Você está na página 1de 18

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

Campus Diadema

UC - BIOQUÍMICA INTEGRADA

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS

PROFESSORES
Giselle Zenker Justo (coordenadora)
Karin Simon
Nídia Alice Pinheiro
Virgínia Junqueira

2018
1

NORMAS E RECOMENDAÇÕES NO LABORATÓRIO

LEIA AS NORMAS DE SEGURANÇA EM LABORATÓRIO NO FINAL DA APOSTILA.

O USO DE AVENTAL NAS AULAS PRÁTICAS É OBRIGATÓRIO.

COMER, BEBER E FUMAR NO RECINTO DO LABORATÓRIO NÃO É PERMITIDO.

Leia cuidadosamente os procedimentos experimentais (protocolos) e preste atenção nas instruções fornecidas
antes de iniciar o experimento.

Familiarize-se com o ambiente do laboratório, particularmente, com os reagentes, vidraria e equipamentos


disponíveis, procurando utilizá-los com propriedade para evitar erros experimentais, desperdício de material e
acidentes.

Mantenha sua bancada de trabalho organizada e livre de objetos de uso pessoal.

Ao terminar o experimento passe água na vidraria utilizada e a coloque no local indicado.

Qualquer dúvida ou acidente peça auxílio aos professores, monitores, ou técnicos do laboratório.

ÍNDICE DAS AULAS PRÁTICAS

1. Dosagem de proteína ............................................................................................................. 2


2. Cinética enzimática – Invertase de levedura ......................................................................... 5
3. Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ....................................... 9
4. Teste de tolerância à glicose e curva glicêmica ..................................................................... 14
5. Normas de segurança em laboratório ..................................................................................... 16
1. DOSAGEM DE PROTEÍNA

A técnica de espectrofotometria permite a quantificação de substâncias que absorvem luz em um


determinado comprimento de onda. Isto é possível devido à lei de Lambert-Beer, que relaciona a
absorbância de uma substância com sua concentração molar.
Utilizando-se uma solução de concentração conhecida do composto a ser analisado (ou uma
substância que apresente propriedades semelhantes) é possível construir uma curva padrão que relaciona
diferentes concentrações desta substância com os respectivos valores de absorbância em um determinado
comprimento de onda. Utilizando-se esta curva padrão, é possível saber a concentração da amostra de
concentração desconhecida, desde que as medidas tenham sido realizadas nas mesmas condições
(mesmos reagentes, mesma temperatura...). Para que isto seja possível, é também importante que a
concentração da substância a ser analisada esteja compreendida no intervalo de concentrações da curva
padrão.
Um dos métodos utilizados para dosagem de proteína é chamado de método de Biureto. Esse
método se baseia na propriedade de ions Cu2+ em meio alcalino de formar ligações com o nitrogênio
das ligações peptídicas. Desta reação resulta uma coloração púrpura intensa que permite que este método
seja usado para determinar colorimetricamente a quantidade de proteína de uma solução. A intensidade
da cor obtida é proporcional à quantidade de ligações peptídicas e, portanto, à quantidade de proteína.
A absorbância de uma amostra é diretamente proporcional à concentração da molécula
responsável pela absorção

I0=intensidade de luz incidente


I=intensidade de luz transmitida
e=absortividade molar
b=caminho ótico da luz pela amostra
C=concentração da solução em estudo

OBJETIVOS
Determinar a concentração de uma solução de proteína de concentração desconhecida utilizando
o método de Biureto.
3

MATERIAL E REAGENTES

• Solução aquosa de albumina bovina 8 mg/mL.


• Solução aquosa de albumina de concentração desconhecida.
• Reagente de Biureto.
• 7 tubos de ensaio médios.
• Pipetas de vidro de 2 mL e 5 mL.
• Pipeta automática e ponteiras (azuis) descartáveis.
• Cubetas para espectrofotômetro (maior capacidade em volume).
• Espectrofotômetro.
• Estante para tubos.
• Banho (ou estufa) a 37oC.

Preparo do reagente de Biureto

Dissolva 1,5 g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) e 6,0 g de tartarato duplo de sódio e potássio
(KNaC4H4O6.4H2O) em 500 mL de água destilada. Adicione, sob agitação constante, 300 mL de solução
de NaOH 10%. Adicione 1 g de iodeto de potássio (KI). Complete o volume para 1 L com água destilada
e guarde o reagente em frasco âmbar. Esse reagente conserva-se por tempo indefinido.

PROCEDIMENTO

1. Preparar os tubos como descrito na Tabela 1 utilizando uma solução de 8 mg/mL de albumina (proteína
padrão) e a solução de proteína de concentração desconhecida. Um dos tubos será o branco e nele não será
adicionada nenhuma solução de proteína. Siga a ordem de adição de reagentes mostrada na tabela.

Tabela 1: Curva padrão para determinação da concentração de proteína.


Volume de Volume de H2O Reagente Concentração de Abs
Tubos albumina proteína destilada de proteína (mg/mL) λ (nm)
8 mg/mL desconhecida (mL) Biureto
(mL) (mL) (mL)
Branco - - 1,5 2,5
1 0,1 - 1,4 2,5
2 0,2 - 1,3 2,5
3 0,4 - 1,1 2,5
4 0,7 - 0,8 2,5
5 1,0 - 0,5 2,5
6 - 1,0 0,5 2,5

2. Após adição dos reagentes, agitar e incubar os tubos por 15 min a 37°C.
3. Transferir o conteúdo dos tubos Branco e 6 para cubetas de espectrofotômetro. Medir a absorbância nos
diferentes comprimentos de onda: 450, 470, 500, 520, 540, 580, 600, 630, 650, 680 e 700 nm. Não esquecer de
zerar o aparelho com o branco para cada comprimento de onda.
4. Plotar os dados em um gráfico e definir o comprimento de onda a ser utilizado no ensaio.
5. Transferir o conteúdo de cada tubo da curva padrão para cubetas de espectrofotômetro e ler as absorbâncias no
comprimento de onda definido no passo acima. O espectrofotômetro será zerado com o Branco antes dessas
leituras.
6. Construir o gráfico da curva padrão, obter a equação da reta média e calcular a concentração de proteína na
amostra desconhecida. CALCULAR É DIFERENTE DE ESTIMAR!!!

QUESTÕES PARA DISCUSSÃO:

1. Como é a reação de Biureto?


2. Quais são as bases dos métodos de Bradford e de Lowry para quantificação de proteínas?
3. Quais as vantagens e desvantagens de cada um dos métodos mencionados comparando-se com o método de
Biureto? Quais são os interferentes em cada método?
4. Incluir os gráficos e cálculos que levaram à obtenção do valor de concentração da solução desconhecida.
5. Qual a importância de se saber o λmáx de uma substância quando se quer quantificá-la por espectrofotometria?
6. O que é intervalo de linearidade de uma medida? O que deve ocorrer com a reta de absorbância em função da
concentração de uma amostra para valores muito altos de absorbância? Porque se deve conhecer este
intervalo quando se quer determinar a concentração de uma solução de proteína?
5

2. CINÉTICA ENZIMÁTICA – INVERTASE DE LEVEDURA

A Cinética Enzimática tem como objetivo estudar os mecanismos e a velocidade de reações


químicas catalisadas por enzimas. As enzimas são responsáveis pela ocorrência e controle da maioria
dos processos metabólicos numa célula. Possuem como principais características: (a) grande
especificidade pelo(s) substrato(s); (b) grande eficiência de catálise; (c) condições de reação muito mais
brandas; (d) capacidade de regulação; (e) saturação pelo substrato.
A descrição matemática de um processo enzimático foi desenvolvida por L. Michaelis e M.
Mentem, através de um modelo simplificado que envolve a enzima livre (E), o substrato (S), o complexo
enzima-substrato (ES) e o produto (P). Esse modelo pode ser expresso como:

Este modelo deu origem à equação de Michaelis-Menten que expressa a velocidade de uma
reação catalisada enzimaticamente e permite descrever o comportamento de diversas enzimas:

Vmax[S]
Vo =
Km+[S]
Enzimas Michaelianas apresentam uma curva hiperbólica de vo em função da concentração de
substrato. Nestas circunstâncias, o sistema tende a adquirir velocidade de reação máxima (Vmáx), que é
função da concentração inicial da enzima livre (E). Pode-se também definir uma concentração de
substrato na qual obtém-se metade de Vmáx. Esse valor corresponde ao Km, um parâmetro relacionado
com a afinidade da enzima pelo substrato.
O modo mais preciso de determinar essas grandezas num experimento de Cinética Enzimática é
através do gráfico de Duplo-recíproco ou de Lineweaver-Burk, que relaciona 1/vo com 1/[S] e constitui
uma reta.
Neste experimento, será estudada a cinética da reação catalisada pela invertase de levedura, que
hidrolisa sacarose produzindo glicose e frutose.

CH 2OH CH 2OH
O CH 2OH O O CH 2OH O CH 2OH
invertase
OH H HO
CH 2OH + H2O
OH H + H
HO
OH
HO O HO OH
OH OH
OH OH

1 sacarose 1 glicose 1 frutose


(açúcar não redutor) (açúcares redutores)

A reação será acompanhada através da dosagem dos açúcares redutores formados, que se baseia
na reação destes com ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). Esta reação gera um produto alaranjado cuja
formação pode ser acompanhada espectrofotometricamente pela medida da absorbância a 540 nm.
OBJETIVOS

Estudar a influência da concentração de substrato na velocidade de uma reação enzimática.


Examinar as curvas obtidas, calcular alguns parâmetros cinéticos (Km e Vmáx) e discutir seus valores e
importância.

MATERIAL E REAGENTES

Material Reagentes

1) 15 tubos de ensaio grandes (180 x 20 mm); 1) Tampão Acetato 0,02 M


2) 1 proveta de 25 mL; 2) Sacarose 100 mM em tampão acetato.
3) 1 pissete com água destilada; 3) Solução Padrão Redutora 12 mM (6.0 mM de
4) 1 estante para tubos; Glicose + 6.0 mM de Frutose)
5) 2 cubetas para espectrofotômetro; 4) Ácido 3,5 Dinitrosalicílico (DNS)
6) 1 erlenmeyer com água destilada; 5) Solução da enzima Invertase (8 µg/mL)
7) 1 caixa com gelo com a enzima;
8) 1 caneta para marcação de tubos;
9) Fita crepe;
10) Pipetas: 1 de 2 mL, 1 de 5 mL;
11) Micropipetas P200 e P1000 e respectivas ponteiras;
12) Banho fervente;
13) Banho a 37oC.

PROCEDIMENTO

Curva padrão
A curva padrão tem por finalidade relacionar a quantidade (em µmols) de sacarose hidrolisada com
valores de absorbância a 540 nm.

Adicionar a seis tubos de ensaio (180 x 20 mm) volumes crescentes de solução padrão redutora,
conforme indicado abaixo, completando o volume em cada tubo para 2 mL com tampão. Como não ocorrerá
hidrólise de sacarose neste caso, pode-se acrescentar o reagente DNS logo após o tampão.

Tubos Sol. Padrão Tampão pH Reagente Abs (540 nm) Sacarose


Redutora 12 4,77 (mL) DNS (mL) hidrolisada
mM (mL) (µmoles/mL)
Branco --------- 2,0 2,0
1 0,2 1,8 2,0
2 0,4 1,6 2,0
3 0,6 1,4 2,0
4 0,8 1,2 2,0
5 1,0 1,0 2,0

Obs: para o cálculo da concentração de sacarose hidrolisada, lembrar que a estequiometria da reação é de 1
sacarose produzindo 2 açúcares redutores.

Após a adição do DNS, colocar os tubos em banhos-maria fervente por 10 min, terminado este tempo,
esfriar em água corrente e adicionar 16 mL de água destilada. Homogeneizar os tubos por inversão e ler as
absorbâncias a 540 nm contra o branco.
Construir um gráfico Abs (540 nm) em função da quantidade de sacarose hidrolisada (µmoles/mL).
7

Efeito da concentração de substrato na atividade enzimática

1) Numerar nove tubos de ensaio (180 x 20 mm), que devem estar no gelo, e adicionar os reagentes
segundo o protocolo abaixo:

Sacarose Tampão Sol. enzima Abs (540nm) Sacarose Velocidade Sacarose


Tubos 100 mM pH 4,77 (8µg/mL) hidrolisada da reação Inicial
em tampão (mL) (mL) (µmoles/mL) (umoles/mL/ (mM)
(mL) min)
Branco ------- 1,9 0,1
1 0,05 1,85 0,1
2 0,1 1,8 0,1
3 0,3 1,6 0,1
4 0,5 1,4 0,1
5 0,7 1,2 0,1
6 1,0 0,9 0,1
7 1,5 0,4 0,1
8 1,9 ------- 0,1

2) Após a adição da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos da temperatura de 0oC e colocá-los
simultaneamente em banho-maria a 37oC por 5 min. Transcorrido este tempo, os tubos devem
retornar imediatamente para o gelo. Assume-se que nesse instante a reação para. Ainda no gelo,
adicionar a cada tubo 2 mL de DNS. Na presença de DNS, devido à alcalinidade do reagente, a enzima
para de funcionar.
3) Transferir os tubos para banho-maria fervente e esperar 10 min. Terminado este tempo, esfriar em
água corrente e adicionar 16 mL de água destilada a cada tubo. Homogeneizar os tubos por inversão e
ler as absorbâncias a 540 nm.
4) Calcular os valores de concentração de sacarose hidrolisada utilizando as leituras de absorbância e a
curva padrão obtida no item anterior. Calcular a velocidade inicial de reação considerando o tempo de
reação a 37oC (5 min).
5) Fazer um gráfico da velocidade (µmols de sacarose hidrolisada/min) em função da concentração inicial
do substrato (mM de sacarose). Estimar os valores de Vmáx e Km.
6) Fazer um gráfico de Lineweaver e Burk e calcular os valores de Vmáx e Km.
ANEXO I: Soluções utilizadas:

1) Tampão Acetato 0,02 M pH 4,77 (1 L):


Em um béquer de 1 litro pipetar 11,5 mL de ácido acético glacial (PA)
Colocar 0,4 g de hidróxido de sódio
Dissolver juntos, acertar o pH para 4,77
Completar o volume para um litro.

2) Sacarose 100 mM (1 L):


Dissolver em tampão acetato 0,02 M pH 4,77
Completar o volume para um litro.

3) Solução Padrão Redutora (1 L):


(A) 6.0 mM de Glicose
(B) 6.0 mM de Frutose
Dissolver a solução (A) e (B) com H2O destilada
Completar o volume para um litro.

4) DNS: Ácido 3,5 Dinitrosalicílico (1 L):


Em um béquer adicionar:
10 g de DNS
200 mL de hidróxido de sódio 2 M.
300 g de tartarato de sódio e potássio.
500 mL de água destilada
Dissolver em banho fervente e completar o volume para 1 litro.

5) Enzima Invertase
1,0 mg em 25 mL para uma concentração final de 40 µg/mL, em H2O. Diluir 5x para obter solução 8
µg/mL.
9

3. ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)

Dentre os métodos de separação de proteínas, a eletroforese é particularmente útil na


determinação do peso molecular de uma proteína desconhecida ou para se conhecer a pureza de uma
preparação de proteínas. Na separação eletroforética as proteínas, submetidas a um campo elétrico,
migram diferencialmente em função de suas massas.
O gel utilizado na eletroforese de proteínas é constituído de um polímero de acrilamida. A
polimerização de um monômero de acrilamida ocorre na presença de radicais livres, os quais são gerados
por persulfato de amônio e estabilizados por TEMED (N,N,N’,N’-tetrametiletilenediamina). A
polimerização também depende da presença de um agente bifuncional N,N’-metilenebisacrilamida
tornando as cadeias ligadas entre si, formando o gel cuja porosidade é determinada pelo comprimento
das cadeias e pelo grau de interligação entre estas. A porcentagem de acrilamida utilizada tem influência
direta na porosidade do gel. Géis com maiores porcentagens de acrilamida são mais adequados para a
separação de proteínas de menor peso molecular, enquanto géis com menores porcentagens de
acrilamida são mais adequados para a separação de proteínas de maior peso molecular.
O sistema de eletroforese que será utilizado é denominado descontínuo. São utilizados dois tipos
de gel, um denominado gel de empilhamento e outro denominado gel de corrida. A função do gel de
empilhamento é concentrar amostras com grande volume, resultando em uma melhor definição e
resolução dos resultados. As moléculas são então separadas no gel de corrida.
OBJETIVOS

Estimar o peso molecular de uma preparação de proteína. Observar a eficiência de separação por SDS-
PAGE das proteínas de uma amostra complexa.

MATERIAIS E REAGENTES

Materiais

1) Pipetas de vidro de 5 e 10 mL.


2) 2 béquers de 50 mL.
3) Luvas de látex.
4) Cuba para eletroforese vertical, com placas de vidro, espaçadores e pentes.
5) Micropipetas de 20 e 200 uL e respectivas ponteiras.
6) Fonte para eletroforese.

Reagentes

1) Acrilamida Bis-acrilamida 30%.


2) Tris-HCl pH 8,8, 1,5 M.
3) Tris-HCl pH 6,8, 0,5 M.
4) Persulfato de Amônio 10%.
5) TEMED.
6) Tampão de corrida Tris/Glicina/SDS.
7) Dodecil sulfato de sódio (SDS) 10%.
8) Tampão de amostra (4x)
9) Padrão de peso molecular para proteínas.
10) Albumina bovina.
11) Outras amostras de proteína.

PROCEDIMENTO
Serão montados géis de poliacrilamida de concentração 12% para separação de proteínas de diferentes
pesos moleculares.

Obs: Os monômeros de acrilamida são neurotóxicos, portanto, evite aspirar ou deixar cair na pele.
Caso isto ocorra, lave imediatamente, com bastante água e sabão. O polímero (poliacrilamida) é
inócuo/atóxico.
11

MONTAGEM DAS PLACAS NA CUBA DE ELETROFORESE

1. Limpe bem o conjunto de duas placas de vidro com etanol e seque com papel absorvente.
2. Monte o cassete de gel com as duas placas de vidro, colocando dois espaçadores entre as mesmas, um
em cada extremidade lateral do conjunto. Esses espaçadores irão delimitar a espessura do gel que será
polimerizado entre as placas de vidro.
3. Posicione o cassete de vidro no módulo de corrida, certificando-se de que o vidro com entalhe esteja
voltado para o lado interno. Ajuste os prendedores de maneira a deixar o cassete bem preso ao módulo.
4. Para vedar a base do cassete, aplique uma solução aquecida de agarose 2% no canal localizado na base
do módulo de corrida. Deixe a agarose solidificar por 15 minutos.

PREPARO DO GEL DE POLIACRILAMIDA (GEL DE SEPARAÇÃO E GEL DE EMPILHAMENTO)

1. Prepare primeiro o Gel de Separação, de acordo com a tabela abaixo.

PREPARO DO MINI-GEL DE SEPARAÇÃO (Gel 12%)

Soluções Volume (mL)


H2O destilada 3,4 mL
1,5M Tris-HCl pH 8,8 2,5 mL
10% SDS 100 µL
Acrilamida / bis-acrilamida 30 % 4,0 mL
10% persulfato de amônio 100 µL
TEMED 15 µL
Volume total 10 mL
2. Aplique o Gel de Separação no espaço entre as placas de vidro do cassete com o auxílio de uma pipeta
Pasteur, até o líquido atingir a altura desejada. Mantenha o restante da solução no béquer de preparo
para acompanhar a polimerização.
3. Adicione vagarosamente água destilada (com uma pipeta) por cima da solução de acrilamida a fim de
evitar possíveis imperfeições na linha divisória entre o gel de empilhamento e o de corrida.
4. Espere até que a acrilamida do béquer controle esteja completamente polimerizada e retire a água
adicionada sobre o gel de corrida.
5. Prepare primeiro o Gel de Empilhamento, de acordo com a tabela abaixo.

PREPARO DO MINI-GEL DE EMPILHAMENTO (Gel 5%)

Soluções Volume (mL)


Água destilada 3,6 mL
0,5M Tris-HCl pH 6,8 5,0 mL
10% SDS 100 µL
Acrilamida/bis-acrilamida 30% 1,3 mL
10% persulfato de amônio 100 µL
TEMED 15 µL
Volume total 10 mL

6. Aplique o Gel de Empilhamento sobre o Gel de Separação polimerizado, até a borda.


7. Imediatamente, ajuste o pente, permitindo a formação dos canais onde serão aplicadas as amostras.
8. Espere o gel controle polimerizar e retire o pente delicadamente. Lave os poços formados duas vezes
com água destilada.

OBSERVAÇÃO: Evite a formação de bolhas durante a aplicação dos géis e no posicionamento do pente.

Preparo das amostras

1. Em um tubo eppendorf, adicionar 2,5 µL de tampão de amostra 4x a 10 µL de uma solução de proteína


(2 mg/mL).
2. Ferver as amostras por 5 minutos para desnaturar as proteínas antes de aplicá-las no gel.

ELETROFORESE (CORRIDA) DO GEL DE POLIACRILAMIDA

1. Adicione o tampão de corrida (Obs: diluir 5x esta solução antes do uso) nas partes inferior e superior
da mini-cuba de eletroforese.
2. Com o auxílio de um pipetador automático, aplique lentamente 5 µL de mistura de proteínas de peso
molecular conhecido (marcador de peso molecular) a um dos poços de corrida.
3. Aplique as amostras previamente desnaturadas aos outros poços de corrida.
4. Tampe a cuba e conecte os cabos elétricos. Aplique uma tensão de 200 V por cerca de 45 minutos,
cuidando para que a linha do corante (azul de bromofenol-“linha de frente”) não ultrapasse os limites
inferiores do gel.
13

COMPOSIÇÃO DO PADRÃO DE PESO MOLECULAR DE PROTEÍNA

PROTEÍNA MASSA MOLECULAR


Miosina 200.000
β-galactosidade 116.000
Albumina bovina 76.000
Ovoalbumina 52.000
Anidrase carbônica 36.800
Inibidor de tripsina de soja 27.200
Lisozima 19.000
Aprotinina 6.500

VISUALIZAÇÃO DAS BANDAS DE PROTEÍNAS NO GEL

1. Desmonte a cuba e retire cuidadosamente o gel das placas de vidro, mergulhando-o em solução para
coração contendo Coomassie Blue. Deixe o gel 1 hora nesta solução.
2. Retire o gel da solução de coração e coloque na solução de descoramento, até ser possível visualizar as
bandas de proteínas (para um melhor resultado, deixe “overnight”).

SOLUÇÕES UTILIZADAS:

1) Acrilamida Bis-acrilamida 30%.


-29 g de Acrilamida
-1 g de bis-acrilamida
Completar o volume para 100 mL com H2O destilada
2) Tampão de Corrida (5x)
-15 g de Tris
-72 g de Glicina
-5 g de SDS
Completar o volume para 1 L com água destilada.

3) Tampão de amostra (4x)


-494 µL da solução de tampão Tris-HCl 1,0 M pH 6,8 (concentração final: 247 mM)
-400 µL de β-mercaptoetanol (concentração final de 20%).
-0,16 g de SDS (concentração final de 8%)
-0,01 g de azul de bromofenol (concentração final de 0,05%)
-800 µl de glicerol (concentração final de 40%)

4) Solução corante de gel (1L)


-10 g de Coomassie brilliant blue R-250
-400 mL de etanol
-100 mL de ácido acético

5) Solução de descoramento de gel (1L)


-40% de etanol
-10% de ácido acético
4. TESTE DE TOLERÂNCIA À GLICOSE E CURVA GLICÊMICA

OBJETIVOS

O teste oral de tolerância à glicose e a curva glicêmica são usados no diagnóstico de diabetes
mellitus, embora respostas anormais também ocorram em outras doenças, tais como nefrite e certas
anormalidades endócrinas. O teste avalia a capacidade do indivíduo de remover da circulação o excesso
de glicose adicionada.
Inicialmente, colhe-se uma amostra de sangue basal após o jejum de uma noite. Então, se
administra ao paciente 1 g de glicose por kg de peso, com um limite máximo de 75 g de glicose, por via
oral, diluída em cerca de 300 mL de água. A glicemia se excede na primeira hora, voltando
gradativamente ao normal após duas horas. No exame com fins clínicos, o paciente deve estar
confortavelmente sentado durante todo o teste, não deve fumar ou realizar exercícios e deve ter tido
uma dieta normal pelo menos 3 dias antes do teste.
Esta prática tem como objetivo determinar a captação de glicose por meio da curva glicêmica no
repouso e após a atividade física.

MATERIAIS E REAGENTES

Material

1) Glicosímetro.
2) Fitas para glicosímetro.
3) Lancetador automático.
4) Lancetas descartáveis.
5) Algodão.
6) Luvas descartáveis.

Reagentes

1) 1 copo de suco de laranja açucarado e/ou 4-5 bolachas doces.


2) Álcool 70% para assepsia.

Material Biológico

1) Voluntários humanos.
15

PROCEDIMENTO

A) Observações sobre coleta de material biológico humano.

1. Sempre usar luvas de procedimento para coleta do material.


2. Realizar assepsia local com álcool 70% antes da coleta. Não levar o dedo à boca após a
coleta. Estancar eventual sangramento com um pedaço de algodão limpo.
3. Descartar material descartável perfurocortante (lancetas descartáveis) contaminadas em
recipientes adequados (“Descarpak”).

B) Realização da curva glicêmica.

1. Com o uso do lancetador automático, coletar uma pequena amostra de sangue de cada
voluntário em jejum. Dosar a concentração de glicose com auxílio do glicosímetro.
2. Ingerir 1 g/kg de peso de sacarose em solução (máximo de 75 g de sacarose) ou beber o suco
de laranja e/ou ingerir 4-5 bolachas.
3. O voluntário deverá manter-se sentado durante todos os intervalos de coleta.
4. Medir a glicemia de cada voluntário nos tempos 30, 60, 90 e 120 minutos, com o auxílio do
glicosímetro.
5. Organizar os dados por indivíduo de cada grupo, calcular a média da turma e faixa máxima e
mínima obtida na turma, construindo gráficos com os dados de valores de glicemia na
ordenada e tempo na abscissa.

QUESTÕES

1) Explique a eventual diferença (ou não) nos valores de glicemia no jejum e nos diferentes tempos
após a ingestão de açúcar.
2) Como seria a curva de um paciente com suspeita de diabetes mellitus?
3) Quais são os critérios definidos pela Organização Mundial de Saúde (OMS), American Diabetes
Association (ADA) e Sociedade Brasileira de Diabetes (SBD) para o diagnóstico de Diabetes
mellitus?
NORMAS DE SEGURANÇA EM LABORATÓRIO

Qualquer laboratório onde se manipule substâncias químicas é potencialmente perigoso. Portanto, tenha o
máximo de cautela e atenção ao realizar um experimento, evitando conversas e brincadeiras que dispersem a
concentração.

As substâncias químicas, principalmente os solventes, são normalmente voláteis, corrosivos e combustíveis.


Desta forma, o uso de chama deve ser evitado e quando utilizado, deve-se tomar todas as precauções.

Existe uma regra geral que deve ser seguida neste ambiente: toda substância desconhecida é potencialmente
perigosa até que se prove o contrário!

A toxicidade das substâncias químicas varia enormemente e nem todas, mesmo as mais comuns, tiveram seus
aspectos toxicológicos suficientemente estudados.

Muitas das operações de laboratório necessitam de instruções específicas que os alunos devem seguir para a sua
segurança e de seus colegas. Embora as normas aqui assinaladas devam se estender a todos os ambientes onde se
manipulem substâncias químicas, nesta explanação, a sua importância se restringirá exclusivamente ao
laboratório de Bioquímica.

Diversas operações são desenvolvidas na rotina de um laboratório de Bioquímica. Entretanto, algumas práticas
gerais devem ser sempre obedecidas:

1. Não trabalhe sozinho no laboratório. O técnico responsável ou professor deverá estar presente. Além
disso, um companheiro, ao menos, sempre será uma ajuda em caso de acidente.
2. Use avental de mangas longas e confeccionado com tecido 100% algodão para proteger a roupa.
3. Use sapato fechado (NUNCA sandálias).
4. Use calças compridas (NUNCA saias, vestidos, bermudas ou shorts).
5. O material de uso pessoal deve ser guardado longe da bancada de trabalho, de modo a evitar acidentes.
6. Não fume no laboratório.
7. Não é permitido correr e realizar brincadeiras ou jogos no laboratório. Ao transitar pelo laboratório,
cuidado com os colegas que estão trabalhando nas bancadas, para evitar esbarrões que poderão causar
acidentes.
8. Se algum ácido ou outro produto químico for derramado, lave o local com bastante água.
9. Leia com atenção o rótulo dos reagentes para se ter certeza de que pegou o frasco correto.
10. Não jogue material sólido na pia.
11. Observe a limpeza dos materiais antes de utilizá-los.
12. Não gaste reagentes e soluções inutilmente, utilize somente o necessário para o experimento.
13. Nunca pese material diretamente sobre o prato da balança; use béquer, vidro de relógio, papel alumínio
ou papel manteiga.
14. Não ingira ou beba qualquer alimento no laboratório.
15. Não recoloque nos frascos soluções restantes, podem contaminar o conteúdo do recipiente.
16. Quando utilizar soluções e reagentes, certifique-se que o rótulo esteja voltado para cima, evitando que se
estrague.
17. Só use água destilada nos experimentos, a menos que indicado o contrário.
18. Não trabalhe com material defeituoso, principalmente de vidro.
19. Não deixe sobre a mesa a lamparina acesa com chama forte.
20. Não deixe vidro quente em lugar que possam pegá-lo inadvertidamente.
21. Não prove ou engula reagentes do laboratório.
22. Não trabalhe com materiais ou substâncias inflamáveis próximo a chamas.
23. Não aqueça tubos de ensaio com a boca virada para si ou para outra pessoa. Habitue-se a aquecer o tubo
de ensaio de forma intermitente.
24. Não aqueça substâncias inflamáveis ou voláteis em chama direta, use banho-maria.
25. Feche direito os frascos das soluções e regentes, principalmente os que forem voláteis e inflamáveis.
17

26. Não jogue líquidos inflamáveis na pia, se o fizer abra bastante a torneira.
27. Lave bem as mãos ao deixar o laboratório.
28. NUNCA pipete com a boca soluções ou líquidos puros. Use pêras de sucção.
29. NUNCA adicione água a uma solução de ácido ou base concentrada para diluí-los. Sempre adicione
essas soluções concentradas à água.
30. Substâncias como vapores tóxicos tais como: bromo, cloro, ácido clorídrico e nítrico concentrados,
solução concentrada de amônia entre outras devem ser manipuladas na capela.
31. A neutralização de ácidos e bases deve ser realizada na capela. Use sempre luvas de borracha.
32. Tão importante quanto trabalhar em segurança é trabalhar ordenadamente, com consciência da seqüência
a ser realizada. Leia atentamente o procedimento experimental certificando-se de que todos os materiais
e reagentes necessários estão disponíveis. Anote os resultados obtidos relacionando-os à teoria da
prática.
33. Consulte o professor quando tiver dúvidas e avise-o de qualquer acidente que ocorra por menor que
pareça.
34. O laboratório gera resíduos provenientes dos restos das amostras analisadas e produtos líquidos (aquosos
ou orgânicos) ou sólidos provenientes de processos de análise, digestões etc. Em princípio, devemos
procurar reduzir ao mínimo a geração de lixo requisitando apenas o necessário e suficiente de materiais e
reagentes para a realização da análise e, sempre que possível, adotar métodos analíticos que utilizem o
mínimo de amostras. Antes de realizar o descarte de reagentes ou resíduos e a lavagem de materiais
utilizados na aula prática, procure identificar os locais apropriados, formas de tratamento e descarte dos
mesmos, especificados pelo técnico responsável.

Com relação aos tipos de substâncias que deverão sofrer tratamento antes do descarte, algumas
informações gerais que podem ser úteis são:

• Para materiais perfurocortantes como agulhas, seringas, lâminas, material descartável há um local
adequado para descarte.
• Líquidos aquosos sem metais pesados e sem fluoretos, soluções geradas em análises titulométricas
ácido-base, de precipitação, determinações de metais alcalinos terrosos com EDTA, acertar o pH entre 5
e 9, diluir com água e descartar na pia.
• Soluções contendo metais pesados (por exemplo, mercúrio presente em termômetros) requerem
tratamento especial pela alta toxidez e rigidez da legislação vigente. Portanto, há local adequado para
descarte de soluções contendo metais pesados. Muitas vezes pode-se quebrar o bulbo de um termômetro
de mercúrio. Em caso de derramamento de mercúrio, chame o professor ou técnico responsável. Deverá
ser providenciado ventilação exaustiva no laboratório e o uso de EPIs (equipamentos de proteção
individual: máscara respiratória adequada, óculos e luvas de borracha) específicos para a remoção do
mercúrio, fazendo amálgama com limalha ou fio de cobre para que o material possa ser encaminhado
para empresas de reciclagem. Por isso, seja BASTANTE CUIDADOSO com os termômetros utilizados
no laboratório; evite brincadeiras e seja cuidadoso para evitar derrubá-los no chão ou na bancada.