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Eficcia de agentes

antimicrobianos em
biofilmes para o controle de
contaminao na indstria
de domissanitrios
Autores: Eliane Gama Lucchesi1, Slvia Yuko Eguchi2
e ngela Maria Moraes1
1
Departamento de Processos Biotecnolgicos,
Faculdade de Engenharia Qumica, Eliane Gama Lucchesi
Universidade Estadual de Campinas Slvia Yuko Eguchi
2
Dosage Pesquisas Laboratoriais, Investiga Institutos
ngela Maria Moraes
de Pesquisa
Contato: ammoraes@feq.unicamp.br

podem-se citar polissacardeos, protenas, cidos nu-


1. Introduo clicos e fosfolipdios [2]. Assim, esta matriz extracelular
formada em parte pelas prprias clulas, podendo tam-
Biofilmes microbianos tm sido estudados nos mais bm incluir componentes do ambiente, como detritos,
diferentes segmentos industriais, onde so os principais materiais inorgnicos e at mesmo outros organismos.
causadores de contaminaes de difcil controle. Os biofilmes asssociados a doenas tm sido deta-
O histrico de problemas com biofilmes est invaria- lhadamente estudados nas reas de medicina e odonto-
velmente presente em todos os segmentos industriais logia, nas quais os problemas gerados so mais crticos
que possuem gua em seu sistema, tais como: torres de por envolver diretamente vidas humanas. Nestes casos,
resfriamento, sistemas de tratamento de gua (resinas ocorrem principalmente porque os fluidos corpreos so
de troca inica, osmose reversa) e em todos os demais excelentes meios de cultivos, provendo nutrientes varia-
sistemas que tenham quaisquer fluidos em circulao. dos para os micro-organismos. Estima-se que os biofil-
Biofilmes microbianos so definidos como associa- mes estejam envolvidos em 65% dos casos de infeces
es de clulas bacterianas e de fungos [1], inclusas em humanas de origem bacteriana [3]. Dispositivos mdicos
uma complexa matriz polimrica extracelular (MPE). A propcios colonizao por biofilmes, como catteres,
MPE possui variada composio qumica, e no somen- so responsveis diretos pelo fracasso de muitos trata-
te prov a estrutura orgnica do biofilme, como tambm mentos tradicionais [4], pois permitem a instalao de
facilita o arranjo espacial das diferentes espcies que o micro-organismos de difcil controle e que apresentam
compem. Dentre os principais componentes da MPE maior resistncia erradicao por agentes antimicro-

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bianos como antibiticos, biocidas e desinfetantes [5] do para inibir ou erradicar cepas causadoras de infeces.
que as clulas planctnicas, pioneiras na formao de Os testes da CIM e da CMM so ensaios padres para
biofilmes. verificar a susceptibilidade de clulas planctnicas a an-
Supe-se que menos de 10% dos micro-organismos tibiticos. Devido reprodutibilidade, os testes de CIM
presentes num sistema sejam, de fato, clulas planct- e CMM passaram a ser utilizados para auxiliar na de-
nicas, estando mais de 90% na forma de biofilmes [6]. finio de dosagem mnima de outros antimicrobianos,
Nas comunidades microbianas possvel observar in- tais como conservantes necessrios para preservao
teraes de mutualismo, comensalismo, antagonismo e de produtos com gua em sua composio.
saprofismo, responsveis pela estabilizao do sistema, Entretanto, em se tratando de biofilmes, este mtodo
podendo ocorrer entre micro-organismomicro-organis- no deve ser aplicado, pois os ensaios de susceptibilida-
mo ou micro-organismoorganismo multicelular [2]. de mostram que a concentrao de agente ativo para a
A formao do biofilme est diretamente relacionada erradicao do biofilme de 100 a 1.000 vezes maior do
adeso celular. Dentre os fatores que do incio ao pro- que a determinada para clulas planctnicas [6]. Esta re-
cesso de adeso esto as cargas superficiais da parede sistncia d-se principalmente pela MPE e pela compo-
celular das bactrias. A presena de fmbrias e pilis e sio da membrana externa e da parede celular, e ocor-
fatores genticos inerentes possibilitam sua interao re predominantemente com bactrias Gram-negativas
com variados tipos de superfcies [7], [8]. [10]. Degradao e inativao dos biocidas por enzimas
Segundo a American Society for Microbiology [9], a e metablitos das clulas do biofilme podem ocorrer [11],
formao do biofilme divide-se em cinco etapas conse- diminuindo drasticamente a sua eficcia na erradicao
cutivas. A etapa inicial, de adsoro reversvel, ocorre das clulas.
em segundos, e nela predominam as foras fracas de Variados sistemas vm sendo utilizados para o de-
atrao. Em seguida, ocorre uma etapa de adeso ir- senvolvimento controlado de biofilmes in vitro para que
reversvel, na qual predominam foras fsicas e qumi- se possa testar, de forma mais precisa e reprodutvel,
cas, que duram de segundos a horas. Aps esta etapa, sua susceptibilidade aos antimicrobianos, determinando
por perodos de horas a dias, ocorrem o crescimento e a concentrao inibitria mnima para clulas ssseis
a diviso celular, seguidos da formao da MPE [10]. e da concentrao inibitria mnima de erradicao de
Finalmente, na quinta e ltima etapa, ocorre a adeso biofilmes (CIMEB) [12]. Sistemas como a imobilizao
de outros organismos e a liberao de micro-colnias de clulas em hidrogis, o cultivo celular em quimios-
microbianas, que prolongam por perodos de dias as tatos, o uso de fermentador de filme com espessura
meses [10]. constante, reatores de fluxo simples, o dispositivo de
Durante a adeso, as clulas modificam seu fenti- Robbin modificado e o cultivo de clulas em placas
po em funo da proximidade do suporte, respondendo com micro-poos como o dispositivo MBEC podem
s condies ambientais com padres de crescimento ser empregados [1]. Entretanto, questes frequentes
diferentes dos observados em clulas livres [8]. Alm como a dificuldade de operao e os custos elevados
da maior resistncia a agentes antimicrobianos, outros limitam seu emprego como mtodos de uso rpido para
problemas esto associados presena dos biofilmes, o diagnstico de problemas e a proposio de possveis
dentre estes, maior populao em comparao de solues.
clulas planctnicas (podendo chegar a valores de at Como alternativa aos sistemas citados anteriormen-
10 a 10 UCF/mL), maior dificuldade de remoo das
11 12
te, foi desenvolvida uma estratgia baseada no uso
clulas do sistema, limpeza, manuteno de equipamen- de esferas de vidro como suporte para a formao de
tos, chegando at os efeitos deletrios sobre o produto biofilmes sob condies cisalhantes e em sua utilizao
final [10]. para a determinao da CIM e da CIMEB em processos
A anlise da concentrao inibitria mnima (CIM) e contaminados com micro-organismos ssseis [13]. Tal
da concentrao de morte mnima (CMM) muito utiliza- estratgia permite gerar biofilmes in vitro de foram rpi-
da na rea mdica e veterinria com intuito de se verifi- da e simultnea, de forma a possibilitar a realizao de
car a dosagem mnima de antimicrobianos necessrios testes com variados tipos de agentes antimicrobianos,

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de forma simples, rpida, verstil, reprodutiva e menos
dispendiosa em comparao aos dispositivos encon-
trados no mercado. Esta abordagem j foi testada com
sucesso na determinao da CIM e da CIMEB em amos-
tras de fluido de corte provenientes de processos de usi-
nagem de metais contaminados por micro-organismos Solues integradas
formadores de biofilmes [13]. Alm do vidro, outros tipos
de materiais podem ser utilizados como suporte para para seu projeto de
o desenvolvimento de biofilmes, como ao inoxidvel e
PVC, de uso comum em processos industriais.
sala limpa
Um dos setores industriais que apresenta proble-
mas com contaminao microbiana disseminada por
biofilmes o da produo de domissanitrios. Este seg-
mento passou por grandes mudanas em 2009, quando
a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA),
atravs da RDC 035/2008, proibiu a utilizao de formal-
dedo como conservante nestas formulaes.
Devido ao microbicida e microbiosttica do for- Produtos Swell:
maldedo, a maior parte das ocorrncias de contamina-
Divisrias / Portas / Visores / Pass-trough
o no processo fabril de domissanitrios era, de certa
Acessrios / Sistema de ar condicionado para reas
forma, corrigida com suplementao do conservante,
uma vez que o baixo custo do formaldedo permitia o
classificadas / Controles de temperatura
aumento na dosagem usada. Com a proibio do uso Umidade / Pureza do ar / Gradiente de presso
de formol, buscar alternativas de preservao passou a
ser premente.
Devido intensa contaminao por biofilmes nos
processos de fabricao, proveniente de vrios fatores,
a simples troca do formaldedo por outros agentes anti-
microbianos foi, num primeiro momento ineficaz, criando
a necessidade de repensar todos os conceitos no que
se refere contaminao microbiana neste segmento.
No presente estudo, o uso da tcnica de esferas de
vidro foi avaliada para o estabelecimento da dosagem
de erradicao de biofilmes e da estratgia de tratamen-
to para o controle da contaminao em duas indstrias
do setor domissanitrio, que apresentavam graves
problemas de contaminao microbiana. A eficcia dos
antimicrobianos em clulas ssseis, pela abordagem de
desenvolvimento dos biofilmes em de esferas de vidro,
foi comparada com a erradicao das clulas planctni-
cas pela anlise da CIM tanto em detergentes quanto em
amaciantes de roupas, que apresentaram problemas de
contaminao. Testes comparativos, empregando a me- Rua Caravelas, 225 Jd. Vale do Sol
todologia j estabelecida baseada no sistema MBEC, So Jos dos Campos SP CEP 12238-170
foram realizados, assim como ensaios empregando es-
Tel.: (12) 3939.5854 comercial@swell.eng.br
feras de ao inoxidvel em substituio s de vidro.

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235 (soluo aquosa de cloreto de alquil dimetil benzil


amnio), gentilmente cedidos pela empresa IPEL Itibanyl
2. Material e mtodos Produtos Especiais Ltda. (Jarinu, SP, Brasil). O produto
BHD-208 empregado como agente preservante de
2.1. Material formulaes, enquanto o BP-600 e o BP-610 so utili-
No caso de detergentes, para efetuar os ensaios de zados como sanitizantes industriais e o BHD-235, como
formao de biofilme e anlise de sua susceptibilidade desinfetante domstico.
a biocidas foi utilizado como inculo uma alquota de Como diluente e soluo de lavagem foram utilizadas
detergente contaminado misturada a micro-organismos gua destilada estril e/ou soluo de NaCl a 0,9% (m/v),
coletados na superfcie dos tanques, na forma de pool, conforme sugerido por Capelletti et al. (2005)[14].
tendo-se por objetivo obter um consrcio microbiano em
que foram preservadas as interaes entre os micro- 2.2. Determinao da concentrao inibitria
-organismos e o meio ao qual estavam adaptados. Os mnima (CIM) e da concentrao mnima de morte
micro-organismos foram coletados, com o auxlio de uma (CMM) para clulas planctnicas
haste flexvel com ponta de algodo estril (Swab), nas Todos os ensaios de anlise de eficcia de agentes
superfcies dos tanques de ao inoxidvel utilizados na para o controle de biofilmes e clulas planctnicas con-
fabricao de detergente e transferidos para meio de cul- taminantes foram realizados nos Laboratrios da IPEL
tura para crescimento de bactrias. Aps a proliferao Itibanyl Produtos Especiais Ltda. Os testes foram exe-
celular, a cultura foi dividida em cinco partes iguais, em cutados em cabine de segurana biolgica (VLFS-12,
frascos de vidro para reagentes (tipo Schott) contendo Veco), em sala controlada com presso positiva.
meio de cultura lquido e estril. Este inculo foi mantido Para a determinao da CIM, foi utilizado como in-
refrigerado. Nos estudos enfocando o amaciante, o incu- culo, em ambos os casos, suspenses microbianas com
lo consistiu do prprio amaciante de roupas contaminado. concentraes ajustadas em 1,0x108 UFC/mL com TSB.
No foi possvel efetuar a proliferao e a manuteno do Foram preparadas, isoladamente, solues dos qua-
inculo em meios de cultura, pois os micro-organismos tro antimicrobianos com concentraes iniciais ao dobro
contaminantes deste produto no se multiplicavam na au- das concentraes normalmente utilizadas. Estas solu-
sncia do amaciante. Foram estudadas duas empresas es foram diludas de forma seriada, na proporo de
situadas no Estado de So Paulo (Brasil). 1:1 (v/v), com meio TSB previamente contaminado com
Para a propagao celular, a anlise de bactrias 1% (v/v) de cada inculo, at que se atingisse 1,56%
heterotrficas totais, a formao de biofilmes e para os da concentrao inicial de cada biocida. Para tal, foram
ensaios de susceptibilidade microbiana aos biocidas empregados 3mL de soluo de biocida e 3mL do meio
foram utilizados os meios de cultivos Tryptic Soy Agar de cultura TSB em cada etapa da diluio, totalizando
(TSA) e Tryptic Soy Broth (TSB), ambos da Difco. Para sete transferncias. Os tubos controle continham: meio
o desenvolvimento dos biofilmes foram utilizados tubos de cultura TSB como controle negativo, meio de cultura
de ensaio com tampa de rosquevel de 16mm x 100mm com o inculo como controle positivo, e meio de cultura
contendo esferas de vidro de 0,85mm de dimetro m- contendo biocida para o controle da turbidez. O cresci-
dio (modelo U 20, S Esferas, So Paulo, SP, Brasil) ou mento bacteriano foi evidenciado pela turbidez do meio
esferas de ao inoxidvel de 1,0mm de dimetro mdio de cultura. A menor concentrao na qual no houve
(AISI 304L - Nacional Esferas Ltda.). crescimento foi assumida como a concentrao inibit-
Para o estudo foram utilizados biocidas comercial- ria mnima.
mente disponveis: BHD-208 (soluo aquosa de 2-bro- Aps a leitura dos resultados da CIM, de cada um
mo-2nitropropano-1,3-diol, 5-cloro-2-metil-4isotiazolin- dos tubos que no apresentaram crescimento microbia-
-3ona e 2-metil-4-isotiazolin-3-ona), BP-600 (soluo no visvel a olho nu, foi retirada uma alquota de 10L
aquosa de 1,5-pentanodial), BP-610 (soluo aquosa com uma ala de inoculao calibrada, que foi estriada
de cloreto de alquildimetil benzil amnio, polihexameti- na superfcie do meio de cultivo TSA solidificado em pla-
lenoguanidina hidroclorada e 1,5-pentanodial) e BHD- cas de Petri, para a verificao de crescimento celular. A

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menor concentrao de cada agente antimicrobiano na tantes foram semeadas (por estrias) em meio de cultivo
qual no se verificou crescimento celular foi assumida TSA devidamente distribudo e solidificado em placas
como a CMM. de Petri. A menor concentrao na qual no se verificou
crescimento de clulas foi denominada concentrao
2.3. Formao de biofilme na superfcie de mnima de erradicao de biofilme (CMEB).
esferas de vidro ou ao inoxidvel e anlise de sua
susceptibilidade aos antimicrobianos 2.4. Formao de biofilmes no dispositivo
Os ensaios foram realizados com base na metodolo- MBECHTP e anlise de sua susceptibilidade aos
gia descrita por Lucchesi [15]. Para cada tipo de contami- antimicrobianos
nante os ensaios foram efetuados em triplicata, empre- Assim como no procedimento envolvendo esferas de
gando os quatro biocidas em diferentes concentraes. vidro, o ensaio com o dispositivo MBEC-HTP, produzido
Alquotas de 0,3g de esferas de vidro ou ao inoxidvel em poliestireno, foi realizado em duas etapas, onde numa
previamente lavadas foram acondicionadas em tubos de se inocula o contaminante formador de biofilme e nou-
ensaio com tampa de rosca (16mm x 100mm) e a cada tra onde se avalia seu comportamento frente a agentes
um dos tubos foram adicionados 4,5mL de cada suspen- antimicrobianos. A primeira etapa envolve um dispositivo
so microbiana contaminante (contendo 1,0 x 108 UFC/ formado por uma base retangular escavada provida de
mL), alm de 0,5mL de meio de cultivo TSB. Os tubos fo- 8 canais, onde colocada a populao contaminante, e
ram colocados em um homogeneizador (modelo AP-22, uma tampa com 96 pinos onde as clulas se fixam, for-
Phoenix) e foram agitados por movimentos rotacionais mando o biofilme. Na segunda etapa, a tampa contendo
(4 a 5 rpm) em estufa (modelo 320 L, Tecnal) ajustada os pinos transferida para uma nova base onde se en-
temperatura de 361C por 48 horas para a gerao dos contram 96 poos preenchidos com solues de biocidas
biofilmes em condies cisalhantes. e de amostras para a realizao de ensaios controle.
Aps a incubao, as esferas de vidro ou ao ino- Assim, para a primeira etapa, em bases distintas
xidvel foram removidas com o auxlio de uma cureta, foram adicionados 22 mL de cada um dos inculos pa-
transferidas para novos tubos de ensaios estreis, e la- dronizados (1,0x108 UFC/mL), e 2 mL de meio de cultura
vadas por duas vezes com gua destilada estril para a TSB. Os dispositivos foram tampados e transferidos para
remoo das clulas no aderidas e dos nutrientes em uma mesa agitadora com movimentos oscilatrios (4 a 5
contato com as partculas. Aps a lavagem foram adicio- oscilaes por minuto e inclinao de 5), posicionando-
nados 2,5mL do meio de cultura TSB e 2,5mL de soluo -os de forma que o fluxo do meio de cultura na base do
aquosa dos quatro biocidas testados nas concentraes dispositivo ficasse direcionado no sentido dos canais. O
de 1%, 5%, 10%, 15% e 20% (em massa) de cada produ- crescimento microbiano foi efetuado em estufa (modelo
to. Os tubos foram ento incubados em estufa a 361C 320 L, Tecnal) a 361C, por 48 horas para permitir a for-
por mais 24 horas, no caso das amostras provenientes mao dos filmes em cada um dos pinos com populao
do processo de produo de detergente, e por 3 horas microbiana superior a 1,0x10 6 UFC/pino.
no caso da amostra de amaciante contaminado. Aps Aps a incubao, a tampa do dispositivo MBEC
o perodo de incubao, as solues de biocidas foram foi retirada e lavada por duas vezes com soluo salina,
drenadas e as esferas lavadas com gua destilada estril para remoo das clulas planctnicas. Esta lavagem foi
por duas vezes. Em cada tubo foi adicionado 5mL de meio efetuada colocando-se a tampa do dispositivo em uma
de cultivo TSB, que foram sonicados (modelo USC1450, placa do tipo ELISA com 96 poos, contendo 0,2mL de
25 khz, Thornton) por 30 minutos para a desagregao soluo salina estril por poo. Aps a lavagem, a tampa
dos biofilmes e, aps 24 horas de incubao, a turvao do dispositivo foi encaixada em outra microplaca do tipo
ou no dos meios de cultivo foi analisada visando deter- ELISA com 96 orifcios, cada um contendo 0,1mL das di-
minar a menor concentrao de cada microbicida capaz ferentes concentraes dos biocidas e 0,1mL do meio de
de inibir o crescimento das clulas ssseis, ou seja, a cultura TSB, de modo a encaixar um pino em cada poo.
concentrao inibitria mnima de biofilme (CIMB). Para As placas foram incubadas a 361C por 24 horas. Aps
os tubos sem turvao, as suspenses celulares resul- o perodo de incubao, a tampa foi novamente lavada

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com soluo salina e colocada em uma nova microplaca recomendadas pelo fabricante [18] (estabelecidas com
contendo 200L de meio TSB fresco por poo. Aps 30 base em valores superiores CIM e CMM, na tentativa
minutos de sonicao, a placa foi incubada por mais 24 de antever e prevenir contaminaes em produtos aca-
horas, quando, ento, foi analisado o crescimento celu- bados e que variam de acordo com o tipo de aplicao)
lar por turbidez ou por estrias em meio TSA. A menor so de 1.000 a 2.000 ppm para o produto BHD-208, de
concentrao na qual no foi verificado o crescimento de 10.000 a 50.000 ppm para o BP-600 e o BP-610, e de
clulas foi denominada concentrao mnima de erradi- 5.000 a 10.500 ppm para o BHD-235.
cao do biofilme (CMEB). Os resultados apresentados nas Tabelas 1 e 2 cor-
roboram as afirmaes anteriores para as amostras de
2.5. Caracterizao das clulas contaminantes do detergente contaminado tratadas com os antimicrobia-
amaciante nos testados. Enquanto os dados coletados para micro-
A identificao dos micro-organismos contaminan- -organismos planctnicos (Tabela 1) apontam eficcia
tes do amaciante foi efetuada pela equipe do Prof. Dr. dos quatro microbicidas utilizados em concentraes
Welington Luiz de Arajo, da Universidade de Mogi das muito abaixo das indicadas pelo fabricante, os resulta-
Cruzes (So Paulo). Uma amostra representativa do dos obtidos para clulas em biofilmes mostram que as
amaciante contaminado foi inoculada em meio de cultura concentraes requeridas para o controle da contamina-
TSB a 10% e aps 72 h, foi realizada a extrao de DNA o so, de fato, muito superiores.
total. O gene 16S rRNA foi parcialmente amplificado por Quando comparados os resultados das duas tabelas
PCR e os fragmentos amplificados foram clonados em pode-se verificar o aumento significativo das dosagens
E. coli. A biblioteca de clones resultante foi caracteriza- para erradicao dos biofilmes formados em relao aos
da por ARDRA, utilizando-se as enzimas de restrio
HaeIII e HhaI. Clones divergentes foram identificados Tabela 1
por sequenciamento. A anlise fentica foi realizada
CIM (ppm de CMM (ppm de
Agente antimicrobiano
com o programa MEGA 4.0 e a rvore de similaridade foi agente ativo) agente ativo)
construda pelo mtodo de neighbour-joining. BHD-208 13,5 13,5
BP-600 10,5 10,5
BP-610 10,0 10,0
3. Resultados e discusso BHD-235 9,0 9,0

Resistncia dos micro-organismos oriundos do


Agentes microbicidas com ao preservante (ou processo de produo de detergente aos agentes
conservante) so aqueles que impedem ou retardam a antimicrobianos testados, para clulas planctnicas,
deteriorao de um produto acabado [16], normalmente em termos de concentrao inibitria mnima (CIM)
e concentrao mnima de morte (CMM).
possuindo como caractersticas a dupla ao de redu-
zir a contaminao inicial e de preservar o material de
interesse por longos perodos. Os agentes sanitizantes, Tabela 2
por outro lado, reduzem o nmero de contaminantes CIMB (ppm de CMEB (ppm de
Agente antimicrobiano
agente ativo) agente ativo)
bacterianos a nveis relativamente seguros [17], geral-
BHD-208 16.200 40.250
mente apresentando ao de morte microbiana rpida
(da ordem de horas). A clara diferenciao entre estes BP-600 10.005 10.005

dois tipos de produtos de relevncia na discusso de BP-610 10.000 10.000

resultados como os apresentados a seguir. BHD-235 10.800 10.800

Resistncia de biofilmes formados na superfcie de


3.1. Formao e teste de susceptibilidade do esferas de vidro a partir de micro-organismos oriundos
do processo de produo de detergente aos agentes
biofilme desenvolvido na superfcie das esferas de
antimicrobianos em termos de concentrao inibitria
vidro a partir de detergente contaminado mnima para biofilmes (CIMB) e concentrao mnima
No caso dos produtos testados, as concentraes de erradicao de biofilmes (CMEB).

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resultados obtidos para as clulas planctnicas. Varia- formados nos dois tipos de materiais (Tabela 5). Pos-
es de 953 a 1200 vezes foram notadas na CIMB em sivelmente, os biofilmes formados em vidro e em ao
relao CIM, e de 953 a 2981 para a CMEB em com- inoxidvel possuem caractersticas similares.
parao CMM para os variados agentes microbicidas Variaes idnticas, de 1009 a 1020 para a CIMB em
avaliados. As menores concentraes requeridas para relao CIM, e de 1009 a 2032 para a CMEB em com-
o controle dos biofilmes foram obtidas com os produtos parao CMM foram obtidos tanto para o vidro quanto
BP-600 e BP-610. A maior discrepncia foi observada para o ao inoxidvel. Para todos os agentes microbicidas
para o microbicida BHD-208, que atua como um exce-
lente preservante, porm apresentou-se pouco eficaz
Tabela 3
como agente sanitizante.
CIMB (ppm de CMEB (ppm de
A Tabela 3 mostra os resultados do teste de erra- Agente antimicrobiano
agente ativo) agente ativo)
dicao de biofilmes efetuados empregando o sistema BHD-208 13,5 13,5
MBEC. A total correlao nos dados obtidos no sistema BP-600 10,5 10,5
MBEC em relao aos biofilmes produzidos na super-
BP-610 10,0 10,0
fcie das esferas de vidro confirma e valida de uso da
BHD-235 9,0 9,0
tcnica de esferas para este tipo de aplicao.
Resistncia de biofilmes formados, no dispositivo
MBEC, a partir de micro-organismos oriundos do
3.2. Formao e susceptibilidade do biofilme
processo de produo de detergente aos agentes
desenvolvido na superfcie das esferas de antimicrobianos em termos de concentrao inibitria
vidro ou ao de inoxidvel a partir de amaciante mnima para biofilmes (CIMB) e concentrao mnima
de erradicao de biofilmes (CMEB).
contaminado
Os resultados da CIM e da CMM obtidos para as
amostras de amaciante contaminado esto apresenta-
Tabela 4
dos na Tabela 4, enquanto que o comportamento quanto
CIM (ppm de CMM (ppm de
CIMB e CMEB verificado em esferas de vidro e de Agente antimicrobiano
agente ativo) agente ativo)
ao inoxidvel apresentados na Tabela 5. BHD-208 25,8 51,6
Assim como verificado para as amostras de deter-
BP-600 12,2 24,4
gente, os testes da CIM e da CMM com o amaciante
BP-610 10,05 10,05
de roupas contaminado mostraram a eficcia dos an-
BHD-235 12,2 12,2
timicrobianos para o controle dos micro-organismos
planctnicos, foram em concentraes muito inferio- Resistncia dos micro-organismos oriundos do
processo de produo de amaciante aos agentes
res s indicadas pelo fabricante.
antimicrobianos testados, para clulas planctnicas,
No foram observadas diferenas quanto s concen- em termos de concentrao inibitria mnima (CIM)
traes necessrias para a erradicao dos biofilmes e concentrao mnima de morte (CMM).

Tabela 5
CIMB (ppm de agente ativo) CMEB (ppm de agente ativo)
Agente antimicrobiano
Vidro Ao Inoxidvel Vidro Ao Inoxidvel
BHD-208 26.300 26.300 52.600 52.600
BP-600 12.322 12.322 24.644 24.644
BP-610 10.150 10.150 10.150 10.150
BHD-235 12.440 12.440 24.800 24.800

Resistncia de biofilmes formados na superfcie de esferas de vidro e de ao inoxidvel a partir de micro-organismos


oriundos do processo de produo de amaciante aos agentes antimicrobianos em termos de concentrao inibitria
mnima para biofilmes (CIMB) e concentrao mnima de erradicao de biofilmes (CMEB).

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observa-se que as concentraes requeridas para o con- plexo Burkholderia cepacia, Buttiauxella sp., Acidobac-
trole dos biofilmes foram maiores no caso das amostras teriaceae e Gemmatimonadaceae, sendo que nestes
de amaciante que das de detergente contaminado, o que dois ltimos no foi possvel avanar na identificao,
indica que a microbiota do amaciante contaminado mais o que sugere que estas possam ser espcies ainda no
resistente, possivelmente por resultar de uma populao descritas na literatura.
pr-existente que j havia sido exposta, por prolongado
perodo, a microbicidas com baixa ao residual, como
o formol. 4. Concluses
Durante os testes com amaciante de roupas
contaminado, verificou-se que os micro-organismos Os resultados deste estudo mostram que caso o
possuam um comportamento peculiar. Mesmo utili- tratamento para eliminar a contaminao dos sistemas
zando-se diversas tcnicas de manuteno e recupe- de fabricao do detergente e do amaciante de roupas
rao de micro-organismos, no foi possvel efetuar fosse baseado somente nos testes de CIM utilizando
a propagao deste consrcio microbiano em meios clulas planctnicas, a eficincia seria comprometida
de cultivo tradicionais. Observou-se que estes micro- necessitando rever toda a sistemtica de sanitizao e
-organismos somente se multiplicavam na presena preservao.
do amaciante de roupas, e que quando se retirava o Na prtica, definir o preservante mais eficaz, recupe-
produto, no havia crescimento de colnias em meio rar os produtos devolvidos e aumentar a dosagem de mi-
slido distribudo nas placas de Petri ou no meio de crobicida no foram aes que solucionaram o problema
cultivo lquido. Este comportamento levou ao inte- de contaminao. Foi necessrio, concomitantemente,
resse de identificar a populao microbiana presente efetuar um procedimento de limpeza mecnica com pos-
nesta amostra, atravs da caracterizao molecular terior sanitizao, para que as empresas erradicassem
destes contaminantes. Os resultados obtidos so a contaminao.
apresentados na Figura 1. O sistema de esferas mostrou-se simples, eficiente,
A comunidade bacteriana encontrada neste ama- com a vantagem de permitir a medida CIMB, alm de
ciante de roupas foi composta por organismos do com- representar um custo 40% inferior ao MBEC.

Figura 1 Padro de bandas dos isolados da amostra de amaciante, obtida por meio da tcnica de ARDRA. A:
resultados obtidos com a enzima HaeIII; B: resultados obtidos com a enzima Enzima HhaI; M: marcador molecular de
100pb; A01 a A18: isolados.

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SBCC - Set/Out - 2012
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