por NMR de 1H e

13

C: amostras de 10 mg dos compostos 4Z-LL e

4Z,8Z-ML previamente isolados conforme descrito na seo III.4.2, foram

analisadas por NMR de 1H e

13

C. As amostras foram diludas em CDCl3 e

38

analisadas em um espectrmetro de NMR da marca Bruker, modelo Avance,

nas frequncias de 400 MHz (1H) e 100 MHz (13C) para o composto 4Z-LL e
nas frequncias 500 MHz (1H) e 125 MHz (13C) para o composto 4Z,8Z-ML.
iv) Anlises por NMR 2D (1H-13C HSQC e

H-1H COSY): tambm foram

realizados experimentos 2D de 1H-13C HSQC e 1H-1H COSY para auxiliar na

caracterizao estrutural dos analitos. As frequncias empregadas foram as
mesmas dos experimentos 1D descritos anteriormente.

III.4.4.

Teste preliminar: extrao dos analitos de interesse da

planta por PHWE.

i)

Extrao: uma poro de 5,0 ( 0,1) g da planta moda foi submetida

extrao por PHWE. A extrao foi realizada a 100 C em 3 ciclos de 20
minutos. Esse procedimento gerou cerca de 40 mL de extrato bruto.

ii) Partio lquido-lquido do extrato: o extrato bruto obtido por PHWE foi
particionado com 3 x 100 mL de acetato de etila. A frao orgnica obtida foi
seca com MgSO4 e, em seguida, o solvente foi removido em rotaevaporador
(40 C).
iii) Anlise por GC-MS: O extrato purificado obtido foi analisado por GC-MS
conforme descrito no item (i) da sesso III.4.3, excetuando-se a rampa de
aquecimento empregada, que foi de 90-150 C (3 C min-1), 150-280 C (20
C min-1) e 280 C por 5 minutos. Anterior a anlise, os extratos foram diludos
com acetato de etila para uma concentrao de 1,0 mg mL-1. A presena dos
compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML foi identificada pelos espectros de massas dos
picos obtidos no cromatograma.

III.4.5.

Otimizao da extrao via PHWE

A otimizao da extrao via PHWE foi realizada alterando-se, de maneira

univariada, os parmetros de temperatura, tempo de ciclo e nmero de ciclos, de
modo a verificar o efeito de cada um, separadamente, na eficincia da extrao.
39

III.4.5.1. Temperatura
i)

Extrao: Pores de 5 g da planta moda foram submetidas extrao por

PHWE em cinco diferentes temperaturas: 70, 90 100, 110 e 130 C. O
nmero de ciclos foi fixado em 3 e o tempo de cada ciclo em 20 minutos. As
extraes foram realizadas em duplicata para cada temperatura, gerando
~40 mL de extrato aquoso bruto por extrao.

ii) Partio: Aps a extrao, 20 mL de cada extrato aquoso foram transferidos,

em duplicata, para tubos tipo Falcon (50 mL). A partio foi feita com
3 x 15 mL de acetato de etila. As trs fraes de acetato de etila obtidas foram
reunidas em outro tubo tipo Falcon (50 mL) e o solvente foi evaporado com
auxlio de N2 at que seu volume tivesse sido reduzido a aproximadamente
10 mL. O solvente remanescente foi seco com MgSO 4 e filtrado em seringa
com filtro de celulose reconstituda (0,22 m). J seco, o solvente foi
transferido para um tubo Falcon (15 mL, previamente pesado) e removido em
evaporador rotativo a vcuo (2 horas, 50C). Os extratos secos tiveram,
ento, suas massas determinadas.

III.4.5.2. Tempo de ciclo

i)

Extrao: Pores de 5 g da planta moda foram submetidas extrao por

PHWE em cinco diferentes tempos de ciclo: 1, 5, 10, 20 e 30 minutos. O
nmero de ciclos foi fixado em 3 e a temperatura foi mantida em 100 C As
extraes foram realizadas em duplicata para cada tempo.

ii) Partio: a partio foi realizada conforme descrito no item (ii) da sesso
III.4.5.1.

III.4.5.3. Nmero de ciclos

i)

Extrao: uma mesma cela de extrao contendo 5 g da planta moda foi

submetida a 4 extraes consecutivas, de modo a simular 4 ciclos de
extrao. Assim, os extratos representando cada um dos ciclos foram obtidos
40

separadamente. As extraes foram realizadas a uma temperatura de 100

C com ciclos de 1 minuto. O procedimento foi realizado em duplicata.
ii) Partio: a partio foi realizada conforme descrito no item (ii) da sesso
III.4.5.1.

III.4.5.4. Repetitividade do procedimento de extrao

Neste trabalho, foi avaliada a repetitividade intra-dia e inter-dia do mtodo de
extrao. O coeficiente de variao (CV) intra-dia foi determinado por meio da
anlise, no mesmo dia, de solues do extrato purificado nas concentraes
descritas na Tabela 1 (pg. 38). O extrato foi obtido em quintuplicata para essa
determinao. O CV inter-dia foi determinado modificando-se o dia da anlise. As
concentraes das solues de extrato purificado analisadas neste ensaio tambm
se encontram na Tabela 1. Neste caso, o extrato foi obtido em triplicata.
A extrao e a purificao do extrato se deram da seguinte forma:
i)

Extrao: pores de 5 g da planta moda foram submetidas extrao por

PHWE nas condies otimizadas previamente: temperatura de 100 C, com
4 ciclos de 1 minuto cada.

ii) Partio: a partio foi realizada conforme descrito no item (ii) da sesso
III.4.5.1, com uma modificao. Neste ensaio, o extrato aquoso bruto obtido
foi avolumado em balo de 50 mL e somente uma alquota de 20 mL foi
particionada.

III.4.6.

Determinao dos analitos de interesse nos extratos

purificados
Em todos os extratos purificados por partio deste trabalho, os analitos de
interesse (4Z-LL e 4Z,8Z-ML) foram quantificados da seguinte forma:
i)

Condies cromatogrficas: foi utilizado um cromatgrafo a gs com sistema

de deteco por ionizao em chama (FID). A separao foi realizada em
41

uma coluna Agilent HP-5 (30 m x 0,320 mm x 0,25 m). Para a obteno da
curva analtica, foi empregada uma corrida isotrmica a 115 C por 19
minutos e, na anlise dos extratos, foi adicionada a esta condio uma rampa
de limpeza de 115 a 200 C (20 C min-1). A temperatura do injetor foi de
200 C e a temperatura do detector foi de 300 C. O volume de injeo
utilizado foi de 1 L, com split 1:50. A vazo do gs de arraste (nitrognio) foi
de 2 mL min-1
ii) Preparo das solues-padro: as solues-estoque dos compostos 4Z-LL e
4Z,8Z-ML isolados da planta foram preparadas separadamente em acetato
de etila, na concentrao de 1000 g mL -1.
iii) Curva analtica: a curva analtica foi obtida a partir de solues de trabalho
preparadas em acetato de etila contendo os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML
nas concentraes de 5, 10, 20, 30, 40 e 50 g mL -1. Foi utilizado
padronizao interna com cumarina na concentrao de 15 g mL-1
iv) Anlise dos extratos purificados por partio: as amostras de extrato
purificado foram preparadas nas concentraes descritas na Tabela 1 e
analisadas nas condies cromatogrficas citadas anteriormente. Para cada
um dos dois compostos, foi necessria a utilizao de uma determinada
concentrao de extrato, de modo a fazer com que as reas dos seus picos
sempre estivessem dentro da faixa linear de trabalho.

42

Tabela 1 - Concentraes em que cada extrato obtido foi analisado por GC-FID.

Concentrao do extrato (mg mL-1)

Etapa

4Z-LL

4Z,8Z-ML

Otimizao da temperatura (C)

(3 ciclos de 20 minutos)

70
90
100
110
130

0,40
0,20
0,25
0,30
0,70

1,60
1,00
1,00
1,00
1,00

Otimizao do tempo de ciclo (min)

(3 ciclos a 100 C)

1
5
10
20
30

0,16
0,16
0,24
0,30
0,36

1,00
1,00
1,00
1,00
1,00

Otimizao do nmero de ciclos

(ciclos de 1 min a 100 C)

1 ciclo
2 ciclo
3 ciclo
4 ciclo

1,00
1,00
1,00
1,00

1,00
1,00
1,00
1,00

Intra-dia

0,25

1,00

Inter-dia

0,25

1,00

Repetitividade
(4 ciclos de 1 minuto a 100C)

III.4.7.

Bioensaios

Os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML, isolados da planta C. canadensis, tiveram

suas atividades antifngicas avaliadas contra 10 fungos associados a doenas pscolheita de frutas. Os fungos utilizados foram isolados a partir de diferentes frutas
(laranja, manga, melo e uva) e esto identificados na Tabela 2. Foi realizado um
screening via ensaio de difuso em disco com o intuito de averiguar quais fungos
se mostrariam susceptveis aos compostos avaliados para, posteriormente,
estabelecer qual a concentrao mnima inibitria de cada composto contra os
fungos afetados.

43

Tabela 2 - Fungos utilizados nos bioensaios para avaliao da atividade antifngica dos
compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML.

Cdigo

Fungo

Fruta

CCMA 1129
CCMA 1130
CCMA 1131
CCMA 1133

Colletotrichum gloeosporioides
Alternaria alternata
Lasiodiplodia theobromae
Botryosphaeria dothidea

Manga

CCMA 1132
CCMA 1135
CCMA 1136

Aspergillus niger
Alternaria alternata
Cladosporium sp.

CCMA 1134
CCMA 1137

Fusarium pallidoroseum
Alternaria alternata

CCMA 1190

Penicillium digitatum

Uva

Melo

Laranja

CCMA: Coleo de Cultura de Microrganismos de Importncia Agrcola e Ambiental.

III.4.7.1. Ensaios de difuso em disco

i)

Meio de cultura: Foram preparados 500 mL de meio de cultura BDA (batatadextrose-gar) em erlenmeyer (1000 mL). O meio foi autoclavado a 120 C
por 20 min e, aps o resfriamento, vertido em placas de Petri descartveis
(90 x 15 mm).

ii) Preparao dos discos de celulose: Discos de celulose esterilizados ( = 6

mm) foram impregnados com 10 L de soluo de amostra (4Z-LL ou 4Z,8ZML) em acetato de etila na concentrao de 5 mg mL -1, o que corresponde a
50 g de substncia por disco. Os discos foram depositados sobre as placas
conforme mostrado na Figura 7. Como controle (C), foram utilizados discos
impregnados apenas com acetato de etila puro.

44

Figura 7 - Disposio do inculo e dos discos de celulose na placa de Petri para o ensaio de
difuso em disco.

iii) Preparo do inculo: Os fungos de baixa esporulao e/ou crescimento mais

rpido (CMAA 1129, 1130, 1131, 1133, 1134, 1135 e 1137) foram inoculados
com um plug micelial circular obtido a partir de uma cultura do fungo isolado.
O plug foi colocado no centro da placa (Figura 7) de modo a se obter um
crescimento o mais uniforme possvel. J os fungos de esporulao mais
intensa e/ou crescimento mais lento (CMAA 1132, 1136 e 1190) foram
inoculados com uma suspenso de 10 6 esporos mL-1. A concentrao de
esporos na soluo foi determinada por contagem em cmara de Neubauer.
iv) Incubao: as placas foram incubadas em cmara de germinao a 281 C
por um perodo que variou de 2 a 20 dias, conforme a velocidade de
crescimento de cada fungo.

III.4.7.2. Concentrao Mnima Inibitria

Os ensaios de MIC foram realizados pelo mtodo de microdiluio em caldo
empregando-se microplacas com 96 poos. Esse mtodo foi adaptado da norma
M38-A do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute): Referncia para
Testes de Diluio em Caldo para a Determinao da Sensibilidade a Terapia
Antifngica dos Fungos Filamentosos (CLSI, 2002).
45

Em cada poo da microplaca foram dispensados 95 L de meio de cultura

(RPMI 1640), 100 L de soluo com determinada concentrao da substncia
avaliada diluda no meio de cultura e 5 L de soluo de esporos na concentrao
de 106 esporos mL-1. As solues das substncias avaliadas foram preparadas em
diferentes concentraes a partir de uma soluo estoque na concentrao de
128 g mL-1 em meio de cultura contendo 10% de DMSO. As concentraes finais
dos compostos em cada poo foram de 64, 32, 16, 8 e 4 g mL -1. Como controle
positivo (CI) foram utilizados 100 L de uma soluo de nistatina (64 g mL -1) e
como controle negativo (CII) foram utilizados 100 L de soluo de NaCl
(0,85% m/v). Tanto o controle (CI e CII) quanto as solues dos compostos em
diferentes concentraes foram avaliados em quintuplicata. As placas foram
incubadas por 48 horas a 352 C. A Figura 8 esquematiza o teste de microdiluio
empregado. Os fungos avaliados foram Aspergillus niger (CMAA 1132),
Cladosporium spp. (CMAA 1136) e Penicillium digitatum (CMAA 1190). A MIC foi
determinada observando-se quais poos no apresentavam crescimento visvel dos
fungos aps o perodo de incubao.

Figura 8 - Teste de microdiluio em caldo para a determinao de MIC.

46

IV. RESULTADOS E
DISCUSSO

47

48

Os resultados apresentados envolvem o isolamento e a caracterizao dos

compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML encontrados nos espcimes de C. canadensis
brasileiros; os ensaios visando a extrao destes compostos por PHWE; a
otimizao do mtodo de extrao e os bioensaios para avaliao da atividade
antifngica das substncias obtidas contra os fungos descritos na Tabela 2
(pg 39).

IV.1.

Coleta das plantas

Inicialmente, para que este trabalho pudesse se concretizar, foi necessrio

coletar e investigar a presena dos compostos 4Z-LL, 4Z,8Z-ML e 2Z,8Z-ME nos
espcimes de C. canadensis nativos do Brasil. Apesar desses compostos terem
sido encontrados em plantas nativas dos EUA, no necessariamente eles seriam
encontrados em plantas brasileiras, uma vez que so metablitos secundrios cujo
mecanismo de produo pode estar associado a fatores de estresse especficos de
cada regio (temperatura, patgenos, insetos, deficincia de nutrientes, entre
outros) (MAZID; KHAN; MOHAMMAD, 2011; MIRESMAILLI; ISMAN, 2014;
ZHONG, 2011).
Visando coletar espcimes em quantidade suficiente para os ensaios, foi feita
uma busca por locais onde a C. canadensis era encontrada em abundncia. Como
essa planta se estabelece em lavouras (entressafra) e reas com manejo reduzido
do solo (LAZAROTO; FLECK; VIDAL, 2008), no houve dificuldades em se
encontr-la numa fazenda no municpio de Casa Branca/SP em junho de 2013 (UEC
179014) e no campo experimental da Embrapa Meio Ambiente, no municpio de
Jaguarina/SP, em agosto de 2013 (UEC 179015).
As plantas coletadas foram secas por uma semana em estufa a 40 C e
modas conforme procedimento descrito no item i da sesso III.4.2.

49

IV.2.

Extrao e isolamento das substncias puras a partir dos

extratos
A extrao e o isolamento dos compostos alvo foram realizados inicialmente
conforme descrito por Queiroz et al. (2012) e detalhado sesso III.4.2. A partir de
250 g da planta foram obtidos 13,1 g de extrato bruto. Aps partio deste extrato
com diferentes solventes, as fraes clorofrmica e hexnica foram analisadas por
GC-MS para averiguar a eventual presena dos compostos 4Z-LL, 4Z,8Z-ML e
2Z,8Z-ME. Na anlise, foi constatado que os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML estavam
presentes em quantidades significativas tanto na frao clorofrmica quanto na
frao hexnica. O composto 2Z,8Z-ME tambm foi encontrado em ambas as
fraes, no entanto, em quantidades muito reduzidas, impossibilitando seu
isolamento com o procedimento adotado.
A baixa concentrao de 2Z,8Z-ME encontrada nos extratos da planta difere
do resultado obtido por Queiroz et al. (2012), no qual este o composto isolado em
maior quantidade. No entanto, isso no surpreendente, uma vez que diversos
artigos reportam variaes na composio do leo essencial de C. canadensis,
conforme o local coletado e a fase de crescimento da planta (LIS; PIGGOTT; GRA,
2003; TZAKOU et al., 2005).
Como a frao clorofrmica foi aquela que apresentou menos concomitantes,
ela foi submetida separao em sistema de cromatografia flash preparativa para
o isolamento dos analitos de interesse. Possivelmente devido semelhana entre
as molculas de 4Z-LL e 4Z,8Z-ML (Figura 4), a tcnica no foi capaz de separlas completamente. Das fraes coletadas, seis delas foram agrupadas e
identificadas como sendo o composto 4Z-LL (~338 mg) e outras seis como sendo o
composto 4Z,8Z-ML (~53 mg). No entanto, nove fraes intermedirias (~476 mg)
foram agrupadas para uma posterior purificao, j que eram misturas dos dois
compostos obtidos ou apresentaram impurezas.

50

IV.3.

Caracterizao das Substncias Puras Isoladas

IV.3.1.

Anlises por GC-MS e GC-MS/MS

As anlises de GC-MS das fraes descritas no item IV.2 indicaram que o

isolamento dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML foi atingido com sucesso. A existncia
de um nico pico nos cromatogramas aliada presena dos fragmentos
caractersticos de cada molcula no espectro de massas, so fortes indicativos de
que ambos os compostos foram isolados e estavam puros. As Figura 9 Figura 10
mostram os cromatogramas obtidos para os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML,
respectivamente, aps o processo de isolamento. Tambm so apresentados os
espectros de massas correspondentes a cada pico. Os espectros obtidos esto de
acordo com a literatura e confirmam a identidade das molculas (BR; SCHULTZE,
1996; CSUPOR-LFFLER et al., 2011; RIVERA; ARANCIBIA; CASTILLO, 1989).

51

LACH

MATR

Figura 9 - Cromatograma (TIC) obtido para o composto 4Z-LL (acima) e seu respectivo espectro
de massas (abaixo). Coluna HP-5 (30 m x 250 m x 0,25 m). Programa de temperatura de
120-240 C (8 C min-1). Temperatura do injetor 240 C, temperatura da transferline 200 C,
temperatura da fonte 230 C e temperatura do quadrupolo 150 C. Volume de injeo 1 L, split
1:100, vazo do gs de arraste 1 mL min-1, concentrao do composto 200 g mL-1, solvent delay
5 minutos.

52

LACH

MATR

MATRES

Figura 10 - Cromatograma (TIC) obtido para o composto 4Z,8Z-ML (acima) e seu respectivo
espectro de massas (abaixo). Coluna HP-5 (30 m x 250 m x 0,25 m). Programa de temperatura
de 120-240 C (8 C min-1). Temperatura do injetor 240 C, temperatura da transferline 200 C,
temperatura da fonte 230 C e temperatura do quadrupolo 150 C. Volume de injeo 1 L, split
1:100, vazo do gs de arraste 1 mL min-1, concentrao do composto 200 g mL-1, solvent delay
5 minutos.

53

De modo a confirmar a identidade dos compostos isolados e identificados por

GC-MS, a cromatografia a gs associada espectrometria de massas sequencial
(GC-MS/MS) foi utilizada. Para ambos os analitos, o on precursor foi o seu prprio
on molecular, monitorado no modo SIM (Single Ion Monitoring). Aps a sua
fragmentao, os ons produto forneceram espectros de massas cujos padres de
fragmentao foram consoantes com as estruturas das molculas.
A Figura 11 mostra o espectro MS2 do on molecular do composto 4Z-LL
(m/z 162). Seus ons produto esto de acordo com a fragmentao proposta na
literatura, apresentando picos em m/z 147 [M-CH3]+, m/z 133 [M-C2H5]+, m/z 119
[M-C3H7]+, m/z 105 [M-C2H5-CO]+, m/z 91 [M-C3H7-CO]+ e m/z 82 [C4H2O2]+
(QUEIROZ et al., 2012; RIVERA; ARANCIBIA; CASTILLO, 1989).

Figura 11 - Espectro MS2 do on [M+] em m/z 162 (composto 4Z-LL).

A Figura 12 mostra o espectro MS2 do on molecular do composto 4Z,8Z-ML,

(m/z 160). A fragmentao de seus ons produto foi proposta com base na
fragmentao de seu ismero 4E,8Z-ML, uma vez que, somente para este
composto, foi encontrada descrio do padro de fragmentao na literatura (BR;
SCHULTZE, 1996). O espectro apresenta picos em m/z 145 [M-CH3]+,
m/z 131 [M-C2H5]+, m/z 104 [M-C2H4-CO]+, e m/z 78 [M-C4H2O2]+.

54

Figura 12 - Espectro MS2 do on [M+] em m/z 160 (composto 4Z,8Z-ML).

IV.3.2.

Anlises por NMR de 1H e 13C

As anlises de NMR de 1H e

13

C confirmaram as estruturas dos compostos

4Z-LL e 4Z,8Z-ML isolados a partir de extratos da planta C. canadensis. A Tabela 3

mostra os deslocamentos qumicos de carbono e de hidrognio atribudos a cada
um dos compostos. Os dados esto em conformidade com a literatura, indicando
que os analitos de interesse foram isolados adequadamente (CSUPOR-LFFLER
et al., 2011; QUEIROZ et al., 2012; RIVERA; ARANCIBIA; CASTILLO, 1989).
Tabela 3 - Deslocamentos qumicos dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML nos ensaios de NMR de
1
H e 13C.

Posio
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

4Z-LL (C10H10O2)
1H (ppm), J (Hz)
13C (ppm)
-168,9
6,22 (1H, d, J = 5,2)
120,1
7,37 (1H, d, J = 5,2)
142,6
-156,0
5,31 (1H, t, J = 2,4)
95,1
-104,6
-74,8
2,43 (2H, td, J = 7,2 e 2,4)
21,8
1,62 (2H, sext, J = 7,2)
22,1
1,03 (3H, t, J = 7,2)
13,5

4Z,8Z-ML (C10H8O2)
1H (ppm), J (Hz)
13C (ppm)
-168,8
6,25 (1H, dd, J = 5,4 e 0,5)
120,4
7,40 (1H, d, J = 5,0)
142,4
-155,9
5,48 (1H, d, J = 2,5)
94,6
-88,0
-99,4
5,72 (1H, dm, J = 10,5)
109,9
6,16 (1H, dq, J = 10,5 e 7,0)
141,8
1,97 (3H, dd, J = 7,0 e 1,5)
16,5

Os espectros de NMR 1H e 13C para o composto 4Z-LL esto mostrados nas

Figura 13 e Figura 14, respectivamente.
55

10

CHDDD
2
Cl33
CHCl

TMS

Figura 13 - Espectro de NMR 1H a 400 MHz em CDCl3 para o composto 4Z-LL.

CDCl3

9 8 10
7

Figura 14 - Espectro de NMR 13C a 100 MHz em CDCl3 para o composto 4Z-LL.

56

Os espectros de NMR 1H e 13C para o composto 4Z,8Z-ML esto mostrados

nas Figura 15 e Figura 16, respectivamente.

TMS

10
3

CHCl3

2
9

Figura 15 Espectro de NMR 1H a 500 MHz em CDCl3 para o composto 4Z,8Z-ML.

57

CDCl3

9
3

10

TMS

Figura 16 Espectro de NMR 13C 125 MHz em CDCl3 para o composto 4Z,8Z-ML.

No espectro de NMR 1H da Figura 13, importante ressaltar que a integrao

do sinal em 1,62 ppm foi de 2,8 e no de aproximadamente 2, como era esperado
para a molcula de 4Z-LL. Isso ocorreu devido presena de gua na amostra ou
no solvente, pois, em CDCl 3, o deslocamento qumico da gua ocorre em,
aproximadamente, 1,56 ppm (GOTTLIEB; KOTLYAR; NUDELMAN, 1997). A
presena de tal deslocamento tambm pode ser observada no espectro da Figura
15, porm, nesse caso, ele no interferiu com nenhum outro sinal.
As anlises de NMR foram imprescindveis para a determinao da
estereoisomeria dos compostos isolados. Tal dado relevante, pois entre as
espcies da tribo Astereae a qual pertence a planta C. canadensis comum
encontrarem-se os ismeros E e Z dos analitos de interesse (CHRISTENSENT;
LAM, 1991; CSUPOR-LFFLER, 2012). No caso do composto 4Z-LL, que foi
encontrado na planta, possvel diferi-lo do ismero 4E-LL principalmente pelo
deslocamento qumico do H-5, que ocorre em torno de 5,30 ppm para o ismero Z,
58

mas deslocado para menor campo (0,350,45 ppm) no ismero E (RIVERA;

ARANCIBIA; CASTILLO, 1989). Para o composto 4Z,8Z-ML, obtido a partir dos
extratos da planta, temos uma situao semelhante. Sua diferenciao do ismero
4E,8Z-ML, cuja presena foi reportada em exemplares de C. canadensis por
Csupor-Lffler et al.(2011), possvel, novamente, graas ao deslocamento
qumico do H-5, que ocorre em torno de 5,48 ppm para o ismero 4Z,8Z, mas em
torno de 5,79 ppm para o ismero 4E,8Z (CSUPOR-LFFLER et al., 2011).

IV.3.3.

Anlises por NMR 1H-13C HSQC e 1H-1H COSY

A anlise por NMR 1H-13C HSQC traz informaes acerca do acoplamento

entre o carbono e o(s) hidrognio(s) ligado(s) diretamente a ele ( 1JCH). A sigla HSQC
quer dizer heteronuclear single

quantum

coherence

(coerncia

quantica

heteronuclear nica), o que significa que dois diferentes tipos de ncleo (no caso,
1

H e

13

C) so correlacionados em um experimento 2D. Os picos desse tipo de

espectro aparecem no cruzamento entre o sinal do carbono (vertical) e o sinal do

hidrognio (horizontal), indicando que existe correlao entre estes dois ncleos, ou
seja, que existe uma ligao simples entre eles (JACOBSEN, 2007a).
Para o composto 4Z-LL, o espectro de NMR 1H-13C HSQC (Figura 17)
confirmou a estrutura da molcula, mostrando correlaes entre os trs hidrognios
(H-10) em 1,03 ppm e o carbono (C-10) em 13,5 ppm; entre o hidrognio (H-5) em
5,31 ppm e o carbono (C-5) em 95,1 ppm; entre o hidrognio (H-3) em 7,37 ppm e
o carbono (C-3) em 142,6 ppm e entre o hidrognio (H-2) em 6,22 ppm e o carbono
(C-2) em 120,1 ppm.
Com o auxlio desta tcnica, tambm foi possvel descobrir um equvoco na
atribuio encontrada na literatura para os carbonos C-8 e C-9 do composto
4Z-LL (RIVERA; ARANCIBIA; CASTILLO, 1989). Via de regra, espera-se que,
quanto maior a proximidade da ligao tripla, maior o deslocamento do sinal do
hidrognio no espectro de NMR 1H para campos menores (maiores frequncias),
devido reduo de sua blindagem pelo efeito anisotrpico dos eltrons da
instaurao (PAVIA; LAMPMAN; KRIZ, 2001).
59

Desse modo, no espectro de

NMR 1H (Figura 13), os hidrognios em 1,62 e 2,43 ppm devem ser atribudos a
H-9 e H-8 respectivamente, como atesta a literatura anteriormente citada. No
entanto, estes mesmo artigos atribuem aos carbonos C-9 e C-8, os sinais
encontrados, respectivamente, em 21,8 e 22,1 ppm, no espectro de NMR

13

(Figura 14). Contudo, o espectro de NMR 1H-13C HSQC revela que o hidrognio
H-9 se correlaciona com o carbono em 22,1 ppm e, portanto, este sim deveria ser
identificado como C-9. O hidrognio H-8, por sua vez, se correlaciona com o
carbono em 21,8 ppm, sendo este aquele que deveria ser identificado como C-8.
Estes dados so, ainda, compatveis com tabelas encontradas na literatura para o
deslocamento de carbonos e hidrognios prximos a triplas ligaes (PRETSCH;
BHLMANN; BADERTSCHER, 2009).

Figura 17 - Espectro de NMR 1H-13C HSQC para o composto 4Z-LL.

60

Para o composto 4Z,8Z-ML, o espectro de NMR 1H-13C HSQC (Figura 18)

apenas confirmou a estrutura da molcula, mostrando correlaes entre os trs
hidrognios (H-10) em 1,97 ppm e o carbono (C-10) em 16,5 ppm; entre o
hidrognio (H-9) em 6,16 ppm e o carbono (C-9) em 141,8 ppm; entre o hidrognio
(H-8) em 5,72 ppm e o carbono (C-8) em 109,9 ppm; entre o hidrognio (H-5) em
5,48 ppm e o carbono (C-5) em 94,6 ppm; entre o hidrognio (H-3) em 7,40 ppm e
o carbono (C-3) em 142,4 ppm e entre o hidrognio (H-2) em 6,25 ppm e o carbono
(C-2) em 120,4 ppm. Especial destaque regio ampliada do espectro, que
diferencia com clareza os carbonos C-3 e C-8 a partir dos hidrognios diretamente
ligados a eles. Estes dados esto de acordo com o descrito na literatura para o
composto 4Z,8Z-ML (CSUPOR-LFFLER et al., 2011).

Figura 18 - Espectro de NMR 1H-13C HSQC para o composto 4Z,8Z-ML.

61

A anlise por NMR 1H-1H COSY correlaciona um prton a outro atravs de

seus acoplamentos, usualmente com duas ou trs ligaes de distncia ( 2J e 3J) e,
em alguns casos, com quatro ou cinco ligaes (4J e 5J). A sigla COSY significa
correlation spectroscopy (espectroscopia de correlao) e os seus espectros
mostra, nos dois eixos, as frequncias de um mesmo istopo, no caso, o 1H. Existem
dois tipos de picos nos espectros gerados por esse experimento: os picos diagonais,
que possuem a mesma frequncia em ambos os eixos e so equivalentes aos picos
do espectro de NMR 1H e os picos cruzados, que so espelhados acima e abaixo
da diagonal e marcam o acoplamento entre os dois ncleos que o formam
(JACOBSEN, 2007b).
Para o composto 4Z-LL, o espectro de NMR 1H-1H COSY (Figura 19)
confirmou a estrutura molecular do composto e a atribuio realizada para os
prtons na literatura (QUEIROZ et al., 2012; RIVERA; ARANCIBIA; CASTILLO,
1989), identificando os acoplamentos existentes entre eles.

62

Figura 19 - Espectro de NMR 1H-1H COSY para o composto 4Z-LL.

Para o composto 4Z,8Z-ML, o espectro de NMR 1H-1H COSY (Figura 20)

tambm confirmou a estrutura molecular do composto e a atribuio realizada para
os prtons na literatura (CSUPOR-LFFLER et al., 2011), identificando os
acoplamentos existentes entre eles.

63

Figura 20 -Espectro de NMR 1H-1H COSY para o composto 4Z,8Z-ML.

IV.4.

Teste preliminar para a extrao dos bioativos da planta

por PHWE
Um estudo preliminar foi realizado a fim de investigar a capacidade da tcnica
de PHWE de extrair os princpios ativos de interesse. Como a extrao foi feita
exclusivamente com gua, optou-se por particionar o extrato obtido com acetato de
etila, de modo a verificar se esse solvente seria adequado para remover os analitos
64

da fase aquosa e permitir sua determinao por GC. A Figura 21 mostra o

cromatograma obtido para o extrato testado. Os resultados foram satisfatrios e
mostraram que, de fato, a tcnica de PHWE capaz de extrair os compostos 4Z-LL
e 4Z,8Z-ML da planta. Observa-se, ainda, uma preponderncia significativa de
4Z-LL nos extratos, resultado coerente com o observado na extrao por macerao
(item IV.2).
A obteno de um extrato aquoso destes compostos representa um avano
no que se refere aplicao direta de extratos em frutos ps-colheita, pois, quando
comparado com aqueles obtidos a partir de solventes clorados, o extrato aquoso
oferece menos riscos em sua utilizao.

4Z-LL

4Z,8Z-ML

Figura 21 Cromatograma (TIC) obtido em anlise de GC-MS de um extrato feito via PHWE.
Coluna HP-5 (30 m x 250 m x 0,25 m). Programa de temperatura de 90-150 C (3 C min-1),
150-280 C (20 C min-1) e 280 C por 5 minutos. Temperatura do injetor 240 C, temperatura da
transferline 200 C e temperatura do quadrupolo 150 C. Volume de injeo 1 L, split 1:100, vazo
do gs de arraste 1 mL min-1 e concentrao do extrato 1,0 mg mL-1.

IV.5.

Curvas analticas

Embora tenha sido empregado anteriormente o GC-MS para a determinao

dos dois compostos de interesse, foi avaliada tambm a possibilidade de realizar as
65

anlises por GC-FID, uma vez que esta tcnica de fcil operao e de menor custo
e esse equipamento possua uma maior disponibilidade de uso. Pelos
cromatogramas obtidos por GC-FID dos extratos (Figura 22) no foi verificada a
presena de outros compostos da matriz que pudessem causar interferncia e,
portanto, a curva analtica foi obtida tambm nesta tcnica e as subsequentes
determinaes realizadas por esta. Para a determinao da linearidade e da faixa
linear foram construdas curvas analticas por padronizao interna em seis nveis
de concentrao no intervalo de 5 a 50 g mL -1. Como padro interno foi utilizada a
cumarina em uma concentrao de 15 g mL -1. Cada ponto da curva foi analisado
em duplicata independente. Na Tabela 4 so apresentados os coeficientes
angulares, lineares e de correlao (r) determinados pelo mtodo dos mnimos
quadrados ordinrios, bem como seus respectivos desvios.
Tabela 4 - Parmetros da regresso linear referente s curvas analticas obtidas e seus
respectivos desvios.

Composto
1
2

Coeficiente
Angular (mL g-1)
0,0476
0,0595

Desvio
(mL g-1)
0,0002
0,0009

Coeficiente
Linear
-0,045
-0,107

Desvio
0,009
0,027

Coeficiente de
correlao
0,999
0,997

A Figura 22 um exemplo de cromatograma caracterstico obtido para a

quantificao por GC-FID dos compostos nos extratos.

66

4Z-LL

Cumarina
4Z,8Z-ML

Figura 22 - Cromatograma obtido em anlise de GC-FID de um extrato feito via PHWE (100 C, 3
ciclos de 20 minutos). Coluna HP-5 (30 m x 320 m x 0,25 m). Programa de temperatura de
115 C (19 minutos), 115-200 C (20 C min-1. Temperatura do injetor 200 C e temperatura do
detector 300 C. Volume de injeo 1 L, split 1:50, vazo do gs de arraste 2 mL min-1.
Concentrao do extrato 1,0 mg mL-1, concentrao do padro interno (cumarina) 15 g mL-1

IV.6.

Otimizao da extrao via PHWE

Dentre os principais fatores que afetam a eficincia e a seletividade da

extrao por PHWE, esto a temperatura, o tempo do ciclo e o nmero de ciclos
empregados. Desse modo, fundamental a otimizao desses parmetros para
que se atinja uma extrao adequada dos analitos de interesse (HENG et al., 2013;
TEO et al., 2010).

IV.6.1.

Temperatura

A temperatura um fator determinante para a eficincia da extrao via

PHWE, afinal sua influncia regula a polaridade do solvente extrator e a sua
capacidade de penetrar na matriz atravs da reduo da tenso superficial e da
67

viscosidade da gua. Alm disso, a escolha adequada da temperatura

fundamental para prevenir a degradao de compostos termolbeis e evitar a
ocorrncia de reaes de hidrolise e oxidao em temperaturas mais elevadas
(HENG et al., 2013; MUSTAFA; TURNER, 2011; TEO et al., 2010).
Desse modo, foi de grande importncia avaliar o seu efeito na extrao em
questo. Como ponto de partida, a temperatura de 100 C foi selecionada, pois era
comumente encontrada em trabalhos envolvendo extrao de produtos naturais a
partir de plantas (TEO et al., 2010). Como forma de estabelecer uma condio de
contorno, as temperaturas de 70, 90, 110 e 130 C tambm foram selecionadas
para integrar o estudo de otimizao.
Aps a realizao das extraes em diferentes temperaturas, as massas de
extrato purificado seco foram determinadas e esto compiladas na Tabela 5,
juntamente com o rendimento de cada extrao com relao massa inicial de
planta (5,0 g). Observou-se que o aumento da temperatura de extrao provocou
um aumento na massa dos extratos, denotando que, de fato, quanto maior a
temperatura, maior a eficincia da gua como solvente extrator. No entanto, massas
maiores no necessariamente indicam que os analitos de interesse foram extrados
com maior rendimento. Assim, faz-se necessria a quantificao dos compostos
4Z-LL e 4Z,8Z-ML em cada extrato obtido.
Tabela 5 - Massas dos extratos secos obtidos em diferentes temperaturas e rendimento global da
extrao comparado massa inicial de planta (5,0 g).

Temperatura (C)
70
90
100
110
130

Replicata
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2

Massa (mg)
63
56
70
59
85
81
88
87
108
120

68

Rendimento
1,2%
1,1%
1,4%
1,2%
1,7%
1,6%
1,8%
1,7%
2,2%
2,4%

No intuito de verificar se a extrao dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML seria

afetada pela temperatura os extratos obtidos foram analisados por GC-FID e os

Teor de composto na planta

(mg g-1)

resultados esto apresentados na Figura 23

1,55
1,32

1,30

0,82

0,66

0,05

4Z-LL

0,20

0,25
0,21 0,16

4Z,8Z-ML

Figura 23 Mdia (n=2) e desvio mdio do teor dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML nos extratos
purificados em cada uma das temperaturas avaliadas (70, 90, 100, 110 e 130 C). Teor dado em
miligramas de composto por grama de planta.

Como possvel observar, a extrao a 100 C foi aquela que levou ao maior
rendimento para ambos os analitos. Nas temperaturas de 70 e 90 C, foram obtidos
menores rendimentos, provavelmente devido reduo menos significativa da
tenso superficial e da viscosidade da gua, o que prejudicou sua capacidade de
penetrar na matriz e extrair os analitos. J acima de 100 C, embora no tenha sido
possvel observar produtos de degradao no cromatograma, provavelmente,
houve degradao dos analitos pela temperatura.

IV.6.2.

Tempo de ciclo

O processo de extrao por PHWE pode ser descrito em quatro etapas:

i) dessoro dos compostos a partir dos stios ativos da matriz; ii) difuso dos
compostos pela matriz at atingirem a interface entre o solvente e a matriz; iii)
solubilizao dos analitos na fase extratora e iv) eluio dos analitos da cela
extratora para o frasco coletor (TEO et al., 2010). Como em amostras compostas
69

por material vegetal as etapas limitantes so aquelas que envolvem processos de

difuso e solubilizao do composto (MUSTAFA; TURNER, 2011), espera-se que,
quanto maior o tempo da extrao, maior a sua eficincia. Contudo, h de se
considerar que aquecimentos prolongados podem levar degradao dos
compostos de interesse (TEO et al., 2010). Sendo assim, o tempo de ciclo outro
fator decisivo na otimizao da extrao por PHWE.
Aps a realizao das extraes em diferentes tempos de ciclo, as massas
de extrato purificado seco foram determinadas e esto compiladas na Tabela 6,
juntamente com o rendimento de cada extrao com relao massa inicial de
planta (5,0 g).
Tabela 6 - Massas dos extratos secos obtidos em diferentes tempos de ciclo e rendimento global
da extrao comparado massa inicial de planta (5,0 g).

Tempo (min)
1
5
10
20
30

Replicata
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2

Massa (mg)
65
62
65
63
75
70
86
78
80
80

Rendimento
1,3%
1,2%
1,3%
1,3%
1,5%
1,4%
1,7%
1,6%
1,6%
1,6%

Observou-se que o aumento do tempo de ciclo provocou um aumento na

massa dos extratos, confirmando que, de fato, a eficincia da tcnica pode ser
incrementada com maiores tempos de extrao. No entanto, novamente, massas
maiores no necessariamente indicam que os analitos de interesse foram extrados
com maior rendimento.
No intuito de verificar se a extrao dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML seria
afetada pelo tempo do ciclo de extrao, os extratos purificados obtidos foram
analisados e os resultados esto apresentados na Figura 24.

70

Teor de composto na planta

(mg g-1)

1,91

1,87

1,73
1,47
1,30

0,31 0,28 0,28

0,24 0,19

4Z-LL

4Z,8Z-ML

Figura 24 Mdia (n=2) e desvio mdio do teor dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML nos extratos
purificados em cada um dos tempos de ciclo avaliados (1, 5, 10, 20 e 30 min). Teor dado em
miligramas de composto por grama de planta.

Como possvel observar, a extrao utilizando ciclos de 1 minuto foi mais

eficiente para ambos os analitos. Aqui, novamente, pode-se levantar a hiptese de
que o aquecimento prolongado esteja degradando os analitos antes de sua eluio
da cela de extrao, no entanto, produtos de degradao no foram encontrados
nos cromatogramas analisados de modo a confirmar esta hiptese.

IV.6.3.

Nmero de ciclos

Quando a PHWE empregada no modo esttico, como foi o caso deste

trabalho, sua eficincia depende fortemente da constante de partio e da
solubilidade dos compostos naquela temperatura. Assim, algumas extraes em
modo esttico podem ser incompletas, devido ao volume limitado de solvente
comportado pela cela de extrao. Uma forma de minimizar este problema
empregar um maior nmero de ciclos na extrao (TEO et al., 2010).
Buscou-se investigar qual seria a parcela dos analitos de interesse extrada
em cada ciclo separadamente e quantos ciclos seriam necessrios para extrair
quantidades significativas desses compostos sem que um grande volume de extrato
71

fosse gerado. Assim, a composio de 4 ciclos de extrao consecutivos foi

investigada e, ao contrrio da quantificao dos analitos realizada na otimizao da
temperatura e do tempo, optou-se pela simples comparao das reas dos analitos
extrados em cada um dos diferentes ciclos. Os grficos das Figura 25 e Figura 26
mostram, para os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML, respectivamente, a porcentagem
de analito extrada em cada um dos ciclos, quando comparada com a soma das
reas de cada ciclo.
possvel verificar que, para o composto 4Z-LL, o segundo ciclo apresenta
um maior rendimento, enquanto que o quarto e ltimo ciclo responsvel por, em
mdia, apenas 6,8% da quantidade total da substncia presente no extrato
purificado. J para o composto 4Z,8Z-ML, o primeiro e o segundo ciclo possuem
rendimentos mdios comparveis (44,3% e 41,3%, respectivamente), enquanto que
o quarto ciclo responsvel por, em mdia, 3,2% da quantidade total da substncia
presente no extrato purificado.

Eficincia dos ciclos de extrao: 4Z-LL

47,0%
42,3%
34,1%
27,2%
22,3%
13,7%
5,2% 8,3%

CICLO 1

CICLO 2

CICLO 3

Replicata 1

CICLO 4

Replicata 2

Figura 25 Proporo, em porcentagem, do composto 4Z-LL em cada ciclo avaliado.

72

Eficincia dos ciclos de extrao: 4Z,8Z-ML

47,1%
41,5%

41,9% 40,8%

13,9%
8,3%

CICLO 1

CICLO 2

2,7% 3,7%

CICLO 3

Replicata 1

CICLO 4

Replicata 2

Figura 26 - Proporo, em porcentagem, do composto 4Z,8Z-ML em cada ciclo avaliado.

Como a presena de ambos os compostos no quarto ciclo foi baixa, quando

comparada aos outros ciclos, o emprego de quatro ciclos de extrao foi
considerado adequado e suficiente. Optou-se pela no incluso de mais ciclos no
processo de extrao para que o volume de extrato aquoso gerado no fosse
excessivo, exigindo maior quantidade de acetato de etila para a partio. Ademais,
a incluso de mais ciclos, por aumentar o volume de solvente, acabaria por diluir os
compostos, reduzindo sua concentrao no extrato aquoso.
Em geral, os resultados obtidos na quantificao dos compostos durante a
otimizao da temperatura, do tempo e do nmero de ciclos, reforam a viabilidade
e a eficincia da PHWE na extrao de metablitos secundrios da C. canadensis.
As quantidades obtidas so compatveis com o fato de que metablitos secundrios,
quando presentes, normalmente compem menos de 1% da massa seca das
plantas (ZHONG, 2011).
Uma vez estabelecidos os parmetros de operao do PHWE para a
extrao dos bioativos da planta (temperatura de 100 C, 4 ciclos de 1 min cada),
foi avaliada a repetitividade deste procedimento de extrao. Para tanto, extraes
sucessivas (5 replicatas independentes) foram realizadas em um mesmo dia e mais
trs replicatas foram feitas em um segundo dia. A disperso dos resultados para
73

esses dois ensaios, intra- e inter-dia, foi expressa como o coeficiente de variao.
A quantificao dos bioativos no extrato obtido foi realizada por GC-FID conforme
mtodo descrito na sesso III.4.6.
O CV foi calculado em porcentagem pela razo entre a estimativa do desvio
padro (s) e a mdia das concentraes experimentais ( ) conforme Equao 1.
(%) =

100

( 1)

Os valores de CV intra-dia e inter-dia para os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML

esto apresentados na Tabela 7. Todos os valores foram menores do que 7% e so
considerados aceitveis para os objetivos propostos.
Tabela 7 - Valores de CV intra e inter-dia para 4Z-LL e 4Z,8Z-ML

CV (%)
Intra-ensaio (n=5)
6,3
5,8

4Z-LL
4Z,8Z-ML

IV.7.

Inter-ensaio (n=8)
5,7
6,7

Bioensaios

IV.7.1.

Ensaio de difuso em disco

Os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML apresentaram atividades antifngicas

semelhantes. Ambos inibiram o crescimento dos fungos Aspergillus niger (CMAA
1132) e Cladosporium sp (CMAA 1136). Para este ltimo, no entanto, 4Z-LL foi mais
ativo que 4Z,8Z-ML. Adicionalmente, apenas 4Z-LL inibiu significativamente o
crescimento do fungo Penicillium digitatum (CMAA 1190) (Tabela 8).

74

Tabela 8 - Resumo das atividades dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML contra diferentes fungos
associados a doenas ps colheita em frutas.

Cdigo

Fungo

4Z-LL

Substncias
4Z,8Z-ML

CCMA 1129 Colletotrichum gloeosporioides

CCMA 1130
Alternaria alternata
CCMA 1131
Lasiodiplodia theobromae
CCMA 1133
Botryosphaeria dothidea
CCMA 1132
Aspergillus niger
+
+
CCMA 1135
Alternaria alternata
CCMA 1136
Cladosporium spp.
++
+
CCMA 1134
Fusarium pallidoroseum
CCMA 1137
Alternaria alternata
CCMA 1190
Penicillium digitatum
+
Score: (-) inativo, (+) ativo (halo 15 mm), (++) altamente ativo (halo > 15 mm).

A Figura 27 exemplifica um ensaio de difuso em disco no qual os compostos

no apresentaram bioatividade (Figura 27A) e um caso onde eles apresentaram-na
(Figura 27B), destacando-se o halo de inibio tipicamente obtido nesse teste para
compostos bioativos.

Figura 27 Ensaios de difuso em disco mostrando um exemplo no qual o composto no

apresentou atividade antifngica (fig. 27A) e um exemplo no qual o composto apresentou atividade
antifngica (fig. 27B).

IV.7.2.

Concentrao Mnima Inibitria

A concentrao mnima inibitria dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML foi

determinada a partir de ensaio de microdiluio em caldo proposto pela norma
75

M38-A da CLSI. O intuito desse teste avaliar qual a quantidade mnima de cada
composto que provoca a inibio do crescimento do fungo em questo. Tal
informao relevante para que futuros testes envolvendo a aplicao do extrato
aquoso da planta C. canadensis em frutas possam ser realizados com
concentraes adequadas dos compostos.
Todos os trs fungos avaliados tiveram seu crescimento inibido em alguma
das concentraes testadas dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML. O composto 4Z-LL
apresentou maior atividade contra o fungo Penicillium digitatum (32 g mL-1) e o
composto 4Z,8Z-ML apresentou maior atividade contra o fungo Aspergillus niger
(32 g mL-1). Os resultados obtidos para o ensaio de MIC esto listados na
Tabela 9.
Tabela 9 - Atividade antifngica (MIC) dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML obtida pelo mtodo de
microdiluio em caldo.

Fungo
Aspergillus niger (CMAA 1132)
Cladosporium spp. (CMAA 1136)
Penicillium digitatum (CMAA 1190)

MIC (g mL-1)
4Z-LL
4Z,8Z-ML
64
32
64
64
32
64

Os resultados obtidos neste ensaio so promissores, uma vez que os fungos

que se mostraram susceptveis ao tratamento so patgenos comuns no pscolheita de frutas e legumes (COATES; JOHNSON, 1997). O fungo Aspergillus niger
causador da doena conhecida como mofo preto e de outras podrides em
ctricos, uvas, figos, pssegos, mangas, mas e morangos. Alm disso, um dos
responsveis no Brasil pela contaminao de uvas e vinhos com ocratoxina A
(VARGA et al., 2008), uma micotoxina com efeitos nefrotxicos, teratognicos,
hepatotxicos e imunotxicos em animais e possivelmente em humanos, sendo
classificada ainda como uma possvel substncia carcinognica (IARC, 1993;
POZO-BAYN et al., 2012). Os fungos do gnero Cladosporium so causadores de
podrides em meles, berries, tomates e berinjelas (COATES; JOHNSON, 1997;
TERAO et al., 2008). O fungo Penicillium digitatum o agente causador do bolor
verde em frutas ctricas, sendo o principal responsvel pelas suas perdas na ps76

colheita. Estudos indicam que 60 a 80% das perdas de citros durante a

armazenagem sejam causadas pela podrido associada a esse fungo (BALLESTER
et al., 2011).

77

78

V. CONCLUSES E
PERSPECTIVAS
FUTURAS

79

80

V.1.

Concluses

Em linhas gerais, este trabalho apresentou um estudo da composio de

extratos da planta Conyza canadensis com relao a compostos de ao antifngica
reportados na literatura (MEEPAGALA et al., 2002; QUEIROZ et al., 2012). Mais
especificamente, o foco do trabalho foi a busca dos compostos 4Z-lachnophyllum
lactona, 4Z,8Z-matricaria lactona e 2Z,8Z-matricaria ester em espcimes brasileiros
da planta C. canadensis, uma vez que estes compostos haviam sido reportados por
Queiroz et al. (2012) em plantas da mesma espcie coletadas nos EUA.
A partir de extratos obtidos por macerao com agitao empregando
diclorometano como solvente extrator, foi possvel isolar dois dos trs bioativos
identificados nas plantas norte-americanas. Os compostos 4Z-lachnophyllum
lactona e 4Z,8Z-matricaria lactona foram isolados com o auxlio de cromatografia
flash

preparativa

caracterizados

mediante

anlises

de

GC-MS,

GC-MS/MS e NMR de 1H e 13C, alm dos experimentos de NMR 2D de 1H-1H COSY

e 1H-13C HSQC. Os dados obtidos esto em conformidade com a literatura existente
sobre esses compostos, no entanto, os experimentos de NMR 2D acrescentaram
novidades atribuio de dois carbonos do composto 4Z-LL. Os referidos carbonos
(C-8 e C-9) compunham, juntamente com C-10, um radical propila prximo uma
tripla ligao. Contudo, a atribuio de seus deslocamentos estava invertida, de
modo que o valor outrora atribudo ao C-8 deveria ser atribudo ao C-9 e vice-versa.
Foi tambm demonstrada a capacidade da tcnica PHWE de gerar extratos
contendo os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML. A utilizao desta tcnica, em
detrimento da tcnica convencional de macerao com agitao empregada por
Queiroz et al. (2012), gera menos impactos ao ambiente e abre portas para uma
possvel aplicao segura dos extratos em frutos ps-colheita. De modo a se
otimizar o mtodo de extrao por PHWE, foi realizado um estudo do efeito da
temperatura, do tempo de ciclo e do nmero de ciclos no rendimento da extrao,
bem como uma avaliao da repetitividade do mtodo em ensaios intra e inter-dia.
Dentre as cinco temperaturas testadas (70, 90, 100, 110 e 130 C), aquela que se
mostrou mais eficiente na obteno dos bioativos de interesse foi a de 100 C.
81

Dentre os tempos de ciclo avaliados (1, 5, 10, 20 e 30 min), aquele que se mostrou
mais eficiente foi o de 1 minuto. Nessas condies (100 C e 1 minuto de ciclo), a
composio de 4 ciclos consecutivos foi avaliada separadamente e conclui-se que
o quarto ciclo apresentou, em mdia, apenas 6,8 % do composto 4Z-LL e 3,2% do
composto 4Z,8Z-ML, quando as concentraes neste ciclo foram comparadas a
quantidade total extrada. Desse modo, a condio tima de extrao foi definida
como sendo 4 ciclos de 1 minuto cada a 100 C. Nessas condies, o CV obtido
para cinco replicatas independentes da extrao realizadas em um dia e trs
realizadas em um dia diferente ficou abaixo de 7,0%, valor considerado aceitvel
para a aplicao desejada.
Com relao aos bioensaios, os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML apresentaram
atividade contra trs dos dez fungos avaliados nos ensaios de difuso em disco. Os
fungos susceptveis foram Aspergillus niger, Cladosporium spp., e Penicillium
digitatum e o ensaio de MIC revelou que as concentraes mnimas inibitrias dos
compostos para esses fungos variaram entre 32 e 64 g mL -1. Tal resultado
promissor, pois os fungos afetados so patgenos comuns na ps-colheita de frutas
e legumes (BALLESTER et al., 2011; COATES; JOHNSON, 1997; POZO-BAYN
et al., 2012; TERAO et al., 2008; VARGA et al., 2008).

V.2.

Perspectivas Futuras

Este trabalho est inserido em um projeto da Embrapa Meio Ambiente

(Jaguarina/SP) coordenado pela Dr. Sonia Queiroz e financiado pelo CNPq, que
se intitula Avaliao de atividade antimicrobiana, ecotoxicolgica e uso na pscolheita de frutas de extratos e substncias isoladas de Conyza canadensis. Sendo
assim, ser dada continuidade aos estudos aqui desenvolvidos para que,
eventualmente, um biopesticida vivel para aplicao na ps-colheita de frutas
possa ser obtido. As prximas etapas compreendem a aplicao dos extratos
aquosos brutos obtidos por PHWE em frutas colhidas, a avaliao da estabilidade
dos compostos nesses extratos e o desenvolvimento e validao de um mtodo de
quantificao dos analitos de interesse nos extratos por GC-MS/MS. Tambm sero
82

realizados ensaios ecotoxicolgicos a fim de averiguar a toxicidade dos extratos

aquosos brutos e das substncias puras para microrganismos fitoplanctnicos e
microcrustceos. Mais estudos so necessrios, ainda, com relao composio
dos extratos da planta ao longo do ano e nos diferentes estgios de crescimento da
C. canandensis.

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