222

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCINCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA

VANESSA CRISTINA OLIVEIRA DE LIMA

EFEITO GRASTROPROTETOR DE ISOLADOS PROTEICOS DE

SEMENTES DE Erythrina velutina COM AO INIBITRIA
SOBRE ELASTASE DE NEUTRFILOS EM MODELO DE
LCERA EXPERIMENTAL

NATAL/RN

2014

VANESSA CRISTINA OLIVEIRA DE LIMA

EFEITO GRASTROPROTETOR DE ISOLADOS PROTEICOS DE

SEMENTES DE Erythrina velutina COM AO INIBITRIA
SOBRE ELASTASE DE NEUTRFILOS EM MODELO DE
LCERA EXPERIMENTAL

Dissertao de mestrado apresentada ao PPG do

departamento de bioqumica da universidade federal do rio
grande do norte, como requisito parcial obteno do ttulo
de mestre em bioqumica.
Orientadora: Profa. Dra. Adriana Ferreira Ucha
Co-orientadora: Profa. Dra. Ana Heloneida de Arajo Morais

NATAL/RN

2014

Aos meus amados pais, Deusimar e Irene, dedico.

Porque metade de mim amor, e a outra metade tambm
Oswaldo Montenegro

AGRADECIMENTOS
O cu de repente anuviou
E o vento agitou as ondas do mar
E o que o temporal levou
Foi tudo que deu pra guardar
S Deus sabe o quanto se labutou
Custou mas depois veio a bonana
E agora hora de agradecer
Pois quando tudo se perdeu
E a sorte desapareceu
Abaixo de Deus s ficou voc ...

Primeiramente agradeo a Deus. Sua presena se faz sentir pelo amor que me
rodeia. Eu no poderia ser mais iluminada! Obrigado meu Deus por no ter
encurtado meus caminhos, nem tirado o fardo dos meus ombros. Agradeo pelas
batalhas dirias e pelas vezes que as perdi. Pelos meus medos e pela minha fraqueza.
Pelas frustraes e pelas lgrimas que derramei. Pois nos momentos de angstia fiz
de Ti minha fortaleza, e pela tua fora, eu me fiz forte.
Agradeo a meu querido pai, Deusimar, meu maior exemplo de que um
homem determinado capaz de mudar sua prpria histria. Pai, voc meu modelo
de honestidade, de competncia, de responsabilidade, e muitas coisas mais que no
caberiam num simples agradecimento. Obrigada por fazer por mim tantas coisas, que
as vezes, nem estavam ao seu alcance. Mais que sua filha, sou sua f! Te amo!
A minha amada me, Irene. Minha guerreira! Espero sempre ter sua fora e
seu otimismo frente as dificuldades. Espero ser uma mulher corajosa como voc . Eu
espero ter a f na vida que voc tem. E seu eu no conseguir, eu quero voc do meu
lado pra me ajudar a levantar. Eu sou imensamente grata a Deus pelo milagre dirio
que sua presena em minha vida. Te amo!
Agradeo a meu irmo Vincius. Obrigada por no saber quase nada de
bioqumica, e ainda por cima saber fazer rir como ningum. muito bom chegar em
casa e desopilar rindo das suas besteiras. Agradeo a Gabi, minha cunhada, que j
considero parte da minha famlia, pelo apoio, e por suas risadas impagveis.
Ao meu namorado Wagner. To pouco tempo em minha vida e j se tornou to
especial. Obrigada pela fora, por estar sempre disposto a me ajudar, por me

incentivar tanto, por ser o cara especial que voc . Espero que esse seja s o comeo
de uma longa e bela jornada. Amo voc.
Agradeo a minha Orientadora, Ana Heloneida, por ter acreditado em mim.
Obrigada por me fazer sonhar com coisas grandes, e hoje me despertar pra um futuro
que pouco a pouco vai se concretizando. Hoje devo a voc muito do que j constru.
Poucos professores atentam para o significado que possuem na vida de seus alunos.
Eu que nunca pensei em chegar aqui, j quero ir mais longe. Obrigada professora, por
ter mudado minha histria.
Agradeo a Professora Adriana, pela acolhida. Obrigado por ter me recebido
to gentilmente e por ter feito tanto por mim. Pelos ensinamentos no s de bancada,
mas ensinamentos de vida. Eu espero um dia ser uma professora to boa quanto voc
.
...Quando tudo parece que estar perdido
nessa hora que voc v
Quem parceiro, quem bom amigo
Quem t contigo quem de correr
A sua mo me tirou do abismo
O seu ax evitou o meu fim
Me ensinou o que companheirismo
E tambm a gostar de quem gosta de mim...

Agradeo as minhas queridas amigas! Da universidade para vida: Raphaela,

Juliana, Pammela, Fernanda, Sarine, Anny e Theresa. Minhas piris, todos os
momentos vividos com vocs foram e so muito especiais. Amo vocs! Obrigada pelo
apoio e incentivo de sempre! Fico muito feliz em compartilhar com vocs mais essa
vitria, e estar presente nas vitrias de vocs.
A Bel e a Karol, pela amizade, pela maravilhosa companhia, pelas muitas
risadas juntas e pelas lamentaes tambm. Passamos pelo estresse das disciplinas, a
angstia de ter que tirar sempre A para no perder a bolsa, e o perrengue que ser
ps-graduando. Meninas espero em um futuro no muito distante, apenas
comemorarmos! Aos meus colegas de mestrado, Moacir, Ingrid, Mrcia, Gabriel,
Keith, Luiza, pelo aprendizado, pelo crescimento no s intelectual, aprendi muito
mais com cada um de vocs

A Richele, por ter me ensinado muito do que eu sei hoje, ter sido to paciente e
sempre disposta a ajudar. Sua colaborao nesse trabalho foi essencial. Obrigada
amiga e sucesso! A Norberto, pela colaborao e sugestes.
A Tici (Beb!!!), pela companhia, pelas conversas, pelos almoos juntas. Espero que
seus sonhos se concretizem, voc merece! A nego (Anderson) por ser to prestativo e
paciente e a Jonalson, sempre disposto a ajudar. Sem vocs dois o Laboratrio jamais
seria o mesmo. A Paulinha, Antnio, Luciana, Russi, Serquiz, Patrcia, pela
convivncia, pelas conversas sem futuro, pelas boas risadas, vocs com certeza
fizeram mais leve meu dia a dia. As meninas do laboratrio: Iana, Iane, Ana Glria,
Espanhola (Guiulliana) e Isabela, obrigada pela companhia.
...Na hora que a gente menos espera
No fim do tnel aparece uma luz
A luz de uma amizade sincera
Para ajudar carregar nossa cruz
Foi Deus quem ps voc no meu caminho
Na hora certa pra me socorrer
Eu no teria chegado sozinho
A lugar nenhum se no fosse voc...

A professora Christina pela imensa colaborao e pelo apoio e todo o pessoal do

laboratrio de prticas histolgicas. A Ibson, pela ajuda imprescindvel nesse
trabalho. Sou muito grata pela colaborao. A Izael, sempre muito esforado e
prestativo, obrigada pela fora e pela disposio. Agradeo tambm a Alexandre e a
equipe do Biotrio da UNP, por gentilmente terem cedido o espao e as ferramentas
para o nosso trabalho, obrigada pela ajuda, sou muito grata.
Aos professores Elizeu, Bruna e Sandra pelo cuidado com que olharam meu trabalho
e pela valiosa contribuio que fizeram. Agradeo as professoras Aurigena Antunes e
Liziane Lima por se disponibilizarem a acrescentar ainda mais ao trabalho. Meu
muito obrigada. A todos os funcionrios e professores do departamento de
Bioqumica da UFRN. Ao programa de Ps-Graduao em Bioqumica. Ao CNPq e a
Capes pelo auxlio financeiro.
...Quando o vento parou e a gua baixou
Eu tive a certeza do seu amor
Zeca Pagodinho

Cada um de ns compe a sua histria

Cada ser em si
Carrega o dom de ser capaz
De ser feliz
Almir Sater

RESUMO

A lcera gstrica uma patologia inflamatria na qual ocorre um desequilbrio entre

os fatores protetores e agressores da mucosa, nos quais a elastase de neutrfilo
humano (ENH) est inserida e cuja hiperatividade corrobora no processo
inflamatrio. Os inibidores de tripsina e quimotripsina da espcie Erythrina velutina j
foram anteriormente isolados, e tiveram sua ao anti-inflamatria atestada. Logo,
esse estudo tem por objetivo avaliar o efeito gastroprotetor por ao inibitria sobre
ENH de isolados proteicos com atividades antitrptica e antiquimotrptica de
sementes de E. velutina em modelo experimental de lcera gstrica. Para tal, os
isolados proteicos foram obtidos por extrao, saturao com sulfato de amnio e
cromatografia em coluna de afinidade com matriz sepharose, derivatizada com as
respectivas enzimas imobilizadas inibidas por cada isolado. Aps atestada as
atividades antitrptica e antiquimotrptica dos isolados, estes foram denominados
IPAT e IPAQ respectivamente. Foi determinado para IPAT a IC50, a Ki para ENH e a
estabilidade em diferentes pH e temperaturas. Para avaliar o feito gastroprotetor dos
isolados proteicos, foram utilizados seis grupos de animais (ratas wistar; 8 semanas;
180-220g; n = 6): dois grupos receberam IPAT (0,2 e 0,4 mg/kg), um terceiro grupo
recebeu IPAQ (0,035 mg/kg); como controle negativo, um quarto grupo recebeu o
Cloridrato de Ranitidina (50 mg/kg) como controle positivo; um quinto grupo recebeu
a soluo salina 0,9%; e um ltimo grupo, no sofreu interveno (Sham). Aps
cinco dias de administrao, foi induzida em cinco grupos de animais, a lcera
gstrica com etanol 99%. Como resultado, o IPAT apresentou alta afinidade e
atividade inibitria sobre ENH com valores de Ki de 0,4 g/mL e uma IC50 de 1,0
g/mL, alm de estabilidade e em uma ampla faixa de temperatura (37 a 100C) e
de pH (2 a 14). Ambos os isolados proteicos foram eficazes em proteger contra
danos mucosa gstrica, principalmente as leses hemorrgicas, apresentando
resultados estatisticamente significativos. Alm disso, no apresentaram efeitos
txicos aos animais. Dessa forma, IPAT e IPAQ mostraram-se eficientes
gastroprotetores, despontando como uma teraputica alternativa na preveno da
lcera gstrica.

Palavras-chave: Atividade neutroflica. Mucosa gstrica. lcera gstrica. Atividade

antitrptica. Atividade antiquimotrptica.

ABSTRACT

Gastric ulcer is an inflammatory condition that is a consequence of an imbalance

between aggressive and protective factors of the mucosa, in which the human
neutrophil elastase (HNE) is inserted and whose hyperactivity supports the
inflammatory process. The trypsin and chymotrypsin inhibitors from Erythrina velutina
species were previously isolated and had a certified anti-inflammatory action.
Therefore, this study aims to evaluate the gastroprotective effect by inhibitory action
on protein isolates from HNE, antitryptic and antichymotryptic activities of E. velutina
seeds in experimental gastric ulcer. To this end, the protein isolates were obtained by
extraction saturation with ammonium sulfate and chromatography on sepharose
affinity matrix column derivatized with the respective immobilized enzymes inhibited
by each isolate. After confirmed the isolated activities of antitryptic and
antichymotryptic, these PIAT and PIAQ were named respectively. PIAT was
determined for IC50, the Ki for HNE and stability at different pH and temperatures. To
assess the gastroprotective made of protein isolates, six groups of animals (male
Wistar, 8 weeks, 180-220g, n = 6) were used: two groups received PIAT (0.2 and 0.4
mg / kg), a third group received PIAQ (0.035 mg / kg); as negative control, a fourth
group received ranitidine hydrochloride (50 mg / kg) as a positive control; a fifth
group received 0.9% saline; and a final group suffered no intervention (Sham). After
five days of administration, gastric ulcer with 99% ethanol was induced in five groups
of animals. As a result, the PIAT showed high affinity and inhibitory activity of HNE
with Ki values of 0.4 mg / ml and an IC50 of 1.0 mg / mL, in addition to stability and a
wide temperature range (37-100 C) and pH (2 to 14). Both protein isolates were
effective in protecting against damage to the gastric mucosa, mainly hemorrhagic
lesions, showing statistically significant results. Besides, the animals did not show
any toxic effects. Thus, PIAT and PIAQ were effective gastroprotectors, emerging as
an alternative therapy in the prevention of gastric ulcer.

Keywords: Neutrophil activity. Gastric mucosa. Gastric ulcer. Antitryptic activity.

Antichymotryptic activity.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Representao da mucosa gstrica e seus respectivos componentes

celulares.....................................................................................................................20

FIGURA 2. Esquema da produo da secreo cida nas clulas parietais.............21

FIGURA 3. Esquema do sistema de proteo antioxidante.......................................29

FIGURA 4. Erytrina velutina. A) rvore. B) Flores. C) Sementes..............................40

FIGURA 5. Erythrina velutina. A) Sementes. B) Cotildones. C) Farinha..................46

FIGURA 6. Esquema de extrao em tampo e fracionamento com sulfato de

amnio em trs percentuais de saturao (030%, 3060%, 6090%) das sementes
de E. velutina..............................................................................................................49

FIGURA 7. Desenho experimental do modelo de ulcerao gstrica........................56

FIGURA 8. Percentual (%) de Inibio da atividade da tripsina pelo extrato bruto e

fraes proteicas F1, F2, e F3 (saturao com sulfato de amnio em 0 30%, 30
60%, 60 90%, respectivamente) de sementes de E. velutina.................................59
FIGURA 9. A) Perfil cromatogrfico da F2 (saturao com 30 60% de sulfato de
amnio) de sementes de Erythrina veluntina em cromatografia de afinidade TripsinaSepharose CNBr 4B. B) Eletroforese em gel de poliacrilamida a 12%......................60

FIGURA 10. A) Estabilidade de IPAT extrado de sementes de Erythrina velutina em

diferentes condies de pH e B) temperatura............................................................61

FIGURA 11. Determinao do IC50 e do Ki isolado proteico com atividade antitrptica

obtido de sementes de Erythrina velutina para HNE..................................................62

FIGURA 12. Percentual (%) de Inibio da atividade da quimotripsina pelo extrato

bruto e fraes proteicas F1, F2, e F3 (saturao com sulfato de amnio em 0
30%, 30 60%, 60 90%, respectivamente) de sementes de E. velutina................63
FIGURA 13. A) Perfil da F2 (saturao com 30 60% de sulfato de amnio) de
sementes de Erythrina velutina em cromatografia de afinidade QuimotripsinaSepharose

CNBr

4B.

B)

Eletroforese

em

gel

de

poliacrilamida

12%............................................................................................................................64

FIGURA 14. Grfico da plotagem do ndice de Leso Ulcerativa (ILU) dos grupos
IPAT 0,2 e 0,4 mg/kg e IPAQ 0,035 mg/kg em relao ao controle positivo (soluo
salina 0,9%) e ao controle negativo (Cloridrato de Ranitidina) .................................66

FIGURA15. Estmagos dos animais que receberam os isolados proteicos obtidos de

sementes de E. velutina, dissecados e abertos pela curvatura maior e lavados com
soluo salina 0,9%, representando cada grupo do experimento (n= 6) ..................67

FIGURA 16. Cortes histolgicos dos estmagos dos animais aos quais administrouse os isolados proteicos obtidos de sementes de E. velutina, dissecados e abertos
pela curvatura maior e lavados com soluo salina 0,9%, representando cada um
grupo do experimento (n= 6), corados com HE em aumento de 10 x........................69

FIGURA 17. Cortes histolgicos dos fgados e pncreas dos animais que receberam
IPAT (Isolado Proteico com Atividade Antitrptica) obtidos de sementes de E.
velutina, corados com HE, em aumento de 10 x........................................................70

LISTA DE TABELAS

TABELA 1. Famlia de inibidores de proteinases de plantas.....................................39

TABELA 2. Escores e parmetros de anlise macroscpica do dano epitelial para
modelo experimental de lcera gstrica.....................................................................57

LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS

AINE Anti-inflamatrio No Esteroide

AMPc Adenosina 3,5 Monofosfato Cclico
BApNa N-Benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride
BSA Albumina Srica Bovina
CEUA Comit de tica em Uso animal
COX Clicooxigenase
CRF Corticotrofina
DMSO Dimetilsufxido
DUP Doena da lcera Pptica
EB Extrato Bruto
EGF-R Receptor do Fator de Cescimento
ENH Elastase de Neutrfilo Humano
EP1-R Receptor da Prostaglandina 1
ERO Espcies Reativas de Oxignio
ETI Inibidor de Tripsina de Erythrina variegata
EvCI Inibidor de Quimotripsina de Erythrina velutina
EvTI Inibidor de Tripsina de Erythrima velutina
GPx Glutationa Peroxidase
GR Glutationa Redutade
GSH Glutationa Reduzida
GSSG Glutationa Oxidada
HE Hematoxilina/Eosina
HPLC Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
IBP Inibidor da Bomba de Prtons
ICMBio/MMa Instituto Chico Mendes de Conservao da Biodiversidade
IGF-1 Fator de Crescimento Semelhante a Insulina
IPAQ Isolado Proteico com Atividade Antiquimotrptica
IPAT Isolado Proteico com Atividade Antitrptica
MPO Mieloperoxidase
NADP Nicotinamida Adenina Dinucleotdeo Fosfato

NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleotdo Fosfato Reduzida

NC- IUBMB Enzyme Nomenclature of the Committee of the International Union of
Biochemistry and Molecular Biology
NO xido Ntrico
NOS xido Ntrico Sintase
NOSe xido Ntrico Sintase endotelial
NOSi xido Ntrico Sintase induzvel
NOSn xido Ntrico Sintase neuronal
PAF Fator Ativado de Plaquetas
PG Prostaglandina
SOD Superxido Dismutase
TFF Trefoil Factor Family

SUMRIO

1. INTRODUO ................................................................................................... 19
1.1

O ESTMAGO E A MUCOSA GSTRICA ................................................. 19

1.2 FATORES DE PROTEO ......................................................................... 22

1.2.1 Camada de muco e bicarbonato ............................................................ 22
1.2.2 Fatores Epiteliais ................................................................................... 23
1.2.3 Fatores Sub-endoteliais ......................................................................... 25
1.2.4 Sistema Antioxidante ............................................................................. 27
1.3 LCERA GSTRICA................................................................................... 29
1.3.1 Conceito e etiologia ............................................................................... 29
1.3.2 Sintomatologia e Tratamento ................................................................. 32
1.4

PROTEASES ............................................................................................... 35

1.5

INIBIDORES DE PROTEASES ................................................................... 37

1.6

Erythrina velutina ....................................................................................... 39

JUSTIFICATIVA........................................................................................................ 43
2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 45
2.1

OBJETIVO GERAL...................................................................................... 45

2.2

OBJETIVOS ESPECFICOS ........................................................................ 45

3. MATERIAL E MTODOS ................................................................................... 46

3.1 MATERIAL ................................................................................................... 46
3.1.1 Sementes .............................................................................................. 46
3.1.2 Animais .................................................................................................. 46
3.1.3 Reagentes ............................................................................................. 47
3.1.4 Equipamentos ........................................................................................ 48
3.2.1 Obteno do extrato bruto de E. Velutina .............................................. 48
3.2.2 Fracionamento do extrato bruto proteico de sementes de E. velutina por
precipitao com sulfato de amnio ................................................................... 49
3.2.3 Quantificao de protenas .................................................................... 50
3.2.4 Preparo das solues usadas como substrato ...................................... 50
3.2.5 Atividade antiquimotrptica ..................................................................... 50
3.2.6 Atividade antitrptica .............................................................................. 51
3.2.7 Atividade antielastsica neutroflica ....................................................... 51
3.2.8 Cromatografia de Afinidade em Tripsina-Sepharose CNBr 4B .............. 51
3.2.9 Cromatografia de Afinidade em Quimotripsina-Sepharose CNBr 4B..... 52

3.2.10 Avaliao do grau de pureza e estimativa da massa molecular dos

isolados proteicos por eletroforese em Gel de Poliacrilamida Descontnuo e
Desnaturante (SDS-PAGE) ................................................................................ 53
3.2.11 Estabilidade em variao de pH ............................................................ 54
3.2.12 Estabilidade trmica .............................................................................. 54
3.2.13 Determinao da IC50 para ENH de IPAT.............................................. 54
3.2.14 Avaliao do efeito gastroprotetor de IPAT e IPAQ ............................... 55
3.2.15 Anlise Estatstica ................................................................................. 58
4. RESULTADOS ................................................................................................... 59
4.1 Determinao da atividade inibitria sobre tripsina das fraes
proteicas de sementes de Erythrina velutina .................................................... 59
4.2 Isolamento proteico em cromatografia de afinidade de TripsinaSepharose CNBr 4B ............................................................................................. 60
4.3

Estabilidade de IPAT em diferentes pH e temperatura ........................... 61

4.4 Determinao da IC50, da Ki e do mecanismo de inibio do IPAT para

ENH 61
4.5 Determinao da atividade inibitria sobre quimotripsina das fraes
proteicas de sementes de Erythrina velutina .................................................... 63
4.6 Isolamento proteico em cromatografia de afinidade de QuimotripsinaSepharose CNBr 4B ............................................................................................. 63
4.7 Avaliao do efeito gastroprotetor de IPAT e IPAQ em modelo
experimental de lcera induzida por etanol ...................................................... 64
4.7.1 Avaliao Macroscpica ........................................................................ 64
4.7.2 Avaliao Histomorfolgica ................................................................... 68
4.7.3 Anlise Toxicolgica .............................................................................. 70
5. DISCUSSO ...................................................................................................... 71
6. CONCLUSO ..................................................................................................... 77
REFERNCIAS ......................................................................................................... 78

19

1. INTRODUO
1.1 O ESTMAGO E A MUCOSA GSTRICA
O estmago a regio mais dilatada do tubo digestivo, responsvel pela
formao e processamento do alimento ingerido em um fluido denso e cido
conhecido como quimo. Este rgo liquefaz os alimentos, continuando sua digesto
por meio da produo de cido clordrico e das enzimas pepsina, renina e lipase
gstrica, e da produo de hormnios parcrinos. Anatomicamente, possui uma
curvatura menor, cncava, e uma maior, convexa, e dividido em quatro regies:
crdia, fundo, corpo e antropilrico (regio pilrica) (GARTNER; HIATT, 2007).
Na mucosa gstrica, a diversidade de funes das clulas que compem o
tecido gstrico acaba por manter esse epitlio em um ambiente luminal hostil, com
condies extremas de acidez e presena de proteases agressivas, capazes de
digerir o prprio tecido que as gerou. Somando-se a tudo isso a contnua exposio
a patgenos externos possivelmente veiculados por alimentos, alimentos ingeridos a
altas temperaturas ou alta osmolaridade, lcool, dentre outros. Entretanto, apesar da
exposio contnua a estes fatores prejudiciais, sob condies normais, uma srie
de mecanismos de defesa evita danos locais e mantem a integridade estrutural e
funcional

dessa

mucosa

(NAYEB-HASHEMI;

KAUNITZ,

2009;

TULASSAY;

HERSZNYI, 2010).
A mucosa gstrica constituda por trs componentes usuais: o epitlio que
reveste o lmen, o tecido conjuntivo subjacente chamado de lmina prpria e a
camada muscular lisa. O epitlio do corpo e do fundo (mucosa oxntica ou glandular)
possui vrios tipos celulares: clulas parietais ou oxnticas (presentes no fundo das
glndulas oxnticas), as clulas principais ou zimognicas, clulas mucosas
superficiais e as clulas enteroendcrinas secretoras de hormnios. J a mucosa
glandular possui clulas mucosas na regio do colo das glndulas gstricas, alm de
clulas estaminais, que atuam na regenerao do epitlio superficial (Figura 1)
(GARTNER; HIATT, 2007; GYIRES; NMETH; ZDORI, 2013).

20

Figura 1: Representao da mucosa gstrica e seus respectivos componentes celulares. Fonte:

Traduzido de http://higheredbcs.wiley.com/

As glndulas gstricas produzem aproximadamente 2 a 3 litros de suco

gstrico por dia, o qual formado por gua, derivada do fluido extracelular do tecido
conjuntivo e liberada pelas clulas parietais, cido clordrico (HCl) e fator intrnseco
produzidos pelas clulas parietais, as enzimas pepsina, renina e lipase gstrica,
produzidas pelas clulas principais e o muco solvel produzido pelas clulas
mucosas do colo. Uma pequena absoro dos produtos alimentares ocorre no
estmago, embora algumas substncias como lcool, possam ser absorvidas
diretamente pela mucosa gstrica (GUYTON; HALL, 2009; MILLS; SHIVDASANI,
2011).
A secreo de HCl no estmago tem importante papel na funcionalidade do
rgo, embora envolvida na patognese da maioria das doenas de acometimento
gstrico. Tambm, est envolvida com a desnaturao proteica, a absoro de ferro,
clcio e cobalamina e ainda atua como agente microbicida. O HCl ativa ainda a
proenzima pepsinognio, transformando-a na pepsina proteoliticamente ativa,
gerando as condies de baixo pH necessrias sua atividade. A liberao de HCl
pode se dar por fatores psicolgicos, sensoriais ou pela presena de alimento no

21

trato gastrointestinal, alm de molculas indutoras como a histamina, a acetilcolina e

o hormnio gastrina (LAINE; TAKEUCHI; TARNAWISKY, 2008).
Quando as molculas indutoras se ligam aos receptores na membrana da
superfcie basal das clulas parietais, ocorre a sinalizao para liberao de HCl
para o canalculo celular, que por estimulao, se abre na membrana apical da
clula, a qual tambm possui um sistema tbulo-vesicular rico em bombas de
prtons (H+/K+-ATPase) secretoras de hidrognio (H+) (Figura 2). A atividade da
bomba protmica regulada por protenas quinases, cuja atividade depende das
concentraes intracelulares de adenosina 3,5 monofosfato cclico (AMPc) e
diacilglicerol. Uma vez ativada a clula, o sistema tbulo-vesicular funde-se a
membrana projetando as microvilosidades nos canalculos, aumentando o contato
dessa poro da membrana com o lmen gstrico (GANONG, 2006).

Figura

2:

produo

da

Esquema
secreo

cida

nas

clulas

parietais.

Fonte:

Traduzido

da
de

http://z7.invisionfree.com/Farmacoterapia_USP/index.php?showtopic=17

Dessa forma, as molculas de H+/K+-ATPase ficam expostas ao potssio (K+)

extracelular e passam a trocar H+ por K+. O on H+ proveniente da dissociao do
cido carbnico (H2CO3), formado a partir da hidratao do gs carbnico (CO2), pela
ao da enzima anidrase carbnica. O HCO3- assim formado deixa a clula parietal

22

atravs de um antitransportador presente na membrana basolateral que troca o

bicarbonato por cloreto (Cl-). Por ser o nion mais abundante no lquido extracelular,
o Cl- difunde-se para o lmen a favor do seu gradiente de concentrao (GUYTON;
HALL, 2009).

1.2 FATORES DE PROTEO

1.2.1 Camada de muco e bicarbonato
A superfcie epitelial recoberta por gel de muco, bicarbonato (HCO3-) e
fosfolipdios surfactantes, que juntos constituem a primeira linha de defesa da
mucosa (ALLEN; FLEMSTRM, 2005). O muco gstrico consiste de um gel viscoso,
elstico, aderente e transparente, secretado pela poro apical das clulas epiteliais
da superfcie da mucosa, formado por aproximadamente 95% de gua e 5% de
mucina, uma glicoprotena rica em resduos de serina, treonina e tirosina, cuja
agregao essencial caracterstica de gel da estrutura. Sua secreo
estimulada pelos hormnios gastrina, secretina e agentes colinrgicos (TULASSAY;
HERSZNYI, 2010).
Existem quatro tipos de mucinas gelificantes (MUC2, MUC5AC, MUC5B, e
MUC6) cujas estruturas j foram elucidadas. No estmago, MUC5AC expressa na
superfcie epitelial das clulas da crdia, do fundo e do antro. J MUC6 secretada
na poro mdia das clulas glandulares do fundo e do antro. MUC5AC e MUC6 se
organizam em estratos alternados na formao da camada de muco em humanos. O
gel mucoso secretado juntamente com peptdeos de baixo peso molecular
conhecido como TFF (Trefoil Factor Family). TFF so partes integrantes das
vesculas secretoras de muco e desempenham papel na montagem intracelular das
molculas de mucina, estabilizando a rede do gel, alm de aumentar sua
viscosidade (THIM; MADSEN; POULSEN, 2002; ZAK; SHAH; BLIN, 2009).
O HCO3- secretado pelas clulas epiteliais e sua funo consiste em
neutralizar os ons H+ que se difundem pela camada de muco aderente, de modo a
criar um microambiente com pH estvel prximo a neutralidade na interface entre o
muco e a superfcie da mucosa. A produo de HCO3- perfaz apenas 10% do total
de HCl produzido. Apesar da baixa produo de HCO3- em relao secreo cida,
a viscosidade da barreira de muco retm o HCO3-, evitando que o mesmo se difunda

23

na luz estomacal, minimizando assim as perdas. A barreira mucosa tambm retm a

pepsina liberada no espao luminal, impedindo que a enzima alcance a mucosa e
cause digesto do epitlio (TULASSAY; HERSZNYI, 2010).
Estudos tem mostrado que o cotransporte Na+/HCO3- atravs da membrana
basolateral auxilia na captao de bicarbonato. Estudos utilizando a mucosa gstrica
de ratos e coelhos demonstraram a expresso de trocadores aninicos de Cl-/HCO3nas membranas apicais de clulas epiteliais da superfcie gstrica (TAKEUCHI et al.
1997; ROSSMANN et al. 1999). No estmago, prostaglandinas estimulam a
secreo de HCO3- por meio dos receptores EP1 (prostaglandin E receptor 1). A
secreo cida, o fator liberador de corticotropina (CRF), a melatonina, a
uroguanilina e orexina tambm estimulam a secreo de bicarbonato (ALLEN;
FLEMSTRM, 2005).
A eficcia das propriedades protetoras da barreira de muco no depende
apenas da estrutura do gel, mas tambm da quantidade ou espessura da camada
que cobre a superfcie mucosa. A espessura da camada de muco por sua vez
resultante do balano entre sua produo e a eroso mecnica causada pelo
processo digestivo e qumico, devido ao proteoltica, principalmente em relao
pepsina luminal. Porm, apesar da presena de fatores agressores ser uma
constante, a camada mucosa mantm uma aderncia fisicamente nica, no
sofrendo disperso, nem alterao das suas propriedades reolgicas (TULASSAY;
HERSZNYI, 2010).
A barreira de muco/bicarbonato a nica barreira pr-epitelial entre lmen e
epitlio. Quando este mecanismo de proteo se encontra sobrecarregado ou o
equilbrio entre fatores protetores e agressores se rompe, como nas doenas, a
prxima srie de mecanismos de proteo entra em jogo, incluindo a neutralizao
intracelular do cido, a rpida reparao epitelial e a manuteno e distribuio do
fluxo sanguneo da mucosa (LAINE; TAKEUCHI; TARNAWISKY, 2008).

1.2.2 Fatores Epiteliais

A linha de defesa subsequente barreira de muco a camada epitelial,
formada por clulas que produzem prostaglandinas (PG), protenas de choque
trmico, protenas da famlia Trefoil Factor Family (TFF), e catelicidinas. Devido
presena de fosfolipdios de superfcie, estas clulas apresentam carter

24

hidrofbico, repelindo agentes agressores solveis em gua e em cido (LAINE;

TAKEUCHI; TARNAWISKY, 2008). Um estudo demonstrou que a membrana apical
de uma cultura de clulas principais apresentou resistncia em pH fortemente cido
(pH 2,0), enquanto as regies basais das mesmas clulas apresentaram
sensibilidade a condies de pH levemente cido (pH 5,5), ressaltando a
importncia da justaposio celular como mecanismo de proteo contra a difuso
de cido s camadas mais profundas (SANDERS et al., 1985).
Apesar de constituir uma barreira fsica que separa o ambiente luminal do
meio interno do organismo, a camada epitelial deve promover uma permeabilidade
seletiva, de modo a atender a funo fisiolgica do rgo (absoro de nutrientes e
secrees gstricas, por exemplo) e ao mesmo tempo impedir a penetrao de
microrganismos e outros patgenos externos porventura contidos em alimentos. Os
elementos cruciais que garantem essa funo so as junes intercelulares,
tornando as clulas epiteliais metabolicamente e eletricamente interligadas,
fornecendo vias para o transporte transepitelial de forma intercelular e paracelular
(MATYSIAK-BUDNIK; HEYMAN; MGRAUD, 2003).
Dentre os fatores de proteo produzidos pelas clulas epiteliais, pode-se
destacar as protenas de choque, geradas em resposta ao estresse trmico,
oxidativo e agentes citotxicos (OYAKA et al., 2006). Elas impedem desnaturao
por conduzir o correto dobramento proteico e a agregao de protenas, protegendo
as clulas contra leses. Catelicidinas e -Defensinas so peptdeos catinicos que
desempenham um papel no sistema de defesa inato na superfcie mucosa,
prevenindo a colonizao bacteriana. Foi demonstrado que esses elementos so
capazes de acelerar a cicatrizao de lceras (TANAKA et al., 2007). As TFF
secretadas no muco tambm asseguram a integridade da mucosa, regulando a
reepitelizao por migrao celular, inibindo apoptose e inflamao e protegendo as
clulas contra uma srie de substncias txicas (HERNANDZ et al., 2009).
A mucosa gstrica tambm produz as PG PGE2 e PGI2, as quais so
essenciais para manuteno da integridade da mesma, protegendo contra agentes
necrticos e ulcerognicos. Atuando em receptores E2 ligados protena G, essas
prostaglandinas inibem a secreo cida, estimulam a secreo de muco, HCO3- e
fosfolipdios, alm de aumentar o fluxo sanguneo e estimular a regenerao
epitelial. PG tambm inibem a ativao de mastcitos e leuccitos e a adeso de

25

plaquetas

ao

endotlio

vascular

(ATAY;

TARNAWSKI;

DUBOIS,

2000;

BRZOZOWSKY et al., 2005).

A manuteno da integridade epitelial tambm requer um equilbrio preciso
entre proliferao e morte celular. Assim, o epitlio continuamente renovado por
um processo de proliferao celular altamente coordenado e controlado, que permite
a substituio da superfcie danificada ou envelhecida por clulas estaminais. As
clulas da mucosa do estmago apresentam altas taxas de rotatividade e morrem
em poucos dias aps a sua formao. A substituio completa do epitlio estomacal
leva entre trs e sete dias, enquanto a substituio de clulas glandulares pode levar
meses (MURPHY, 1998).
A proliferao de clulas estaminais controlada pelo receptor do fator de
crescimento (EGF-R), derivado de saliva, clulas esofgicas e glndulas duodenais.
Os principais fatores de crescimento que ativam esse receptor so o fator de
crescimento transformante (TGF-) e o fator de crescimento semelhante insulina
1 (IGF-1). A ativao de EGF-R desencadeia a cascata de fosforilao iniciada pela
protena cinase ativada por mitgeno, iniciando a ao trfica na mucosa. Alm de
estimularem a proliferao de clulas epiteliais aps um ferimento, tambm podem
atuar estimulando a produo de muco e controlando a secreo cida (LAINE et al.,
2007).

1.2.3 Fatores Sub-endoteliais

A microcirculao gstrica formada por uma densa rede capilar que permeia
a mucosa gstrica desde a lmina prpria at as clulas epiteliais glandulares
(Figura 1). No nvel da camada muscular da mucosa, vasos capilares oriundos das
artrias submucosas avanam para dentro do tecido em direo as glndulas
gstricas, convergindo em vnulas coletoras na regio mais luminal da lmina
prpria subjacente s clulas mucosas da superfcie. As clulas endoteliais que
compem a microcirculao esto interligadas por intermdio de junes aderentes,
formando uma barreira endotelial que evita a difuso entre os espaos
intercelulares. Essas clulas tambm atuam permitindo a troca de solutos, oxignio,
CO2 e nutrientes, com especial atividade na produo de fatores de coagulao,
substncias

vasoativas,

hormnios,

fatores

(TARNAWSKI; AHLUWALIA; JONES, 2012)

de

crescimento

citocinas

26

A modulao da microcirculao da mucosa gstrica desempenha um papel

essencial na manuteno da sua integridade, especialmente para o fornecimento de
oxignio e nutrientes, e a remoo de substncias txicas. As artrias gstricas,
mais calibrosas, se ramificam em finos capilares, e penetram na lamina prpria, na
proximidade de clulas epiteliais glandulares gstricas. Na base das clulas
epiteliais da superfcie, os vasos capilares convergem em vnulas coletoras (LAINE
et al., 2007; TULASSAY; HERSZNYI, 2010).
Quando a mucosa gstrica exposta a uma substncia irritante ou quando
ocorre a difuso do HCl do espao luminal para o epitlio gstrico, verificado um
rpido e acentuado aumento do fluxo sanguneo na mucosa. Este aumento permite
a remoo e /ou diluio do cido difundido ou dos agentes txicos e a redistribuio
sangunea, tamponando o tecido. O HCO3- produzido pelas clulas parietais
transportado para corrente sangunea, alcalinizando o sangue, de modo a neutralizar
possveis ons H+ que se difundam. Este fenmeno conhecido como Mar
Alcalina. Esta resposta se mostra essencial para a defesa da mucosa porque, uma
vez abolida por meio de restrio mecnica do fluxo sanguneo, leva necrose
hemorrgica. Esta resposta por hiperemia mediada por nervos aferentes
sensoriais (HOLZER, 2006).
O aumento do fluxo de sangue da mucosa em resposta secreo cida
mediado, pelo menos em parte, pelo aumento do xido ntrico (NO), gerado pela
enzima xido ntrico sintase (NOS), a partir do aminocido L-Arginina. A NOS est
presente em trs isoformas, duas constitutivas, sendo uma neuronal (NOSn) e outra
endotelial (NOSe), mais importantes no trato gastrointestinal, e uma terceira
isoforma induzvel (NOSi) (BRZOZOWSKI et al., 2004). O NO tem potente efeito
vasodilatador, alm de regular a produo de muco, inibir a agregao de neutrfilos
e auxiliar no processo de cicatrizao da lcera. NO protege a mucosa gstrica
contra leses por etanol e endotelina-1, enquanto que a inibio de sua sntese
aumenta a leso gstrica por ativao de mastcitos e liberao de histamina e fator
ativador de plaquetas (PAF), levando ao aumento da produo de HCl (HOLZER,
2006).
A interao de neutrfilos com o endotlio vascular essencial para seu
recrutamento rea de injria. As consequncias celulares dessa interao incluem
a abertura das junes celulares endoteliais e aumento da permeabilidade,
facilitando a migrao neutroflica para o ponto de injria, o que, em condies

27

patolgicas ocorre de forma descontrolada, levando ao dano vascular agudo por

ao enzimtica da elastase e consequente hemorragia (FRIEDRICH et al., 2011).
Juntamente com a microcirculao, a inervao gstrica tem fundamental
importncia na manuteno da hemostasia. Vasos da mucosa e submucosa gstrica
so inervados por neurnios sensoriais aferentes primrios e nervos formando um
denso plexo na base da mucosa. As fibras nervosas desse plexo entram na lmina
prpria, acompanhando os vasos sanguneos, e terminam logo abaixo das clulas
epiteliais da superfcie. Essas terminaes nervosas monitoram o contedo cido
luminal e a difuso de cidos na mucosa, atravs de canais sensveis a cidos. A
ativao desses nervos afeta diretamente o tnus das arterolas da submucosa,
alterando o fluxo sanguneo na regio. A estimulao dos nervos sensoriais gstrico
leva liberao de neurotransmissores como o peptdeo relacionado ao gene da
calcitonina e a substncia P em nervos inseridos ou prximos a grandes vasos da
mucosa, desencadeado resposta de defesa (HOLZER, 2007).

1.2.4 Sistema Antioxidante

Devido s implicaes geradas pelas Espcies Reativas de Oxignio (ERO),
as clulas desenvolveram importantes sistemas antioxidantes de proteo,
envolvendo componentes enzimticos e no enzimticos. Em organismos aerbios,
ERO so gerados frequentemente em decorrncia do metabolismo do oxignio,
processos inflamatrios ou outros eventos no fisiolgicos. As ROS incluem todos
os radicais de oxignio como hidroxila (OH), superxido (O2-), alquila (L), alcoxila
(LO) e peroxila (LOO), as quais apesar de apresentarem efeito protetor at certo
ponto, quando produzidas de forma descontrolada causam danos s membranas,
alterando sua estabilidade e a permeabilidade e o fluxo de substncias. ERO
tambm podem causar dano ao material gentico celular (HELLOU; ROSS; MOON,
2012).
A catalase, um dos componentes enzimticos desse sistema, uma heme
protena heterotetramrica, que contm um grupo porfirina por subunidade. Catalisa
a reduo de perxido de hidrognio (H2O2) em gua e oxignio, na qual o NADP,
produzido da via das pentoses fosfato, se liga aos tetrmeros da enzima,
protegendo-a contra inativao causada pelo seu prprio substrato. Localizada nas
mitocndrias e nos peroxissomos, a catalase se faz presente em todos os

28

vertebrados, com atividade particularmente alta em eritrcitos e no fgado (NIKI,

2012).
As superxido dismutases (SOD) so um grupo de metaloenzimas que
tambm constituem o sistema de defesa antioxidante. So amplamente distribudas
nos organismos e desempenham papel de defesa contra danos celulares mediados
pelo radical superxido. So classificadas em grupos de acordo com o cofator
metlico (cobre e zinco; ferro, mangans; nquel). A dismutao do nion superxido
pela SOD resulta na produo de H2O2 (FUKAI; USHIO-FUKA, 2011).
Outro componente enzimtico de proteo antioxidante encontrado em muitos
tecidos de origem animal e a glutationa peroxidase (GPx). Esta enzima possui como
particularidade constitutiva a incorporao de um resduo de selenocistena no seu
stio ativo. Atua na remoo do perxido de hidrognio gerado pelas SOD no citosol
e na mitocndria e por remover perxidos orgnicos tendo a glutationa reduzida
como coenzima (LU; HOLMGREN, 2009).
O principal componente no-enzimtico do sistema antioxidante endgeno
contra o estresse oxidativo a glutationa reduzida (GSH, L--glutamil-Lcisteinilglicina), um tripeptdeo contendo cistena (KRETZSCHMAR, 1996). O ncleo
do resduo cistenilglicina da glutationa est envolvido na sua funo antioxidante,
mais especificamente como um redutor intracelular, utilizando o NADPH como
substrato. Desenvolve papel central como sequestrador de radicais livres e atua
como cofator enzimtico na reduo de perxidos pela GPx e na biotransformao e
eliminao de xenobiticos potencialmente lesivos s clulas.

Em ambas as

reaes enzimticas, ocorre a formao de glutationa oxidada (GSSG), que

reduzida novamente a GSH pela glutationa redutase (GR) (Figura 3) (KUMAR;
VASUDEVAN, 2007).

29

Figura 3: Esquema do sistema de proteo antioxidante. Fonte: PRADO (2013). CAT: Catalase; SOD:
Superxido Dismutase; GPx: Glutationa Peroxidade; GSH: Glutationa Reduzida; GSSG: Glutationa
Oxidada; GR: Glutationa Redutase.

1.3 LCERA GSTRICA

1.3.1 Conceito e etiologia
A lcera gstrica uma leso necrtica profunda, que penetra atravs da
mucosa, onde tanto os componentes do tecido epitelial quanto conectivo, incluindo
miofibroblastos subepiteliais, clulas do msculo liso, vasos e nervos so destrudos.
Devido s suas grandes semelhanas com lceras em outras partes do trato
digestivo, a lcera gstrica frequentemente referenciada com lceras esofgicas e
duodenais em conjunto, como a doena de lcera pptica (DUP). Embora no seja
to comum como as lceras duodenais, lceras gstricas so frequentemente mais
propensas a desenvolver malignidade (FREINSTEIN, 2010).
No estmago, as lceras localizam-se mais frequentemente no antro (60%) e
na juno do antro com o corpo (25%). Apesar de sua natureza robusta e
multifacetada, muitos fatores diretamente relacionados deficincia na defesa da
mucosa podem alterar a barreira epitelial e incentivar a formao da leso, dentre os
mais importantes esto: secreo cida, bactrias e seus produtos, antiinflamatrios no esteroides, lcool, espcies reativas de oxignio, bem como
diferentes compostos qumicos. Seus efeitos sobre a barreira gstrica representam
importantes mecanismos de patognese da lcera gstrica, gastrite crnica e outras
doenas gstricas (TULASSAY; HERSZNYI, 2010).
Durante dcadas a secreo gstrica foi consagrada como agente causador
da lcera, uma vez que o manejo teraputico baseado na sua reduo apresentava

30

efeitos satisfatrios, sendo intensamente estudados os mecanismos pelos quais o

cido clordrico produziria a lcera. Com o advento de novas teraputicas e a
descoberta da importncia de Helicobacter pylori na patognese, retirou-se o foco da
secreo como agente nico, embora a presena de hipersecreo de cidos
continua a ser uma condio necessria para a produo da lcera e uma variedade
de distrbios gastrointestinais comuns (GUSTAFSON; WELLING, 2010).
Apesar de facilitar os processos digestivos e absortivos, a secreo cida,
quando em nveis elevados, sobrecarrega o sistema de defesa da mucosa, levando
ao desenvolvimento, alm da lcera, de doenas como refluxo gastroesofgico e
esfago de Barrett. O provvel mecanismo da leso se d por acesso ao contedo
luminal por canais abertos na camada de muco criados pela relativa alta presso
hidrosttica

intraglandular

gerada

durante

hipersecreo

(JOHANSSON;

SYNNERSTAD; HOLM, 2001).

Outro importante agente etiolgico a bactria H. pylori, apresentando
prevalncias superiores a 90% em pases em desenvolvimento e constituindo um
importante problema de sade pblica. Este bacilo gram-negativo sobrevive mal no
lmen gstrico, porm multiplica-se eficientemente na mucosa gstrica e nas
proximidades, ou at mesmo em anexo a camada epitelial. Por meio da produo de
urease, a H. pylori consegue criar um microambiente neutro em meio acidez
gstrica. Os metablitos da produo de urease so extremamente txicos para o
epitlio

gstrico,

desencadeando

mecanismo

ulcerativo.

Dos

indivduos

acometidos, 10% a 15% desenvolvem lcera e 1% a 2%, um processo neoplsico

(HANDA; NAITO; YOSHIKAWA, 2010; ERNEST; GOLD, 2000).
A utilizao de medicamentos do tipo anti-inflamatrios no esteroides (AINE)
tambm um fator que predispe o processo ulcerognico. Os AINE esto entre os
medicamentos mais utilizados no mundo sendo que 90% das prescries so
destinadas a pessoas com mais de 65 anos devido ao aumento da incidncia de
doenas reumticas. O principal mecanismo por meio do qual os AINE provocam
lceras e complicaes gastrointestinais provavelmente por inibio da
ciclooxigenase (COX), uma enzima chave na biossntese de prostaglandinas (PG)
(LAINE et al., 2007).
H duas isoformas da COX, a COX1 e a COX2. A isoforma COX1 expressa
na maioria dos tecidos, produzindo as prostaglandinas que desempenham um papel
essencial na proteo do estmago por estimular a sntese e secreo de muco e

31

HCO3-, o aumento no fluxo de sangue da mucosa e a proliferao epitelial

(SULEYMAN; AKCAY; ALTINKAYNAK, 2002). A COX2 tem pouca ou nenhuma
expresso na maioria dos tecidos, mas rapidamente induzida em resposta a
estmulos inflamatrios. Por meio do mecanismo dos AINE, inibindo as COX de
forma no seletiva, cria-se um ambiente gstrico que mais suscetvel ao ataque
por fatores endgenos e exgenos (BIAS et al., 2004).
O lcool figura como importante fator etiolgico devido ao amplo consumo
mundial. Entre os vrios sistemas de rgos que medeiam os efeitos do lcool sobre
o corpo humano, o trato gastrointestinal desempenha um papel particularmente
importante. O lcool pode interagir diretamente com a mucosa gstrica, ou pode
atuar por meio de um mecanismo mais geral que afeta a liberao de hormnios e a
regulao das funes nervosas envolvidas na secreo de cido. A formao de
lcera por efeito do etanol uma resposta inflamatria, sendo a injria iniciada pela
mediao de fatores inflamatrios que induzem vasoconstrio, isquemia e morte
celular (DUFFIN; SHAW, ROSSI, 2008).
A administrao intragstrica de etanol em ratos produz leses na mucosa
gstrica que so comumente utilizadas no estudo da patognese da doena e
desenvolvimento de novos mtodos teraputicos. As leses so produzidas de
forma confivel e simples utilizando-se volumes variados de etanol concentrado.
Dependendo da quantidade administrada, 10 a 40% das regies glandulares do
estmago tornam-se cobertas de eroses hemorrgicas quando examinadas cerca
de uma a duas horas aps a induo (SZABO et al., 1985).
A atividade neutroflica outro fator comumente relacionado injria gstrica,
e est intimamente ligado a dano gerado pelo consumo de etanol. Os neutrfilos e
os fatores deles derivados desempenham um importante papel em diversas formas
de modelos de ulcerao gastrointestinal e inflamao. O dano epitelial mais
comumente relacionado atividade neutroflica a isquemia e o dano hemorrgico.
Fatores expressos pelos neutrfilos como integrinas reagem com molculas de
adeso endotelial desempenhando importante papel na infiltrao neutroflica
(KVIETYS et al., 1990, KUJBIDA et al., 2008).
A elastase de neutrfilo humano (ENH) presente nos grnulos primrios dos
leuccitos polimorfonucleares, constitui-se, em condies fisiolgicas, um importante
mecanismo de defesa contra microrganismos invasores. Devido importncia de
manter sua atividade equilibrada, o organismo dispe de protenas inibidoras da

32

elastase, como a 1-antitripsina, 2-macroglobulina e o inibidor de leucoprotease

secretria (SHAPIRO, 2002; SHAPIRO et al., 2003), que limitam a rea de ao da
enzima, devido sua ubiquidade diminuindo assim a exposio de tecidos
saudveis e protenas de vias biolgicas importantes degradao desnecessria.
Esse equilbrio inibidor-elastase rompido no processo inflamatrio, culminando em
danos teciduais severos (TRAVIS; SALVESEN, 1983; BODE et al., 1989).
O desenvolvimento de isqumia-reperfuso causada na mucosa por uma
injria

externa

com

consequente

ativao

neutroflica,

desempenha

papel

fundamental no dano epitelial. Os neutrfilos uma vez ativados liberam enzimas que
podem levar a alteraes na permeabilidade da mucosa. A mieloperoxidase (MPO)
est relacionada ao dano por sua atuao na gerao de ERO (TAKEUCHI et al.,
1998). Alm da MPO, a elastase tem potencial ao lesiva por catalisar a
degradao da elastina, importante protena envolvida na integridade da matriz
tecidual. A reduo da atividade anti-inflamatria dos neutrfilos por meio da
utilizao de inibidores externos vista como uma teraputica promissora na
preveno da lcera bem como outras doenas inflamatrias (ROCHA et al., 2011).

1.3.2 Sintomatologia e Tratamento

O sintoma predominante da lcera gstrica a dor epigstrica, a qual pode
ser acompanhada por outros sintomas disppticos como inchao, saciedade precoce
e nuseas. Entretanto, as lceras crnicas podem ser assintomticas; em particular,
esta ausncia de sintomas observada nas lceras induzidas por AINE, onde o
sangramento ou perfurao a primeira manifestao clnica da doena
(MALFERTHEINER et al., 2009).
Por muito tempo a lcera foi controlada de maneira cirrgica, o que resultava
em altas taxas de morbidade e mortalidade. A maioria das cirurgias realizada
atualmente de carter de urgncia, devido a hemorragias e perfuraes, e
procedendo-se a cirurgia de controle dos danos, no sendo realizada cirurgia
redutora de cido. Devido aos bons resultados do tratamento mdico, o tratamento
cirrgico da lcera no complicada tornou-se obsoleto. Hoje, com as teraputicas
disponveis, possvel tratar conservadoramente cerca de 90% dos casos (GOMES;
MARQUES; PINHEIRO, 2013).

33

A supresso farmacolgica eficaz da secreo de cido iniciou em meados da

dcada de 70, com a introduo dos antagonistas de receptores histaminrgicos H2.
A secreo gstrica de cido produzido pelas clulas parietais da mucosa do
estmago controlada pela histamina, gastrina, acetilcolina e prostaglandinas (E2 e
I2). A ligao da histamina, acetilcolina ou gastrina a seus receptores produz a
ativao de uma bomba de prtons H/K-ATPase, que secreta HCl para a luz do
estmago, enquanto a ligao das prostaglandinas aos seus receptores diminui a
produo de cido gstrico (ARAWAKA et al., 2012).
Os bloqueadores de receptor histaminrgico H2 agem como antagonistas
reversveis de receptores H2 situados no estmago, em vasos sanguneos e em
outros locais. Possuem a ao de inibir totalmente a secreo de cido clordrico
induzido

por

histamina

ou

gastrina.

Exemplos

de

frmacos

amplamente

comercializados so a ranitidina, a cimetidina e a famotidina. A ranitidina tem ao

mais prolongada do que a cimetidina, e cinco a dez vezes mais potente. A
famotidina trs a dez vezes mais potente do que a ranitidina, e tambm tem a ao
prolongada (CHUBINEH; BIRK, 2012). At a dcada de 90 foram os frmacos mais
prescritos no mundo, reduzindo as cirurgias em mais de 80% (JAIN et al., 2007).
Os antagonistas dos receptores H2 foram gradualmente substitudos por uma
classe de drogas inibidoras de cido mais potente, os inibidores da bomba de
prtons (IBP). Esses frmacos pertencentes classe dos benzimidazis foram
substitudos, sendo comercialmente conhecidos como omeprazol, lanzoprazol,
pantoprazol e esomeprazol. Os IBP so medicamentos que bloqueiam seletivamente
a bomba de prtons (H+, K+-ATPase) da clula parietal, suprimindo a secreo de
ons hidrognio para a luz do estmago (NAJM, 2011).
Em pH neutro, esses frmacos so quimicamente estveis, lipossolveis,
formando bases fracas e sem atividade inibidora. Ao atingir as clulas parietais
gstricas, se difundem para os canalculos secretores onde ficam retidos, tornandose protonados. O agente protonado se rearranja para formar um cido sulfnico e
uma sulfenamida. A sulfenamida interage de forma covalente com os grupamentos
sulfidrila em pontos crticos do domnio extracelular da bomba protmica da
superfcie da membrana (NAJM, 2011).
Um terceiro grupo de drogas direcionado para o reforo da barreira mucosa,
do qual se destaca o misoprostol, um anlogo de prostaglandina, nico do grupo
aprovado para comercializao, necessitando de altas dosagens para surtir efeito

34

biolgico (MALFERTHEINER et al., 2009). Os anlogos das prostaglandinas so

menos eficazes do que os antagonistas H2. Assim, tem sido recomendado somente
em pacientes que necessitam do uso de AINE prolongado em funo do risco de
desenvolverem lcera pptica, principalmente em idosos ou pacientes com
complicaes ulcerosas. Quando a H. pylori est presente, o tratamento enfoca a
sua erradicao com o uso dessas drogas combinadas com antibiticos (NAJM,
2011).
Entretanto, apesar da grande efetividade apresentada pelos antagonistas dos
receptores H2 e IBP, esses medicamentos podem apresentar alguns inconvenientes
quando utilizados por longos perodos devido intensa supresso do cido. Dentre
esses efeitos, podemos citar a osteoporose, riscos aumentados de infeces
entricas, metabolismo alterado de outros medicamentos, e desenvolvimento de
plipos gstricos que podem evoluir para cncer gstrico (CHUBINEH; BIRK, 2012;
ROHSS; HASSELGREN; HEDENSTROM, 2002).
Constipao, cefaleia e tonturas so efeitos colaterais advindos do uso de
antagonistas dos receptores H2. Em pacientes idosos o uso prolongado de
cimetidina pode provocar confuso e alucinaes devido ao no sistema nervoso
central. A cimetidina tambm pode causar efeitos endcrinos como ginecomastia e
galactorria. Cefaleia, diarreia e rash cutneo, prurido, vertigem, fadiga, obstipao,
e vmitos, flatulncia, artralgia, mialgia so efeitos relatados no uso de IBP.
Aumento do risco de infeces gastrointestinais pode ocorrer em decorrncia da
reduo da produo de cido. No Brasil, a venda de medicamentos base de
misoprostol est restrito e sujeito a controle criterioso devido ao seu uso clandestino
como agente abortivo (CHUBINEH; BIRK, 2012; FITTIN; WISEMAN, 1996; BALDI;
MALFERTHEINER, 2003).
Uma variedade de produtos botnicos tem sido relatada na literatura pela sua
atividade antiulcerognica, sendo esta constatao baseada principalmente na ao
farmacolgica em animais experimentais (GADEKAR et al., 2010). Existem vrios
produtos botnicos com potenciais aplicaes teraputicas, devido sua alta
eficcia e baixa toxicidade. Destes, destacam-se substncias extradas de plantas,
isoladas e atestados os seus efeitos biolgicos, muitas vezes comprovando o seu
emprego na medicina popular, como o exemplo do Plaunotol, um diterpeno acclico
extrado de uma planta chamada plau noi, muito utilizada como agente

35

gastroprotetor no Japo, com atividade antibactericida para H. pilory e capacidade

de inibir a liberao de ENH pelos neutrfilos (MURAKAMI et al., 1999).

1.4 PROTEASES
As proteases esto envolvidas em inmeros processos fisiolgicos, e o
desequilbrio de sua atividade pode causar perturbaes patolgicas importantes
como inflamao, acidente vascular cerebral, cncer e infeco parasitria. As
proteases so enzimas que hidrolisam as ligaes peptdicas de protenas e
apresentam

ampla

demonstrando

distribuio
importncia

entre
de

plantas,

sua

animais

presena

em

microrganismos,

organismos

vivos,

desempenhando papeis fisiolgicos importantes em diversos processos biolgicos.

Vrios e diferentes processos fisiolgicos em todas as formas de vida so
dependentes de proteases, como processamento e turnover de protenas
endgenas, digesto de protenas alimentares, regulao da formao e lise dos
cogulos, ativao de vias de apoptose, germinao das plantas, esporulao,
ativao hormonal, translocao atravs das membranas, fertilizao, controle de
resposta imune, diferenciao celular e crescimento (SANTOS et al., 2012).
Devido variedade em seu comportamento cataltico, proteases so difceis
de classificar seguindo as regras estabelecidas para o resto de enzimas e em vez
disso, trs so os critrios utilizados para a sua classificao. Um deles se baseia na
principal propriedade, estabelecido pela NC-IUBMB (Enzyme Nomenclature of the
Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology), que
classifica estas enzimas dentro do grupo 3 (hidrolases) e subgrupo 4 (hidrolases de
ligaes peptdicas). A subclasse 3.4 pode ser por sua vez, subdividida em endo ou
exopeptidases (aminoterminal ou carboxiterminal), dependendo da sua capacidade
de hidrolisar ligaes peptdicas internas ou localizadas nas extremidades da cadeia
(BARRETT, 1994).
O segundo critrio classifica as proteases de acordo com o seu stio cataltico,
dividindo as proteases em seis classes mecanicistas: serinoproteases (EC 3.4.21),
cisteinoproteases, anteriormente designadas como tioproteases (EC 3.4.22),
proteases asprticas, primeiramente conhecidas como proteases cidas; proteases
glutmicas (EC 3.4.23), metaloproteases (EC 3.4.24), e treoninoproteases (EC

36

3.4.25). Serinoproteases, treoninoproteases e cisteinoproteases so cataliticamente

muito diferentes das proteases asprticas e as metaloproteases em que o nuclefilo
presente no stio cataltico do primeiro grupo parte de um aminocido, enquanto
que nos dois ltimos, uma molcula de gua ativada (HARTLEY, 1960).
Diferentes tipos de proteases possuem uma proximidade evolutiva visualizada
por semelhanas estruturais. De acordo com a sequncia aminoacdica, as
proteases podem ser agrupadas em famlias ou cls. As proteases que
compartilhavam homologia entre si foram colocadas dentro de uma mesma famlia, e
as famlias as quais se acreditava ter um ancestral comum, apesar da divergncia
evolutiva, foram agrupadas dentro do mesmo cl. A clara evidncia entre cl e
famlia est contida na semelhana da estrutura tridimensional, a qual se relaciona
diretamente a disposio de resduos de aminocidos na cadeia polipeptdica
(RAWLINGS et al., 1993; BARRETT, 2001).
De acordo com a reao catalisada, as proteases esto divididas em dois
grupos: as exopeptidases, que clivam um ou poucos resduos de aminocidos da
extremidade N- ou C- terminal, e as endopeptidases, que atuam em ligaes
internas de cadeias polipeptdicas. Em relao nomenclatura, o termo
proteinases refere-se apenas s endopeptidases, enquanto que proteases e
peptidases incluem, alm das endopeptidases, as exopeptidases. A clivagem das
ligaes peptdicas no limitada transformao de protenas maduras em
aminocidos livres, como tambm relevante modificao e maturao proteica
(BARRETT, 2001).
As serinoproteases so um grupo diverso de enzimas que so caracterizadas
pela presena do aminocido serina no stio ativo, o qual formado por uma trade
cataltica representada pelos resduos de Serina, Histidina e Asparagina. Quase um
tero das proteases pode ser classificada como serinoproteases e esto presentes
em importantes processos fisiolgicos como digesto, proliferao e diferenciao
celular, inflamao, reabsoro ssea, coagulao sangunea e respostas imunes,
como fatores do complemento B, C e D (SIM; TSIFTSOGLOU, 2004).
O mecanismo bsico de ao de serinoproteases envolve a transferncia do
grupamento acil de um substrato para um grupo funcional da enzima. Os dois
passos bsicos de catlise realizados por este grupo de enzimas incluem, primeiro,
a formao de um ster entre o tomo de oxignio de serina e o grupamento acil do
substrato, o qual produz um intermedirio tetradrico e libera a parte amino do

37

substrato e, em seguida, o ataque da gua no intermedirio acil-enzima, que quebra

e libera o produto acdico, enquanto ocorre a regenerao da forma original da
enzima (ANTO; MALCATA, 2005).
Dentre os exemplos clssicos de serinoproteases, destacam-se a tripsina, a
quimotripsina e a elastase, que pertencem a uma superfamlia de protenas, que
parecem ter evoludo de um ancestral comum, por apresentarem semelhanas na
estrutura e mecanismo de reao e so responsveis para a digesto inicial de
protenas no intestino da maioria dos animais superiores (GARCIAOLMEDO et al.,
1987).
In

vivo,

as

serinoproteases

atuam

clivando

cadeias

polipeptdicas

essencialmente intactas em peptdeos curtos, que ento sofrem ao de

exopeptidases para gerar os aminocidos, os produtos finais de digesto de
protenas. As serinoproteases se distuinguem com base na sua especificidade:
tripsina cliva especificamente na poro C-terminal entre resduos que possuem
uma cadeia lateral bsica (Lys, Arg); quimotripsina mostra uma preferncia para a
clivagem C-terminal de resduos de aminocidos que possuem a cadeia lateral
hidrofbica (Phe, Tyr, Leu); e elastase que mostra uma preferncia pela clivagem na
poro C-terminal de resduos que possuem uma pequena cadeia lateral neutra
(Ala, Gly) (RYAN, 1990).

1.5 INIBIDORES DE PROTEASES

Qualquer composto que reduza a taxa de catlise de um substrato , em
princpio, um inibidor enzimtico. Protenas capazes de formar complexos nas
enzimas proteolticas inibindo a atividade das mesmas so denominadas inibidores
de proteases. Estes so amplamente distribudos entre plantas, animais e
microrganismos, podendo possuir massas moleculares que variam entre 10 e 90
kDa (NEURATH, 1989; RAO et al., 1998).
Os inibidores de proteases atuam na regulao da protelise, e so
importantes para proteger fludos ou tecidos de degradao por atividades
proteolticas indesejadas, principalmente os que esto sujeitos ao de proteases
externas, a exemplo do sangue, cinos pancreticos e tecidos de armazenamento
de plantas (NEURATH, 1990). As famlias de inibidores encontrados so especficas
para quatro classes mecanicistas de enzimas proteolticas: serina, cistena,

38

asprticas e metaloproteases. A expresso dos inibidores varia de acordo com o

estado fisiolgico do organismo. Em plantas, os nveis destes inibidores dependem
da fase de maturao, localizao do tecido, tempo de colheita e de
armazenamento, como tambm da variedade da planta, com a possvel coexistncia
de diferentes classes de inibidores, bem como uma variedade de isoformas num
nico tecido ou rgo (SANTOS et al., 2012).
Existem duas amplas classes de inibidores de enzima: Os reversveis, cuja
interao com a enzima estabilizada pela somao de ligaes fracas, e os
irreversveis, que se ligam a enzima de forma covalente, podendo at destruir o
grupamento funcional da mesma. Os inibidores que realizam interaes reversveis
so agrupados quanto ao tipo de interao, esta podendo ser competitiva, no
competitiva e mista. Inibidores competitivos competem com o substrato pelo stio
ativo da enzima por muitas vezes possuir estrutura similar ao substrato. Os
inibidores no competitivos ligam-se a um stio distinto do stio ativo do substrato, e
diferentemente dos inibidores competitivos, se ligam ao complexo enzima-substrato.
J nos inibidores mistos podem se ligar tanto a enzima livre como ao complexo
(NELSON; COX, 2011).
As diversas classes de inibidores foram subdivididas em vrias famlias
baseando-se em caractersticas tais como homologia entre os membros, relaes
topolgicas entre pontes dissulfeto e localizao do stio ativo. A classe de inibidores
mais bem caracterizada a das serinoproteases, amplamente distribuda no reino
vegetal, principalmente em plantas das famlias brassicaceae, curcubitaceae,
salicicaceae, glycinaceae, leguminosae, solanaceae, fabaceae. Estes inibidores
foram agrupados em oito subfamlias: BowmanBirk, Kunitz, Batata I, Batata II,
Abbora, Cereal, Taumatina e RagiA1. As mais bem caracterizadas famlias de
inibidores de serinoproteases so os inibidores do tipo Kunitz e Bowman-Birk
(Tabela 1) (HAQ; ATIF; KHAN, 2004; RAMOS et al., 2008).
Os inibidores de serinoproteases do tipo Kunitz possuem massa molecular de
18 a 22 kDa, com estrutura primria composta por cerca de 181 resduos de
aminocidos, um nico stio ativo que se liga a tripsina, uma ou duas cadeias
polipeptdicas e um baixo teor de cistina. Geralmente as pontes dissulfeto so
estabilizadas por quatro resduos de cistena, cuja ligao uma vez rompida,
acarreta perda da atividade biolgica de inibio. J os inibidores do tipo BowmanBirk apresentam baixa massa molecular, a qual varia entre 8 e 10 kDa, um alto teor

39

de cistina e dois stios ativos por molcula, cada um com uma afinidade por uma
faixa de serinoproteases como tripsina, quimotripsina, elastase e calicrena.
Diferente dos inibidores tipo Kunitz, que so codificados por um nico gene, a famlia
Bowman-Birk codificada por pelo menos trs genes para a sntese das suas
isoformas (HABIB; FAZILLI, 2007; BIRK, 1985).
TABELA 1. Famlia de inibidores de proteinases de plantas

Proteinases

Classes de inibidores

Famlias de inibidores
Bowman-Birk
Kunitz

Sernicas

Inibidores de proteinases
sernicas

Batata I
Batata II
Superfamlia de Cereais
Taumatina
RagiA1/milho

Cistenicas

Inibidores de proteinases
cistenicas

Fitocistatinas

Asprticas

Inibidores de proteinases
asprticas

Inibidores de proteinases
asprticas

Metalo-proteinases

Inibidores de metaloproteinases

Inibidores de carboxipeptidases
AeB

Fonte: RYAN, 1990

1.6 Erythrina velutina

A grande diversidade de plantas atualmente conhecidas e utilizadas pelo
homem resultado da histrica procura em seu ambiente natural de meios que
viessem suprir suas necessidades alimentcias, industriais, mdicas e at mesmo
ritualsticas. A partir do sculo XIX, com o avano na pesquisa de produtos naturais,
comeou-se a ter ideia do rico arsenal de compostos bioativos presentes na
natureza, cuja atividade biolgica era continuamente confirmada cientificamente
(MIGUEL; MIGUEL, 2004).

40

Dentre as plantas de interesse cientfico, o gnero Erythrina destaca-se pelo

grande potencial para prospeco de molculas com ampla gama de atividades
biolgicas. composto por plantas arbreas da famlia Fabaceae, subfamlia
Papillionoideae; Compreende cerca de 120 espcies tropicais em regies quentes,
temperadas e dividido em cinco subgneros e 26 sees. No Brasil, existem 12
espcies conhecidas, das quais oito esto localizadas no nordeste e em Minas
Gerais (LORENZI; MATOS, 2008). A espcie E. velutina, popularmente conhecida
como mulungu, suin, canivete ou corticeira, um arbusto pequeno, de caule
tortuoso e ores vermelho-alaranjadas (Figura 4) (EPAMIG, 1993).

Figura 4: Erytrina velutina. A) rvore. B) Flores. C) Sementes.

As vrias espcies de Erythrina tm sido amplamente exploradas em estudos

das mais diversificadas aplicaes biolgicas. Um estudo sobre a atividade do
extrato alcolico de E. velutina no sistema nervoso demonstrou a presena de efeito
ansioltico com doses agudas e crnicas do extrato em modelo animal para
ansiedade, utilizando o teste T-maze (RIBEIRO et al., 2006). Outro estudo realizado
com a administrao intraperitoneal de um extrato aquoso de E. velutina demonstrou
prolongamento da durao do sono induzido por pentobarbital de sdio em doses
mais elevadas e bloqueou a aquisio de memria em modelo de choque na pata
em doses mais baixas (DANTAS et al., 2004).
Essa atividade biolgica est atrelada presena de alcalides e flavonides,
particularmente isoflavonides nas sementes de E. velutina, corroborando assim o
uso na medicina popular da planta como tranquilizante natural (CHACHA; BOJASE-

41

MOLETA; MAJINDA, 2005). Os isoflavonides e flavonides tambm apresentam

atividades bactericidas e antifngicas, alm de inibir a agregao plaquetria. Aos
alcalides tambm so conferidos efeitos cardiovasculares e no tratamento da asma
(NKENGFACK et al., 2000; SHARMA et al., 2012).
No gnero Erythrina j foram relatadas vrias protenas bioativas. Lectinas
purificadas de vrias espcies apresentaram a capacidade de aglutinar eritrcitos
humanos, preferencialmente os do tipo O, sendo a maioria ligante a D-galactose e
seus derivados. Exemplos de lectinas bem caracterizadas so as encontradas em E.
cristagalli e E. corallodendron e dentre as atividades biolgicas conferidas a essas
lectinas destaca-se a atividade mitognica, indicando que as protenas de diferentes
espcies possuem uma estrutura altamente conservada (STOJANOVIC et al., 1994)
Outra classe de protenas bioativas no gnero Erythrina j bem relatadas na
literatura so os inibidores de serinoproteases. Na espcie E. caffra foi purificado um
inibidor de tripsina do tipo kunitz com 172 resduos de aminocidos, duas pontes
dissulfeto e capacidade de se ligar e inibir o ativador de plasminognio tecidual
(HEUSSEN; JOUBERT; DOWDLE, 1984; ONESTI; BRICK; BLOW, 1990). Nas
sementes de E. variegata foram isolados dois inibidores de tripsina do tipo Kunitz:
ETIa, com 176 resduos de aminocidos e ETIb com 172 resduos (KOUZUMA;
SUETAKE, KIMURA, 1992). Alm disso, nessa mesma espcie tambm foram
isolados um inibidor de quimotripsina e um inibidor do tipo Bowman-Birk (KIMURA et
al., 1994). Nas espcies E. acanthocarpa e E. latissima foram purificados dois
inibidores em cada uma, um especfico para tripsina e outro especfico para
quimotripsina (JOUBERT, 1982a; JOUBERT, 1982b; JOUBERT et al., 1981).
Na espcie E. velutina foi isolado o inibidor de quimotripsina EvCI (Inibidor de
quimotripsina E. velutina) o qual se mostrou uma molcula antagonista dos
receptores PAF/fMLP com potencial para o combate de distrbios relacionados a
inflamao (sepse), por apresentar alta inibio para ENH, alm de ao na
coagulao intravascular disseminada e cncer (MONTEIRO, 2011). Tambm nessa
espcie, Machado et al. (2013) purificaram um inibidor de tripsina do tipo Kunitz
(EvTI) com propriedades anti-inflamatrias e anticoagulante, porm, nesse estudo a
atividade para ENH no foi avaliada. Baseado no efeito anti-inflamatrio das
protenas e peptdeos bioativos isolados e purificados de sementes de E. velutina e
no seu potencial em inibir uma enzima to intimamente relacionada ao processo

42

inflamatrio, a ENH, ressalta-se a necessidade de explorar essa ao em outros

modelos experimentais de inflamao.

43

JUSTIFICATIVA

Elastase de Neutrfilos Humano (ENH) uma protease que quando hiperativa

est envolvida na destruio de tecidos e inflamao que caracterizam muitas
doenas, incluindo enfisema hereditrio, doena pulmonar obstrutiva crnica, fibrose
cstica, sndrome da angstia respiratria do adulto, leso de isquemia-reperfuso,
artrite reumatoide e lcera gstrica. Assim, ENH tem sido objeto de extensa
pesquisa para identificar inibidores potentes visando combater a sua ao destrutiva
e inflamatria. A pesquisa na rea e a procura dessas molculas se voltam busca
de novas fontes ou a nova aplicao de molculas j bem estudadas, sejam elas
sintticas, recombinantes ou de ocorrncia natural (HENRIKSEN, 2014).
Os inibidores de serinoproteases, molculas de ocorrncia extremamente
comum, os quais vm sendo isoladas, purificadas e caracterizadas de um grande
nmero de organismos, principalmente de plantas, concorrem como fortes
candidatos em funo de seu amplo espectro de aes heterlogas em processos
biolgicos de interesse cientfico, dentre eles o processo inflamatrio (VALUEVA;
MOSOLOV, 2004; CHRISTELLER, 2005; HAQ; ATIF; KHAN, 2004). Muitos estudos
demonstraram que inibidores de serinoproteases tm a capacidade de inibir a ENH.
Muitos extratos de sementes de leguminosas, tais como aqueles obtidos a partir de
feijo lima (Phaseolus limensis), feijo comum (Phaseolus vulgaris), feijo adzuki
(Phaseolus angularis), lentilha (Lens Culinares), ervilha (Pisum sativum) e de
tamarindo (Tamarindus indica) mostraram ser ricas fontes desses inibidores com
potencial anti-inflamatrio (HOJIMA; PISANO; CHOCRANE, 1983; LARIONOVA,
1993; FOOK et al., 2005).
De todos os trabalhos envolvendo E. velutina, os estudos realizados por Mo
nteiro (2011) e Machado et al., (2013) so de especial interesse. Monteiro (2011)
purificou um inibidor de quimotripsina com atividade antielastsica, avaliou seus
parmetros cinticos para ENH, tolerncia em diferentes pH e temperaturas,
demonstrou seu potencial anti-inflamatrio e sua ao inibitria sobre a ENH, alm
da ausncia de toxicidade celular. Machado (2012) purificou um inibidor de tripsina,
com atividade anti-inflamatria por reduo da liberao de citocinas, entretanto sua
atividade antielastsica reduzia significativamente junto com a purificao, sendo

44

marcante no isolado proteico com atividade antitrptica.

O potencial efeito em

modelos que envolvam dano tecidual por ao da ENH atestado por esses estudos
despertou o interesse em utilizar isolados proteicos contendo os respectivos
inibidores, norteando a elaborao deste trabalho.

45

2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito gastroprotetor de isolados proteicos com atividades antitrptica
e antiquimotrptica de sementes de Erythrina velutina em modelo experimental de
lcera gstrica induzida por etanol.

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Obter isolados proteicos com atividade antitrptica e antiquimotrptica de
sementes de Erythrina velutina;
Caracterizar o isolado proteico com atividade antitrptica quanto a estabilidade
trmica e a diferentes pHs;

Estimar a massa molecular das protenas do isolado proteico com atividade

antitrptica;

Caracterizar a especificidade para a enzima elastase neutroflica do isolado

proteico com atividade antitrptica IC50 e KI;
Analisar o dano tecidual da mucosa gstrica de ratas wistar que receberam os
isolados

proteicos

com

atividade

antitrptica

antiquimotrptica

macroscopicamente e histomorfolgicamente;
Avaliar a toxicidade resultante da administrao dos isolados proteicos com
atividade antitrptica nas concentraes analisadas.

46

3. MATERIAL E MTODOS
3.1 MATERIAL
3.1.1 Sementes

As sementes de Mulungu (Erythrina velutina) foram gentilmente fornecidas

pelo banco de sementes da Floresta Nacional de Nsia Floresta, Instituto Chico
Mendes de Conservao da Biodiversidade - ICMBio/MMA.

Figura 5: Erythrina velutina. A) Sementes. B) Cotildones. C) Farinha. Fonte: Monteiro, 2011.

3.1.2 Animais
Ratas (Rattus norvegicus) da linhagem Wistar, com dois meses de idade,
pesando entre 180220 g foram obtidas no biotrio da Universidade PotiguarRN/Brasil. Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas com, no mximo, seis
animais por gaiola, em fotoperodo de 12/12 horas, temperatura aproximada de 25
2 C, gua e alimentos ad libitum. Todos os experimentos envolvendo animais
esto de acordo com as normas da comisso de tica no uso de animais (CEUA)
Universidade Federal do Rio Grande do Norte sob protocolo de aprovao 042/2009.

47

3.1.3 Reagentes

Acetona (VETEC Qumica Fina LTDA.);

cido actico (VETEC Qumica Fina LTDA.);

cido clordrico (VETEC Qumica Fina LTDA);

cido tricloroactico (TCA) (VETEC Qumica Fina LTDA);

lcool Metlico (VETEC Qumica Fina LTDA.);

BSA (albumina srica bovina) (Sigma-co);

Cloreto de sdio (VETEC Qumica Fina LTDA.);

Coomassie Blue G-250 (Sigma-co);

DMSO (dimetilsulfxido) (VETEC Qumica Fina LTDA.);

DTT (ditiotreitol) (Sigma-co);

Folmaldedo (VETEC Qumica Fina LTDA.);

Padro de massa molecular (Fermantas Life Sciences);

Sulfato de amnio (VETEC Qumica Fina LTDA.);

SDS (dodecil sulfato de sdio) (VETEC Qumica Fina LTDA.);

Sepharose-4B (Sigma-co);

Parafina;

Persulfato de amnio (Sigma-co);

TEMED N, N, N-tetrametiletilinodiamino (Sigma-co);

Tetraborato de sdio (VETEC Qumica Fina LTDA.);

Tris-HCL (VETEC Qumica Fina LTDA.);

Triton X-100 (Sigma -co);

TCA (cido tricloroactico) (VETEC Qumica Fina LTDA.);

Proteinase sernica: Elastase neutroflica neutrfilo humano (Sigma-co);

Xilol (VETEC Qumica Fina LTDA.);

Proteinase sernica: Quimotripsina - pncreas bovino (Sigma-co);

Proteinase sernica: Tripsina pncreas bovino (Sigma-co);

Azocasena (Sigma-co);

BApNA: Benzoilarginina nitroanilida (Sigma-co);

MeOSucAAPVpNA: Metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida (Sigma-co);

Todos os outros reagentes utilizados neste trabalho foram de grau analtico,

sendo manuseados segundo recomendao do fabricante, quando especificado.

48

3.1.4 Equipamentos

Agitador Magntico Tecnal TE-081;

Balana analtica eletrnica Tecnal classe II;

Banho Maria Tecnal Te 056;

Centrfuga HITACHI CR 21;

Centrfuga Mikro 200R Eppendorf;

Concentrador 5301 Eppendorff;

Espectrofotmetro U-2000 (HITACHI);

Liofilizador L108;

Leitor de microplaca com incubao (Bio-Tek PowerWave HT - USA);

Moinho refrigerado TE 631/2 TECNAL;

Microcentrfuga Eppendorf 5410;

Microscpio Trifocal Leipzig;

Estereoscpio;

Phmetro PHTEK;

Purificador de gua Milli-Q Water System da Millipore Corp. (Bedford, MA,

USA);

Sistema de Eletroforese Unidimensional.

3.2 MTODOS
3.2.1 Obteno do extrato bruto de E. Velutina

As sementes de Mulungu (E. velutina) foram descascadas e os cotildones

triturados em um processador refrigerado (6 oC) at a obteno de uma farinha de
granulao fina, a qual foi padronizada com uma peneira de 40 mesh. Em seguida, a
farinha foi homogeneizada em tampo Tetraborato de sdio 20 mM, pH 7,5 na
proporo 1:10 (p/v) sob agitao constante por 3 horas temperatura ambiente. O
homogenato foi centrifugado a 8.000 x g por 30 minutos a 4 0C. O sobrenadante
resultante dessa centrifugao foi denominado extrato bruto (EB).

49

3.2.2 Fracionamento do extrato bruto proteico de sementes de E.

velutina por precipitao com sulfato de amnio

O extrato bruto foi fracionado por meio da precipitao com sulfato de amnio
em trs percentuais de saturao: 030%, 3060%, 6090%. Aps cada etapa de
precipitao, a mistura permaneceu a 4

C por aproximadamente 24 horas e

posteriormente foi centrifugada a 8.000 x g por 30 minutos a 4 0C. Os precipitados

obtidos foram ressuspensos em tampo Tetraborato de sdio 20 mM, pH 7,5 e
submetidos dilise por aproximadamente 48 horas contra o mesmo tampo (Figura
6). Aps a dilise, as fraes denominadas como F1(0-30%), F2(30-60%) e F3(6090%) foram congeladas a -20 C.

Figura 6: Esquema de extrao em tampo e fracionamento com sulfato de amnio em trs

percentuais de saturao (030%, 3060%, 6090%) das sementes de Mulungu (E. velutina). A
extrao e o isolamento seguiram a metodologia descrita por Monteiro (2011) e Machado (2012).

50

3.2.3 Quantificao de protenas

As protenas foram quantificadas pelo mtodo de Bradford (1976), utilizando
albumina srica bovina (BSA) como padro, sendo as leituras das absorbncias
realizadas em espectrofotmetro em comprimento de onda de 595 nm.

3.2.4 Preparo das solues usadas como substrato

Azocasena a 1% (substrato proteico para quimotripsina) foi preparada
pesando-se 1 g de azocasena, que foi dissolvida em 100 mL de tampo Tris-HCl 50
mM, pH 7,5 e fervida por cerca de 15 minutos, aps resfriamento o volume
evaporado foi completado com gua destilada. A soluo foi conservada no
congelador at sua utilizao.
BApNA a 1,25 mM (substrato sinttico especfico para tripsina) foi dissolvido
em DMSO (1%, v/v) e o volume completado para 100 mL com tampo Tris-HCl 50
mM, pH 7,5.
MeOSucAAPVpNA a 5 mM (substrato sinttico para elastase), foi preparado
uma soluo de 15 mM (soluo estoque) em DMSO 100%. Posteriormente, para os
ensaios, foi preparada uma soluo de 5 mM diluda em PBS 150 mM, pH 7,4.
3.2.5 Atividade antiquimotrptica
As atividades inibitrias sobre a quimotripsina do EB e das fraes foram
determinadas utilizando azocasena como substrato (XAVIER-FILHO et al., 1989).
Alquotas de 10 L de soluo de quimotripsina bovina (0,1 mg/mL em tampo TrisHCl 50 mM, pH 7,5, contendo CaCl2 20 mM) foram pr-incubadas com tampo TrisHCl 50 mM, pH 7,5, contendo CaCl2 20 mM e 100 L das amostras por 15 minutos a
37 0C. Aps esse perodo a reao foi iniciada adicionando-se 200 L de azocasena
a 1%. Decorridos 30 minutos, a reao foi interrompida adicionando-se 300 L de
soluo de TCA a 20%. A mistura de reao foi centrifugada a 12000 x g por 10
minutos e o sobrenadante alcalinizado com NaOH 2 N na proporo de 1:1. A
absorbncia foi medida em espectrofotmetro na faixa de comprimento de onda de

51

440 nm. Provas em branco foram realizadas e os ensaios foram feitos em triplicata.
Os resultados foram expressos em percentual de inibio.

3.2.6 Atividade antitrptica

As atividades antitrpticas do EB e das fraes foram determinadas utilizando
BApNA como substrato (KAKADE et al., 1969). Alquotas de 10 L de soluo de
tripsina bovina (0,3 mg/mL em tampo Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) foram princubadas, por 10 minutos a 37 0C, com 120 L de HCl 2,5 mM, 270 L de tampo
Tris-HCl, 50 mM, pH 7,5 e 100 L das amostras. Aps esse perodo a reao foi
iniciada adicionando-se 500 L de BApNA a 1,25 mM. A reao prosseguiu por mais
15 minutos nas mesmas condies de incubao, sendo interrompida adicionandose 120 L de cido actico 30%. A formao de p-nitroanilida foi monitorada em
absorbncia por espectrofotmetro em comprimento de onda de 410 nm. Provas em
branco foram realizadas e os ensaios foram feitos em triplicatas. Os resultados
foram expressos em percentual de inibio.

3.2.7 Atividade antielastsica neutroflica

Para

ensaio

de

inibio

da

ENH

foi

determinada

utilizando

MeOSucAAPVpNA com substrato (JOHANSSON et al., 2002). Alquotas de 10 L de

soluo da elastase neutroflica sinttica (0,4 g/L em PBS 150 mM, pH 7,4) foram
pr-incubada com 50 L de IPAT e IPAQ (10 g) e 680 L de tampo PBS 150 mM,
pH 7,4 por 15 minutos a 37 C. Em seguida a reao foi iniciada com a adio de 5
L de substrato MeOSucAAPVpNA a 5 mM. Aps 2 horas a reao foi parada com a
adio de 250 L de cido ctrico 2%. Os tubos foram centrifugados por 10 minutos
a 10.000 x g a 25C, e ento foi realizada a leitura da absorbncia no
espectrofotmetro a 405 nm. Provas em branco foram realizadas e os ensaios foram
feitos em triplicatas. Os resultados foram expressos em percentual de inibio.

3.2.8 Cromatografia de Afinidade em Tripsina-Sepharose CNBr 4B

A cromatografia foi realizada seguindo metodologia descrita por Machado
(2012). Cerca de 7 mg da F2 (30-60%), que apresentou a melhor atividade

52

antirptica, foram aplicados em uma coluna de afinidade, preenchida com resina

Sepharose derivatizada com tripsina. A coluna foi eluda com tampo Tetraborato de
sdio 2,0 x 10-2 M, pH 7,5 para a remoo do material no-retido. As protenas
adsorvidas na matriz foram eludas com HCl 5,0 x 10 -3 M e coletadas em alquotas
de 5 mL a um fluxo de 2 mL/min. O contedo proteico das fraes coletadas foi
acompanhado por espectrofotometria com leituras de absorbncia em comprimento
de onda de 280 nm. As fraes obtidas por cromatografia de afinidade foram
dialisadas contra gua, liofilizadas e submetidas a ensaios de inibio de tripsina
utilizando BApNA, conforme descrito no item 3.2.6. Em seguida o material foi
congelado e armazenado em freezer a -20C. J o material no retido foi utilizado
para obteno do isolado proteico com atividade antiquimotripsina.
3.2.9 Cromatografia de Afinidade em Quimotripsina-Sepharose
CNBr 4B
A cromatografia foi realizada seguindo metodologia descrita por Monteiro
(2011). O material no retido obtido de duas cromatografias de tripsina-sepharose,
com cerca de 8,0 mg de protena, foi aplicado em coluna de afinidade preenchida
com resina Sepharose derivatizada com quimotripsina. O material foi eludo com
tampo Tetraborato de sdio 2,0 x 10-2 M, pH 7,5. As protenas adsorvidas na matriz
foram eludas com HCl 5,0 x 10-3 M com volume de fracionamento de 5 mL a um
fluxo de 2 mL/min. O perfil proteico foi acompanhado pela leitura da absorbncia por
espectrofotometria a 280 nm. As fraes obtidas por cromatografia de afinidade
foram dialisadas contra gua, liofilizadas e submetidas a ensaios de inibio de
quimotripsina utilizando a Azocasena e de tripsina utilizando o BApNA como
substratos, descritos no item 3.2.5 e 3.2.6, respectivamente. Assim, denominados de
isolado proteico com atividade antitrptica (IPAT) e isolado proteico com atividade
antiquimiotrptica (IPAQ). Em seguida o material foi congelado e armazenado em
freezer a -20 C.

53

3.2.10 Avaliao do grau de pureza e estimativa da massa

molecular dos isolados proteicos por eletroforese em Gel de
Poliacrilamida Descontnuo e Desnaturante (SDS-PAGE)

Com o intuito de confirmar o isolamento proteico, avaliar o grau de pureza e

estimar a massa molecular de IPAT e IPAQ. EB, F2, IPAT e IPAQ foram submetidos
eletroforese em gel de poliacrilamida a 12,5% em presena de SDS, de acordo
com a metodologia descrita por Laemmli (1970). O gel de separao foi preparado
com 6,25 mL de acrilamida 30%; 1,55 mLde bis-acrilamida 1%; 3,75 mL de tampo
Tris-HCl 1,5 M pH 8,7; gua destilada 3,2 mL; 75 L de SDS 20%; 10 L de TEMED
50% e 75 L de persulfato de amnio 10%. O gel de concentrao continha 1,67 ml
de acrilamida 30%; 1,30 mL bis-acrilamida 1%; 1,25 ml de tampo Tris-HCl 1 M, pH
6,8; 4,4 mL de gua destilada; 50 L de SDS 20%; 10 L de TEMED 50% e 50 L
de persulfato de amnio 10%. O tampo de corrida consistia de Tris 2,5 x 10-2 M;
glicina 1,92 x 10-1 mM e SDS 10%. Uma vez diluda em tampo de amostra Tris-HCl
6,25 x 10-2 M, SDS 2%, glicerol 10% v/v, 0,01% de azul de bromofenol, num volume
de 10 L, alquotas contendo cerca de 30, 15 e 10 g de protena (EB, F2, IPAT e
IPAQ), foram aplicadas no gel (10 x 14 cm, com espaadores de 0,75 mm), o qual
foi submetido a uma corrente constante de 30 mA por, aproximadamente, 1 horas.
Aps a eletroforese, as protenas foram fixadas por 30 minutos com uma soluo
fixadora contendo etanol, cido actico, gua e formaldedo 37%. Aps a fixao, o
gel foi submetido a duas lavagens consecutivas com a soluo de etanol 50%, tendo
cada lavagem durao de 10 segundos. Uma soluo de tiossulfato de sdio (0,3
mg/mL) foi adicionada em seguida e mantida sob agitao por 1 minuto.
Posteriormente, foram feitas trs lavagens rpidas com gua destilada, adicionando
logo em seguida uma soluo de nitrato de prata (100 mg de nitrato de prata + 37.5
L de formaldedo em 50 mL de gua destilada), mantendo sob agitao por 20
minutos. O gel foi lavado rapidamente em gua destilada (trs vezes) e imerso em
soluo reveladora (3 g de carbonato de sdio, 25 l de formaldedo e 200 l de
tiossulfato de sdio 0,2 mg/mL para um total de 50 mL de gua destilada). Para
cessar a revelao, foi utilizada a soluo fixadora logo aps o aparecimento das
bandas proteicas. Para determinar a massa molecular da protena isolada, foram
utilizados padres de protenas com massas moleculares conhecidas.

54

3.2.11 Estabilidade em variao de pH

Para avaliar a estabilidade de IPAT variao de pH, seguiu-se a

metodologia como descrita em Gomes et al. (2005), na qual alquotas de 1 mL do
isolado proteico foram dialisadas contra o tampo com o pH desejado por 16 horas.
Esses tampes foram: glicina-HCl pH 2,0-3,0; fosfato de sdio pH 6,0 e 8,0; e
glicina-NaOH pH 11-12, nos quais a concentrao de soluto foi de 100 mM. Aps 30
min de incubao a 37 C nos referidos tampes, as amostras foram dialisadas por
cerca de 4 horas em Tetraborato de sdio 20 mM, pH 7,5. Os ensaios de atividade
inibitria sobre tripsina foram feitos em triplicata como descrito no item 3.2.6. Provas
em branco tambm foram realizadas.

3.2.12 Estabilidade trmica

Para determinar a estabilidade trmica de IPAT, seguiu-se a metodologia

como descrita por Gomes et al. (2005), na qual alquotas de 1 mL do isolado
proteico foi incubada por 30 minutos, a 37, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 100 C. Decorrido
o tempo de incubao foram resfriadas a 4 C e aps esse procedimento as
alquotas do isolado proteico foram utilizadas no ensaio de atividade inibitria sobre
a tripsina como descrito no item 3.2.6. Os ensaios foram realizados em triplicatas e
provas em branco em duplicatas foram realizadas.

3.2.13 Determinao da IC50 para ENH de IPAT

A concentrao de IPAT que inibe 50% da atividade (IC50) da ENH foi determinada
pela construo de uma curva de inibio que relaciona o percentual de inibio da
ENH e concentrao da mesma. Para a construo dessa curva, concentraes
crescentes do isolado proteico (0,0; 0,1; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 6,0; 10,0; 24,0; e 48,0 g)
foram incubadas com alquotas de 10 L (0,4 g) de enzima e o ensaio foi realizado
como descrito no item 3.2.7. O percentual de inibio da atividade da ENH para
cada concentrao de isolado proteico foi utilizada na construo de uma curva de
titulao e determinao da IC50. Para determinar o valor da Ki para ENH foi
construdo um grfico como descrito por Dixon et al. (1979). O valor de Ki foi obtido

55

a partir dos pontos de intercepo das retas das duas concentraes (2,5 mM e 5,0
mM) do substrato Meo-SucAAPVpNa utilizadas. O valor da velocidade foi
determinado por V = DO405 nm/h/mL.

3.2.14 Avaliao do efeito gastroprotetor de IPAT e IPAQ

3.2.14.1 Modelo Experimental

Os animais foram agrupados randomicamente em seis grupos (n=6) sendo
que dois grupos receberam IPAT nas concentraes de 0,2 e 0,4 mg/kg, um terceiro
grupo recebeu IPAQ na concentrao de 0,035 mg/kg. O quarto grupo recebeu a
soluo de Cloridrato de Ranitidina (controle negativo), na concentrao de 50
mg/kg, e um ltimo grupo recebeu apenas soluo salina 0,9% (controle positivo). O
sexto grupo, chamado de grupo sham, foi composto por animais no submetidos a
nenhum tipo de interveno. As concentraes dos isolados proteicos foram
solubilizadas em soluo salina 0,9% e administradas via oral por gavagem com
auxlio de uma agulha de gavagem de inox (1,2 mm de dimetro, esfera de 2,3 mm,
40 mm de raio e 54 mm de comprimento) e seringa de 3 mL. A administrao foi
realizada diariamente por um perodo de cincos dias, sempre em um mesmo horrio,
e as diferentes concentraes dos isolados proteicos e de Cloridrato de Ranitidina
foram veiculadas em um volume dirio de 1 mL, o mesmo volume dado ao grupo
que recebeu com soluo salina 0,9%. Aps a quarta administrao, foi retirada a
rao, deixando os animais em jejum e com livre acesso gua. No quinto dia, a
gavagem foi realizada conforme protocolo e ento se iniciou o processo de induo
de lcera.

3.2.14.2 Induo de lcera gstrica com etanol

A induo de lcera por etanol a 99% foi realizada por meio do mtodo
descrito por Robert et al. (1979). No quinto dia de experimento, uma hora aps a

56

realizao da ltima gavagem, a lcera foi induzida em todos os animais.

Administrou-se em cada animal 1 mL do etanol via oral por gavagem. Aps uma
hora, foi realizado o sacrifcio dos animais, em cmara de CO 2. Aps o sacrifcio,
fez-se a dissecao e remoo dos estmagos pela parte anterior ao esfncter
esofgico inferior e pela poro posterior ao esfncter pilrico. O delineamento do
experimento in vivo est apresentado na figura 7.

Figura 7: Desenho experimental do modelo de ulcerao gstrica.

3.2.14.3 Anlise macroscpica do dano tecidual

Os estmagos coletados foram abertos pela curvatura maior, lavados com
soluo salina e colocados em placas de Petri, e realizada a anlise em
estereoscpio, onde se realizou a avaliao macroscpica das leses gstricas de
acordo com o escore de Adami et al. (1964) com modificaes relativas critrios de
avaliao. Os critrios de avaliao e suas respectivas pontuaes esto
apresentados na Tabela 2. A determinao do ndice de Leso Ulcerativa (ILU) para
cada parmetro foi obtido pelo somatrio dos escores.

57

Tabela 2: Escores e parmetros de anlise macroscpica do dano epitelial para modelo experimental
de lcera gstrica. Adaptado de Adami et al. (1964)

ITENS
ANALISADOS
Colorao da
mucosa

Normal
(0 pontos)

Hipermica
(1 ponto)

Descorada
(1 ponto)

Perda de pregas da
mucosa

Leve
(1 ponto)

Moderado
(2 pontos)

Intenso
(3 pontos)

Petquias

Leve
(1 ponto)

Moderado
(2 pontos)

Intenso
(3 pontos)

Edema

Leve
(1 ponto)

Moderado
(2 pontos)

Intenso
(3 pontos)

Hemorragia

Leve
(1 ponto)

Moderado
(2 pontos)

Intenso
(3 pontos)

Perda de muco

Leve
(1 ponto)

Moderado
(2 pontos)

Intenso
(3 pontos)

ATRIBUIES DE ESCORES

3.2.14.4 Anlise histomorfolgica do dano tecidual

Fragmentos de tecido gstrico foram fixados por 24 h em formalina
tamponada 10% para a anlise histomorfolgica. Aps a fixao, o material foi
desidratado em uma srie alcolica crescente, diafanizado em xilol, impregnado e
emblocado em parafina. O fragmento foi submetido a cortes de 5 m de espessura,
corado por Hematoxilina e Eosina (HE) e analisado em microscpio triocular Leipzig
em aumento de 10 x.

3.2.14.5 Anlise Toxicolgica

Outros dois grupos de ratas (n =6) Wistar (180 220 g) receberam por cinco
dias IPAT nas concentraes 0,2 e 0,4 mg/kg via oral em 1 mL administrado por
gavagem. Os animais foram deixados 24 h de jejum antes da ltima gavagem e
aps a realizao da mesma, foram eutanasiados em cmara de CO2. Aps a
eutansia, foram removidos o fgado e o pncreas dos animais. Fragmentos de
tecido heptico e pancretico foram fixados por 24 h em formalina tamponada 10%

58

para a anlise histopatolgica. Aps a fixao o material foi desidratado em uma

srie alcolica crescente, diafanizado em xilol, impregnado e emblocado em
parafina. O fragmento foi submetido a cortes de 5 m de espessura, corado por
Hematoxilina e Eosina (HE) e analisado em microscpio triocular Leipzig em
aumento de 10 x.

3.2.15 Anlise Estatstica

Todos os dados representam pelo menos trs experimentos independentes e
foram expressos com mdia DP (Desvio Padro), exceto fosse indicado de outra
maneira. As diferenas entre os grupos foram comparadas pelo teste ANOVA e pelo
ps-teste de Bonferroni. Foram consideradas diferenas significativas quando o
valor de p foi inferior a 0,05. Os dados estatsticos foram analisados pelo software
GraphPad prism 6.0.

59

4. RESULTADOS

4.1 DETERMINAO DA ATIVIDADE INIBITRIA SOBRE TRIPSINA DAS

FRAES PROTEICAS DE SEMENTES DE Erythrina velutina
A atividade cataltica da tripsina foi inibida em 62%, 69%, 92% e 90% no EB e
nas Fraes 1, 2 e 3, respectivamente. A frao F2 teve maior atividade inibitria
sobre a tripsina e foi submetida aos procedimentos subsequentes de isolamento

Inibio (%)

(Figura 8).

Figura 8: Percentual de Inibio da atividade da tripsina pelo extrato bruto e fraes proteicas F1, F2,
e F3 (saturao com sulfato de amnio em 0 30%, 30 60%, 60 90%, respectivamente) de
sementes de E. velutina. Para o ensaio utilizou-se 100 l do extrato bruto e das fraes proteicas e
BApNA como substrato.

60

4.2 ISOLAMENTO PROTEICO EM CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE DE

TRIPSINA-SEPHAROSE CNBr 4B
A frao F2, que apresentou maior atividade inibitria sobre a tripsina, foi
aplicada em coluna de afinidade de Tripsina-Sepharose (Figura 9A). O IPAT
apresentou 100% de inibio sobre tripsina e foi submetido a SDS-PAGE a 12.5%
(Figura 9B). Foi observada a presena de duas bandas proteicas predominantes
com massas moleculares de aproximadamente 20 e 23 kDa.
B

Figura 9: A) Perfil da F2 (saturao com 30 60% de sulfato de amnio) de sementes de E. veluntina

em cromatografia de afinidade Tripsina-Sepharose CNBr 4B. Aplicou-se aproximadamente 7 mg de
-2

protena. A coluna foi previamente equilibrada com tampo Tetraborato de sdio 2,0 x 10 M, pH 7,5
e a eluio do material no retido foi realizada com o mesmo tampo. Protenas adsorvidas na matriz
foram eludas com HCl 5,0 x 10

-3

M e as fraes proteicas (5,0 mL) foram monitoradas pela

absorbncia a 280 nm. A atividade inibitria do pico proteico eludo foi verificada por ensaio de
inibio sobre tripsina utilizando-se 50 L do isolado proteico. B) Eletroforese em gel de poliacrilamida
com SDS a 12,5% corado com nitrato de prata. M: Marcador; EB: Extrato Bruto (30 g); F2: Faixa de
saturao com 30 60% de sulfato de amnio (15g); IPAT: Isolado Proteico com Atividade
Antitrptica (10 g).

61

4.3 ESTABILIDADE DE IPAT EM DIFERENTES PH E TEMPERATURA

A estabilidade de IPAT em diferentes pH foi verificada incubando-se o isolado
proteico em solues tampo com pH variando de 2 a 12, por 30 min, a 37 0C.
Observa-se que o isolado proteico manteve seu potencial inibitrio sobre a atividade
cataltica de tripsina na faixa de pH testado (Figura 10A). IPAT tambm foi avaliado
quanto a sua estabilidade em diferentes temperaturas (37 a 100 C). A Figura 10B
mostra que o mesmo manteve potencial de inibio sobre a atividade cataltica da
tripsina prximo a 100% em todas as temperaturas testadas.

Figura 10: Estabilidade de IPAT extrado de sementes de E. velutina em diferentes condies de pH e

temperatura. Alquotas de 1 mL de isolado proteico foram pr-incubadas por 30 minutos em
diferentes temperaturas (37 a 100C). (A) e diferentes pH (2 a 12) (B) e posteriormente testadas em
ensaio de inibio sobre tripsina com BapNa como substrato proteico. IPAT (Isolado Proteico com
Atividade Antitrptica)

4.4 DETERMINAO DA IC50, DA KI E DO MECANISMO DE INIBIO DO

IPAT PARA ENH
De acordo com a titulao, a IC50 de IPAT de cerca 1,0 g. O percentual
mximo de inibio obtido na curva foi de 83,8%. A anlise do grfico mostra que o
isolado proteico inibe a ENH de modo competitivo e com valor de Ki de 0,4 g
(Figura 11).

62

Figura 11: Determinao da IC50 e da Ki de IPAT obtido de sementes de E. velutina para ENH. A) Foi
construda uma curva de titulao utilizando-se concentraes crescentes do isolado proteico (0,0;
0,1; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 6,0; 10,0; 24,0; e 48,0 g) e concentrao fixa da ENH (0,4 g) para determinar
a IC50. B) A constante de inibio (Ki) de IPAT sobre a elastase foi determinada pelo mtodo de Dixon
et aI. (1979). O valor da Ki foi obtido a partir dos pontos de intercepo das retas das duas
concentraes (2,5 mM e 5,0 mM) do substrato Meo-SucAAPVpNA utilizadas. O valor da velocidade
foi determinado por V = DO405 nm/h/mL. IPAT (Isolado Proteico com Atividade Antitrptica)

63

4.5 DETERMINAO DA ATIVIDADE INIBITRIA SOBRE QUIMOTRIPSINA

DAS FRAES PROTEICAS DE SEMENTES DE Erythrina velutina
A atividade cataltica da quimotripsina foi inibida em 99%, 95%, 92% e 90%
no EB e nas Fraes 1, 2 e 3, respectivamente. A frao F2 foi utilizada, sendo

Inibio (%)

submetida aos procedimentos subsequentes de isolamento (Figura 12).

Figura 12: Percentual de Inibio da atividade da quimotripsina pelo extrato bruto e fraes proteicas
F1, F2, e F3 (saturao com sulfato de amnio em 0 30%, 30 60%, 60 90%, respectivamente)
de sementes de E. velutina. Para o ensaio utilizou-se 100 L do extrato bruto e das fraes proteicas
e azocasena como substrato.

4.6 ISOLAMENTO PROTEICO EM CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE DE

QUIMOTRIPSINA-SEPHAROSE CNBr 4B
A frao F2 foi aplicada em coluna de afinidade de Quimotripsina-Sepharose
(Figura 13A). O isolado proteico apresentou 86% de inibio sobre a atividade da
enzima quimotripsina, 85% de inibio sobre a atividade da ENH e no foi detectada
a atividade inibitria sobre a enzima tripsina, mostrando que a quantidade aplicada
no saturou a coluna. IPAQ foi submetido a SDS-PAGE a 12.5% (Figura 13B). Foi
observada a presena de uma banda proteica predominante com massa molecular
aproximada de 17 kDa.

64

Figura 13: A) Perfil da F2 (saturao com 30 60% de sulfato de amnio) de sementes de E.

veluntina

em

cromatografia

de

afinidade

Quimotripsina-Sepharose

CNBr

4B.

Aplicou-se

aproximadamente 8 mg de protena. A coluna foi previamente equilibrada com tampo Tetraborato de

sdio 2,0 x 10

-2

M, pH 7,5 e a eluio do material no retido foi realizada com o mesmo tampo.

-3

Protenas adsorvidas na matriz foram eludas com HCl 5,0 x 10 M e as fraes proteicas (5,0 mL)
foram monitoradas pela absorbncia a 280 nm. A atividade inibitria do pico proteico eludo foi
verificada por ensaio de inibio sobre quimotripsina utilizando-se 50 L do isolado proteico. B)
Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS a 12,5% corado com nitrato de prata. M: Marcador;
EB: Extrato Bruto (30 g); F2: Faixa de saturao com 30 60% de sulfato de amnio (15g); IPAQ:
Isolado Proteico com Atividade Antiquimotrptica (10 g).

4.7 AVALIAO DO EFEITO GASTROPROTETOR DE IPAT E IPAQ EM

MODELO EXPERIMENTAL DE LCERA INDUZIDA POR ETANOL
4.7.1 Avaliao Macroscpica
No experimento in vivo, aps a induo da lcera, o dano tecidual foi
avaliado diante da presena e intensidade dos seguintes quesitos: colorao da
mucosa, perda de pregas, petquias, edema, hemorragia e perda de muco. Ao tratar
estatisticamente os escores para os parmetros analisados, pode-se verificar que
IPAT e IPAQ possuram efeito protetor semelhante, e em alguns casos, superior que
ao frmaco padro (controle negativo). No parmetro colorao da mucosa, todos os
grupos foram eficazes na proteo em relao ao grupo controle positivo, no

65

havendo diferena significativa entre os grupos que receberam o IPAT 0,04 mg/kg, o
IPAT 0,2 mg/kg e o IPAQ 0,035 mg/kg. No houve diferenas entre os grupos
avaliados quanto a reduo na perda de pregas, exceto no grupo que recebeu IPAQ,
tendo esse dano sido reduzido em relao aos demais grupos. O IPAT nas duas
concentraes testadas foi to eficiente em reduzir a formao de petquias quanto
o frmaco. A formao de edema foi significativamente reduzida nos grupos que
receberam os isolados proteicos, sendo que nos grupos IPAT 0,2 mg/kg e o IPAQ
0,035 mg/kg, a proteo foi mais eficiente que o no grupo do frmaco padro. O
grupo controle positivo apresentou alto ndice de leses hemorrgicas, enquanto os
grupos IPAT 0,2 mg/kg e IPAQ 0,035 mg/kg, a proteo contra o dano hemorrgico
foi to eficiente quanto a conferido pelo frmaco. A perda de muco foi reduzida
significativamente nos demais grupos em relao ao controle positivo e no houve
diferenas estatsticas entre a proteo conferida pelo grupo controle negativo e
IPAT 0,2 mg/kg e entre os grupos IPAT 0,4mg/kg e o grupo IPAQ 0,035 mg/kg
(Figura 14). Na Figura 15 so demonstrados os estmagos representativos de cada
grupo, includo o grupo sham, que no foi submetido a nenhuma interveno
teraputica ou induo de dano, mostrando que o experimento fez uso de animais
sadios, e que o dano foi exclusivo da induo.

66

Figura 14: Grfico da plotagem do ndice de Leso Ulcerativa (ILU) obtidos com a administrao dos animais de IPAT de sementes de E. velutina 0,2 e 0,4
mg/kg e IPAQ 0,035mg/kg em relao ao controle positivo (soluo salina 0,9%) e ao controle negativo (Cloridrato de Ranitidina). A contagem do dano
macroscpico foi adaptada de Adami et al. (1961). Controle positivo: Soro fisiolgico; Controle negativo: Cloridrato de Ranitidina; IPAT: Isolado Proteico com
Atividade Antitrptica; IPAQ: Isolado Proteico com Atividade Antiquimotrptica. ANOVA, ps-teste de Bonferroni, p<0,0001.

67

Figura 15: Estmagos, dos animais que receberam os isolados proteicos obtidos de sementes de E. velutina, dissecados e abertos pela curvatura maior e
lavados com soluo salina 0,9%, representando cada grupo do experimento (n= 6). A) Grupo controle positivo (soluo salina 0,9%). B) Grupo controle
negativo (Cloridrato de Ranitidina 50 mg/kg). C) IPAT (Isolado Proteico com Atividade Antitrptica) (0,2 mg/kg) e D) 0,4 mg/kg. E) IPAQ (Isolado Proteico com
Atividade Antiquimotrptica) (0,035 mg/kg. F) Grupo sham (sem nenhuma interveno).

68

4.7.2 Avaliao Histomorfolgica

Os cortes histolgicos enfatizam a camada epitelial da mucosa gstrica,
apresentando-a no aumento 10x em microscpio. Pode-se visualizar no grupo
controle positivo (Figura 16A) a eroso da camada mucosa, com consequente
desorganizao da estrutura das fossetas gstricas, quando comprado aos demais
grupos, onde a arquitetura histolgica encontra-se preservada. Bem como, a
presena difusa de hemcias, alm de vasos rompidos. Nas lminas dos grupos
controle negativo (16B), IPAT 0,2 mg/kg (Figura 16C) e 0,4 mg/kg (Figura 16D) no
apresentaram indicativo de dano endotelial, estando a arquitetura tecidual ntegra e
uma boa delimitao entre as clulas. Nas lminas do grupo que recebeu IPAQ
0,035 mg/kg (Figura 16E) pode-se verificar alguns pontos de ruptura de vasos,
porm numa proporo menor em comparao ao controle positivo.

69

Figura 16: Cortes histolgicos dos estmagos, dos animais aos quais administrou-se os isolados
proteicos obtidos de sementes de E. velutina, dissecados e abertos pela curvatura maior e lavados
com soluo salina 0,9%, representando cada um grupo do experimento (n= 6), corados com HE em
aumento de 10 x. A) Grupo controle positivo (soluo salina 0,9%). B) Grupo controle negativo
(Cloridrato de Ranitidina 50 mg/kg). C) IPAT (Isolado Proteico com Atividade Antitrptica) (0,2 mg/kg)
e D) 0,4 mg/kg. E) IPAQ (Isolado Proteico com Atividade Antiquimotrptica) (0,035 mg/kg). F) Grupo
sham (sem nenhuma interveno).

70

4.7.3 Anlise Toxicolgica

Para avaliar algum indcio de toxicidade relacionada a administrao de IPAT,
avaliou-se a arquitetura histolgica do fgado e pncreas de ratas que receberam as
duas concentraes do isolado (0,2 mg/kg e 0,4 mg/kg). As lminas de fgado
apresentaram um parnquima heptico normal, com estroma preservado, assim
como as membranas e ncleos dos hepatcitos e ausncia de morte celular diante
de ambas as concentraes de IPAT (Figura 17A e 17B). A anlise do tecido
pancretico mostrou integridade tecidual tambm frente ambas as concentraes,
apresentando

ilhotas

de

Langerhans

tecido

conjuntivo

sem

alteraes

morfolgicas e sem a presena de hiperplasia celular, alterao tpica resultante da

administrao de inibidores de enzimas digestivas (Figura 17C e 17D).

Figura 17: Cortes histolgicos dos fgados e pncreas dos animais que receberam IPAT (Isolado
Proteico com Atividade Antitrptica) obtidos de sementes de E. velutina, corados com HE em aumento
de 10 x. 17A) Fgado do grupo IPAT na concentrao 0,2 mg/kg. 17B) Fgado do grupo IPAT 0,4
mg/kg. 17C) Pncreas do grupo IPAT na concentrao 0,2 mg/kg. 17D) Pncreas do grupo IPAT na
concentrao 0,4 mg/kg.

71

5. DISCUSSO
As sementes do gnero Erythrina compem um grupo dentro da famlia
Fabaceae que se destaca pelo seu potencial anti-inflamatrio, tendo a espcie
Erytrhina velutina como um dos seus representantes. Vrios estudos tm se voltado
a essa caracterstica da espcie, a qual classicamente atribuda aos inibidores de
enzimas digestivas (SCHULER et al., 1998; VASCONCELOS et al., 2011; OLIVEIRA
et al., 2012). Nesse aspecto, os estudos desenvolvidos por Varela (2010) e Monteiro
(2011), que isolaram o EvCI so de especial interesse por terem comprovado, alm
da atividade antiproliferativa sobre linhagens de clulas cancergenas e atividade
anticoagulante, um forte potencial anti-inflamatrio, atribudo a sua ao inibitria
sobre a ENH. Outro estudo, tambm com sementes de E. velutina desenvolvido por
Machado et al. (2013) purificou um inibidor de tripsina que possua potencialidades
anti-inflamatrias, dessa vez associado ao efeito imunomodulador e reduo de
citocinas inflamatrias. Assim, baseado na alegao anti-inflamatria dos inibidores
de quimotripsina e tripsina de E. velutina, foram obtidos isolado proteicos ricos nos
respectivos inibidores, com o objetivo de empreg-los num modelo experimental de
inflamao que envolvesse dano causado pela ao da ENH.
Para tal, IPAQ foi isolado utilizando a metodologia utilizada por Monteiro
(2011) desde a obteno do extrato bruto at o passo de cromatografia de afinidade.
Os valores de inibio sobre a enzima quimotripsina obtidos nesse estudo para o EB
e as fraes foram de 99%, 95%, 92% e 90%, respectivamente. O percentual
inibitrio das enzimas quimotripsina e ENH para IPAQ foram respectivamente 86% e
85%, corroborando com os achados por Monteiro (2011). O mesmo realizou a
caracterizao da cintica inibitria da molcula purificada, EvCI, para ENH e
tambm detectou inibio de 94% e 92% para as enzimas quimotripsina e ENH.
J na obteno do IPAT, seguindo a metodologia utilizada por Machado et al.,
(2012) desde a obteno do extrato bruto at o passo de cromatografia de afinidade,
foi observado 92% de inibio sobre tripsina na F2 (30 60% de sulfato de amnio),
a qual passou para 100% aps ser cromatografada em afinidade Tripsina-Sepharose
CNBr 4B. O IPAT tambm apresentou alta atividade para ENH (85%), caracterstica
que no foi observada por Machado et al., (2013) que purificaram o (EvTI), utilizando
cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) aps a coluna de afinidade Tripsina-

72

Sepharose CNBr 4B. No estudo, o EvTI apresentou alta eficincia inibitria sobre
tripsina, inibiu fracamente a ENH e no inibiu a quimotripsina. Apesar de as
cromatografias de afinidade possurem uma baixa adsoro de protenas no
especficas, possvel que molculas com estrutura semelhantes, como um inibidor
com ao para elastase, se ligue a matriz tal qual os inibidores de tripsina (SANTOS
et al., 2012).
A SDS-PAGE de IPAT mostrou a presena de duas bandas proteicas com
massas moleculares entre 20 e 23 kDa, dentro do esperado para os inibidores da
famlia Kunitz, com massa molecular que variam de 18 a 26 kDa. Resultado tambm
semelhante ao encontrado por Machado at al. (2013), que obtiveram por
espectrometria de massa com ionizao por Electrospray a massa molecular do EvTI
de 19 kDa. J na eletroforese das protenas de IPAQ, observou-se a presena de
uma banda majoritria com a massa molecular estimada de 17 kDa, a mesma
massa obtida por Monteiro (2011) para o EvCI, por SDS-PAGE.
O IPAT apresentou inibio praticamente inalterada em altas temperaturas.
Muitos inibidores so termoresistentes, a exemplo do inibidor de tripsina de paoca
de amendoim (AHTI) isolado por Serquiz, (2012), o qual apresentou atividade
inibitria mxima a temperatura de 80 C. Bem como o EvTI que manteve sua
capacidade inibitria tambm sobre a atividade cataltica de tripsina em toda faixa de
pH e variaes de temperatura testadas (Machado et al. 2013). Alm disso, o
isolado proteico com atividade antitrptica demosntrou estabilidade em uma ampla
faixa de pHs, demonstrando que o ambiente cido estomacal no seria um fator
limitante em sua atividade (MACEDO; MATOS; MACHADO, 2000). J o EvCI
purificado por Valera, (2010) apresentou inibio num intervalo de temperatua
variando de 85 a 100 C e inibies que variaram de 83 a 89% numa faixa de pH de
2 a 12.
Nesse estudo, o IPAT mostrou uma IC50 para ENH de 1,0 g/mL e uma Ki de
0,4 g/mL. A IC50 do EvCI obtido por Monteiro (2011) para a ENH foi de 0,053 g/mL
(3,12 nM), valor baixo quando comparado a outros inibidores, como de Tamarindus
indica purificado por Fook et al., (2005) e ao SKTI (Ribeiro et al., 2010), com valores
de 55 e 8 g/mL respectivamente, mostrando que em relao aos inibidores de
serinoproteases com ao para inibir ENH, ambos os isolados proteicos utilizados
nesse estudo possuem uma alta eficcia inibitria. Dessa maneira, as caractersticas
cinticas de estabilidade em amplas faixas de pH e temperatura e os seus

73

mecanismos de inibio, bem como a eficcia inibitria demonstrada para as

enzimas estudadas, concorre para a manuteno das suas atividades inibitrias num
ambiente cido e hostil, os colocando como candidatos gastroprotetores.
Ademais, a inibio enzimtica reversvel no competitiva, que como se
comportam os isolados estudados frente s enzimas digestivas tripsina, demostrada
por Machado et al., (2013), e quimotripsina vista por Monteiro, (2011),
caracterizada pela ligao reversvel dos inibidores enzima em um stio prprio de
ligao, podendo estar ligado mesma ao mesmo tempo em que o substrato
(NELSON; COX, 2011). Logo, este tipo de inibio depende apenas da
concentrao do inibidor, diferente da inibio enzimtica reversvel competitiva, em
que o inibidor se liga reversivelmente ao mesmo stio de ligao do substrato
(NELSON; COX, 2011). Assim, o efeito revertido aumentando-se a concentrao
de substrato, sendo, portanto o mecanismo de inibio dependente das
concentraes de substrato e de inibidor, o que positivo, j que esse tipo de
mecanismo visto para os isolados frente ENH, mostrado nesse estudo para IPAT
e por Monteiro, (2011) para IPAQ. Sabe-se que muitos medicamentos usados
rotineiramente baseiam-se na inibio competitiva especfica de enzimas (LI et al.,
2003).
O modelo de induo de lcera na hiperatividade neutroflica j vem sendo
amplamente utilizado em vrios estudos, entretanto estes trabalhos focam na
atividade da mieloperoxidase, porm a hiperativao neutrfilica traz consigo uma
grande liberao de ENH, com consequente dano (ARNHOLD, 2004; NORGAARD;
ANDERSON; NIELSON, 1995; MOONEY et al., 1991; GUSLANDI, 1999). Devido
escassez de estudos que relacionem o dano causado pela ENH no modelo
experimental de lcera gstrica, despertou-se o interesse de se avaliar mais uma
possvel aplicao biolgica dos inibidores de serinoproteases.
Nesse estudo utilizou-se o etanol 99% como agente indutor da lcera. Esse
mtodo constitui uma forma segura de induo de lcera e rene vrios fatores
como reduo da produo de muco e de prostaglandinas, reduo do fluxo
sanguneo local, aumento da produo das espcies reativas de oxignio com
consequente aumento na peroxidao lipdica, levando a reduo dos componentes
de defesa antioxidantes. Porm esse mtodo de induo tambm est intimamente
relacionado infiltrao neutroflica e consequente produo de metablitos reativos

74

de oxignio, mediadores lipdicos e enzimas, dentre elas a ENH, enzima

predominante nessas clulas (REPETTO, LLESUY, 2002).
Com o intuito de reduzir o dano gstrico causado pela infiltrao neutroflica e
consequente hiperatividade da ENH, trs dos cinco grupos analisados nesse estudo
receberam isolados proteicos ricos em inibidores de serinoproteases com atividade
inibitria sobre ENH, dois receberam duas concentraes de IPAT (0,2 mg/kg e 0,4
mg/kg), e um recebeu IPAQ (0,035 mg/kg), administrados via oral em 1 mL por
gavagem. A concentrao utilizada nos testes com IPAQ foi baseada no estudo de
Monteiro (2011), no qual o mesmo utilizou 1 g de EvCI por animal, sendo feita
portanto a adequao de peso. J as utilizadas nos testes com IPAT foi baseada na
curva da IC50 para elastase encontrada nesse estudo, na qual a inibio mxima foi
alcanada com 48 g.
Pela anlise macroscpica realizada segundo metodologia adaptada de
Adami et al., (1964) os grupos aos quais foram administrados os isolados proteicos,
mostraram resultados com relevncia estatstica significativa quando comparado ao
grupo controle negativo (Cloridrato de Ranitidina). Os grupos que receberam IPAT e
IPAQ, ambos com ao inibitria sobre ENH apresentaram-se eficientes em proteger
a mucosa gstrica contra a perda de muco, hemorragia, formao de petquias,
edema e descolorao da mucosa. Um estudo de Liu et al., (1998) mostrou que a
atividade da elastase diminui a produo de prostaglandinas do tipo PGI 2, sendo as
PG um dos responsveis pela formao da camada de muco. A teraputica com
inibidores comerciais para ENH inibe essa reduo protegendo contra a perda de
muco e o dano ao epitlio. Provavelmente, por um mecanismo semelhante, os
isolados proteicos utilizados neste estudo tambm protegeram a mucosa gstrica
contra a perda de muco.
Na anlise histomorfolgica pode-se verificar que o dano, cuja caracterstica
predominante visualizada no grupo controle foi ruptura de vasos, indicativo de
processo hemorrgico, foi ausente nos grupos que receberam IPAT e amenizado no
grupo que recebeu IPAQ quando comparados ao controle positivo. Sabe-se que a
interao do neutrfilo com o endotlio vascular, essencial para seu recrutamento
rea de injria, culmina na abertura das junes celulares endoteliais e aumento da
permeabilidade vascular, levando ao dano endotelial (FRIEDRICH et al., 2011).
Dessa maneira, os isolados proteicos por inibirem a hiperatividade da ENH podem

75

ter contribudo para no ocorrncia do dano endotelial, mesmo nos grupos tendo
sido o etanol o agente indutor da lcera.
Alguns estudos com inibidores de elastase apontam para o provvel efeito
destes sobre o endotlio vascular. O mesmo estudo de Liu et al., (1998) verificou
que a ao dos inibidores de ENH impediram a diminuio do fluxo sanguneo da
mucosa gstrica nos animais submetidos ao estresse, assim como evitou um
aumento significativo na permeabilidade microvascular da mucosa gstrica em ratos
submetidos a lcera induzida por estresse.

No estudo de Nagaraju (2012) foi

observado que a ao dos inibidores de ENH impediu a diminuio do fluxo

sanguneo, assim como evitou um aumento significativo na permeabilidade
microvascular da mucosa gstrica em ratos submetidos lcera induzida por
estresse. Nesse estudo esse mesmo aspecto tambm foi verificado.
Um estudo sobre o papel da ENH na compresso espinhal induzida, mostrou
que o uso de dois inibidores comerciais da enzima (Eglin C and L658,758) reduziu o
dano hemorrgico (TAOKA et al, 1998). A injria pulmonar aguda, uma doena
inflamatria que envolve edema alveolar e hiperatividade neutroflica teve a
incidncia de leso hemorrgica acentuadamente reduzida pela ao do sivelestat,
um inibidor de ENH, reduzindo o processo inflamatrio, sendo essa ao atribuda
inibio da enzima (TODA et al., 2007). Esses estudos relacionados reduo do
dano hemorrgico, contribuindo para manuteno da integridade vascular,
mecanismo intimamente ligado inibio de ENH, corroboram com os achados do
estudo em questo. Alm disso, tanto IPAT quanto IPAQ, ainda que inibam as
enzimas tripsina e quimotripsina respectivamente, tambm inibem a ENH.
Alguns trabalhos mostraram o potencial gastroprotetor das molculas que
atuam sobre os neutrfilos e a ao da ENH. A ao do Plaunotol, um gastroprotetor
natural, foi comprovada pela sua capacidade de induzir a liberao de ENH pelos
neutrfilos e a liberao de clcio, um segundo mensageiro para a ativao dessas
clulas (MURAKAMI et al., 1999). O Teprenone, uma droga cuja ao era atribuda
reduo da secreo cida, mostrou atividade na reduo da infiltrao neutroflica
na mucosa (KOBAYASHI et al., 2001). At o frmaco Ranitidina, utilizado nesse
experimento como controle negativo, cuja ao clssica a antagonista dos
receptores de H2, mostrou atividade inibitria sobre a atividade de neutrfilos,
demonstrando mais um mecanismo protetor contra o dano gstrico, e a importncia
do mesmo (OKAJIMA et al., 2000).

76

A fim de verificar se alm dos efeitos gastroprotetores apresentados, IPAT

poderia gerar algum efeito txico para os animais foram realizadas anlise
toxicolgica de fgado e pncreas. bem fundamentada as alteraes hepticas e
pancreticas relacionadas administrao de inibidores de serinoproteases, uma
vez que, a inibio sobre as enzimas digestivas tripsina e quimotripsina causam
alteraes nesses dois rgos. Neste estudo no foi verificada nenhuma alterao
na estrutura celular destes dois tecidos, mostrando que as doses aplicadas alm de
produzir efeitos benficos, so seguras do ponto de vista toxicolgico. Monteiro
(2011) e Machado et al., (2013), j tinham verificado em seus estudos a ausncia de
citotoxicidade e atividade hemoltica em clulas expostas ao EvCI e EvTI,
respectivamente.
A hiperatividade neutroflica est envolvida em uma srie de processos
patolgicos, de forma que uma teraputica que aborde essa vertente de extremo
interesse a um grande nmero de enfermidades. Baseado no retrospecto de estudos
realizados com os inibidores de tripsina e quimotripsina de sementes de E. velutina,
pode-se afirmar que seu potencial anti-inflamatrio j est bem fundamentado. Os
efeitos gastroprotetores aqui evidenciados corroboram o crescente interesse na
descoberta de novas molculas com atividade inibitria sobre a ENH, despontando
os inibidores de serinoproteases de plantas como uma rica fonte dessas molculas,
cuja eficcia e segurana vm sendo continuamente comprovadas.

77

6. CONCLUSO
Foram obtidos isolados com atividade antitrptica e antiquimotrptica de
sementes de Erythrina velutina estveis em uma faixa de temperatura de 37 C a
100 e pH de 2 a 12, com alta afinidade para as enzimas tripsina e quimotripsina e
ao inibitria para ENH, apresentado efeito protetor mucosa gstrica em modelo
de lcera induzida por etanol, sendo observada a reduo da perda de muco,
hemorragia, formao de petquias, edema e descolorao da mucosa por meio da
anlise macroscpica e histomorfolgica do dano tecidual, provavelmente pelos
isolados proteicos inibirem a hiperatividade da ENH sem apresentar toxidade nas
concentraes analisadas.

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