Minicurso Alergenicos 3M

Métodos para Analisar Alergênicos
Sumaré, 23 de abril de 2014

1 5©May
3M 2014. All Rights Reserved.
O que são Alergias?
Alergias são reações hipersensíveis imuno-

moduladas que podem afetar vários órgãos, mais
comumente a pele, vias aéreas e digestivas.
2 5©May
© 3M 2007. All Rights
Alergia x Intolerância
 Alergia é uma resposta imune à uma substância
― O corpo trata uma substância como um agente infeccioso
IgE → histamina → inchaço/urticária/etc.
 Resposta por Mediação Celular (ex. Doença Celíaca)
 Intolerância é uma resposta não-imune a uma substância

― Resposta “natural” a uma substância
― Ex. Intolerância à Lactose
 Lactose não é metabolizada (por ausência da enzima Lactase)
 Lactose se torna alimento para bactérias
 Bactérias produzem gases → cólicas etc…
3 5©May
Sintomas de Alergias Alimentares
 Vermelhidão da pele
 Câimbras abdominais
 Dificuldade respiratória
 Inchaço generalizado
 Perda da consciência
 Coceiras
 Tosse
 Fotossensibilidade
4 5©May
Sintomas Graves das Alergias Alimentares
 Constrição das vias aéreas

 Diminuição severa da pressão sanguínea e choque (choque
anafilático)
 Sufocamento por inchaço da garganta
 Morte
5 5©May
Qual a parte dos alimentos é alergênica?
 Amendoim – Ara H 2  Ostras – Tropomiosina

 Leite – Caseína  Peixe – Parvalbumina
 Ovo – Ovalbumina  Amêndoas – vicilinas, leguminas, 2S albuminas
 Trigo – Glúten  Soja – proteínas da Soja
Todas estas moléculas são Proteínas….
6 5©May
Detectando Alergênicos
 Em Produtos Finais
― Procurar por ug/g (ppm) de uma proteína em um mar de outros
materiais
 Ambiental
― Procurar por ug/cm (ppm) de uma proteína onde não deve haver
nenhuma proteína
7 5©May
Estratégias para Analisar um Alergênico
 Visual
 Teste para alergênico específico
― ELISA/Lateral Flow
 Espectometria de Massa – EM
 Reação de Cadeia Polimerase - PCR
 Teste Indicador de Alergênicos (Swabs)
― Proteína
8 5©May
ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbant Assay)
 Método baseado em anticorpos

 Detecta presença de proteínas através de sanduíche de anticorpos,
detectando um marcador (enzima vermelha) ligado a um dos anticorpos
* ** *
(anticorpo conjugado amarelo)
* ** *
YYYYYY YYYYYY
Positivo Negativo
9 5©May
Métodos de ELISA/Anticorpos
 Vantagem
- Permite detectar o alergênico de forma específica.
- Considerado o método mais rápido para produto final.
- Protocolo de análise simples.
- Apresenta alto rendimento
- São empregados quando há necessidade de reultados Quantitativos.
 Desvantagens
- Possuem poucas Validações AOAC.
- um Kit por alergênico.
- Especificidades e Sensibilidades diferentes (depende do fabricante)
10 5©May
Espectometria de Massa - EM
É a técnica consiste em um bombardeamento das moléculas
por um feixe de eletrons de alta energia. Por sua vez promove uma
aceleração dos íons em um Campo Elétrico ou Magnético e a
separação dos íons pela razão Massa/Carga. Com isso, ocorre a
detecção dos íons com a determinada separação dos íons da razão
Massa/Carga.
EM pode detectar moléculas orgânicas como proteínas/peptídeos

em níveis bem baixos semelhantes aos determinados por ELISA e PCR.
11 5©May
Espectometria de Massa - EM
12 5©May
Vantagens e Desvantagem da Espectometria de Massa
 Vantagens
- Permite detectar múltiplos alergênicos em um único ensaio
(considerado uma triagen- screening).
- Permite detectar proteínas que tiveram suas estruturas alteradas pelo
processamento industrial.
 Desvantagens
- Necessidade de mão de obra especializada.
- Necessidade de Validação para cada tipo de matriz
- Elevado custo do equipamento.
13 5©May
Detecção de Alergênico por PCR
É uma técnica de Biologia Molecular, que permite amplificar

um fragmento específico do DNA (Ácido Desoxirribonucléico)
alvo. Quantidades mínimas do DNA são replicados em bilhões de
cópias através de um termociclador e posteriormente detectados
por marcadores de fluorescência.
14 5©May
15 5©May
Vantagens e Desvantagem da PCR
Vantagens
- Técnica de biologia molecular (BM) com alta sensibilidade.
- Uma ótima substituição para análises de alguns alergênicos que não são analisados
por Elisa, EX.: Aipo e Salsão.
- Por se tratar de uma técnica de BM pode-se desenhar primers específicos.
- Técnica muitas vezes automatizadas e fácil manipulação.
 Desvantagens
- A detecção de alergênico alimentares é controversa, pois não detecta a substância em
si, e sim o DNA marcador. Isso não caracteriza a presença do alergênico no alimento.
Não sendo confiável para algumas matrizes como Ovos e Leite em Pó.
- Instabilidade do DNA em meios ácidos. Ex.: Molho de Tomate
- Necessidade de uma área isolada no laboratório para análises de BM.
16 5©May
Swabs para Detecção de Proteínas no Ambiente
 Teste Colorimétrico para
proteínas*
 Swab, Ative, Incube por 15

min, Leia a cor
 “if its green, its clean…”

 Semi-quantitativo
17 5©May
Swabs para Detecção de Proteínas no Ambiente
 Teste para proteína total – Não específico
 Não há proteína = Não há proteínas alergênicas.
 Somente para amostras ambientais – não consegue identificar alergênicos

com o ruído da composição do alimento.
18 5©May
“ …Teste para Proteínas”
 Teste é baseado na redução do Cobre Cu+2 para Cu+1 por pontes entre
aminoácidos na cadeia protéica.
 Será positivo com qualquer substância que reduzir o Cobre.
― Açúcares Redutores (glicose, frutose…mas não sucrose)
― Agentes Redutores – como sulfitos!
19 5©May
Se estiver usando frutas – não terei proteínas?
 Se for in natura…tem proteína!
 Ex. Suco de Laranja
Controle 1:10.000 1:10.000 1:10.000

Suco de Leite em Leite
Laranja pó Integral
20 5©May
Referências
 http://www.foodallergy.org/
 http://www.foodallergyalliance.org/
 FDA www.cfsan.fda.gov/~dms/alrgqa.html
 http://www.foodsafetybrazil.com
 http://www.charm.com/images/stories/pdf/atp/iafp_2007_poster.pdf
 Food Facts: http://www.cfsan.fda.gov/%7Edms/alrgqa.html
 Mechanisms and treatment of allergic disease in the big picture of regulatory T cells - Cezmi A. Akdis,
MD, and M€ubeccel Akdis, MD, PhD Davos, Switzerland. J ALLERGY CLIN IMMUNOL APRIL 2009
 Food Allergy Among U.S. Children: Trends in Prevalence and Hospitalizations
 Amy M. Branum, M.S.P.H. and Susan L. Lukacs, D.O., M.S.P.H. NCHS Data Brief, No. 10, October
2008
21 5©May
Thank you!!!
Sylnei Santos
Mobile: 19 99840-0610
E-mail: sbsantos@mmm.com
22 5©May

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Sumaré, 23 de abril de 2014

Alergias são reações hipersensíveis imuno-

 Intolerância é uma resposta não-imune a uma substância

 Constrição das vias aéreas

 Amendoim – Ara H 2  Ostras – Tropomiosina

Todas estas moléculas são Proteínas….

 Método baseado em anticorpos

EM pode detectar moléculas orgânicas como proteínas/peptídeos

É uma técnica de Biologia Molecular, que permite amplificar

 Swab, Ative, Incube por 15

 “if its green, its clean…”

 Teste para proteína total – Não específico

 Não há proteína = Não há proteínas alergênicas.

 Somente para amostras ambientais – não consegue identificar alergênicos

 Será positivo com qualquer substância que reduzir o Cobre.

― Açúcares Redutores (glicose, frutose…mas não sucrose)

― Agentes Redutores – como sulfitos!

Controle 1:10.000 1:10.000 1:10.000

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