UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA

CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DISCIPLINA DE BIOLOGIA MOLECULAR

LIZANDRA MARIA DE AGUIAR ZANON SOARES

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA

EXTRAÇÃO DE DNA
12/09/2018
1. INTRODUÇÃO

O DNA é um ácido nucleico presente em todas as células dos organismos

vivos, além de ser responsável por carregar toda a informação genética
(ALONSO et al, 2003). A extração de ácidos nucléicos é o passo de saída para a
realização da maioria das técnicas biomoleculares, podendo o DNA ser obtido a
partir de inúmeros tipos de tecidos e células (tecido animal, tecido vegetal e
microrganismos). A extração se baseia na lise das membranas lipídicas,
purificação, preciptação e reidratação do DNA, para que assim possa ser
aplicado à tecnica de leitura ou quantificação escolhida (WATSON et al, 2015).

A metodologia adotada para extração foi de acordo com a origem celular

utilizada (bactéria Gluconacetobacter diazotrophicus) e a análise do DNA
extraído foi feita através de eletroforese em gel, sendo o princípio dessa técnica
baseado no fato da molécula de DNA possuir carga negativa em valores de pH
neutro e consequentemente, quando aplicada na matriz de gel submetida a um
campo elétrico, migra em direção ao pólo positivo. A movimentação e migração
das moléculas carregadas em um campo e!étrico na eletroforese ocorre através
de um gel que funciona como filtro, separando essas moléculas. A separação
desses fragmentos depende da concentração da agarose, do tamanho do
fragmento e da voltagem aplicada durante a eletroforese (OLIVEIRA, 2007).

1.1. OBJETIVOS

O objetivo da aula prática foi extrair, purificar e quantificar a amostra de DNA

da bactéria Gluconacetobacter diazotrophicus através da técnica de
eletroforese em gel.
1.2. MATERIAIS E MÉTODOS

• Tipo celular utilizado: cultura bacteriana (Gluconacetobacter diazotrophicus).

• Meterias: pipetas, luvas, tubos eppendorf e reagentes específicos para

extraçãod de DNA.

• Equipamentos: centrifuga, cuba de eletroforese, vortéx (agitador),

espectofotômetro (NaNoDrop ND-1000 UV-Vis)

 Foi transferido 1,5mL de cultura bacteriana para o tubo tipo eppendorf e

centrifugado a 14.000 RPM por 2 minutos.
 O sobrendante foi descartado e o precipitado ressuspendido com o meio
que restar no tubo com o auxílio do vortéx.
 Acrescentou-se 300μL de Plant DNAzol (auxilía na alta qualidade de
isolamento do DNA), que foi agitado por 5 minutos em temperatura
ambiente.
 Acrescentou-se 300μL de clorofórmio (utilizado para purificação do DNA,
provocando a desnaturação das proteínas de maneira eficiente), que foi
agitado por 5 minutos em temperatura ambiente.
 O material foi centrifugado durante 10 minutos a 10000 rpm e a fase
aquosa foi transferida para outro tubo.
 O DNA foi precipitado pela adição de 2,5 volumes (aproximadamente 300
μL) de etanol 100%, misturado por inversão e incubado durante 5 minutos
em temperatura ambiente.
 Novamente o material foi centrifugado durante 4 minutos a 12000 rpm e
descartado o sobrenadante.
 O precipitado foi lavado com 300 μL de etanol 70% gelado e centrifugado
durante 4 minutos a 10000 rpm.
 O sobrenadante surgido foi descartado, o precipitado foi secado e
ressuspendindo em 50 μL de TE RNAse.
 A amostra foi incubada a 37°C por 1 hora e armazenada em freezer -20°C
para posterior aplicação das amostras nos poços eletroforéticos.
 Foi utilizado o espectofotômetro para fazer a quantificação do DNA.
1.3. RESULTADOS E DISCUSSÕES

A interpretação do gel ocorre de acordo com a intensidade das concentrações

apresentadas nas bandas. Abaixo, apresentado na figura 1, a banda C3 não
demonstrou migrar no gel (quando a banda migra/se espalha é sinal de
degradação do DNA), tratando-se assim de uma banda de boa qualidade. O gel
de agarose vai permitir que se verifique o sucesso da extração de DNA, pois
quanto mais forte e corada a banda, maior a quantidade de DNA extraído; no
caso do resultado da amostra C3, observa-se uma banda nítida, porém abaixo da
quantificação esperada.

No que se refere a razão de absorvâncias, pode-se inferir que a razão ficou

em 85,43 ng/uL, não demonstrando um total grau de pureza do DNA, o que
também influência em como a banda de destaca no gel.

Figura 1 – Gel de eletroforese das amostras de DNA

1.6. CONCLUSÕES

Dado a análise dos resultados da amostra C3, a extração, purificação e

quantificação do DNA foi alcançada sem que ocorresse degradação do
mesmo; porém, apesar da extração eficaz e sem fragamentação, a amostra
não atingiu seu grau total de pureza, formando uma banda menos nítida e
abaixo da qualidade esperada.
 1.7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALONSO, V. et al. Avaliação de três métodos de extração de DNA de material

parafinado para amplificação de DNA genômico pela técnica da
PCR. Brazilian Journ al of Veterinary Research and Animal Science, [S.L],
mar. 2003.

BAREA, Jaqueline A.; PARDINI, Maria Inês M. C.; GUSHIKEN, Tsieko.

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OLIVEIRA, M. C. D. S. et al. Fundamentos teóricos-práticos e protocolos
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