Historia do DNA

Em 1865 Mendel realizou os primeiros estudos a cerca do genes, porem

mesmo sabendo que os genes que continham as informaes fundamentais a
todos os seres vivos, no era conhecido pela comunidade cientifica qual
molcula continha os genes. A descoberta do DNA ocorreu em 1869 e foi feita
pelo bioqumico alemo Johann Friedrich Miescher que mesmo descobrindo
tal molcula no tinha ideia de sua estrutura to pouco de sua funo na clula.

Em 1928 um experimento muito interessante feito por Griffith, conhecido como

principio transformante, foi fundamental para descoberta de que era o DNA que
continha os genes. Esse experimento foi realizado com o
pneumococo Streptococcus pneumoniae, que apresentam duas formas, a
forma virulenta que causa a morte em camundongos por pneumonia e a
forma no virulenta, que no causa pneumonia em camundongos. Sobre a
infeco de camundongos por essas bactrias, sabia-se que bactrias do tipo
S (virulentas) mortas pelo calor, ao serem injetadas em camundongos, no lhes
causavam pneumonia, assim como a injeo de bactrias R (no virulentas).
Griffith injetou ento em camundongos uma mistura de bactrias S mortas e
bactrias R, e observou que os camundongos desenvolviam pneumonia. Alm
disso, foi observado tambm que clulas S apareciam vivas nos animais
mortos e que essas clulas S eram do mesmo tipo que as clulas S mortas
injetadas. Desse fato a nica explicao plausvel a de que as bactrias R
haviam sido transformadas em bactrias S por algum tipo de substncia
liberada pelas bactrias mortas.

No entanto, a elucidao de qual era a substancia responsvel pelo principio

transformante s aconteceu em 1944, aps anos de estudos de Oswald Avery
e seus colaboradores. isolaram, a partir de 75 litros de Streptococcus, 25
miligramas de um extrato com altssimo poder transformante. Eles trataram
esse extrato com diferentes substncias; amilase (enzima que degrada
polissacardeos); protease (enzima que degrada protenas); ribonuclease
(enzima que degrada RNA); dnase (enzima que degrada DNA). O nico
tratamento que fez o extrato perder completamente o seu poder
transformante foi o tratamento com dnase. Assim, em 1944, Avery e seu
colaboradores, chegaram concluso de que a substncia transformante era o
DNA.
A partir de ento, os pesquisadores comearam a levantar algumas hipteses.
Alguns achavam que se o DNA era capaz de transformar as caractersticas
hereditrias das bactrias, ento que ele mesmo era o prprio material
hereditrio. Outros, no entanto, acreditavam que mesmo aps a purificao,
poderiam restar quantidades mnimas de protenas e que essas eram as
responsveis pela transformao. Por volta de 1952, conseguiu-se obter
extratos que continham apenas 0,02% de protenas, o que eliminava a
possibilidade das protenas serem as responsveis pela transformao das
bactrias.

Depois de se descobrir que o DNA era o portador da informao gentica se

iniciou uma corrida para se conhecer mais a cerca dessa molcula. E no ano
de 1953 Watson e Crick apresentaram a primeira estrutura do DNA aceitvel,
sendo ela a simples molcula que ns conhecemos to bem atualmente. A
estratgia empregada por Watson e Crick foi construir um modelo molecular
que levasse em conta o tamanho e a configurao espacial dos nucleotdeos.
Assim, atravs de estudos de difrao de raios X, Watson e Crick revelaram
que a molcula de DNA um composto formado por duas longas cadeias
paralelas, constitudas por nucleotdeos dispostos em sequncia. Os
nucleotdeos so molculas compostas por uma pentose (desoxirribose), uma
molcula de cido fosfrico e uma base nitrogenada sendo que essas duas
cadeias polinucleotdicas so rigorosamente complementares: se houver uma
base nitrogenada do tipo adenina (A) em uma das cadeias, haver, na outra
cadeia, na mesma posio, uma timina (T). Da mesma forma, se houver uma
citosina (C) em uma das cadeias, haver uma guanina(G) na posio
correspondente da cadeia complementar. Os nucleotdeos de uma das cadeias
da molcula de DNA mantm-se unidos aos nucleotdeos da outra cadeia por
ligaes de hidrognio, estabelecidas entre as bases: a adenina liga-se
especificamente timina, e a citosina liga-se especificamente guanina.
Portanto, segundo o modelo proposto por Watson e Crick, a molcula de DNA
constituda por duas cadeias polinucleotdicas dispostas em hlice ao redor
de um eixo imaginrio, girando para a direita (uma hlice dupla). Os estudos de
difrao de raios X revelaram tambm que o dimetro externo da dupla hlice
de cerca de 2 nm, enquanto que a distncia entre os pares de bases vizinhos
de 0,34 nm. A hlice d uma volta completa a cada 3,4 nm, que corresponde a
cerca de 10 pares de bases. Em 25 de abril de 1953, Watson e Crick
publicaram seus resultados em uma edio da revista cientfica Nature - e em
1962 receberam o Prmio Nobel de Medicina e Fisiologia, tornando-se dois dos
cientistas mais importantes da histria moderna.

Um experimento muito importante na historia do DNA foi o de Meselson e

Sthal, que em 1958 com o objetivo de descobrir qual era o mecanismo de
replicao do DNA, cultivaram clulas de E. coli em um meio contendo apenas
istopo pesado de nitrognio(15N) e aps 14 geraes todas as molculas
sintetizadas naquela populao de bactrias, teriam incorporado 15N , essa
populao portanto tinha um DNA mais denso do que a E. coli cultivada no
meio comum com istopo leve de nitrognio 14N, de acordo com o
experimento com a ultracentrifugao realizado antes que mostrava que a E.
Coli com 15N era sedimentada mais ao fundo do que a E. coli 14N. Para
conclurem por fim qual era o mecanismo de replicao do DNA, eles
transferiram clulas com 15N para um meio contendo apenas 14N e permitiram
a duplicao de duas geraes, todavia no intervalo de tempo da primeira
gerao extraram DNA e fizeram o mesmo na segunda gerao. As amostras
de DNA isoladas nos diferentes tempos foram ultracentrifulgados at que
encontrasse sua posio no tubo de centrifuga, ou seja, onde sua densidade
era correspondente a da soluo de cloreto de csio. Na primeira gerao se a
duplicao fosse conservativa haveria duas bandas uma pesada e outra leve,
se fosse semiconservativa ou dispersiva haveria uma nica banda ao meio. Na
segunda gerao no modo conservativo continuaria igual, no semiconservativo
surgiriam duas bandas uma na posio do meio e a outra mais leve e no modo
dispersivo continuaria como na primeira gerao. Os resultados obtidos
mostraram que aps a primeira gerao era visto apenas uma banda ao meio
excluindo assim o modo conservativo, j na segunda gerao era observado,
uma banda mais leve e outra intermediaria, concluindo assim que o mecanismo
de duplicao do DNA era semiconservativo.
Principais caractersticas gerais d molcula de DNA

O DNA uma macromolcula com capacidade de armazenar informaes

fundamentais ao organismo de seres vivos, alm disso, possui o mecanismo
necessrio para se duplicar fielmente possibilitando assim a diviso celular.
Sua estrutura caracterizada por duas fitas compostas de nucleotdeos que
por sua vez so compostos de um grupo de fosfato, uma acar
(Desoxirribose) e uma base nitrogenada que podem ser classificadas como
pricas (Adenina e Guanina) ou pirimdicas (Citosina e Timina), o que ocasiona
a estrutura de dupla hlice do DNA o pareamento das bases complementares
de cada fita, sendo que Adenina sempre se liga com Timina por duas pontes de
hidrognio e Guanina com Citosina por trs. J a ligao responsvel pela
unio dos nucleotdeos a ligao fosfodiester que liga o carbono trs de um
nucleotdeo ao carbono cinco do outro em uma fita e o contrario na outra,
fazendo que as fitas do DNA sejam antiparalelas.

Enzimas envolvidas na replicao do DNA

Helicase: Tem funo de reconhecer a origem de replicao e quebrar

as pontes de hidrognio entre as bases, para que as duas fitas de DNA
se separem. Essa separao essencial para que a forquilha de
replicao se movimente.
Topoisomerase: Relaxa o DNA super enrolado, regulando a tenso
resultante da abertura pela helicase.
SSB: Protenas que se ligam as fitas de DNA protegendo-as e
impedindo que se unam novamente.
Primase: a enzima que sintetiza os primers (iniciadores), que so
pequenas sequncias de RNA., ela adiciona os primers para fornecer o
terminal 3OH para RNA polimerase III, tanto no inicio da fita continua
quanto em cada fragmento de okasaki da fita descontinua.
DNA polimerase III: Sintetiza a nova fita de DNA adicionando os
nucleotdeos correspondentes a fita molde. A polimerizao acontece no
sentido 5-3 sendo que a DNA polimerase sempre adiciona um
nucleotdeo na extremidade 3OH do outro.
 DNA polimerase I: Retira os primers de RNA e substitui por DNA.
Ligase: Une os fragmentos de okazaki.

Processo de Replicao do DNA

A replicao do DNA ocorre na fase S da interfase, sendo um pr-requisito

para diviso celular, o mecanismo de duplicao semiconservativo, ou seja,
ao final da replicao a fita molde da origem a duas novas molculas de DNA
sendo que cada molcula tem uma fita original e uma recm-sintetizada. A
replicao tem inicio quando a Helicase reconhece a origem de replicao e
quebra as pontes de hidrognio criando assim duas forquilhas de replicao
que se movem em direes opostas, para evitar que durante a abertura o DNA
fique suoer enrolado as topisomerases se prendem as forquilhas para relaxar o
DNA que no esta sendo replicado, as SSB se prendem as fitas separadas
para proteger e impedirem que se unam novamente. Logo em seguida na fita
continua a primase sintetiza o primer para que a DNA polimerase III comece a
sintetizar nova fita a partir da fita molde, j na fita descontinua a primase
adiciona vrios primers para a sntese da nova fita j que a fita molde tem
sentido oposto ao necessrio para o sentido de polimerizao da DNA
polimerase III, no final a fita descontinua possui diversos fragmentos de okasaki
que so compostos do primer de RNA mais a fita recm-sintetizada de DNA,
esses fragmentos so corrigidos pela ao de duas enzimas a DNA polimerase
I que retira os primers de RNA e substitui por DNA e a Ligase que une os
fragmentos finalizando assim a replicao, que ainda passa pela reviso das
DNAs polimerases para se certificar que adicionaram as bases corretas.

Enovelamento do DNA, Cromatina, Cromossomos e Genes:

A Cromatina formada por nucleossomos que por sua vez so formados por
um octamero de histonas(2H2A, 2H2B, 2H3, 2H4) que enrolado por duas
voltas de DNA + a Histona H1 que une os nucleossomos, essa cromatina
encontrada na interfase. J o cromossomo a cromatina super condensada e
observado durante a metfase no seu mximo de condensao. Esse
processo que torna DNA em cromatina e depois em cromossomo chamado
de enovelamento e acontece da seguinte forma: protenas no histonicas se
ligam aos nucleossomos formando um arranjo chamado solenoide que possui
30 nm de dimetro, o solenoide se une as protenas no histnicas sofrendo
uma helicoidizao e ficando com dimetro de 300 nanmetros, novamente
sofre outra helicoidizao ficando agora com 700 nanmetros, e por fim sofre
uma ultima helicoidizao formando o cromossomo mittico que esta no
mximo de condensao estando, portanto pronto para a metfase. Os genes
so partes do DNA que expresso alguma caracterstica e codificam algo.

Principais diferenas entre RNA e DNA

Primeiramente o DNA possui dupla fita j o RNA fita simples, a acar presente
no DNA a desoxirribose j no RNA a ribose, existe outra diferena nas bases
nitrogenadas j que no RNA encontrada a Uracila no lugar da Timina do
DNA.
Transcrio

A transcrio consiste na sntese de RNA. Ela realizada por um complexo

enzimtico cuja enzima chave a RNA polimerase, composta de vrias
subunidades que realizam a polimerizao do RNA a partir de um molde de
DNA. Esse processo ocorre em trs etapas principais, a iniciao,
o alongamento e o trmino, cada um contendo fatores especficos.

Iniciao

A transcrio se inicia quando o fator sigma junto com os demais fatores de

transcrio acoplados a RNA polimerase, identificam uma regio chamada
promotora que contem sequencias de bases especificas repetidas os
chamados stios promotores que so divididos em TATA box, CAAT box e CG
box, essa regio promotora importante pois ela quem sinaliza onde se deve
iniciar a transcrio de determinado gene. Depois que identificado o inicio da
transcrio o fator sigma e os fatores de transcrio se fixam a ela e liberam a
RNA polimerase que deve desenrolar o DNA dplex, formando uma bolha de
transcrio, que consiste em cerca de 17 pares de bases desenrolados, a fita
de RNA sempre polimerizada no sentido 5-3.

Alongamento

a fase que acontece aps a formao da primeira ligao fosfodister, e

durante essa fase que o RNA sintetizado. Uma vez iniciado o alongamento
segue numa velocidade aproximada de 50 nucleotdeos por segundo. A RNA
polimerase diferente da DNA polimerase no tem atividade de nuclease, ou
seja, no revisa a cadeia de RNA nascente, em consequncia a fidelidade da
sntese de RNA bem menor que a da sntese de DNA.

Trmino

A terminao da maioria dos genes acontece quando encontrado uma regio

auto complementar palindrmica rica em GC e AT ou uma sequencia rica em
adenina. Depois de sintetizar alguma dessas sequencias a RNA polimerase
entende como sendo o termino do gene e se desprende da molcula de DNA e
libera a nova fita de RNA. Alguns genes porem no possuem esses sinais na
sua fita de RNA recm sintetizada tornado necessrio o auxilio da protena
RHO para finalizar a transcrio.

Ps Transcrio

Antes que o RNAm possa sair do ncleo so necessrias algumas alteraes

na molcula como a adio do revestimento Cap na sua extremidade 5 e a
cauda poli-A na extremidade 3, que conferem a essa molcula uma maior
proteo e estabilidade, elas tambm auxiliam o ribossomo a reconhecer o
RNAm. Alm disso o RNAm possui partes na sua molcula que no so
codificantes sendo desnecessrias para a traduo, os chamados ntrons, se
faz necessrio ento a retirada desses ntrons para que fique somente as
regies codificantes que so chamadas xons, o nome do processo de retirada
dos introns e ligamento dos exons chamado Splicing e realizado pelos
spliceossomos que so um arranjo de RNA + protenas.
Traduo

A maquinaria que controla a traduo constituda de:

Ribossomo (estrutura encontrada livre ao citosol ou aderida ao retculo

endoplasmtico, que no caracteriza-se como organelas citoplasmtica,
pela ausncia de membrana plasmtica) subdividido em duas unidades,
sendo a menor que promove a leitura do RNAm (RNA mensageiro) e a
unidade maior que contm os stios A, P e E responsveis por alocar os
RNAt (RNA transportador) carregados com o aminocido e tambm com
os peptdeos que sero alongados devido translocao 5 3.
Rna-m que contm as informaes necessrias para a leitura, feita
atraves de trincas de bases (AUG, CAU.) denominados cdon, cuja as
mensagens so oriundas do gene.

Rna-t que contm o aminocido em uma das suas estruturas e o anti-

cdon na sua outra estrutura, onde parear com os cdons do Rna-m,
sendo denominado Pareamento Oscilante de Bases, sempre
respeitando a orientao 5 3.

Etapas da Traduo

Iniciao

Nessa fase a subunidade menor do ribossomo reconhece a regio 5 do RNAm

atravs do cap 5. Ps o reconhecimento a subunidade menor transloca-se at
o cdon de iniciao representado pelas bases AUG, na maioria das vezes,
onde ao mesmo tempo a subunidade maior e o RNAt carregado com o
aminocido metionina tambm acomplam-se ao processo. Geralmente quando
o RNA-t chega carregado com o aminocido ele reconhecido pela stio A,
porm nesse caso como necessrio a formao de uma longa cadeia
polipeptdica o primeiro RNAt reconhecido pela stio P.

Alongamento
O alongamento o processo que ocorre aps o reconhecimento no stio P da
metionina, logo em seguida o prximo RNAt trazendo o aminocido
complementar aos seus anticdons que por sua vez so complementares aos
cdons do RNAm, pousa no sitio A, e por meio de ligao polipeptdica o
aminocido metionina que estava no sitio P se liga ao Aminocido do RNAt que
estava no sitio A, o RNAt do Sitio P passa para o sitio E onde descartado j o
RNAt que estava no sitio A passa paro o P deixando o espao livre para a
chegada de um novo RNAt e aminocido no sitio A esse processo se repete
inmeras vezes e a cadeia peptdica alonga-se cada vez mais.

Trmino

Na fase de trmino, ocorre a leitura do cdon de parada, onde o processo

sinalizado para ser cessado. Para que isso ocorra, mais um fator
acrescentado ao fator de trmino, que por hidrlise ligam-se nas extremidades
do polipeptdeo fazendo com que ocorra um desacoplamento entre ribossomo-
protena. Ao final do processo, todos os participantes so reciclados para que
haja um novo processo.
Mutaes Genticas

qualquer alterao na sequncia de bases na molcula de DNA constituinte

do gene. Pode ocorrer por meio da deleo, adio ou substituio.

Deleo que quando so retiradas algumas bases.

Adio que quando so adicionadas algumas bases.
Substituio quando uma base substituda por outra. A substituio
pode ser dividida em: substituio de transio que quando uma prica
e substituda por uma prica e uma pirimdica por uma pirimdica; e
substituio de transverso que quando prica e substituda por
pirimdicas ou pirimdicas por pricas.

As mutaes podem ser classificadas quanto consequncia

Mutao de sentido errado, que quando a sequencia de Aminocidos

alterada. Essa mutao leva a perda da estrutura original e funo da
protena.
Mutao sem sentido, que quando uma mutao leva a formao de
um cdon de finalizao, que leva a finalizao precipitada da protena
que descartada.
Mutao silenciosa que quando a substituio de bases no altera a
sequencia de aminocidos.

As mutaes podem ser classificadas quanto Origem

Mutaes germinativas, que originam nas clulas germinativas, que so

as clulas que do origem aos gametas, portanto elas passam para as
prximas geraes.
Mutaes somticas, que originam nas clulas somticas, no passam
para prxima gerao por meio da reproduo sexuada.

As mutaes podem ser classificadas quanto Causa

Mutaes espontneas que tem ocorrncia natural.

 Mutaes induzidas que so causadas por agentes mutagnicos
qumicos ou fsicos.

Agentes qumicos exemplos:

Anlogos de base so substancias qumicas que podem substituir as

purinas ou as pirimdicas durante a sntese de DNA.
Substncias Intercalantes so capazes de se inserir entre as bases
sucessivas do DNA causando assim algum possvel erro na leitura
durante a replicao do DNA.

Agentes fsicos exemplos:

Radiaes ionizantes: raios X, ,, gama. Podem provocar alteraes

nas bases e quebras na cadeia do DNA( de uma ou ambas as fitas).
Radiaes no ionizantes: Raios ultravioleta embora no possuam
energia suficiente para ionizar o DNA, carregam energia suficiente para
alterar a molcula. A mais Conhecida ao da radiao UV no DNA a
induo de dmeros de pirimidina. Trata-se da induo de ligaes
carbono-carbono entre pirimidinas adjacentes, sendo mais comum com
a timina. Isto resulta na distoro da molcula ou ligaes entre
molculas adjacentes, o que temporariamente para a replicao do
DNA.
PCR

Para a realizao deste procedimento, o primeiro passo extrair o material

gentico da clula ou do local a ser estudado com cuidado para que o mesmo
no seja danificado e nem sofra contaminao. Habitualmente, o material
coletado o DNA; todavia, pode-se utilizar o RNA em uma RT-PCR que
consiste em um desdobramento do PCR e apresenta outras aplicaes. Aps a
extrao do material, juntamente a este adicionada uma mistura, tambm
chamada de pr-mix, na qual esto presentes os dNTPs
(desoxirribonucleotdeos trifosfato), sendo estas bases nitrogenadas ligadas
com um trs fosfato, os denominados primers (tambm conhecidos por
oligonucleotdeos ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma soluo
tampo. Este material vai para um aparelho conhecido como termociclador,
aquecendo e esfriando o material ali contido em ciclos de temperatura pr-
estabelecidos. Primeiramente, o tudo aquecido a uma temperatura entre 90
a 96C para que ocorra a desnaturao do DNA (separao das fitas). Por
conseguinte, a temperatura do termociclador cai (50 a 60C) para que haja a
hibridizao ou anelamento. Neste ponto do procedimento, os primers se ligam
com especificidade s suas seqncias complementares do DNA.
Subsequentemente, h uma elevao da temperatura a aproximadamente
72C para que ocorra a sntese pela polimerase (extenso de uma nova
molcula). Em seguida, um novo ciclo iniciado, sendo que normalmente so
realizados de 25 a 40 ciclos para cada reao, apresentado taxa de replicao
exponencial. A anlise do resultado feita por um meio da eletroforese em gel
de agarose ou de poliacrilamida, sendo interpretada por um profissional
treinado.

A tcnica de separao dos fragmentos de DNA mais utilizada a eletroforese

atravs de gis de agarose. Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose
preparado, o DNA introduzido em pequenos poos de gel, e ento uma
corrente eltrica aplicada atravs do gel. Como o DNA negativamente
carregado, ele atrado pelo eletrodo positivo. Entretanto, para chegar ao
eletrodo positivo, o DNA deve migrar atravs do gel de agarose. Os fragmentos
de DNA menores podem migrar atravs de um gel de agarose mais
rapidamente que os fragmentos de DNA maiores. A velocidade de migrao de
fragmentos de DNA lineares atravs da agarose inversamente proporcional a
log10 de seus pesos moleculares.