Zoologia Do 2006 Rodrigo Barreto

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Julio de Mesquita Filho
INSTITUTO DE BIOCINCIAS
CMPUS DE BOTUCATU
Efeitos de estressores e do cortisol na memria
em peixes
Rodrigo Egydio Barreto
Orientador: Dr. Gilson Luiz Volpato
Tese apresentada ao Instituto de

Biocincias de Botucatu UNESP
como parte dos requisitos para a
obteno do Ttulo de Doutor em
Cincias Biolgicas, na rea de
Concentrao de Zoologia.
Botucatu SP
2006
Este trabalho foi realizado no RECAW Research Centre on Animal Welfare
Laboratrio de Fisiologia e Comportamento Animal do Departamento de
Fisiologia do Instituto de Biocincias de Botucatu UNESP e parcialmente no
CEH Centre for Ecology and Hydrology Lancaster Environmental Centre
Bailrigg Lancaster Inglaterra. Este trabalho teve apoio financeiro do
Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico CNPq
(Processo: 140307/2002-8) e Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal
de Nvel Superior (Processo: BEX 0182/04-4).
2
minha familia,
Angela, Cesar,
Ana, Tiago e Giovanna
Aquele que mestre na arte de viver bem faz pouca

distino entre o seu trabalho e o seu tempo livre, entre a
sua mente e o seu corpo, entre a sua educao e sua
recreao. Distingue uma coisa da outra com dificuldade.
Almeja, simplesmente, a excelncia em qualquer coisa
que faa, deixando aos demais a tarefa de decidir se est
trabalhando ou se divertindo. Ele acredita que est
fazendo as duas coisas ao mesmo tempo."
(De Masi, 2001)
3
Agradecimentos
Gostaria de expressar minha profunda gratido s pessoas que me ajudaram

e apoiaram ao longo do desenvolvimento deste trabalho, pois sem vocs
nada disso seria possvel. Agradeo especialmente:
Ao meu orientador de vrios anos e principalmente amigo Gilson L.

Volpato, por tudo que me ensinou sobre esse apaixonante caminho da
cincia.
Ao Dr. Tom Pottinger (CEH Lancaster Inglaterra) por ter gentilmente
aberto as portas do seu laboratrio para que eu pudesse realizar parte
deste trabalho.
Ao Antnio C. B. Tardivo, pelo imprescindvel auxlio tcnico durante
diversas fases desse trabalho, mas principalmente pelo grande amigo que
.
Dr. Eunice Oba (Depto. de Reproduo Animal e Radiologia
Veterinria FMVZ UNESP Botucatu) por ceder gentilmente seu
laboratrio para as anlises de cortisol plasmtico.
Ao pessoal da Seo de Ps-Graduao, pelo profissionalismo, eficincia
e amizade com que sempre me auxiliaram.
A todos os professores e funcionrios do Departamento de Fisiologia, que
sempre me auxiliaram e se mostraram grandes amigos, em especial ao
Prof. Helton C. Delcio.
Giovanna R. dos Santos por sempre estar ao meu lado me apoiando,
ajudando e ensinando.
Aos irmos de repblica de ontem e de hoje: Biotererenses e
especialmente Marcelo, Vladimir, Rodrigo e Francisco. E a todos os
colegas da UNESP, obrigado pelos maravilhosos momentos que
passamos juntos. Valeu amigos!!!
4
5
Prembulo
6
Esta tese versa sobre relaes entre memria e estresse. Assim,
inicialmente apresentamos alguns conceitos dessas duas reas que
permeiam os estudos apresentados neste trabalho.
O estresse um fenmeno que tem sido amplamente estudado, tanto
por razes tericas quanto pelas suas implicaes em atividades zootcnicas
de interesse econmico. O estresse conceituado como um estado do
organismo frente situaes de ameaa da perda da homeostase causada por
algum fator (o estressor). Esse estado implica num conjunto relativamente
padronizado de respostas bioqumicas, fisiolgicas e comportamentais.
Pickering (1981) apresenta o quadro geral de estresse em peixes. Segundo
ele, o estressor provoca estimulao no sistema nervoso autnomo simptico
que libera das clulas cromafins da interrenal catecolaminas para o sangue;
estimula tambm o eixo HPI (hipotlamo-pituitria-interrenal), que libera
corticosterides para a circulao. Dessas respostas primrias so induzidas
respostas secundrias que podem mobilizar energia que ento usada para
o organismo se ajustar ameaa imposta pelo estressor. Se esses
mecanismos de resposta persistem respostas tercirias ocorrem, como
imunossupresso, reduo ou inibio do crescimento e funes
reprodutivas. Temporalmente, as respostas primrias e secundrias podem
ocorrer em segundos, ou algumas horas ou dias; as tercirias geralmente
demoram alguns dias para que sejam percebidas. Segundo Moberg (2000), o
estado de estresse aquele em que o organismo usa de suas reservas para
enfrentar a situao de ameaa (estressor), e o estado de distresse ocorre
quando essas reservas so levadas a limites extremos e o uso de energia e
7
vias metablicas implica necessariamente na supresso, total ou parcial, de
outros processos. No presente estudo, centramos as investigaes sobre o
estresse principalmente a partir de medidas de cortisol, considerado um dos
principais indicadores de estresse em peixes (Barton & Iwama, 1991; Bonga,
1997; Barton 2002) e outros vertebrados (Johnson et al., 1992; Chrousos &
Gold, 1992). Em alguns casos, a glicose foi tambm avaliada como
indicadora de estresse.
A partir de estudos em peixes, Moreira & Volpato (2004) propem que
os estressores sejam divididos como: a) aqueles em que h ao fsica do
estressor sobre o animal agredido; b) aqueles que decorrem da percepo de
um coespecfico estressado; e c) aqueles que so induzidos pela
recuperao mnemnica de experincia estressora anterior (lembrana). Este
terceiro tipo de estressor foi descrito em peixes apenas recentemente
(Moreira & Volpato, 2004; Moreira et al., 2004) e, para que possa ser
avaliado, necessrio que se induza essa lembrana no animal, o que na
presente tese foi sempre realizado por condicionamento clssico.
O condicionamento clssico foi descrito em 1927 por Ivan Petrovich
Pavlov, um fisiologista russo nascido em 1849 na cidade de Ryazan. Trata-se
de um processo de aprendizagem que consolida associao entre estmulos,
de forma que a reao do animal emitida a um desses estmulos passa, por
esse condicionamento, a ser emitida tambm a outros estmulos. No exemplo
clssico, Pavlov mostrou que o estmulo carne (estmulo no
condicionado - EN) provocava salivao (resposta no condicionada -
RN) em ces. Ao contrrio, o som de uma campainha no provocava essa
resposta. Porm, Pavlov viu que aps oferecer por algumas vezes
8
concomitantemente esses dois estmulos (campainha e carne) aos ces,
quando apresentava novamente apenas o som da campainha, os ces
salivavam. Ou seja, o significado de um estmulo (carne moda) foi
incorporado ao outro estmulo (som) por meio de experincias sucessivas, o
que caracteriza esse tipo de aprendizagem. Assim, denominou de estmulo
condicionado (EC) o som da campainha aps os ces terem incorporado
essa associao e resposta condicionada (RC) a salivao induzida pelo
som da campainha.
Considerando que foi mostrado que os peixes emitem resposta de
estresse em termos de elevao dos nveis de cortisol plasmtico, neste
trabalho procuramos avanar essa questo tentando responder se o
significado de estmulos memorizados afeta a resposta de estresse em
peixes. Numa primeira anlise comparamos a resposta de estresse em
condicionamentos de dois EN, asfixia e presena de alimento. Usamos como
modelo experimental a tilpia-do-Nilo. Como os animais foram testados em
agrupamentos sociais, a presena de alimento envolvia tambm competio
alimentar, o que nos fez considerar essa condio tambm como um
estressor, avaliando subseqentemente a intensidade desses estressores,
mostrando a possibilidade de ligao entre a severidade do estressor e a
aquisio da RC. Frente a isso, procuramos numa etapa seguinte avaliar os
efeitos do cortisol plasmtico sobre a RC em peixes. Esta etapa foi
desenvolvida no CEH Centre for Ecology and Hydrology Lancaster
Inglaterra, onde o modelo experimental mais usado a truta arco-ris e na
qual tambm foi mostrado o condicionamento do estresse (Moreira et al.,
2004).
9
A apresentao do trabalho nesta tese procurou privilegiar no apenas
os experimentos que forneceram concluses slidas, mas tambm mostrar
testes de hiptese que nem sempre foram bem sucedidas de imediato. Esses
testes foram importantssimos para o redirecionamento do projeto ao longo
deste doutoramento o que nos motivou a inclu-los no corpo deste texto.
10
Efeito do significado do estmulo
no-condicionado sobre estresse
condicionado na tilpia-do-Nilo
11
Introduo
Recentemente, Moreira & Volpato (2004) mostraram que no peixe
tilpia-do-Nilo, Oreochromis niloticus, a recuperao mnemnica de
experincias estressoras induz aumento dos nveis plasmticos de cortisol.
Posteriormente, esse tipo de estressor mnemnico foi descrito tambm em
truta arco-ris, Oncorhynchus mykiss (Moreira et al., 2004). Esses estudos
mostram que nesses peixes respostas neuroendcrinas esto sujeitas ao
condicionamento pavloviano, uma vez que o indicador de estresse utilizado
foi o nvel plasmtico de cortisol. Portanto, os peixes possuem mecanismos
eficazes de aprendizagem para se anteciparem s situaes estressantes,
pois a liberao de cortisol induzida por um EC prepara o organismo para a
situao de ameaa.
No caso de estressores no mnemnicos, tem sido mostrado que a
resposta de estresse modulada pela intensidade do estmulo (Barton &
Iwama, 1991; Bonga, 1997; Barton 2002). Assim, plausvel supor que
diferentes intensidades de estressores mnemnicos tambm modulem os
nveis de cortisol em peixes.
Independente do EC estar associado a um estmulo aversivo, ele pode
alterar os nveis de cortisol. Por exemplo, aps alimentao tem sido relatada
elevao de cortisol plasmtico em algumas espcies de peixes (Bry, 1982;
Boujard & Leatherland, 1992; Reddy & Leatherland, 1994, 1995). A
alimentao certamente uma condio no aversiva e que pode estar
ligada liberao de cortisol (ps-prandial). Apesar disso, um certo grau de
estresse social est presente na alimentao em grupo devido competio
12
alimentar (Carrieri & Volpato, 1991). Mesmo nesse caso, a intensidade do
estressor pode ser menor comparada a estressores no sociais. Assim, a
comparao de estressor no social e alimentao em grupo como EC
implica na avaliao de diferena de estressores e aversividade do estmulo
o que, segundo hipotetizamos neste estudo, deve trazer diferena no
condicionamento de alteraes nos nveis de cortisol plasmtico como RC.
Essa hiptese foi testada no peixe Cicldeo, tilpia-do-Nilo
(Oreochromis niloticus L.), o qual apresenta resposta de estresse
condicionado em termos de elevao de cortisol plasmtico (Moreira &
Volpato, 2004) e na qual a competio alimentar (Carrieri & Volpato, 1991) e
o estresse social (Fernandes & Volpato, 1993; Volpato & Fernandes, 1994;
Alvarenga & Volpato, 1995; Barcellos et al., 1999; Corra et al., 2003;
Merighe et al., 2004) so evidentes.
O estudo foi desenvolvido em quatro etapas: 1) avaliao da
ocorrncia de condicionamento mnemnico do estresse em tilpias-do-Nilo
agrupadas, de forma similar ao demonstrado para tilpias em isolamento
social (Moreira & Volpato, 2004); 2) efeito da alimentao em grupo nos
nveis de cortisol plasmtico; 3) efeito da alimentao em isolamento social
sobre os nveis de cortisol plasmtico; e 4) avaliao do condicionamento
mnemnico dos nveis de cortisol plasmtico tendo como EN a alimentao
em grupo.
13
Etapa 1: condicionamento de estresse em tilpias-do-Nilo agrupadas
Mtodos
Estocagem dos animais
Exemplares de tilpia-do-Nilo, Oreochromis niloticus (L.), foram
mantidos em tanques por aproximadamente 8 meses, com aerao
constante, temperatura da gua aproximadamente a 24oC. O fotoperodo foi
estabelecido das 06:00 s 18:00h. Os animais foram alimentados 3 vezes por
semana com rao comercial peletizada (38% de protena bruta).
Procedimentos
Setenta e cinco tilpias-do-Nilo provindas da populao de estoque e
sem distino de sexo foram alojadas nos tanques experimentais (base com
= ~ 93 cm; 500 l cada; 15 peixes/ tanque). Em cada tanque havia fluxo de
gua declorinada dirio (aproximadamente 4 h de renovao de gua por dia;
30L/h). Cada tanque possua um sistema de iluminao anexado parte
interna da tampa. Essa iluminao provinha de lmpadas fluorescentes tipo
luz do dia, de 20w, acesas das 06:00 h s 18:00 h. Permaneceram cinco dias
para ajuste a essas condies, sendo alimentados uma vez ao dia, no 1, 3
e 5 dias.
Aps esse perodo, a estratgia bsica consistiu em condicionar os
peixes pela associao de um EC (interrupo da aerao por 30 s) a um EN
(asfixia por 2 min fora dgua), avaliando-se posteriormente se o EC
14
provocava a RC (elevao dos nveis plasmticos de cortisol) sem a
presena do EN. A associao entre EC e EN foi feita por 10 dias
consecutivos, uma vez ao dia, e a RC foi avaliada no 11 dia. Todos esses
procedimentos foram feitos entre 12:00 h e 14:00 h de cada dia.
Os tanques eram de parede opaca e possuam tampa no permitindo
contato visual entre os peixes e o pesquisador, o que evitava a associao do
EN com outros estmulos externos alm do EC a ser testado. Os tanques
tinham uma rede revestindo a parede interna, que era usada para captura
imediata dos peixes para retirada fora dgua (asfixia). O EC foi o desligar do
sistema de aerao por 30 s. A aerao provinha de um quadrado (21 cm de
lado) de cano PVC perfurado (furo = 2 mm) em toda sua extenso para
sada do ar. Esse quadrado era fixado ao centro no fundo do tanque, sendo
suficiente para emitir bolhas em quase toda extenso do tanque. Para a
asfixia (EN), erguia-se a rede que cobria a superfcie interna do tanque,
expondo todos os peixes ao ar por 2 min, que, em seguida, eram
reintroduzidos no tanque pelo abaixamento da rede. Esse procedimento foi
facilitado anexando-se por cordes a rede tampa do tanque, a qual era
suspendida por um sistema de roldanas.
Para controle de variveis interferentes, cinco tratamentos foram
necessrios (Tabela 1).
15
Tabela 1. Delineamento experimental da Etapa 1.
Grupos Dias
Experimentais 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Controle - - - - - - - - - - s
EC I i i i I i i i i i is
EN10 A a a a a a a a a a s
EN11 A a a a a a a a a a as
Condicionamento I ia ia ia ia ia ia ia ia ia is
a
s = coleta de sangue para anlise dos nveis plasmticos
de cortisol.
i = interrupo da aerao.
a = asfixia
n = 6 peixes aleatoriamente coletados de cada tanque
Nos 10 dias iniciais do experimento, no grupo Controle as variveis
do condicionamento (asfixia e interrupo da aerao) no foram impostas
aos peixes; no grupo EC avaliou-se o efeito da interrupo da aerao e no
grupo EN11 investigamos o efeito da asfixia. O grupo EN10 avaliou se a asfixia
induz elevao crnica do cortisol plasmtico. O grupo Condicionamento,
comparado com esses outros grupos, permitiu concluir sobre a presena da
RC. No 11 dia, o sangue dos animais foi coletado no horrio habitual da
experimentao diria, sendo exatamente 30 min aps a apresentao do EC
ou do EN nos grupos com esses estmulos presentes nesse dia.
Para a coleta de sangue, os peixes foram capturados aleatoriamente
com uma rede e imediatamente transferidos para soluo de anestsico
(Benzocaina, 80 mg/ L d`gua). Aps sedao (perda da postura e ausncia
de reflexos), o sangue era coletado por puno cardaca com seringas
heparinizadas. Posteriormente, o sangue era centrifugado a 3000 rpm
durante 5 min, o plasma coletado e mantido congelado (- 20oC) at o
momento das anlises laboratoriais. O peso (g) dos peixes foi similar entre os
16
grupos (ANOVA; F(4;25) = 0,53; P = 0,71): Controle = 49,0 18,3; EC = 45,3
7,8; EN10 = 40,3 7,7; EN11 = 42,1 11,3; Condicionamento 48,2 14,9.
Os dados obtidos foram transformados por raiz quadrada para
aumentar a homogeneidade e homocedasticidade e, em seguida,
comparados por ANOVA (inteiramente casualizados) seguido por Newman-
Keuls para as comparaes pos-hoc, considerando-se = 0,05.
Resultados
Na figura 1 observa-se que o tratamento imposto aos animais afetou
significativamente o nvel plasmtico de cortisol (ANOVA; F(4;25) = 61,49; P <
0,000001). O valor mdio no grupo EN11 foi estatisticamente maior que todos
os demais tratamentos. Alm disso, no grupo condicionamento o valor mdio
foi menor que no grupo EN11, mas maior quando comparado com os nveis
dos outros tratamentos. Entre os outros grupos os nveis de cortisol foram
baixos e similares entre si.
17
300
b
250
Cortisol plasmtico (ng/mL)
200
c
150
100
50 a a
a
0
Controle EC EN10 EN11 Condicionamento
Figura 1. Resposta de estresse condicionada na tilpia-do-Nilo. Valores
mdios (DP) de cortisol plasmtico que no compartilham uma
mesma letra so estatisticamente diferentes entre si (ANOVA;
F(4;25) = 61,49; P < 0,0001). Estmulo condicionado (EC) =
Interrupo da aerao; estmulo no-condicionado (EN) = asfixia.
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Etapa 2: Evoluo temporal dos nveis de cortisol plasmtico em
funo da alimentao na tilpia-do-Nilo em agrupamento social.
Mtodos
Foram utilizadas 120 tilpias-do-Nilo sem distino quanto ao sexo e
provindas da populao de estoque e alojadas nos tanques experimentais
(15 peixes/tanque), como descrito na Etapa 1. Os peixes foram mantidos em
jejum durante 5 dias. No 6o dia, 4 tanques receberam alimento em excesso
(cerca de 10% da biomassa do tanque) e os demais permaneceram em jejum
(controle).
Em cada grupo foram amostrados 6 peixes, capturados
aleatoriamente dentre os 15 peixes do respectivo tanque. Aos 15 min, 30 min,
1 h e 2 h aps a alimentao foram amostrados dois tanques (um controle e
um alimentado). Nesses momentos, esses peixes eram anestesiados e
coletava-se o sangue e dados biomtricos, como descrito na Etapa 1. Em
seguida, os peixes foram sacrificados (por exposio prolongada soluo
de benzocana) para avaliao do contedo gstrico, confirmando-se se os
peixes amostrados haviam se alimentado. Nenhum contedo foi observado
no estmago dos peixes controles, enquanto que todos os peixes que
receberam rao haviam se alimentado. A quantidade de rao ingerida no
foi mensurada. O peso (g) dos peixes foi similar entre os grupos (ANOVA;
F(7;40) = 0,56; P = 0,78): Jejum, 15 min = 43,9 13,8, 30 min = 48,9 14,9, 1h
19
= 44,0 8,9, 2h = 40,0 9,4; Alimentado, 15 min = 44,2 14,1, 30 min = 44,8
9,0, 1h = 44,8 7,2, 2h = 42,9 15,7.
Os dados do presente experimento foram primeiramente
transformados por raiz quadrada para normalizao e aumentar a
homocedasticidade. Em seguida, os dados foram comparados por teste t de
Student (amostras independentes) para cada par de grupos (alimentados x
jejum) em cada intervalo de tempo.
Resultados
Na figura 2 esto os dados mdios de cortisol plasmtico obtidos.
Observa-se que os nveis plasmticos de cortisol nos intervalos de tempo de
30 min e 1h foram estatisticamente maiores nos peixes alimentados quando
comparado aos respectivos controles (Test t de Student para amostras
independentes; P15 min = 0,30; P30 min < 0,01; P1h < 0,05; P2h = 0,98).
20
200
Alimentado
Jejum
150
*
100 *
50
0
15 min 30 min 1h 2h
Figura 2. Evoluo temporal dos nveis plasmticos de cortisol em funo da
alimentao na tilpia-do-Nilo. Dados mdios ( DP) de 6 animais
em cada situao. * indica diferena estatistica entre peixes
alimentados e controles (jejum) para cada intervalo (Test t de
Student para amostras independentes; P15 min = 0,30; P30 min < 0,01;
P1h < 0,05; P2h = 0,98).
21
Etapa 3: Evoluo temporal dos nveis de cortisol plasmtico em
funo da alimentao na tilpia-do-Nilo em isolamento social.
Mtodos
Utilizaram-se os mesmos procedimentos da Etapa 2, exceto que a
avaliao temporal dos nveis plasmticos de cortisol restringiu-se aos
tempos de 30 min e 1 h aps alimentao, uma vez que foram os momentos
em que ocorreram efeitos significantes na Etapa anterior. Alm disso, os
animais foram estudados em isolamento social, em aqurios de vidro (30 x 35
x 50,5 cm; ~ 53l) completamente isolados entre si e com aerao constante.
O peso (g) dos peixes foi similar entre os grupos (ANOVA; F(3;20) = 0,71; P =
0,56): Jejum, 30 min = 45,5 19,9 e 1h = 48,6 17,3; Alimentado, 30 min =
48,4 16,0 e 1h = 45,3 19,3.
O contedo gstrico tambm foi avaliado como descrito na Etapa 2,
verificando-se que todos os animais do grupo alimentado haviam ingerido
rao.
Resultados
O tratamento e anlise dos dados foram como na etapa anterior e os
dados esto expressos na figura 3. Observa-se que os nveis plasmticos de
22
cortisol no foram estatisticamente diferentes comparando-se os peixes
alimentados com os controles (30 min, P = 0,53; 1h, P = 0,62).
50
Alimentado
Jejum
40
30
20
10
30 min 1h
Figura 3. Evoluo temporal dos nveis plasmticos de
cortisol em funo da alimentao em tilpias-do-
Nilo isoladas socialmente. Dados mdios (DP) de 6
peixes em cada caso. Nenhuma diferena
estatstica foi observada entre peixes alimentados e
em jejum nos dois intervalos de tempo (Teste t de
Student para amostras independentes; P > 0.5).
23
Etapa 4: condicionamento a EN no aversivo em tilpias-do-Nilo
agrupadas
Mtodos
Os procedimentos bsicos foram iguais aos da Etapa 1 e o
delineamento experimental est representado na Tabela 2. O EN neste caso
foi a alimentao em grupo, que representava um estmulo no aversivo,
porm com certo nvel de estresse (Etapa 2) supostamente pela competio
alimentar, visto que na Etapa 3 no houve tal estresse nos animais isolados.
Sete animais foram amostrados de cada grupo e o peso (g) deles foram
similares entre os grupos (ANOVA; F(3;24) = 0,17; P = 0,91): Controle = 43,9
11,0; EC = 45,4 7,0; EN11 = 41,0 6,6; Condicionamento 43,5 18,1.
Tabela 2. Delineamento experimental da Etapa 4.
Grupos Dias
Experimentais 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Controle a a a a a a a a a a s
EC* ai ai ai ai ai ai ai ai ai ai is
EN11 a a a a a a a a a a as
Condicionamento ia ia ia ia ia ia ia ia ia ia is
* Nesta condio o alimento no foi pareado com o EC (i).
s = coleta de sangue para anlise dos nveis plasmticos
de cortisol.
i = interrupo da aerao.
a = alimento
n = 6 peixes aleatoriamente coletados de cada tanque.
24
No grupo controle, os peixes foram alimentados todos os dias, exceto
no dia de amostragem de sangue, perfazendo um jejum prvio de ~ 24h. No
grupo EC, a interrupo da aerao foi apresentada diariamente durante 10
dias consecutivos. No grupo EN11 os peixes receberam o alimento
diariamente, incluindo o dia da amostragem de sangue. No grupo
condicionamento, os peixes foram condicionados por 10 dias (pareamento
EC-EN) e o sangue amostrado no 11 dia aps apresentao de apenas EC.
No 11 dia, o sangue dos animais foi coletado no horrio habitual da
experimentao diria, sendo que nos grupos com presena de EC ou EN a
coleta foi feita exatamente 30 min aps a apresentao desses estmulos.
Esse intervalo de 30 min para coleta de sangue foi baseado nas evidncias
da Etapa 2, que mostrou que era um tempo suficiente para as tilpias terem
seus nveis de cortisol plasmtico elevado aps se alimentarem em grupo. O
contedo gstrico tambm foi avaliado como descrito na Etapa 2,
registrando-se que todos os animais que receberam alimento no 11 dia
haviam-na ingerido.
Resultados
Aps transformao dos dados como nas etapas anteriores, as mdias
entre os grupos foram comparadas por ANOVA, com comparao a posteriori
pelo teste de Newman-Keuls. Na figura 4 esto mostrados os dados mdios
(DP) obtidos, revelando que o cortisol plasmtico foi significativamente
elevado apenas no grupo EN11 (F(3;24) = 3,42; P = 0,033).
25
150
100
*
50
0
Controle EC EN11 Condicionamento
Figura 4. Resposta de cortisol plasmtico na tilpia-do-Nilo a condicionamento
pavloviano com EN no aversivo, mas estressante. * indica valor
mdio ( DP; n = 7) de cortisol plasmtico diferente estatisticamente
das mdias dos demais grupos (ANOVA; F(3;24) = 3,42; P = 0,033).
Estmulo condicionado (EC) = Interrupo da aerao; estmulo no-
condicionado (EN) = alimentao.
26
Discusso
O presente estudo mostrou que tilpias-do-Nilo tambm podem ser
condicionadas a exibir uma RC (elevao dos nveis plasmticos de cortisol)
em resposta a um EC quando mantidas em grupo, assim como demonstrado
previamente para tilpias isoladas socialmente (Moreira & Volpato, 2004).
Alm da tilpia-do-Nilo, esse tipo de RC em peixes agrupados foi tambm
descrito em trutas arco-ris (Moreira et al., 2004). No presente estudo, os
nveis de cortisol plasmtico aumentaram significativamente quando
apresentado o EC, interrupo da aerao, sem a necessidade da presena
do EN (asfixia) aps condicionamento de 10 dias (pareamento dos estmulos
EC-EN). O EC utilizado claramente no foi estressor, pois no se observou
elevao dos nveis de cortisol aps o perodo de vrias aplicaes desse
estmulo. Uma outra possibilidade que o estressor presente durante o
perodo de condicionamento elevasse cronicamente o estresse, de forma que
os altos nveis de cortisol no dia de teste (11 dia) representassem esse
estado e no fossem conseqncia do processo de condicionamento. No
entanto, a resposta do grupo EN10 mostra que se o estressor no for
aplicado no 11 dia a elevao do cortisol no aparece.
De acordo com isso, as tilpias-do-Nilo podem memorizar uma
situao aversiva e apresentar resposta neuroendcrina antecipadamente a
ela a partir de um sinal externo condicionado. Embora essa constatao
revele a adequao do modelo de condicionamento adotado, a RC no
ocorreu quando o EN foi o alimento.
27
Na figura 1 v-se que o estmulo parada da aerao foi percebido
pelas tilpias, uma vez que pde ser condicionado ocorrncia da asfixia.
Portanto, a ausncia de condicionamento reportada na figura 4 (parada da
aerao associada com alimentao) no pode ser explicada pelo tipo de EC
usado. De forma similar, pode-se pensar que tal ausncia de
condicionamento decorra da ineficincia da alimentao em induzir elevao
do cortisol. De fato, nos estudos mostrados nas figuras 2 e 3, observa-se que
a alimentao eleva os nveis de cortisol plasmtico apenas quando os
peixes so alimentados em grupo. Ou seja, essa elevao do cortisol decorre
do contexto da alimentao e no do alimento. Na alimentao em grupo
pode ocorrer certo nvel de estresse decorrente da competio alimentar. A
ocorrncia de competio alimentar na tilpia-do-Nilo durante a alimentao
bem reportada na literatura (veja Carrieri & Volpato, 1991; Volpato et al.,
1989 e Volpato & Fernandes, 1994). Em outras espcies, essa competio
promove estresse que tem sido mostrado em termos de elevao de cortisol
em (verli et al., 1998). Assim, na figura 4 v-se claramente que apenas a
competio alimentar foi suficiente para elevar os nveis de cortisol
plasmtico nas tilpias, o que parece resultar do estresse social envolvido
nesse contexto de alimentao. Os confrontos agonsticos so freqentes
nessas competies (Carrieri & Volpato, 1991), estressores bem
documentados nesta (Fernandes & Volpato, 1993; Volpato & Fernandes,
1994; Alvarenga & Volpato, 1995; Barcellos et al., 1999; Corra et al., 2003;
Merighe et al., 2004) e em outras espcies (Schreck, 1981; Sakakura &
Tsukamoto, 1999; Sloman et al., 2000a,b,c, 2001; Pottinger & Carrick, 2001).
28
Mesmo que a competio alimentar induzida pela alimentao aos
peixes em agrupamento seja um estressor, no presente estudo o estresse
resultante no pde ser condicionado (Figura 4). Uma explicao que isso
decorra do estressor (EN) ser mais fraco que aquele usado no experimento
mostrado na figura 1, onde foi usado asfixia. Esta interpretao corroborada
quando se avalia a amplitude das elevaes de cortisol registradas. No caso
da asfixia, esse estmulo promoveu elevao mdia de cerca de 240 ng/mL
(Figura 1, grupo EN11), enquanto que na alimentao a elevao foi bem
mais discreta (~ 50 ng/mL; Figura 4, grupo EN11). Assim, pode-se assumir
que a intensidade do estressor, aqui agindo como EC, tenha sido o fator
primordial na modulao do condicionamento entre os dois estmulos
testados, a asfixia e a alimentao em grupo. Isso est de acordo com o
pressuposto de que a intensidade e o significado do EN para o animal so
fatores importantes para o condicionamento (Alcock, 1997).
29
Cortisol prejudica memria na truta
arco-ris
30
Introduo
Recentemente foi demonstrado que peixes so capazes de serem
condicionados a exibir resposta de estresse como uma resposta
condicionada (RC) em associao a um sinal no estressante quando se
utiliza o paradigma clssico do condicionamento Pavloviano (Moreira &
Volpato, 2004, na tilpia-do-Nilo e Moreira et al., 2004, em truta arco-ris).
Esses resultados indicam que os peixes so capazes de ficarem estressados
pela lembrana de experincias prvias estressantes. Nesses experimentos
os peixes foram expostos a um sinal ambiental (EC estmulo condicionado)
pareado com um estressor (EN estmulo no-condicionado). Aps algumas
sees de pareamento dos estmulos EC-EN, a exposio dos peixes apenas
aos EC resulta em uma RC, no caso, elevao dos nveis plasmticos de
cortisol. Essa RC pode ser retida por algumas semanas na ausncia de
reforo (Moreira et al., 2004). Neste ltimo estudo avaliou-se a extino da
RC em duas linhagens de truta arco-ris que divergem entre si quanto
reatividade ao estresse, em termos da magnitude dos nveis plasmticos de
cortisol. Esses autores observaram que as trutas que respondem ao estresse
com baixa elevao dos nveis plasmticos de cortisol retm a RC por um
perodo mais longo que as trutas que respondem ao estresse com alta
elevao dos nveis de cortisol. Essa diferena nas funes cognitivas entre
essas 2 linhagens de truta sugere que o cortisol possa estar modulando esse
processo. De acordo com isso, pode-se supor que o cortisol prejudicaria a
memria em peixes. Reforando essa idia, pode-se destacar que diversos
resultados j obtidos em mamferos indicam que nveis elevados de
31
corticosterides ou exposio ao estresse prejudicam a memria desses
animais (Dachir et al., 1993; Luine et al., 1993, 1994; Arbel et al., 1994;
Bodnoff et al., 1995; Conrad et al., 1996; Krugers et al., 1997; Belanoff et al.,
2001; Roozendaal et al., 2001; Roozendaal, 2003). De modo geral, a
elevao nos nveis circulantes de corticoesterides induz diminuio da
reteno da memria, o que diretamente afeta a formao de memria de
longo prazo (Roozendaal, 2003). Assim, no presente estudo foi avaliado se
nveis circulantes de cortisol elevados cronicamente afetam a reteno da RC
na truta arco-ris, Oncorhynchus mykiss. A RC usada foi a resposta de
estresse, que foi avaliada em termos de elevao do cortisol e glicose,
parmetros bem estabelecidos como indicadores do estresse em peixes
(Barton, 2002).
O presente estudo foi conduzido em trs diferentes etapas. Na
primeira, uma vez que Moreira et al. (2004) utilizou trutas em agrupamentos
sociais, procurou-se confirmar inicialmente se o mesmo tipo de
condicionamento ocorria em trutas mantidas em isolamento social. Na
segunda, a elevao crnica dos nveis plasmticos de cortisol foi realizada
por implantao intra-peritonial de uma fonte exgena de cortisol,
determinando-se a concentrao de cortisol adequada para elevar esse
hormnio por tempo suficiente para a conduo do estudo de
condicionamento. A concentrao adequada foi considerada a que permitia a
elevao plasmtica de cortisol frente ao estressor, mesmo com a linha basal
desse hormnio j elevada pela aplicao exgena. Na ltima fase, testou-se
o efeito do cortisol na RC, com o implante de cortisol feito antes do perodo
de condicionamento (pareamento entre os estmulos EC-EN).
32
Etapa 1: condicionamento de estresse em trutas arco-ris em isolamento
social.
O objetivo desta etapa foi avaliar se trutas mantidas socialmente isoladas
apresentam resposta de estresse como RC. Um total de quatro experimentos
foi realizado at se chegar a um modelo adequado.
Experimento 1
Mtodos e resultados
Trinta trutas arco-ris provindas do estoque do CEH (Centre for
Ecology and Hydrology, Windermere, Inglaterra), peso mdio de 478,1 g
80,2 g, comprimento total de 33,2 cm 2,3 cm, sexualmente imaturas, de
ambos os sexos e idade de 2 anos, foram mantidas em isolamento social em
aqurios de vidro (30 cm x 30 cm x 50 cm). Cada aqurio recebia fluxo
constante (10 l/min) de gua do lago Windermere, U.K. A iluminao dos
aqurios foi com lmpadas fluorescentes tipo luz do dia, com fotoperodo das
06:00 h s 18:00 h. Todos os lados verticais dos aqurios foram cobertos
com cartolina branca de modo que os peixes no tivessem contato visual
com o pesquisador e com os outros peixes, evitando a associao do EN
com outros estmulos alm do EC proposto. Antes da experimentao os
peixes foram alimentados trs vezes por semana. Dez dias foram dados aos
peixes para ajustarem-se a essas condies dos aqurios experimentais.
Aps isso, o EC foi pareado por 10 dias com o estressor, confinamento por
33
restrio de espao (EN). Ento, no 11o dia se avaliou se o EC era capaz de
induzir uma resposta de estresse sem a presena do EN. O EC usado foi o
ligar da aerao por 1 min. O EN consistiu de um perodo de 30 min de
confinamento por restrio de espao, realizado pelo abaixamento de uma
tela que tornava impossvel ao peixe transp-la, limitando sua movimentao
a 10 cm de altura do espao do aqurio a partir do fundo.
Cinco tratamentos foram realizados (n = 6 peixes cada): 1) controle,
sem manipulao ou estresse imposto aos peixes; 2) EC, o sinal (ligar a
aerao por 1 min) foi apresentado diariamente durante 10 dias consecutivos;
3) EN10, os peixes foram confinados diariamente, exceto no 11 dia (coleta de
sangue); 4) EN11, os peixes eram confinados diariamente incluindo o dia da
coleta de sangue; 5) condicionamento, os peixes foram condicionados por 10
dias (pareamento EC-EN).
No 11o dia foi feita a coleta de sangue dos animais, de acordo com as
respectivas condies experimentais. Assim, nesse dia o EC era apresentado
no grupo condicionamento sem a imposio do confinamento (EN). O grupo
EC tambm recebia o sinal da aerao. Exatamente 30 min aps a
apresentao desse sinal o sangue dos peixes era amostrado nos grupos EC
e aprendizado. Os grupos EN e controle no recebiam a imposio de
qualquer manipulao ou estresse, enquanto que os peixes do grupo EN11
foram amostrados imediatamente aps a imposio do EN. Para a coleta de
sangue, os peixes foram capturados com uma rede e imediatamente
transferidos para baldes contendo anestsico (2-fenoxietanol, 10 mL/ 5L de
gua). Aps sedao completa, o sangue foi coletado por puno no sino
branquial utilizando-se seringas heparinizadas. Aps esse procedimento, o
34
peso e o comprimento dos peixes foram aferidos e ento os peixes foram
sacrificados por contuso ceflica para determinao do sexo. Aps
centrifugar o sangue a 3500 rpm durante 5 min, o plasma foi coletado e
mantido congelado at o momento das anlises laboratoriais a - 70oC.
Os dados do presente experimento foram comparados utilizando-se
teste de ANOVA para experimentos completamente casualizados. Na figura 1
esto representados os dados mdios (DP) obtidos. Nenhuma diferena
estatstica foi observada para os nveis plasmticos de cortisol entre os
grupos experimentais (F(4;25) = 0.799; P = 0,537).
O presente resultado indica que o EN utilizado no foi eficiente para
induzir elevao dos nveis plasmticos de cortisol. Dessa forma, qualquer
associao entre EC e EN no pode ter sido detectada ao avaliarem-se os
nveis plasmticos de cortisol. Baseado nesses dados, um novo experimento
foi delineado procurando-se testar um outro estressor (EN) para a induo do
estresse.
35
50
40
30
20
10
0
Figura 1. Resposta de estresse condicionada na truta arco-ris. Nenhuma
diferena estatstica foi encontrada entre os valores mdios
(DP) dos diferentes tratamentos (ANOVA; F(4;25) = 0.799; P =
0,537). Estmulo condicionado (EC) = ligar aerao; estmulo
no-condicionado (EN) = confinamento.
36
Experimento 2
Mtodos e resultados
Trinta trutas arco-ris provindas do estoque do CEH, peso mdio de
481,3 g 67,3 g, comprimento total mdio de 33,6 cm 1,2 cm, sexualmente
imaturas, de ambos os sexos e idade de 2 anos, foram alojadas em tanques
de fibra de plstico opaco (70 cm x 40 cm x 40 cm) situados exteriormente ao
laboratrio. Cada tanque recebia fluxo constante de 10L/min de gua do lago
Windermere (Inglaterra); possua uma tampa evitando qualquer contato dos
peixes com o pesquisador, evitando a associao do EN com outros
estmulos alm do EC e estava submetido a iluminao natural. Antes da
experimentao, os peixes foram alimentados trs vezes por semana. Dez
dias foram dados aos peixes para ajustarem-se s condies dos tanques
experimentais. Aps isso, o EC foi pareado com o estressor, confinamento
por restrio de espao pela diminuio do nvel de gua do tanque (EN),
durante 15 dias consecutivos. Ento, no 16o dia avaliou-se se o EC era capaz
de induzir uma resposta de estresse sem a presena do EN. O perodo de
condicionamento foi estendido para aumentar a possibilidade do aprendizado
da associao EC-EN. O EC foi alterado tambm, substituindo-se o ligar da
aerao por 1 min pela interrupo por 5 min do fluxo de gua que entrava no
tanque. Essa alterao foi necessria, pois o experimento estava sendo
conduzido em tanques externos, o que dificultaria a automatizao com
sistemas eltricos. Esse novo EC foi o mesmo utilizado com sucesso para
condicionar as trutas em cardumes (para detalhes ver Moreira et al., 2004). O
EN foi um perodo de 30 min de confinamento por restrio de espao,
37
realizado pela diminuio do nvel de gua do tanque, de ~ 25 cm at ~ 2 cm
de profundidade, produzida rapidamente pela liberao da gua pelo cano de
escoamento ( = 5 cm).
Cinco tratamentos foram realizados (n = 6 peixes cada): 1) controle,
sem manipulao ou estresse foi imposto aos peixes; 2) EC, o sinal
(interrupo do fluxo de gua que entrava no tanque) foi apresentado
diariamente durante 15 dias consecutivos; 3) EN10, os peixes foram
confinados diariamente exceto no dia da coleta de sangue; 4) EN11, os peixes
foram confinados diariamente incluindo o dia da coleta de sangue; 5)
condicionamento, os peixes foram condicionados por 15 dias (pareamento
EC-EN).
No 16o dia foi feita a coleta de sangue dos animais, de acordo com as
respectivas condies experimentais. Assim, nesse dia o EC era apresentado
no grupo condicionamento sem a imposio do confinamento (EN). O grupo
EC tambm recebia o sinal. Exatamente 30 min aps a apresentao do
sinal, o sangue dos peixes era amostrado em ambos os grupos EC e
condicionamento. Os grupos EN10 e controle no recebiam a imposio de
qualquer manipulao ou estresse. J os peixes do grupo EN11 foram
amostrados imediatamente aps a imposio do confinamento.
Para a coleta de sangue, os peixes foram capturados com uma rede e
imediatamente transferidos para um balde contendo anestsico (2-
fenoxietanol, 10 mL/ 5L de gua). Aps sedao completa o sangue foi
coletado por puno no sino branquial utilizando-se seringas heparinizadas.
Aps esse procedimento, o peso e o comprimento dos peixes foram aferidos
e ento os peixes eram sacrificados por contuso ceflica para determinao
38
do sexo. Aps centrifugar o sangue a 3500 rpm durante 5 min, o plasma foi
coletado e mantido congelado (-70oC) at o momento das anlises
laboratoriais.
teste de ANOVA para experimentos completamente casualizados,
complementado por teste HSD de Tukey. Na figura 2 esto representados os
dados mdios de cortisol plasmtico, dos quais o grupo EN11 foi
estatisticamente maior quando comparado com os nveis dos outros grupos
remanescentes que, por sua vez, foram estatisticamente similares entre si
(F(4;25) = 23,35; P < 0,0001).
O presente resultado mostra que o EN utilizado foi eficiente para
elevar os nveis plasmticos de cortisol, corrigindo o problema surgido no
experimento 1. Entretanto, o aprendizado da associao entre EC-EN no se
mostrou evidente. Apesar do EC utilizado, interrupo da entrada do fluxo de
gua no tanque, ter sido eficiente no estudo previamente realizado por
Moreira et al. (2004) em cardumes de truta, no presente experimento
utilizando-se trutas isoladas tal sinal no foi eficaz. No estudo de Moreira et
al. (2004), a interrupo no fluxo de gua pode no ter funcionado como um
sinal direto. Por exemplo, ao interromper o fluxo de gua as trutas que
nadavam contra a correnteza no tanque perdiam a formao de cardume.
Ento, possvel que a perda dessa formao de grupo tenha sido o EC.
Essa possibilidade explicaria porque as trutas em isolamento no
aprenderam a associao de estmulos proposta (EC-EN). Baseado nessa
suposio, um novo experimento foi delineado utilizando um sinal (EC)
admitido como mais evidente para as trutas.
39
Experimento 3
Mtodos e resultados
Dezoito trutas arco-ris provindas do estoque do CEH, peso mdio de
490,7 g 89,1 g, comprimento total de 34,8 cm 1,4 cm, sexualmente
imaturas, de ambos os sexos e idade de 2 anos, foram alojadas nos tanques
experimentais, em condies similares s do experimento anterior. Antes da
experimentao os peixes foram alimentados trs vezes por semana. Dez
dias foram dados aos peixes para ajustarem-se s condies dos tanques
experimentais. Os peixes foram submetidos a procedimentos de
condicionamento similares aos descritos no experimento anterior. Contudo, o
perodo de condicionamento utilizado foi reduzido para 10 dias. O novo EC
utilizado foi a emisso de um jato dgua atravs de uma pequena abertura
circular na superfcie da tampa ( = 3 cm) em direo superfcie d`gua do
tanque durante 15 s.
Neste experimento, apenas trs tratamentos foram realizados (n = 6
cada): 1) EC, o sinal (jato dgua) foi apresentado diariamente durante 10
dias consecutivos e no 11o dia o sangue era amostrado 30 min aps a
apresentao desse sinal; 2) condicionamento 30, os peixes foram
condicionados por 10 dias (pareamento EC-EN) e no 11o o EC era
apresentado sem a imposio do confinamento (EN) aos peixes desse grupo
e exatamente 30 min aps a apresentao do sinal o sangue dos peixes era
amostrado; 3) condicionamento 60, os procedimentos foram similares aos do
grupo anterior, porm o sangue dos peixes foi coletado 60 min aps a
apresentao do sinal. Neste experimento os nveis de cortisol foram
40
avaliados 30 e 60 min aps a apresentao do sinal porque se aventou a
possibilidade da resposta das trutas ao EC ter pico em um momento diferente
de quando o estressor est realmente presente. Os procedimentos para
coleta de sangue, processamento das amostras, biometria e sexagem dos
animais foram como os descritos para o experimento 2.
complementado por teste HSD de Tukey. Na figura 3 esto representados os
dados mdios de cortisol plasmtico. A resposta no grupo condicionamento
30 foi estatisticamente maior que a do grupo EC e similar ao do grupo
condicionamento 60; alm disso, esses dois ltimos grupos foram
estatisticamente similares entre si (F(2;15) = 4,24; P = 0,035).
O presente resultado sugestivo de que ocorra o condicionamento
pela associao entre EC-EN, sendo o melhor momento para avaliar essa
resposta 30 min aps a apresentao do EC. Com base nisso, para melhor
avaliar esse modelo de condicionamento na truta arco-ris um novo
experimento foi conduzido utilizando-se o delineamento completo (similar ao
experimento 2), contendo todos os controles necessrios.
41
50
40
30
b
20 ab
10 a
0
EC Condicionamento 30 Condicionamento 60
Figura 3. Resposta de estresse condicionada na truta arco-ris. Valores
mdios (DP) que no compartilham uma mesma letra so
estatisticamente diferentes (ANOVA; F(2;15) = 4,24; P = 0,035).
Estmulo condicionado (EC) = jato dgua; estmulo no-
condicionado (EN) = confinamento.
42
Experimento 4
Mtodos e resultados
Trinta trutas arco-ris provindas do estoque do CEH, peso de 500,9 g
88,2 g, comprimento total de 34,7 cm 1,8 cm, sexualmente imaturas, de
ambos os sexos e idade de 2 anos, foram alojadas nos tanques
experimentais, em condies similares s do experimento 2. Antes da
experimentao os peixes foram alimentados 3 vezes por semana. Dez dias
foram dados aos peixes para ajustarem-se s condies dos tanques
experimentais. O delineamento experimental foi tambm similar ao do
experimento 2, mas os procedimentos utilizados para o condicionamento
(EC, EN e dias de pareamento entre EC e EN) foram iguais aos do
experimento 3. Os procedimentos para coleta de sangue, processamento das
amostras, biometria e sexagem dos animais foram similares aos descritos
para o experimento 2. Porm, neste caso, alm do cortisol foi tambm
quantificada a glicose plasmtica nos animais (Mtodo de Trinder, 1969).
complementado por teste HSD de Tukey. Os nveis mdios de cortisol
plasmtico dos grupos EN11 e Condicionamento foram iguais entre si e
maiores quando comparado com os nveis dos demais grupos que, por sua
vez, foram estatisticamente similares entre si (Figura 4; F(4;24) = 15,37; P <
0,0001). Nenhuma diferena estatstica foi observada quando considerados
os nveis plasmticos de glicose (Figura 5; F(4;25) = 1,199; P = 0,34).
43
Esses resultados confirmam que o EC utilizado no foi um estressor
por si s, mas que evocou a RC aps perodo de condicionamento
(pareamento entre EC-EN). Porm, tal efeito ocorreu apenas na quantificao
do cortisol plasmtico, mas no da glicose sangnea. Assim, confirma-se
que o modelo testado para condicionamento pavloviano nas trutas arco-ris
em isolamento social foi adequado, como previamente demonstrado para o
peixe tilpia-do-Nilo (Moreira & Volpato, 2004). Com isso, pode-se seguir a
investigao para se avaliar a participao dos nveis de cortisol na memria
da truta arco-ris. A seguir, procurou-se determinar a concentrao adequada
de cortisol exgeno a ser implantado nos peixes.
44
60
b
50
b
40
30
20
a
10
a a
0
Figura 4. Resposta de estresse condicionada na truta arco-ris. Valores
mdios (DP) de cortisol plasmtica que no compartilham uma
mesma letra so estatisticamente diferentes (ANOVA; F(4;25) =
15.37; P < 0,0001). Estmulo condicionado (EC) = jato dgua;
estmulo no-condicionado (EN) = confinamento.
45
250
Glicose plasmtica (mg/dL)
200
150
100
50
0
Figura 5. Resposta de estresse condicionada na truta arco-ris. Os valores
mdios (DP) de glicose plasmtica no foram estatisticamente
diferentes (ANOVA; F(4;24) = 1,199; P = 0,34).
46
Etapa 2: testando o implante de cortisol
Nesta etapa foi avaliada a concentrao de cortisol ideal a ser
implantada nas trutas para futuros testes do efeito da elevao crnica dos
nveis plasmticos de cortisol na RC. A concentrao adequada foi
considerada aquela que permitiu detectar resposta de estresse nos peixes,
em termos de elevao plasmtica de cortisol, mesmo que esses j
possussem a linha basal dos nveis plasmticos de cortisol elevada. Um total
de dois experimentos foi realizado at obtermos uma concentrao
adequada. A estratgia bsica desses experimentos foi implantar intra-
peritonialmente o cortisol nos peixes e avaliar semanalmente os nveis de
cortisol basais e aps confinamento.
Num primeiro experimento, observou-se que nas concentraes
utilizadas (30, 60 ou 120 mg de hidrocortisona/mL de leo de coco) houve
desenvolvimento de doenas e alta mortalidade, o que sugere estado de
imunosupresso, uma caracterstica dos efeitos crnicos do cortisol (Barton,
2002). Alm disso, a reatividade do eixo hipotlamo-pituitria-interrenal no
foi evidente, no estando de acordo com as caractersticas necessrias para
os implantes, como dito anteriormente. As concentraes utilizadas foram
demasiadamente elevadas para serem utilizadas nos outros testes e um novo
estudo para determinao da concentrao ideal do implante foi necessrio.
A seguir sero relatados apenas os resultados do teste do implante que foi
bem sucedido.
47
Mtodos e resultados
Foram utilizadas 33 trutas arco-ris provindas do estoque do CEH,
peso de 519,4 g 124,9 g, comprimento total 35,8 cm 2,4 cm, sexualmente
imaturas, de ambos os sexos e idade de 2 anos. Vinte e sete dessas trutas
receberam cortisol exgeno (n = 21) ou veculo (Sham, n = 6) e as demais
permaneceram sem implante. Todas foram alojadas nos tanques
experimentais em condies iguais s utilizadas na Etapa 1.
A fonte de cortisol exgena foi obtida misturando-se a quantidade
desejada de hidrocortisona (sigma, CAS# 50-23-7) em leo de coco (veculo;
sigma, CAS# 8001-31-8). Trs diferentes concentraes de cortisol foram
testadas (n = 7 peixes cada): 4 mg/mL, 8 mg/mL e 16 mg/mL. No grupo Sham
os peixes receberam 1 mL de veculo (leo de coco). Para a implantao, os
peixes foram previamente anestesiados (2-fenoxietanol, 10 mL/ 5L de gua)
e 1 mL da soluo de cortisol foi aplicado atravs de uma pequena inciso
abdominal. Os procedimentos para coleta de sangue e estocagem do plasma
e aferio das medidas biomtricas e sexagem foram como descrito na Etapa
1.
Os nveis basais de cortisol e glicose entre os diferentes tratamentos
foram comparados pelo teste de Kruskal-Wallis ANOVA. Os nveis
plasmticos de cortisol induzidos pela implantao foram primeiramente
avaliados no 8o dia aps a implantao. Tais valores esto na Figura 6 e
mostram que apenas o grupo 16 mg/mL forneceu uma concentrao
plasmtica de cortisol estatisticamente maior que a dos controles (Kruskal-
Wallis ANOVA; P < 0,05).
48
Baseado nisso, apenas para os tratamentos controle, sham e 16
mg/mL continuaram a ser avaliados no 14o, 21o e 29o dias aps a
implantao, quando avaliou-se tambm os nveis de glicose. Nesse
seguimento, para se avaliar se os peixes implantados com cortisol (16
mg/mL) permaneciam reativos em termos de elevao do cortisol plasmtico
frente a estressor, os peixes dos grupos Sham e 16 mg/mL foram expostos
ao mesmo estressor (baixamento da gua do tanque), como usado no
condicionamento da Etapa 1 (experimentos 2, 3 e 4). Aps coleta de sangue
para os valores basais, os peixes recebiam esse estressor e 30 min aps
nova coleta de sangue era realizada.
As figuras 7 e 8 mostram, respectivamente, os valores basais de
cortisol e glicose obtidos ao longo do tempo. Nota-se que o cortisol
plasmtico continuou mais elevado no grupo 16 mg/mL. No caso da glicose,
houve uma tendncia de elevao progressiva ao longo do tempo no
tratamento 16 mg/mL, sendo significantemente maior que os outros dois
grupos apenas no 29o dia aps a implantao.
A resposta ao confinamento nos grupos estudados est expressa na
figura 9. No caso dos nveis de cortisol ou glicose antes e aps confinamento
os tratamentos foram comparados utilizando-se teste de Wilcoxon, enquanto
que os nveis basais desses parmetros entre os grupos Sham e 16 mg/mL
foram comparados pelo teste U de Mann-Whitney. Observa-se que o
confinamento induziu elevao dos nveis de cortisol e glicose em
comparao situao pr-exposio ao estressor para ambos os
tratamentos em todos os dias de amostragem, exceto para os nveis de
cortisol do tratamento 16 mg/mL no 21o dia. Considerando essa exceo do
49
21 dia, elaborou-se anlise de cut-off para os valores de cortisol, conforme
descrito em Moreira et al. (2004), classificando-se individualmente os peixes
como estressados ou no estressados. Dessa anlise, constatou-se que a
relao estressados:no estressados foi de 6:1, 5:2 e 6:1,
respectivamente nos dias 14, 21 e 29.
No conjunto, os resultados indicam que o implante de 16 mg/mL no
aboliu a reatividade do eixo hipotlamo-pituitria-interrenal ao estresse.
Assim, considerou-se essa concentrao de implante adequada para o teste
dos efeitos de cortisol na RC em trutas arco-ris, o que foi feito no
experimento a seguir.
50
40
controle
Cortisol plasmtico (ng/ml)
30
sham
20 4 mg/ml
8 mg/ml
a
10 a
a a
16 mg/ml
Figura 6. Efeito de implante de hidrocortisona nos nveis plasmticos de
cortisol na truta arco-ris 8 dias aps aplicao desse implante.
Valores mdios (DP) de cortisol plasmtico que no
compartilham uma mesma letra so estatisticamente diferentes
(Kruskal-Wallis ANOVA; P < 0,05).
51
50
b
controle
40
Cortisol plasmtico (ng/ml)
30
b
sham
20 b
10 a a a
a a 16 mg/ml
a
0
14o 21o 29o
Dia
Figura 7. Efeito de implante de hidrocortisona nos nveis plasmticos
de cortisol na truta Arco-ris. Valores mdios (DP) de cortisol
plasmtico que no compartilham uma mesma letra so
estatisticamente diferentes (Kruskal-Wallis ANOVA; P <
0,05).
52
150
b
b
controle
120
ab
Glicose plasmtica (mg/dl)
90
a
sham
a a
60 a
a a
30
16 mg/ml
0
14o 21o 29o
Dia
Figura 8. Efeito de implante de hidrocortisona nos nveis plasmticos
basais de glicose na truta arco-ris. Valores mdios (DP) de
glicose plasmtica que no compartilham uma mesma letra so
estatisticamente diferentes (Kruskal-Wallis ANOVA; P < 0,05).
53
dia 14 dia 14
140 140
*
*
120 120
100 100
Cortisol (ng/mL)
Glicose (mg/dL)
80 80 *
*
#
60 60
#
40 40
20 20
0 0
basal ps-confinamento basal ps-confinamento
Sham Implante 16 mg/mL Sham Implante 16 mg/mL
dia 21 dia 21
140 200
*
180
120 *
160 *
100 #
Cortisol (ng/mL)
Glicose (mg/dL)
140
120
80
100
60
80
40 60
# 40
20
20
0 0
dia 29 dia 29
140 180
*
* 160
120
# *
140
100
Cortisol (ng/mL)
Glicose (mg/dL)
120
80 100
60 80
* 60
40
40
20
#
20
0 0
Figura 9. Valores mdios (DP) de glicose e cortisol plasmtico em resposta
ao estresse em truta arco-ris implantada ou no com hidrocortisona.
* P<0,05, Teste de Wilcoxon; # P<0,05, Teste U de Mann-Whitney.
54
Etapa 3: efeitos do cortisol na resposta de estresse condicionada
em trutas arco-ris
Mtodos e resultados
Trinta trutas arco-ris provindas do estoque do CEH, peso mdio de
553,1 g 119,2 g, comprimento total de 37,1 cm 2,1 cm, sexualmente
imaturas, de ambos os sexos e idade de 2 anos, foram alojadas conforme
descrito na Etapa 1.
Basicamente, foram repetidos os mesmos procedimentos realizados
no experimento 4 da Etapa 1 para o condicionamento, mantendo-se o mesmo
EC e EN e o mesmo tempo de condicionamento (10 dias). Quatro
tratamentos experimentais foram conduzidos (n = 8 peixes cada): 1) Controle
Sham, os peixes receberam o implante sham (apenas o veculo leo de
coco) e no foram condicionados; 2) Controle Cortisol, os peixes receberam o
implante de 16 mg/mL de cortisol e tambm no foram condicionados; 3)
Condicionamento Sham, os peixes receberam o implante sham e foram
submetidos a 10 dias de condicionamento; 4) Condicionamento Cortisol,
peixes implantados com 16 mg/mL de cortisol foram submetidos a 10 dias de
condicionamento. O sangue de todos os peixes foi amostrado no primeiro dia
aps o trmino do condicionamento (no 11o dia) e posteriormente no 5o, 9o,
13o, 21o, 27o e 35o dias. Como realizado no experimento 4 da etapa 1, aps o
condicionamento o EC era apresentado sem a imposio do confinamento
(EN) aos peixes dos grupos com condicionamento (Condicionamento Sham e
55
Condicionamento Cortisol) e o sangue coletado exatamente 30 min aps a
apresentao desse sinal. Os procedimentos para coleta de sangue e
estocagem do plasma e aferio das medidas biomtricas e sexagem foram
como descrito na Etapa 1.
Os resultados de cortisol plasmtico esto apresentados na figura 10.
Como os grupos implantados com cortisol apresentavam valores basais
maiores que as condies Sham (estratgia metodolgica para avaliar o
efeito do cortisol na memria), a anlise da RC no pode ser feita pela
comparao da magnitude dos grupos condicionados (Condicionamento
Sham x Condicionamento Cortisol). Nesse caso, a anlise contemplou
apenas a existncia ou no do condicionamento em cada grupo. Para essa
constatao, cada um deles foi comparado com o respectivo controle:
Condicionamento Sham x Controle Sham e Condicionamento Cortisol x
Controle Cortisol. Todas essas comparaes foram feitas pelo teste t de
Student para amostras independentes.
Observou-se que durante a experimentao os nveis basais do
controle cortisol foram sempre estatisticamente maiores que os nveis do
controle sham (figura 10). Isso confirma que o implante forneceu
eficientemente uma condio basal de cortisol diferente entre os tratamentos.
Os nveis de cortisol para ambos os grupos condicionados foram
estatisticamente maiores que seus respectivos controles na amostragem do
1o dia aps o perodo de condicionamento, indicando a RC em ambas as
condies. Embora os nveis de cortisol do grupo condicionamento sham
tenham continuado maiores em relao a seu controle at a ltima
amostragem (no 35o dia aps o perodo de condicionamento), no grupo
56
cortisol a RC no ocorreu a partir da segunda amostragem (5 dia aps o
condicionamento).
Quanto glicose plasmtica, nenhuma diferena estatstica foi
observada entre os tratamentos ao longo do experimento (Figura 11). Ou
seja, assim como observado no experimento 4 da etapa 1, esta no foi
detectada como resposta de estresse em termos de RC em trutas arco-ris.
57
100
90 *
*
80 *
*
70
#
60 * *
50
* # #
40 #
*
#
30 # #
20
10
0
1 5 9 13 21 27 35
Dias aps termino do condicionamento
Controle sham Controle cortisol

Condicionamento sham Condicionamento cortisol
Figura 10. Efeitos do implante de hidrocortisona na resposta de estresse
condicionada em truta arco-ris. Valores mdios (DP) de cortisol foram
comparados usando-se teste T de Student para amostra independente: *
P<0,05, controle versus condicionado; # P<0,05, controle cortisol versus
controle sham. Estmulo condicionado (EC) = jato dgua; estmulo no-
condicionado (EN) = confinamento.
58
180
160
Glicose plasmtica (mg/dL)
140
120
100
80
60
40
20
0
1 5 9 13 21 27 35
Dias aps termino do condicionamento
Controle sham Controle cortisol

Condicionamento sham Condicionamento cortisol
Figura 11. Efeitos do implante de hidrocortisona na resposta de estresse
condicionada em truta arco-ris. Valores mdios (DP) de glicose foram
comparados usando-se teste T de Student para amostra independente.
Nenhuma diferena estatstica foi encontrada. Estmulo condicionado
(EC) = jato dgua; estmulo no-condicionado (EN) = confinamento.
59
Discusso
O presente estudo conclui que a administrao de cortisol em truta
arco-ris prejudica a recuperao mnemnica de uma resposta de estresse
condicionada. Esta a primeira demonstrao de um corticosteride
prejudicando a memria em um vertebrado no-mamfero. No caso dos
mamferos, tal efeito bem constatado, como pode ser visto em Dachir et al.
(1993), Luine et al. (1993, 1994), Arbel et al. (1994), Bodnoff et al. (1995),
Conrad et al. (1996), Krugers et al. (1997), Belanoff et al. (2001), Roozendaal
et al. (2001) e Roozendaal (2003). A descrio desse efeito em peixes
sugestivo de tratar-se de um fenmeno geral dos vertebrados.
No presente estudo, inicialmente demonstrou-se o condicionamento
pavloviano de uma resposta de estresse em trutas arco-ris mantidas
individualmente em tanques (Etapa 1). Os nveis de cortisol plasmtico
aumentaram significativamente quando apresentado o EC proposto (jato
dgua direcionado superfcie da gua do tanque), sem a necessidade da
presena do EN (confinamento), aps um perodo de condicionamento de 10
dias (pareamento dos estmulos EC-EN). O EC utilizado no foi estressor,
pois sua aplicao, mesmo que em dias sucessivos, no elevou os nveis de
cortisol. A aplicao do EN durante 10 dias consecutivos no ativou
cronicamente o eixo-HPI, pois o plasma amostrado um dia aps esse perodo
de condicionamento no tinha nveis elevados de cortisol. Assim, esse
modelo adequado para testar os efeitos do cortisol nessa RC das trutas. De
outro lado, a glicose no foi um bom indicador nesse tipo de teste, sugerindo
que a resposta adrenrgica nesse tipo de reao ao estresse (RC) possa no
60
estar presente, uma vez que a glicose um indicador indireto da atividade
das catecolaminas durante estresse agudo (Reid et al., 1992). No entanto,
este aspecto necessita mais investigaes.
A etapa seguinte deste estudo determinou que a dose de 16 mg/mL foi
a adequada para se induzir elevao dos nveis de cortisol para que seu
efeito sobre o condicionamento pudesse ser investigado (Etapa 2). Mais
ainda, nessa etapa demonstrou-se que esses nveis elevados de cortisol no
abolem a resposta de elevao do cortisol frente ao estressor, o que tambm
era uma condio necessria para o seguimento do estudo.
Aps essas padronizaes, na ultima etapa do presente estudo foi
avaliado o efeito da elevao dos nveis de cortisol na reteno da RC. Tanto
o grupo cujos peixes receberam implante de cortisol quanto os que s
receberam o veculo apresentaram RC 1 dia aps o perodo de
condicionamento. Contudo, a partir da segunda amostragem (5 dia aps o
condicionamento) apenas o grupo com cortisol no apresentou a RC, o que
mostra que o cortisol diminuiu o tempo de reteno dessa RC.
Apesar desse efeito sobre a memria, o presente estudo limitado
para se avaliar em que fase da memria tal efeito pode ter atuado. A
memria dividida em: aquisio, consolidao e extino. A aquisio
inferida da recuperao de um trao de memria (a resposta condicionada,
no caso). Porm, essa recuperao pode ocorrer apenas em curto espao de
tempo, no tendo ocorrido a consolidao. Caso ocorra consolidao, a
memria perdurar por mais tempo, chegando a atingir a formao de
memria intermediria a longo prazo, ou caso os traos tornem-se
permanentes, a memria ser de longo prazo. Contudo a memria pode ser
61
extinta, quando os traos de memria so perdidos. Como o implante de
cortisol foi aplicado antes do perodo de condicionamento, fica impossvel
avaliar exatamente a fase em que o cortisol trouxe prejuzo para a memria.
Aqui ambos os grupos condicionamento sham e cortisol exibiram a
RC, mostrando claramente que o cortisol no afetou a fase de aquisio da
RC. Por outro lado, 4 dias sem reforo da associao EC-EN (o intervalo de
tempo entre a primeira e a segunda amostragem de sangue) j foi suficiente
para extino da RC nos peixes com implante de cortisol. Esse aspecto pode
ser considerado por duas hipteses. Numa delas, o cortisol poderia ter
prejudicado a consolidao dessa RC, assim prejudicando a formao de
memria de longo prazo. Na outra, mesmo havendo a consolidao da RC, o
cortisol poderia ter facilitado a extino da RC aps a retirada do pareamento
EC-EN. H estudos abundantes em mamferos demonstrando efeitos
prejudiciais da elevao crnica de glicocorticides na consolidao da
memria (Bodnoff et al., 1995; Conrad et al., 1996; Park et al., 2001), os
quais nos levariam a considerar mais provvel a primeira hiptese. Contudo,
embora conseqncias negativas da elevao crnica de cortisol em
mamferos sejam mais freqentes, em alguns tipos de condicionamento,
especialmente sob condio estressante, esse hormnio pode melhorar a
consolidao da memria (Conrad et al., 1999). Alm disso, como
recentemente observado, trutas arco-ris selecionadas para alta reatividade
ao estresse em termos da magnitude dos nveis de cortisol tm extino da
RC antes das trutas selecionadas para baixa reatividade (Moreira et al.,
2004), indicando que o cortisol poderia desempenhar algum papel facilitador
na extino da memria em peixes. Isso refora a segunda hiptese
62
levantada acima. No entanto, a adequao dessas duas hipteses ainda
permanece para ser esclarecida em estudos futuros.
63
Referncias
64
Alcock JA, 1997. Animal behavior: An evolutionary approach. Sinauer
Associates. Inc., Massachusetts.
Alvarenga CMD, Volpato GL, 1995. Agonistic profile and metabolism in
alevins of the Nile tilpia. Physiol. Behav. 57, 75-80.
Arbel I, Kadar T, Silbermann M, Levy A, 1994. The effects of long-term
corticosterone administration on hippocampal morphology and cognitive
performance of middle-aged rats. Brain Res. 657, 227-235.
Barcellos LJG, Nicolaiewsky S, Souza SMG, Lulhier F, 1999. The effects of
stocking density and social interaction on acute stress response in Nile
tilapia Oreochromis niloticus (L.) fingerlings. Aquacult. Res. 30, 887-892.
Barton BA, Iwama GK, 1991. Physiological changes in fish from stress in
aquaculture with emphasis on the response and effects of corticosteroids.
Ann. Rev. Fish Dis. 10, 3-26.
Barton BA, 2002. Stress in fishes: A diversity of responses with particular
reference to changes in circulating corticosteroids. Integrat. Comp. Biol.
42, 517-525.
Belanoff JK, Gross K, Yager A, Schatzberg AF, 2001. Corticosteroids and
cognition J. Psych. Res. 35, 127-145.
Bodnoff SR, Humphreys AG, Lehman JC, Diamond DM, Rose GM, Meaney
MJ, 1995. Enduring effects of chronic corticosterone treatment on spatial-
learning, synaptic plasticity, and hippocampal neuropathology in young
and mid-aged rats. J. Neurosci. 15, 61-69.
Bonga SEW, 1997. The stress response in fish. Physiol. Rev. 77, 591-625.
Boujard T, Leatherland JF, 1992. Circadian-rhythms and feeding time in
fishes. Env. Biol. Fish. 35, 109-131.
65
Bry C, 1982. Daily variations in plasma-cortisol levels of individual female
rainbow-trout salmo-gairdneri - evidence for a post-feeding peak in well-
adapted fish. Gen. Comp. Endocrinol. 48, 462-468.
Carrieri MP, Volpato GL, 1991. Does snatching frequency really indicate food
ingestion in the Nile tilapia? Physiol. Behav. 50, 489-492.
Chrousos GP, Gold PW, 1992. The concepts of stress and stress system
disorders - overview of physical and behavioral homeostasis J. Am. Med.
Assoc. 267, 1244-1252.
Conrad CD, Galea LAM, Kuroda Y, McEwen BS, 1996. Chronic stress impairs
rat spatial memory on the Y maze, and this effect is blocked by tianeptine
pretreatment. Behav. Neurosci. 110, 1321-1334.
Conrad CD, Magarinos AM, LeDoux JE, McEwen BS, 1999. Repeated
restraint stress facilitates fear conditioning independently of causing
hippocampal CA3 dendritic atrophy Behav. Neurosci. 113, 902-913.
Crrea SA, Fernandes MO, Iseki KK, 2003. Effect of the establishment of
dominance relationships on cortisol and other metabolic parameters in
Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Braz. J. Med. Biol. Res. 36, 1725-
1731.
Dachir S, Kadar T, Robinzon B, Levy A, 1993. Cognitive deficits induced in
young-rats by long-term corticosterone administration. Behav. Neural Biol.
60, 103-109.
Fernandes MO, Volpato GL, 1993. Heterogeneous growth in Nile tilpia:
social stress and carbohydrate metabolism. Physiol. Behav. 54, 319-323.
66
Johnson EO, Kamilaris TC, Chrousos GP, Gold PW, 1992. Mechanisms of
stress - a dynamic overview of hormonal and behavioral homeostasis.
Neurosci. Biobehav. Rev. 16, 115-130.
Krugers HJ, Douma BRK, Andringa G, Bohus B, Korf J, Luiten PGM, 1997.
Exposure to chronic psychosocial stress and corticosterone in the rat:
Effects on spatial discrimination learning and hippocampal protein kinase
C gamma immunoreactivity. Hippocampus 7, 427-436.
Luine VN, Spencer RL, Mcewen BS, 1993. Effects of chronic corticosterone
ingestion on spatial memory performance and hippocampal serotonergic
function. Brain Res. 616, 65-70.
Luine V, Villegas M, Martinez C, Mcewen BS, 1994. Stress-dependent
impairments of spatial memory - role of 5-HT brain corticosteroid
receptors. Ann. New York Acad. Sci. 746, 403-404.
Merighe GKF, Pereira-da-Silva EM, Negro J, Ribeiro S, 2004. Effect of
background color on the social stress of Nile tilapia (Oreochromis niloticus).
Rev. Bras. Zootec. 33, 828-837.
Moberg, G.P., 2000. Biological response to stress: Implications for animal
welfare. In: Moberg GP, Mench JA. (Eds.), The Biology of animal stress:
basic principles and implications for animal welfare. CAB International,
British Library, London, pp. 1-21.
Moreira PSA, Pulman KGT, Pottinger TG, 2004. Extinction of a conditioned
response in rainbow trout selected for high or low responsiveness to
stress. Horm. Behav. 46, 450-457.
Moreira PSA, Volpato GL, 2004. Conditioning of stress in Nile tilapia. J. Fish
Biol. 64, 961-969.
67
Overli O, Winberg S, Damsgard B, Jobling M, 1998. Food intake and
spontaneous swimming activity in Arctic char (Salvelinus alpinus): role of
brain serotonergic activity and social interactions Can. J. Zool. 76, 1366-
1370.
Park CR, Campbell AM, Diamond DM, 2001. Chronic psychosocial stress
impairs learning and memory and increases sensitivity to yohimbine in
adult rats. Biol. Psych. 50, 994-1004.
Pavlov IP, 1927. Conditioned Reflexes. Oxford University Press, London.
Pickering AD, 1981. The concept of biological stress. In: Pickering AD. (Ed.),
Stress and Fish. London: Academic Press, pp. 1-10.
Pottinger TG, Carrick TR, 2001. Stress responsiveness affects dominant-
subordinate relationships in rainbow trout. Horm. Behav. 40, 419-427.
Reddy PK, Leatherland JF, 1994. Does the time of feeding affect the diurnal
rhythms of plasma hormone and glucose concentration and hepatic
glycogen content of rainbow trout. Fish Physiol. Biochem. 13, 133-140.
Reddy PK, Leatherland JF, 1995. Influence of the combination of time of
feeding and ration level on the diurnal hormone rhythms in rainbow trout
Fish Physiol. Biochem. 14, 25-36.
Reid SD, Moon TW, Perry SF, 1992. Rainbow-trout hepatocyte beta-
adrenoceptors, catecholamine responsiveness, and effects of cortisol.
Am. J. Physiol. 262, R794-R799.
Roozendaal B, 2003. Systems mediating acute glucocorticoid effects on
memory consolidation and retrieval Progress in Neuro-Psychopharmacol.
Biol. Psych. 27, 1213-1223.
68
Roozendaal B, Phillips RG, Power AE, Brooke SM, Sapolsky RM, McGaugh
JL, 2001. Memory retrieval impairment induced by hippocampal CA3
lesions is blocked by adrenocortical suppression. Nat. Neurosci. 4, 1169-
1171.
Sakakura Y, Tsukamoto K, 1999. Ontogeny of aggressive behaviour in
schools of yellowtail, Seriola quinqueradiata. Environ. Biol. Fish. 56, 231-
242.
Schreck CB, 1981. Stress and compensation in teleostean fishes: response to
social and physical factors. In: Pickering AD (Ed.). Stress and Fish.
London: Academic Press, pp. 295-321.
Sloman KA, Gilmour KM, Taylor AC, Metcalfe NB, 2000a. Physiological
effects of dominance hierarchies within groups of brown trout, Salmo trutta,
held under simulated natural conditions Fish Physiol. Biochem. 22, 11-20.
Sloman KA, Gilmour KM, Metcalfe NB, Taylor AC, 2000b. Does socially
induced stress in rainbow trout cause chloride cell proliferation? J. Fish
Biol. 56, 725-738.
Sloman KA, Motherwell G, O'Connor KI, Taylor A, 2000c. The effect of social
stress on the Standard Metabolic Rate (SMR) of brown trout, Salmo trutta
Fish Physiol. Biochem 23, 49-53.
Sloman KA, Metcalfe NB, Taylor AC, Gilmour KM, 2001. Plasma cortisol
concentrations before and after social stress in rainbow trout and brown
trout. Physiol. Biochem. Zool. 74, 383-389
Trinder P, 1969. Determination of blood glucose using an oxidase-peroxidase
system with a non-carcinogenic chromogen. J. Clin. Pathol. 22, 158-161.
69
Volpato GL, Fernandes MO, 1994. Social control of growth in fish. Braz. J.
Med. Biol. Res. 27, 797-810.
Volpato GL, Frioli PMA, Carrieri MP, 1989. Heterogeneous growth in fishes:
some new data in the Nile tilapia, Oreochromis niloticus, and a general
view about the causal mechanisms. Bol. Fisiol. Anim. 13, 7-22.
70

Zoologia Do 2006 Rodrigo Barreto

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Julio de Mesquita Filho

Efeitos de estressores e do cortisol na memria

Rodrigo Egydio Barreto

Orientador: Dr. Gilson Luiz Volpato

Tese apresentada ao Instituto de

Laboratrio de Fisiologia e Comportamento Animal do Departamento de

Fisiologia do Instituto de Biocincias de Botucatu UNESP e parcialmente no

CEH Centre for Ecology and Hydrology Lancaster Environmental Centre

Bailrigg Lancaster Inglaterra. Este trabalho teve apoio financeiro do

Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico CNPq

(Processo: 140307/2002-8) e Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal

de Nvel Superior (Processo: BEX 0182/04-4).

Aquele que mestre na arte de viver bem faz pouca

Gostaria de expressar minha profunda gratido s pessoas que me ajudaram

Ao meu orientador de vrios anos e principalmente amigo Gilson L.

inicialmente apresentamos alguns conceitos dessas duas reas que

permeiam os estudos apresentados neste trabalho.

O estresse um fenmeno que tem sido amplamente estudado, tanto

por razes tericas quanto pelas suas implicaes em atividades zootcnicas

de interesse econmico. O estresse conceituado como um estado do

organismo frente situaes de ameaa da perda da homeostase causada por

algum fator (o estressor). Esse estado implica num conjunto relativamente

padronizado de respostas bioqumicas, fisiolgicas e comportamentais.

Pickering (1981) apresenta o quadro geral de estresse em peixes. Segundo

ele, o estressor provoca estimulao no sistema nervoso autnomo simptico

que libera das clulas cromafins da interrenal catecolaminas para o sangue;

estimula tambm o eixo HPI (hipotlamo-pituitria-interrenal), que libera

corticosterides para a circulao. Dessas respostas primrias so induzidas

o organismo se ajustar ameaa imposta pelo estressor. Se esses

mecanismos de resposta persistem respostas tercirias ocorrem, como

imunossupresso, reduo ou inibio do crescimento e funes

reprodutivas. Temporalmente, as respostas primrias e secundrias podem

ocorrer em segundos, ou algumas horas ou dias; as tercirias geralmente

estado de estresse aquele em que o organismo usa de suas reservas para

enfrentar a situao de ameaa (estressor), e o estado de distresse ocorre

quando essas reservas so levadas a limites extremos e o uso de energia e

outros processos. No presente estudo, centramos as investigaes sobre o

estresse principalmente a partir de medidas de cortisol, considerado um dos

principais indicadores de estresse em peixes (Barton & Iwama, 1991; Bonga,

Gold, 1992). Em alguns casos, a glicose foi tambm avaliada como

A partir de estudos em peixes, Moreira & Volpato (2004) propem que

os estressores sejam divididos como: a) aqueles em que h ao fsica do

estressor sobre o animal agredido; b) aqueles que decorrem da percepo de

um coespecfico estressado; e c) aqueles que so induzidos pela

recuperao mnemnica de experincia estressora anterior (lembrana). Este

terceiro tipo de estressor foi descrito em peixes apenas recentemente

avaliado, necessrio que se induza essa lembrana no animal, o que na

presente tese foi sempre realizado por condicionamento clssico.

O condicionamento clssico foi descrito em 1927 por Ivan Petrovich

Pavlov, um fisiologista russo nascido em 1849 na cidade de Ryazan. Trata-se

de um processo de aprendizagem que consolida associao entre estmulos,

de forma que a reao do animal emitida a um desses estmulos passa, por

esse condicionamento, a ser emitida tambm a outros estmulos. No exemplo

clssico, Pavlov mostrou que o estmulo carne (estmulo no

condicionado - EN) provocava salivao (resposta no condicionada -

RN) em ces. Ao contrrio, o som de uma campainha no provocava essa

quando apresentava novamente apenas o som da campainha, os ces

salivavam. Ou seja, o significado de um estmulo (carne moda) foi

incorporado ao outro estmulo (som) por meio de experincias sucessivas, o

que caracteriza esse tipo de aprendizagem. Assim, denominou de estmulo

condicionado (EC) o som da campainha aps os ces terem incorporado

essa associao e resposta condicionada (RC) a salivao induzida pelo

Considerando que foi mostrado que os peixes emitem resposta de

estresse em termos de elevao dos nveis de cortisol plasmtico, neste