UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA – UFBA

ESCOLA POLITÉCNICA
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química

INFLUÊNCIA DO PH DO MEIO E CONCENTRAÇÃO DE QUITOSANA NA

FLOCULAÇÃO DE MICROALGAS DESMODESMUS sp.: OTIMIZAÇÃO DA
EFICIÊNCIA DE SEPARAÇÃO DA BIOMASSA

MARIANA CONCEIÇÃO DOS SANTOS

Salvador – BA
2016
 UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA – UFBA
ESCOLA POLITÉCNICA
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química

INFLUÊNCIA DO PH DO MEIO E CONCENTRAÇÃO DE QUITOSANA NA

FLOCULAÇÃO DE MICROALGAS DESMODESMUS sp.: OTIMIZAÇÃO DA
EFICIÊNCIA DE SEPARAÇÃO DA BIOMASSA

Orientador: Prof. Dr. Samuel Luporini

Co-orientador: Prof. Dr. Emerson Andrade Sales

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química

da UFBA – Escola Politécnica, como requisito parcial à obtenção do Grau de Mestre
em Engenharia Química, Área de Concentração: Processos Biotecnológicos e
Ciências dos Materiais.

Salvador – BA
2016
 Experiment!
Make it your motto day and night.
Experiment, And it will lead you to the light.
The apple on the top of the tree
Is never too high to achieve.
So take an example from Eve ... Be curious, Experiment!
Though interfering friends may frown.
Get furious at each attempt to hold you down.
lf this advice you only employ,
The future can offer you infinite joy
And merriment …
Experiment and you'll see!
Cole Porter
 DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho e todo esforço desempenhado

na sua execução aos meus pais Angelice e Pedro,
por serem meus amores, minha inspiração e
exemplo maior do que é ser humano.

.
 AGRADECIMENTOS

Primeiramente gostaria de agradacer às forças que nos une na terra. Agradecer pela
saúde, disposição e coragem que me dera.

Atoda minha família, por todo amor dedicado, afetividade, e por serem a base
estrutural da minha personalidade, em especial meus pais, Angelice e Pedro, meus
irmãos Valdo, Kelly e Júnior, meus sobrinhos Gustavo e Mariah, e minha avó Maria
Domingas por todos os ensinamento de amor ao próximo. E muitos outros
componentes da família que não há espaço suficiente nas linhas desta página para
expressar meu sentimento por todos vocês. Muito obrigada!

Aos meus orientadores Dr. Emerson Andrade e Dr. Samuel Luporini pela oportunidade
de trabalhar com vocês e por todos os ensinamentos passados. Agradeço de coração.

Aos meu amigos-amores de faculdade Déa, Pattinhas, Maiton, Keury, Djeine,

Marocas, Desiane, por todo o tempo disponibilizados em discussões aleatórias,
diversões e aprendizados de uma forma geral. Aos meus amigos Hélio e Jarlon por
todas as conversas e auxílio na construção desse trabalho.

A minhas novas amizades feitas nesta fase da minha vida, Sonia, Isabel e Luiza, muito
obrigada pelos ensinamentos e contribuições dadas ao meu trabalho, espero levar a
amizade e companheirismo de vocês por toda a minha vida. Sem esquecer de Vivi,
Nick e Gerlane.

Ao grupo Labec pela recepção, compartilhamento de conhecimentos e disponibilidade

de recursos utilizados na execução do trabalho.

Por fim, ao Programa de Pós-Graduação de Engenharia Química da Universidade

Federal da Bahia e a CAPES pela oportunidade e bolsa de estudos.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... i
LISTA DE TABELAS ................................................................................................. iiii
RESUMO ................................................................................................................... iv
ABSTRACT ............................................................................................................... vii
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 13
2. OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 17
2.1 Objetivos específicos ....................................................................................... 17
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................... 18
3.1 Microalgas ........................................................................................................ 18
3.2 Formas de cultivo de microalgas...................................................................... 21
3.3 Métodos de separação de biomassa de microalgas ........................................ 23
3.3.1 Filtração ..................................................................................................... 24
3.3.2 Sedimentação ............................................................................................ 24
3.3.3 Centrifugação ............................................................................................ 25
3.3.4 Flotação ..................................................................................................... 25
3.3.5 Floculação ................................................................................................. 26
3.4. Quitosana ........................................................................................................ 30
3.4.1 Breve Histórico........................................................................................... 31
3.4.2 Estrutura Química da Quitosana ................................................................ 32
3.4.3 Preparação de quitosana ........................................................................... 32
3.4.4 Propriedades e características da quitosana ............................................. 34
3.5 Floculação de microalgas por utilização de quitosana ..................................... 37
4. METODOLOGIA ................................................................................................. 40
4.1 Microalga ......................................................................................................... 40
4.2 Propagação das células para obtenção do inóculo e scale-up ........................ 41
4.3 Cultivo em fotobiorreatores tubulares .............................................................. 42
4.4 Floculação ........................................................................................................ 44
4.4.1. Preparo da solução de quitosana ............................................................. 44
4.4.2. Caracterização da quitosana .................................................................... 44
4.4.3 Modelagem da eficiência de floculação por Metodologia de Superfície de
Resposta (MSR) ................................................................................................. 46
4.5 Reutilização do meio floculado com quitosana ................................................ 49
4.5.1 Espectroscopia RAMAM de biomassa de meio reutilizado ........................ 49
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 50
 5.1 Propagação celular .......................................................................................... 50
5.2 Cultivo em fotobiorreatores tubulares .............................................................. 51
5.2. Caracterização da quitosana .......................................................................... 53
5.2.1 Análise termogravimétrmica da quitosana (ATG) ...................................... 53
5.2.2. Análise Calorimétrica Diferencial da Quitosana (DSC) ............................. 54
5.2.3 Grau de Desacetilação .............................................................................. 56
5.2.4. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ............................................. 57
5.3. Planejamento fatorial ...................................................................................... 58
5.4. Modelagem da eficiência de floculação por MSR ........................................... 59
............................................................................................................................ 65
5.4.1 Modelo matemático e Superfície de Resposta ......................................... 65
5.5. Reaproveitamento do meio de cultivo ............................................................. 69
6. CONCLUSÕES ................................................................................................... 74
7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS .................................................. 75
8. Referências ........................................................................................................... 76
9. ANEXOS ............................................................................................................... 85
Anexo A – Meio de cultivo BBM ............................................................................. 85
Anexo B – Densidade ótica utilizadas para cálculo da Eficiência de Floculação do
tópico 5.4 ............................................................................................................... 86
10. APÊNDICES........................................................................................................ 87
Apêndice A – Curva de crescimento de Desmodesmus sp. para cultivo em
Erlenmeyers de 250 mL ......................................................................................... 87
Apêndice B – Curva de crescimento de Desmodesmus sp., em função da
Absorbância a 680 nm ao longo do período de cultivo em Erlenmeyers de 250 mL
............................................................................................................................... 87
Apêndice C – Curva de crescimento de Desmodesmus sp. para cultivo em
Erlenmeyers de 500 mL ......................................................................................... 88
Apêndice D – Curva de crescimento de Desmodesmus sp., em função da
Absorbância a 680 nm ao longo do período de cultivo em Erlenmeyers de 500 mL
............................................................................................................................... 88
LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Espécies de Desmodesmus. a) Desmodesmus abundans; b) Desmodesmus

communis; c) Desmodesmus protuberans; d) Desmodesmus serratus; e)
Desmodesmus cf. opoliensis var. mononensis (R. Chodat). Fonte: adaptado de
Algaebase e Culture Colection of Autotrophic organisms ....................................... 212

Figura 2. Configuração de reatores para cultivo de microalgas: (a) sistemas de lagoas

abertas; (b) reator twin-layer; (c) e (d) reatores tubulares (adaptado de Harun et al.,
2010 e Li et al., 2015) .............................................................................................. 223

Figura 3. Estrutura química da quitina e quitosana ................................................ 323

Figura 4. Fluxograma do processo de preparação da quitosana............................ 334

Figura 5. Modelo de reator utilizado nos experimentos .......................................... 434

Figura 6. Fases da propagação do cultivo celular de Desmodesmus sp. (a) cultivo em

Erlenmeyers de 250 mL (b) cultivo em Erlenmeyers de 2 L .................................... 512

Figura 7. Cultivo de microalgas Desmodesmus sp. em reatores tubulares ............ 512

Figura 8. Curva de crescimento de Desmodesmus sp. em fotobioreatores tubulares

................................................................................................................................ 523

Figura 9. Curva de crescimento de microalgas Desmodesmus sp., em função da

Absorbância a 680 nm ao longo do período de cultivo em fotobiorreatores tubulares.
.................................................................................................................................. 54

Figura 10. Análise termogravimétrica da quitosana ................................................ 535

Figura 11. Curva DSC da quitosana ....................................................................... 547

Figura 12. Espectro FTIR da quitosana ................................................................. 568

Figura 13. Imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura da quitosana .......... 578

Figura 14. Gráfico quadrado das médias ................................................................. 59

Figura 15. Mecanismo de floculação por charge-patch (M. Hubbe) Error! Bookmark
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Figura 16. Etapas dos ensaios de separação de biomassa de Desmodesmus sp (a)

Ensaios em Jar Teste antes da adição do floculante; (b) Ensaios em Jar Teste após
adição de floculante; (c) Flocos em cones de sedimentação; (d) Biomassa seca em
placas de petri ......................................................................................................... 634

Figura 17. Imagem de microscopia RAMAM de Desmodesmus sp. antes da floculação

. ............................................................................................................................... 644

Figura 18. Imagem de microscopia RAMAM de flocos de Desmodesmus sp. após

floculação .................................................................. Error! Bookmark not defined.5

Figura 19. Valores experimentais e valores estimados para eficiência de floculação

de biomassa de Desmodesmus sp. usando quitosanaError! Bookmark not
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Figura 20. Superfície de Resposta ........................... Error! Bookmark not defined.8

Figura 21. Curvas de contorno ................................................................................. 69

Figura 22. Ensaios de reaproveitamento do meio de cultivo após floculação de

biomassa de Desmodesmus sp. (a) primeiro dia do experimento; (b) último dia do
experimento .............................................................................................................. 70

Figura 23. Curva de crescimento de microalgas Desmodesmus sp. em meio

reutilizado após floculação de biomassa pela utilização de quitosana.Curvas de
contorno .................................................................................................................... 71

Figura 24. Espectro Ramam de microalgas Desmodesmus sp. em meio de cultivo

BBM .......................................................................................................................... 72

Figura 25. Espectro Ramam de microalgas Desmodesmus sp. cultivada em meio de

cultivo BBM reaproveitado....................................................................................... 712
LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Produtos de valor agregado a partir de microalgas (adaptado de

Comprehensive Report on Attractive Algae Product Opportunities – Preview Feb 2015)
.................................................................................................................................. 18

Tabela 2. Comparação dos métodos de separação de biomassa (adaptado de

MILLEDGE e HEAVEN, 2013). ................................................................................. 28

Tabela 3. Condições e eficiência de floculação química para microalga Scenedesmus

sp .............................................................................................................................. 30

Tabela 4. Características de quitosana com diferentes grau de desacetilção .......... 35

Tabela 5. Eficiência de floculação com quitosana para diferentes espécies de

microalgas e condições de pH e Concentração de quitosana (C) ............................. 39

Tabela 6. Resultado da ANOVA para o Planejamento Fatorial Error! Bookmark not

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Tabela 7. Resultados para o delineamento experimental DCCR ......................... 5860

Tabela 8. Resultados da ANOVA para o planejamento DCCR ................................ 65

Tabela 9. Estimativa de efeitos do pH do meio e da concentração de quitosana . 656

Tabela 10. Validação do modelo quadrático proposto .............................................. 69

 RESUMO

Microalgas são células autossuficientes que produzem e armazenam energia, sua

estrutura unicelular permite uma fácil conversão de energia solar em energia química,
que podem ser utilizadas para vários fins, desde produtos de química fina e produtos
farmacêuticos, alimento para consumo humano e ração animal, ou até mesmo como
fonte de biocombustíveis. Estima-se que a recuperação da biomassa é responsável
por, pelo menos, 20 a 30% do total do custo da produção de biomassa de micrroalgas.
Dentre os diversos métodos utilizados para a separação de microalgas a partir do
meio de cultivo, a floculação é uma das técnicas mais promissoras. Produtos naturais
têm sido estudados como potenciais agentes floculantes, dentre estes, a quitosana
tem apresentado bom desempenho. A proposta do presente estudo foi desenvolver
um método eco-eficiente para a separação de uma espécie de microalgas de água
doce, Desmodesmus sp. Para tal propósito, inicialmente foi realizado uma
caracterização da estrutura polimérica da quitosana através da determinação do grau
de desacetilação, análise termogravimétrica (TG), calorimetria exploratória diferencial
(DSC) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Em seguida foi realizada uma
revisão na literatura a cerca das variáveis que influenciam no processo de floculação
de microalgas por utilização de quitosana, e posterior aplicação de planejamento
fatorial para determinar a região de trabalho das variáveis independentes
selecionadas (concentração de quitosana e pH do meio). Os ensaios subsequentes
foram concentrados na modelagem da Eficiência de Floculação (Ef) em função da
concentração de quitosana (C) e pH do meio, para tal foi utilizado um Delineamento
do Composto Central Rotacionado (DCCR) seguido pela Metodologia da Superfície
de Resposta (MSR). De acordo com os resultados da Análise de Variância (ANOVA),
apenas os efeitos linear e quadrático da concentração de quitosana apresentaram
siginificância (p-valor<0,05) na resposta (eficiência de floculação). Apesar de
possuirem p-valor>0,05, o efeito linear do pH e a interação entre os fatores não foram
negligenciados, visto que na prática é possível identificar a importância do pH do meio
na Ef, e a sinergia entre o pH e a quantidade de quitosana necessária para alcançar
uma resposta positiva na Ef, sendo estes incluídos no modelo matemático polinomial.
O modelo polinomial quadrático é considerado adequado em termos de
reprodutibilidade (R²=0,8962). Testes de reaproveitamento do meio de cultivo
sobrenadante após o processo de floculação revelaram resultados positivos, o que
implica que a quitosana pode ser considerada como um produto não-tóxico às
microalgas.

Palavras-chave: Desmodesmus sp., concentração de quitosana, floculação, pH.

 ABSTRACT

Microalgae are self-sufficient cells that produce and store energy, their unicellular
structure allows an easy conversion of solar energy into chemical energy, which can
be used for different purposes, since production of fine chemicals and
pharmaceuticals, food for human consumption and animal feed, or even it can be used
as a source of biofuels. It is estimated that the biomass harvesting process is
responsible for at least 20-30% of the total biomass production cost. Among the
methods used to separate microalgae from the culture medium flocculation is one of
the most promising techniques. Some natural products have been studied as potential
flocculating agents, among them, the chitosan presents a good performance. The
purpose of this study was to develop an eco-efficient method for the separation of a
freshwater microalgae specie, Desmodesmus sp. For this purpose initially a
characterization of polymeric structure of chitosan was performed through
determination of deacetylation degree, thermalgravimetric analysis (TG), differential
scanning calorimetry (DSC) and scanning electron microscopy (SEM). Then for the
next step was realized a literature review about the variables that can directly
influences the microalgae flocculation process by chitosan use and a subsequent was
made an application of experimental design to determine the experimental region of
the selected independent variables (concentration of chitosan and pH of the medium).
Subsequent assays were focused in modeling the flocculation efficiency (FE) as a
function of the concentration of chitosan (C) and medium pH, for this was used a
Central Composite Rotational Design (CCRD) followed by Response Surface
Methodology (RSM). According to the results of analysis of variance (ANOVA), only
the linear and quadratic effects of chitosan concentration were statistically significant
(p <0.05) at the response (flocculation efficiency). Although the linear effect of pH and
the interaction between the factors (C and pH) possess a p-value>0.05, they cant not
be neglected, since in practice it is possible to identify the importance of medium pH
at the FE response, and the synergetic effect of pH and the amount of chitosan
required to achieve a positive response in FE, so these factors were included in the
polynomial mathematical model. The quadratic polynomial model resulted from the
analysis is considered to be appropriate in terms of reproducibility (R ² = 0.8962).
Reuse tests of the medium culture supernatant after flocculation process revealed
positive results, which implies that chitosan can be considered as a non-toxic product
for microalgae.

Keywords: Desmodesmus sp., chitosan concentration, floculation, , pH

 1. INTRODUÇÃO

Biomassa é um termo usado para todo o material orgânico de plantas (incluindo

algas) derivado da reação de fotossíntese entre CO2 (presente no ar), água e luz solar.
Como resultado da reação são produzidos componentes estruturais da biomassa,
estas moléculas armazenam a energia solar em suas ligações químicas
(MCKENDRY, 2002).
A biomassa de microalgas tem atraido grande interesse de pesquisadores,
empreendedores, e do setor governnamental (MEDIPALLY et al., 2015). De acordo
com a FAO (2006), quando comparado à biomassa de vegetais, o cultivo de
microalgas apresenta características mais atrativas, tais como os custos associados
com a colheita e o transporte (menor volume, quando concentrada), que são
relativamente inferior; em virtude de seu diminuto tamanho, podem ser facilmente
tratadas por meio de processos químicos; são cultivadas em condições que não são
adequadas para a produção agrícola convencional; são organismos capazes de fixar
CO2 da atmosfera, facilitando, assim, a redução do aumento dos níveis de CO2 na
atmosfera, considerado um problema global; além de que estas não requerem raízes
e rebentos para a absorção de água ou suporte. A biomassa de microalgas contém
menos compostos estruturais, tais como a lignina e celulose e, portanto, produz
menos produtos residuais do que as culturas agrícolas (VANDAMME, 2013).
As microalgas são microrganismos fotossintéticos, caracterizados como células
autossuficientes que produzem e armazenam energia (GUPTA et al., 2014). Sua
estrutura unicelular permite uma fácil conversão de energia solar em energia química
(HARUN et al., 2010) que podem ser utilizadas para vários fins (GUPTA et al., 2014;
MEDIPALLY et al., 2015 ), desde produtos de química fina e produtos farmacêuticos,
alimento para consumo humano e ração animal, ou até mesmo como fonte de
biocombustíveis (ACIÉN et al., 2013; ZHUANG et al., 2016). Estes microorganismos
contém clorofila que pode ser utilizada para propósitos alimentícios e cosméticos, na
indústria farmacêutica pode-se produzir compostos bioativos, como antioxidantes e
antibióticos (HARUN et al., 2010; ZHUANG et al., 2016). Células de algumas estirpes
de microalgas contém compostos bioativos funcionais, tais como luteína e zeaxantina,
componentes essenciais do pigmento macular da retina dos olhos (WEISS et al.,
2007a; WEISS et al., 2007b).
14
 Além das microalgas serem utilizadas como nutriente suplementar para o consumo
humano, devido ao seu alto teor de proteínas, vitaminas e conteúdo de
polissacarídeos, algumas espécies de microalgas contém elevado conteúdo lipídico
que podem ser extraidos e transesterificados à biodisel. Posteriormente, após a
extração de lipídios, a biomassa residual pode ser convertida para a produção de
diferentes tipos de biocombustíveis, como biometano, bioetanol e biohidrogênio
(HARUN et al., 2010).
As microalgas utilizam nitrogênio e fósforo como nutrientes para desenvolver-se,
aumentar o número de células, e consequentemente volume de biomassa. Águas
residuárias representam uma alternativa de fonte de nutrientes para o cultivo de
microalgas (POSTENA e SCHAUBB, 2009), o que demonstra o grande potencial das
microalgas em reduzir problemas ambientais, como a poluição de água residuária
industrial; além da redução do efeito estufa, devido a sua capacidade de fixar dióxido
de carbono liberado por usinas de energia (HARUN et al., 2010).

De todas as operações unitárias utilizadas na produção de microalgas, a

separação da biomassa a partir do meio de cultura apresenta uma importância crucial
no processo (ZHU, 2012). A necessidade de grandes volumes de água para cultivo
resulta em uma pequena proporção biomassa:líquido, o que aumenta os custos de
processos de downstream para cerca de 30-40% dos custos totais de produção de
biomassa (RAJENDRAN e HU, 2016; ZHUANG et al., 2016).

Além da baixa concentração de biomassa no meio de cultura, a separação da

biomassa de microalgas é um desafio devido ao pequeno tamanho da célula, (ZHU,
2012, GUPTA et al., 2014), e a semelhança da densidade das células com o meio de
cultivo; a presença de cargas negativas na superfície celular transforma a suspensão
de microalgas numa dispersão estável, especialmente durante a fase de crescimento
(MILLEDGE e HEAVEN, 2013).

A biomassa de microalgas pode ser separada do meio por diferentes métodos:

sedimentação, floculação, flotação, centrifugação e filtração, ou a combinação de
alguns destes (MILLEDGE e HEAVEN, 2013). No entanto, a maioria destas técnicas
têm desvantagens, tais como alto custo, baixa eficiência de recuperação ou
dificuldades envolvidas no processo de aumento de escala. Dentre os mais diversos

15
métodos utilizados na separação de microalgas a partir do meio de cultivo, a
floculação é uma das técnicas mais promissoras (SALIM et al., 2011), apresenta-se
como um método relativamente simples (ZHU, 2012), capaz de lidar com grandes
quantidades de suspensão de microalgas e uma vasta gama de espécies (MILLEDGE
e HEAVEN, 2013), e apresenta, portanto, menor impacto ambiental. A maior parte do
ônus ambiental deste processo esta relacionado com a escolha do agente floculante
(BRENTNER et al., 2011).
Diversos métodos têm sido testado para induzir a floculação (SCHLESINGER et
al., 2012) e são amplamente utilizados em setores como o tratamento de água e
mineração (VANDAMME et al., 2010). Estes métodos utilizam tanto agentes
inorgânicos, como cloreto férrico ou de alumínio, polímeros sintéticos ou polímeros
naturais (SUKENIK, 1988; VANDAMME et al., 2013; GRIMA et al., 2003; HARUN et
al., 2010; GUPTA et al., 2014).
Produtos naturais têm sido estudados como potenciais agentes floculantes, tais
como argilas, quitosana e amido catiônico, essas macromoléculas possuem a
vantagem de serem biodegradáveis e apresentam índice de toxicidade nulo para o
consumo humano (WANG et al., 2013). Dentre estes, a quitosana apresenta o menor
impacto na biomassa de microalgas produzida (BRENTNER et al., 2011).
A quitosana é um aminopolissacarídeo produzido a partir da desacetilação alcalina
da quitina (GUALTIERI et al., 1988), este por sua vez é um produto residual da casca
de crustáceos (VANDAMME et al., 2013).
Devido a variações significativas nas propriedades químicas e físicas entre as
cepas de microalgas, a produção de biomassa e parâmetros do processo de
separação precisam ser melhorados para cada linhagem (CHEN et al., 2014).
A floculação depende da composição bioquímica e das propriedades da superfície
da celular, e estas por sua vez diferem entre as espécies e variam também dentro de
uma mesma espécie, dependendo das condições da cultura, e fase de crescimento.
A relação entre superfície celular e biomassa aumenta com a diminuição do tamanho
das células, as espécies menores necessitam de uma dose mais elevada de floculante
para separar a mesma quantidade de biomassa de espécies maiores (VANDAMME et
al., 2013).

16
 Diante do exposto, este trabalho tem como objetivo avaliar a ação da quitosana no
mecanismo de floculação da microalga Desmodesmus sp, visando maximizar a
eficiência de floculação.

17
 2. OBJETIVO GERAL

Desenvolver um método eco-eficiente de separação da biomassa de microalgas

Desmodesmus sp.

2.1 Objetivos específicos

 Avaliar crescimento celular da microalga Desmodesmus sp. e scale-up do

cultivo para fotobiorreatores tubulares.
 Caracterizar a quitosana utilizada no desenvolvimento desse trabalho.
 Maximizar a eficiência de floculação para Desmodesmus sp. através da
metodologia da superfície de resposta e investigar os efeitos das/entres as
condições de floculação.
 Compreender os mecanismos envolvidos na floculação de Desmodesmus
sp. com quitosana.
 Estudar a possibilidade de reuso do meio de cultivo sobrenadante após a
floculação.

18
 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Microalgas

A biotecnologia de microalgas tem sido desenvolvida para diferentes aplicações

comerciais (HARUN et al., 2010). A Tabela 1 mostra uma relação de produtos de
valor agregado provenientes de biomassa de microalgas.

Tabela 1. Produtos de valor agregado a partir de microalgas (adaptado de

Comprehensive Report on Attractive Algae Product Opportunities – Preview Feb 2015)
Alto valor Médio valor Baixo valor
Nutracêuticos Nutracêuticos Fertilizantes e ração
a) Astaxantina a) Spirullina e animal
b) Betacaroteno Chlorella a) Ração para
c) Ácidos graxos aquacultutura
Ômega-3 (ácido (alimentação de
eicosapentaenóico camarão e
e ácido mariscos, peixes
docosahexaenoico) marinhos e cultivo
d) Coezima Q10 de larvas).
b) Alimentação
animal
c) Fertilizantes
Farmacêuticos Químicos Substitutos para
a) Antimicrobianos, a) Corantes e sintéticos
antivirus e pigmentos a) Biopolímeros e
antifungico bioplásticos
b) Produtos b) Lubrificantes
neuroprotetores

Cosméticos Biorremediação
a) Anti-celulite a) Tratamento de
b) Anti- efluentes e
envelhecimento de créditos de
pele, e tratamento nutrientes
para peles
sensíveis – ácido
hialurônico

As microalgas são os principais organismos componentes do fitoplâncton

marinho, representam o início da cadeia alimentar para os organismos heterotróficos
que vivem nos oceanos e em ambientes de água doce (SOUZA e PAULA, 2010;

19
AMARO et al., 2012). Barbosa (2002) afirma que o fitoplâncton é o primeiro elo com o
meio abiótico, e portanto esta comunidade de organismos configura-se como o
principal meio de entrada de matéria e energia, constituindo-se no mais relevante
produtor primário.
Definidas como organismos fotossintéticos, as microalgas podem crescer
como células singulares ou em pequenas colônias (HARUN et al., 2010), habitam
praticamente todos os ecossistemas encontrados na Terra. Elas são bem adaptadas
para sobreviver em um grande espectro de condições ambientais, incluindo (mas não
limitado a calor, frio, salinidade, ambiente foto-oxidativo, anaerobiose, pressão
osmótica e radiação UV (AMARO et al., 2012). Como organismos fotossintéticos, elas
capturam H2O e CO2, nutrientes como fosfato, nitrato e elementos traços específicos
como zinco e cobre, com o auxílio de luz solar, convertem a nutrição em compostos
orgânicos complexos (por exemplo, triglicerídeos) ou simples aceitadores de elétrons
(O2), que são posteriormente acumulados e/ou secretados no meio (AMARO et al.,
2012; VANDAME, 2013).
Oshe et al. (2007) destacam quatro classes de microalgas consideradas como
as mais importantes:
• Diatomáceas (Bacillariophyceae): são as algas dominantes nos oceanos,
sendo também encontradas em águas salobra e doce. Aproximadamente 100.000
espécies são conhecidas. Possuem paredes celulares impregnadas com sílica
polimerizada (frústulas). As células armazenam carbono, seja na forma de óleo
natural ou de um polímero de carboidrato conhecido como crisolaminarina. Suas
células são eucarióticas, sua forma de vida é unicelular cocóide, de colônias
filamentosas e outras formas. Fazem parte de seu complexo coletor de luz clorofilas
a, b e c, β‐caroteno e xantófilas, conferindo uma coloração dourado‐amarronzada.
• Algas verdes (Chlorophyceae): abundantes em água doce, vivem em colônias
ou células individuais. Sua principal forma de reserva é o amido, porém sob
certas condições podem armazenar óleo. Sua coloração é verde, devido aos
pigmentos clorofila a e b, β‐caroteno e xantófilas. Sua parede celular geralmente é
celulósica.
• Algas verde‐azuladas (Cyanophyceae): células procarióticas, sendo muito
semelhantes em estrutura e organização às bactérias. Sua forma de vida é unicelular,
colonial e filamentosa. Apresentam como reserva o amido, glicogênio e

20
cianoficina. Sua coloração pode ser verde‐azulada, verde, violeta, vermelho e
castanho, o que se deve à composição de pigmentos que possuem: clorofila a,
ficocianina, aloficocianina, ficoeritrina, β‐caroteno e xantófila. Estas algas
apresentam papel muito importante na fixação do nitrogênio atmosférico.
Aproximadamente 2.000 espécies são conhecidas nos mais variados habitats.
• Algas douradas (Chysophyceae): grupo similar às diatomáceas
principalmente pela pigmentação e composição bioquímica. Possuem um sistema
de pigmentos mais complexo, podendo ser de coloração amarela, marrom ou
laranja. Suas células são eucarióticas, sendo a maioria dos gêneros unicelulares
flagelados (monodal) ou coloniais; suas substâncias de reserva são constituídas
de óleos naturais e crisolaminarina. Aproximadamente 1.000 espécies são
conhecidas, principalmente em sistemas de água doce.
Em geral, as células de microalgas são muito pequenas (3-50 µm) (LIU et al.,
2013), devido a sua estrutura simples, são capazes de atingir elevadas taxas de
crescimento e eficiência fotossintética (VANDAMME, 2013).
Os mecanismos de fotossíntese das microalgas são semelhantes aos das
plantas terrestres, mas as microalgas são capazes de captar os nutrientes muito
eficientemente fora do seu nicho natural. Em adição a isto, as microalgas são capazes
de crescer exponencialmente quando submetida a condições ótimas. Devido a estas
características únicas, as microalgas apresentam grande potencial para se tornar um
dos organismos mais eficientes na conversão de energia solar em biomassa
(VANDAMME, 2013).
As microalgas verdes (Chlorophycea) contêm aproximadamente 10% de
minerais, 44% de albumina, 12% de ácidos graxos, 32% de fibras totais e 2% de
clorofila da massa seca (SILVA, 2013). O gênero Desmodesmus pertence a esta
subdivisão (GUIRY e GUIRY, 2016).
Há aproximadamente 200 anos desenvolve-se investigações sobre o gênero
Desmodesmus (anteriormente conhecido como Scenedesmus). Em 1829, no gênero
Scenedesmus foram incluídas formas coloniais com e sem “espinhos” (ornamentação
da célula vegetativa). Em 1999, com o uso de análises moleculares, distinguiram-se
as formas com e sem espinhos, desde então as formas “espinhosas” pertencem ao
gênero Desmodesmus e as formas destituídas de espinhos agruparam-se no gênero
original Scenedesmus (GUIRY e GUIRY, 2016).

21
 Inserida no império Eukaryota, reino Plantae, sub-reino Viridae plantae, filo
Chlorophyta, classe Chlorophyceae, ordem Sphaeropleales, família
Scenedesmaceae, sub-família Desmodesmoideae, o gênero Desmodesmus é
composto por uma vasta gama de espécies (GUIRY e GUIRY, 2016). A Figura 1
mostra diferentes espécies de microalgas do gênero Desmodesmus.

Figura 1. Espécies de Desmodesmus. a) Desmodesmus abundans; b)

Desmodesmus communis; c) Desmodesmus protuberans; d) Desmodesmus
serratus; e) Desmodesmus cf. opoliensis var. mononensis (R. Chodat). (Fonte:
adaptado de Guiry e Guiry, 2016) .

De acordo com o Instituto Suíço de Metereologia e Hidrologia (SMHI), além

destas existem ainda outras espécies do gênero Desmodesmus, como D. armatus, D.
bicellularis, D. brasiliensis, D. costato-granulatus, D. denticulatus, D. díspar, D. hystrix,
D. intermedius, D. lefevrei, D. maximus, D. opoliensis, D. spinosus e D. subspicatus.

3.2 Formas de cultivo de microalgas

Em seus estudos, Brentner et al. (2011) realizou uma análise da

sustentabilidade dos métodos utilizados na produção em grande escala de
microalgas, e cita alguns métodos utilizados para cultivo de microalgas que vão desde
sistemas abertos, lagoas de calha aberta, até os sistemas fechados, como
fotobiorreatores de placas planas, tubulares e anulares. Existem ainda outros
modelos, como o twin-layer, fotobiorreatores que utilizam células imobilizadas para
produção de biomassa (NAUMANN et al., 2013; GAO et al., 2015). Alguns modelos
de sistemas de cultivo é mostrado na Figura 2.

22
 No cultivo de microalgas, tanto os sistemas abertos quanto os sistemas
fechados apresentam vantagens e desvantagens. As lagoas de calha aberta são de
fácil construção e baixo custo de manutenção e operação, em contrapartida
apresentam elevadas taxas de evaporação de água, baixa produtividade e alto risco
de contaminação (DAVIS et al., 2011).
Apesar de exigerem um custo maior para construção e operação, os
fotobiorreatores podem diminuir o risco de contaminação e perda de água por
evaporação, além de prover maior controle de variáveis que afetam o crescimento da
microalga (energia luminosa, sistema de mistura, condições de reação) (DAVIS et al.,
2011).
Considerando que a fonte de luz é livre e disponibilizada com facilidade,
fotobiorreatores tubulares apresentam-se como uma das melhores formas de cultivo
de microalgas em suspensão. Estes sistemas baseiam-se no princípio de garantir o
máximo possível de razão área/volume assegurando razoável volume de trabalho com
mistura homogênea e nível de dióxido de carbono (CARVALHO et al., 2006).

Figura 2. Configuração de reatores para cultivo de microalgas: (a) sistemas de

lagoas abertas; (b) reator twin-layer; (c) e (d) reatores tubulares (adaptado de Harun
et al., 2010 e Li et al., 2015).

23
3.3 Métodos de separação de biomassa de microalgas

Com exceção dos reatores de células imobilizadas, nos demais designs de

fotobiorreatores, as microalgas permancem no meio de cultivo em forma de
suspensão (HARUN et al., 2010), isto se deve a uma característica das microalgas
amplamente conhecida. A maioria das microalgas possuem em sua superfície celular
cargas negativas (GULTOM e HU, 2013; GRIMA et al., 2003; VANDAMME, 2013,
AMARO et al., 2012), esta carga é causada pela ionização de grupos funcionais
ionogênicos sobre as paredes das células de microalgas (GULTOM e HU, 2013),
como grupos carboxilícos, aminas, fosfóricos, e hidroxila fosfodiésteres (HARUN et
al., 2010; VANDAMME, 2013), e também pela adsorção de íons a partir do meio de
cultura. A presença das cargas negativas ocasiona uma repulsão entre as células,
mantendo-as em suspensão (CHEN et al., 2014) e prevenindo que as mesmas
agreguem-se (GULTOM e HU, 2013). A espécie da microalga, a força iônica do meio,
pH e outras condições ambientais, têm um grande impacto sobre o desenvolvimento
desta propriedade (GULTOM e HU, 2013).
Um desafio importante no processo downstream de microalgas reside na
separação das microalgas do seu meio de crescimento (VANDAMME, 2013). A
concentração de biomassa no meio de cultura é geralmente muito baixa, isto porque
uma elevada concentração de biomassa leva a um sombreamento mútuo das células
de microalgas e, assim, a uma consequente redução na produtividade.
Dependendo dos métodos de cultivo, a concentração de células no meio pode
variar desde 0,5 g.L-1 em reatores abertos, até cerca de 5 g.L-1 em fotobiorreatores
fechados (VANDAMME et al, 2013, GRIMA et al, 2003), o que significa que grandes
volumes de líquido necessitam ser removidos do meio de cultura (CHEN et al, 2014)
para alcançar uma biomassa de microalgas com umidade desejada.
Um grande número de técnicas de separação de microalgas com base em
processos químicos, físicos ou biológicos têm sido desenvolvidos, mas a
contaminação do efluente com produtos químicos ou os elevados requisitos de
energia impedem o desenvolvimento de um método único universal para a separação
das microalgas (POSADAS et al, 2014; MILLEDGE e HEAVEN, 2013; AMARO et al,
2012). Algumas técnicas de separação de biomassa têm sido aplicado, tal como a
filtração, flotação, sedimentação por gravidade (para espécies de grandes

24
dimensões), centrifugação ou floculação, bem como uma combinação de algumas
destas técnicas (GULTOM e HU, 2013).

3.3.1 Filtração

Geralmente a filtração envolve a passagem contínua do meio de cultura através

de filtros, no qual as algas tendem a se acumular e permite a passagem do meio, até
que se forme uma torta espessa de microalgas no filtro. É reconhecido que o uso de
filtros sob pressão ou à vácuo são métodos adequados para a separação de biomassa
de espécies que possuem grandes dimensões (superior a 70 mm) (MOHN, 1980;
HARUN et al., 2010); mas pode ser prejudicada pela baixa taxa de transferência e
rápida obstrução dos poros (MILLEDGE e HEAVEN, 2013). A pressão para forçar o
fluido através de uma membrana, e, por conseguinte, a energia operacional
necessária, geralmente aumenta com a redução do tamanho dos poros da membrana
(HARUN et al., 2010). Células com dimensões similares às células de bactérias, não
podem ser separadas através desse método (Dunaliella e Chlorella). Apesar de
parecer bastante atrativo, este método está associado a um alto custo de operação e
a exigência de etapas de pré-concentração (HARUN et al., 2010).
Tanto os auxiliares de filtração, como os agentes floculantes serveriam para
auxiliar na filtração e redução dos requisitos de energia operacional, mas a adição de
materiais aumentam os custos. A ultrafiltração é capaz de remover microalgas de
menores dimensões, mas a sua utilização é limitada por uma elevado gasto energético
na entrada, e baixas concentrações de microalgas na saída (MILLEDGE e HEAVEN,
2013).

3.3.2 Sedimentação

Separação sólido-líquido por sedimentação é uma das maneiras mais simples

para a recuperação da biomassa de microalgas. A separação é causada por forças
gravitacionais e a velocidade de sedimentação é determinada pela lei de Stokes, o
que determina que a velocidade de sedimentação é proporcional ao raio das células
e a diferença de densidade entre a microalga e o meio. Este método requer baixos
custos de projeto e poucos requisitos com operadores qualificados (VANDAMME,

25
2013). Embora este método seja considerado de baixo custo e uma técnica simples,
porque não existem aplicação de outras forças além da gravidade, o método só é
apropriado para microalgas de maiores dimensões, tal como Spirulina. Entretanto,
para microalgas com um tamanho menor, a floculação química é necessária para
sedimentação por gravidade, a fim de permitir a recuperação das microalgas
(GULTOM e HU, 2013).

3.3.3 Centrifugação

Na centrifugação a força da gravidade é substituída por uma força muito maior

de separação. O método envolve a aplicação de aceleração centrífuga para separar
o meio de cultivo de microalgas em regiões de baixa e alta densidade. Embora o
método possa ser aplicado para quase todos os tipos de microalgas, e mostrar-se
bastante confiável (MILLEDGE e HEAVEN, 2013; HARUN et al., 2010) para a
produção de metabólitos, ele apresenta algumas limitações. As altas forças
gravitacionais e de cisalhamento aplicadas durante o processo podem romper a
estrutura celular, adicionalmente este não se apresenta como um método rentável,
devido ao alto consumo de energia especialmente quando aplicados em grande
escala (HARUN et al., 2010). Por exemplo, segundo MILLEDGE e HEAVEN (2013), a
energia de operação requerida na centrifugação é aproximadamente quatro vezes a
energia disponível no biodiesel de microalgas.

3.3.4 Flotação

A flotação é um processo de separação baseado na alimentação de bolhas de

ar ou outro gás no meio de cultivo, seguida da adsorção das células de microalgas às
bolhas de ar, com posterior arraste para a superfície do líquido, permitindo a
separação de uma camada de biomassa na superfíce do líquido (WILEY et al., 2009).
Embora algumas microalgas naturalmente flotem na superfície, a flotação pode
ser promovida pela adição de bolhas de ar. Tal como acontece com a sedimentação,
na maioria dos casos a adição de floculantes faz-se necessária para que a flotação
seja considerada um processo eficaz. Geralmente os processos de flotação são
classificados de acordo com o método de produção de bolha: flotação por ar

26
dissolvido, flotação eletrolítica e flotação por ar disperso (MILLEDGE e HEAVEN,
2013).
A flotação pode também apresentar a necessidade de um alto investimento,
além de altos custos operacionais e consumo de energia elevado, especialmente se
forem requeridas diminutadas bolhas de ar (MILLEDGE e HEAVEN, 2013). Mohn
(1988) sugere que o custo do processo de flotação pode ser tão grande ou até mesmo
maior do que os custos relacionados à centrifugação, quando o custo de floculantes
estão incluído.

3.3.5 Floculação

A floculação envolve dois processos: o primeiro processo é a coagulação, por

meio do qual as partículas coloidais e suspensões sólidas muito finas são
desestabilizadas, de modo que elas podem começar a aglomerar-se nas condições
adequadas; o segundo processo é a floculação em si, através da qual as partículas
desestabilizadas realmente conglomeram em agregados maiores, de modo que eles
podem ser separados do meio líquido. Mas a palavra "floculação" geralmente se refere
a ambos os processos (ZHU, 2012).
Durante o processo de floculação as células de microalgas dispersas no meio
agregam-se e formam-se grandes particulas com alta taxa de sedimentação (SALIM
et al., 2011). A floculação de particulas em suspensão pode muitas vezes ser atribuída
a quatro mecanismos de coagulação, atuando isoladamente ou em combinação. Um
desse mecanismo é a neutralização de cargas, é o fenômeno em que íons carregados,
polímeros ou colóides adsorvem fortemente na superfície oposta de uma partícula
carregada, seguido pela desestabilização, coagulação e floculação. Um segundo
mecanismo é por via eletrostática, um fenômeno em que um polímero carregado se
liga a uma partícula com carga oposta. O polímero inverte a carga superfícial das
partículas, resultando em partículas com cargas opostas. Posteriormente as partículas
conectam-se umas com as outras através de suas cargas opostas, causando a
floculação. O terceiro mecanismo denominado ponte, é o fenômeno em que os
polímeros ou colóides carregados ligam-se simultaneamente à superfície de duas ou
mais partículas diferentes para formar uma ponte entre elas. Essas pontes colocam
as partículas em conjunto e faz com que as mesmas floculem. Por fim, a floculação

27
total é o processo no qual as partículas são aprisionadas numa precipitação maciça
de um agente que faz com que elas floculem (VANDAMME, 2013).
A Tabela 2 mostra um estudo comparativo realizado por Milledge e Heaven
(2013) sobre os métodos utilizados no processo de separação de biomassa de
microalgas, dentre estes, a floculação química pode ser reconhecida como um método
de separação relativamente simples e uma opção promissora para a recuperação de
biomassa de microalgas.

28
Tabela 2. Comparação dos métodos de separação de biomassa (adaptado de
MILLEDGE e HEAVEN, 2013).
Método Vantagens Desvantagens Sólidos secos
(%)

Centrifugação Pode ser utilizada com a Elevados 10-22

maioria dos tipos de algas; custos
rápida e eficiente na operacional e
separação de células. de capital e
rompimento da
parede celular.
Filtração Disponibilidade de grande Altamente 2-27
variedade de tipos filtros e dependente da
membranas. espécie da
microalga; mais
adequado para
células
maiores; risco
de entupimento
e dificuldade na
limpeza.
Ultrafiltração Pode ser utilizada para Elevados 1,5-4
células delicadas. custos
operacional e
de capital.
Sedimentação Baixo custo, potencial para Espécies de 0,5-3
o uso como uma primeira algas
etapa para reduzir o específicas,
consumo de energia e mais adequado
custo das etapas à células
subsequentes. densas. A
separação
pode ser lento.
Baixa
concentração
final.
Floculação Disponibilidade de uma Remoção do 3-8
química ampla variedade de floculante;
floculantes. Preços Contaminação
variáveis, pode ser de baixo química.
custo.
Flotação Pode ser mais rápido que Para espécies 7
sedimentação. específicas;
Possibilidade de Elevados
combinação com custos
transferência de gases. operacional e
de capital.

29
 No processo de floculação, a carga superficial das microalgas pode ser anulada
pela adição de compostos químicos conhecidos como agentes floculantes (HARUN et
al., 2010). Ou ainda pela ação de métodos físicos (eletrofloculação, ultrassom) ou
agentes biológicos (cianobactérias, fungos ou microalgas) (VANDAMME et al., 2013;
SALIM et al., 2011; GULTOM e HU, 2013; SCHLESINGER et al., 2012). Em certas
espécies de microalgas, a floculação pode ocorrer de forma espontânea, num
processo lento e instável, conhecido como auto-floculação. Esse processo é uma
resposta ao estresse ambiental; mudanças na concentração de nitrogênio, pH,
oxigênio dissolvido (MILLEDGE e HEAVEN, 2013) ou a alimentação de dióxido de
carbono (SHELEF et al., 1984).
A floculação química pode ser induzida por agentes químicos inorgânicos ou
orgânicos. Um floculante ideal deve ser barato, não tóxico e eficaz em baixas
concentrações, preferencialmente, deve ser um componente não derivado de fontes
de combustíveis fósseis, ser sustentável e renovável (MILLEDGE e HEAVEN, 2013).
Os agentes floculantes de microalgas mais utilizados são os sais metálicos
multivalentes e os polieletrólitos catiônicos como a quitosana (polímero de
acetilglucosamina) (TEIXEIRA et al., 2010).
Os sais metálicos comumente usados incluem cloreto de ferro, sulfato de
alumínio e sulfato de ferro. Sais metálicos polimerizados (como cloreto de polialuminio
e poliferrosulfato) tem demonstrado ser eficiente numa grande faixa de pH.
Entretanto, a floculação por sais metálicos polimerizados não é um método apropriado
para uma separação economicamente viável e sustentável no cultivo em largas
escalas, devido ao fato de que esses agentes apresentam elevados custos e existe
ainda a possibilidade de produção de grandes volumes de lodo, consequência não
favorável, que podem vir a destruir ou inibir o crescimento celular das microalgas,
deixando ainda resíduos no meio que devem ser removidos antes de serem
reutilizados. Outra desvantagem da utilização de sais metálicos concerne na saúde
humana, pois eles aumentam a propensão do desenvolvimento da doença de
Alzheimer e doenças cancerígenas (CHEN et al., 2014), no caso de biomassa de
microalgas para fins de consumo humano.
Outros floculantes químicos comumente utilizados em outros processos são os
polímeros sintéticos de poliacrilamida. Estes podem, todavia, conter vestígios tóxicos

30
de acrilamida e assim também contaminar a biomassa de microalgas (VANDAMME et
al., 2013).
Floculantes derivados de plantas renováveis ou de origem animal podem
apresentar vantagens ambientais sobre ambos floculantes inorgânicos e polieletrólitos
derivados de combustíveis fósseis (MILLEDGE e HEAVEN, 2013).
Para ser capaz de interagir com a carga negativa da superfície das células de
microalgas, polímeros devem estar carregados positivamente, o que é raro na
natureza (VANDAMME et al., 2013). A Tabela 3 demonstra um estudo comparativo
entre os principais floculantes utilizados na separação de Scenedesmus sp., e ressalta
a alta eficiência de floculação associada a uma pequena concentração de quitosana
quando comparada aos demais agentes floculantes.

Tabela 3. Condições e eficiência de floculação química para microalga Scenedesmus

sp. (C=concentração de quitosana; Ef= Eficiência de floculação)
Reagente C (ppm) Ef(%) Referência
Al2SO4 300 >90 Chen et al., 2013
FeCl3 150 >90 Chen et al., 2013
Tanfloc 210 96 Selesu, 2015
Quitosana 40 95 Moreno et al., 2015

A quitosana, um polímero catiônico derivado da casca de crustáceos, fora

inicialmente utilizado no tratamento de águas residuais (KASEAMCHOCHOUNG et
al., 2006; STRAND et al., 2001) e demonstra bons resultados na aplicação de
floculação de microalgas (MORALES et al., 1985; LÚBIAN, 1989). Estudos anteriores
(Tabela 3) mostram a eficiência de floculação de microalgas com baixas concentração
de quitosana, no entanto, na literatura não há dados para floculação de espécies de
Desmodesmus sp., fato que motivou a execução do presente trabalho.

3.4. Quitosana

A quitina é um polímero biodegradável que ocorre na natureza como microfibrilas

cristalinas ordenadas compondo a estrutura básica do esqueleto de caranguejos,
lagostas, camarões, insetos, entre outros (RAO et al., 2014; RINAUDO, 2006). É o
segundo polissacarídeo mais abundante na natureza, atrás apenas da celusose.
Polímero de cadeia linear formado por unidades N-acetil-2-deoxi-D-glicopiranose, na
31
quitina esses monômeros são interligados por ligações glicosídicas β-(1-4) que se
arrajam em alfa hélice estabilizadas por pontes de hidrogênio intramoleculares
(BEZERRA, 2011). Possui um papel análogo ao do colagéno nos animais superiores
e à celulose em plantas terrestres. Celulose e quitina são, assim, dois polissacarídeos
importantes e estruturalmente relacionados que fornecem integridade estrutural e
proteção para plantas e animais, respectivamente (PILLAI et al., 2009), diferenciam-
se apenas pela substituição da hidroxila por um grupo acetoamino no carbono de
posição 2 do anel glicosídico (BEZERRA, 2011).
Por desacetilação parcial da quitina sob condições alcalinas, obtém-se a
quitosana, que é o derivado de quitina mais importante em termos de aplicações
(RINAUDO, 2006). A quitosana é um aminopolisacarídeo com propriedades
multidimensionais, funções altamente sofisticadas e apresentam uma vasta gama de
aplicações na área biomédica e outras áreas industriais (PILLAI et al., 2009).
Apesar de ser caracterizada pela sua produção como um produto químico, a
mesma é considerada como biopolímero pelo fato de poder ser encontrada na
composição de algumas leveduras e fungos, como mencionado por Habibi e Lucia .
(2012).
As cascas de crustáceos (caranguejos, camarão, lagosta, siri, etc), subprodutos
da indústria de alimentos, são comercialmente empregadas para a produção de
quitina e quitosana. Acredita-se que, pelo menos, 1011 toneladas (1013 kg) de quitina
são sintetizadas e degradadas (PILLAI et al., 2009). Considerando a quantidade de
quitina produzida anualmente no mundo, esse é o polímero mais abundante no mundo
depois da celulose (LAFARGA et al., 2013)

3.4.1 Breve Histórico

A quitina foi primeiramente descoberta em cogumelos por Henri Braconnot, um

professor de História da Natureza, em 1811, que denominou o material de fungine.
Em 1823, Odier isolou o mesmo material de plantas e insetos e nomeu-o de quitina,
derivado do grego chiton, que significa túnica ou cobertura, devido a característica
protetora da quitina em insetos e artrópodes. A descoberta da quitosana é atribuida a
Rouget em 1859, quando ele descobriu que aquecendo quitina em hidróxido de
potássio resultava numa quitina solúvel em ácido. Em 1894, Hoppe-Seyler nomeu-a

32
quitosana, entretanto sua estrutura molecular não havia sido estabelecida até 1950.
A existência de quitosana na natureza era desconhecida até 1954, quando ela foi
descoberta em leveduras Phycomyces blakesleeanus. A quitosana ocorre como o
maior componente estrutural da parede celular de certos fungos, principalmente da
espécie Zygomycetes, mas este não é tão abundante como quitina; entretanto a
quitosana é facilmente produzida pela desacetilação química da quitina (HABIBI e
LUCIA, 2012).

3.4.2 Estrutura Química da Quitosana

A quitosana é um copolímero linear composto por um número variável de unidades de

2-acetamida-2-desoxi-β-d-glucopiranose e 2-amino-2-desoxi-β-glicopiranose,
formando ligações glicosídicas β-(1-4), como demonstrado na Figura 3. Os dois
monômeros diferem entre si no que diz respeito ao substituinte no carbono dois no
anel glicosídico, que é um grupo amino ou acetamida (CUNHA et al., 2012).

Figura 3. Estrutura química da quitina e quitosana (Fonte: Battisti & Campana-Filho,

2008).

3.4.3 Preparação de quitosana

Foram relatados diversas técnicas para extrair quitina a partir de diferentes fontes
(YOUNES e RINAUDO, 2015), o método mais comum trata-se do procedimento
químico descrito na Figura 4.

33
 Figura 4. Fluxograma do processo de preparação da quitosana

A extração da quitina a partir das cascas de crustáceos se dá inicialmente através

da desmineralização da matéria-prima utilizando-se ácido diluído, e eliminação de
carbonato de cálcio. Em seguida é realizada a desproteinação, em meio alcalino,
tradicionalmente realizado por tratamento com soluções aquosas de NaOH ou de
KOH. A eficiência dessa etapa depende da temperatura do processo, a concentração
do álcali, e a relação quantidade de solução:quantidade de biomassa de casca de
crustáceo (AL-SAGHEER et al., 2009).
Na análise elementar, a quitosana possui um conteúdo de nitrogênio superior a
7%. A remoção do grupo acetil é um tratamento pesado realizado com uma solução
concentrada de NaOH (aquosa ou alcoólica). A proteção a partir do oxigênio, com
uma purga de nitrogênio ou por adição de boro-hidreto de sódio na solução alcalina,
é necessária a fim de evitar reações indesejáveis, tais como a despolimerização e
geração de espécies reativas. A quantidade de NaOH em excesso representa,
contudo, uma preocupação econômica e ecológica; portanto, as alternativas estão
sendo procuradas a fim de reduzir a quantidade de NaOH para um valor mínimo
(KUMAR et al., 2004).

34
 A reação de desacetilação prossegue-se numa reação heterogénea, levando a
uma distribuição aleatória dos monômeros no polímero de quitosana (CUNHA et al.,
2012).

3.4.4 Propriedades e características da quitosana

Não existe um padrão internacional dos parâmetros fisico-químicos para este

biopolímero. Sabe-se que durante o processo de obtenção da quitosana, altas
temperaturas, assim como altas concentrações de reagentes, podem acarretar danos
irreparáveis à qualidade desse polímero, modificando suas propriedades físico-
químicas (CHEN et al., 2014). As propriedades físicas associadas à caracterização do
polímero são: tamanho das partículas, densidade, solubilidade, viscosidade e
coloração. Já as propriedades químicas são: distribuição molecular, grau de
desacetilação, pH, índice de cristalinidade, valor de retenção de água, proteínas e
índice de metais pesados (BEZERRA, 2011).
A quitosana é caracterizada como um material com alta capacidade de absorção.
Os grupos funcionais presentes na estrutura do polímero, como hidroxila, acetoamido
e amino, são responsáveis por propriedades como alta hidrofobicidade, reatividade e
flexibilidade estrutural, e faz da quitosana um produto solúvel em solução pouco ácida,
quase neutra (CUNHA et al., 2012).
Comercialmente a quitosana é disponível em forma de flocos secos, solução ou
pó de diminuta granulometria (GAIKWAD e PANDE, 2013).

3.4.4.1 Grau de desacetilação

O grau de N-acetilação, ou seja, a proporção de 2-acetamido-2-desoxi-d-

glucopiranose para unidades estruturais 2-amino-2-desoxi-d-glucopiranose tem um
efeito marcante na solubilidade e propriedades da solução de quitina, e
consequentemente da quitosana (CHEN et al., 2014). O Grau de Desacetilação (GD),
é portanto, um importante parâmetro a ser examinado.
O grau de desacetilação norteia importantes propriedades fisico-químicas do
polímero, como solubilidade e conformação, sendo criticamente importante na
efetividade de várias aplicações tecnológicas da quitosana (CUNHA et al., 2012).

35
 Com o objetivo de determinar o GD, muitos métodos analíticos têm sido
proposto, como: espectroscopia na região do infravermelho, titulometría
potenciométrica e ressonância magnética nuclear (BEZERRA, 2011).
Como a desacetilação da quitina para produção da quitosana é parcial, o termo
quitosana não se refere a uma estrutura única bem definida, podendo diferir-se em
suas propriedades físicas, e portanto em suas características, tais como o peso
molecular, grau de desacetilação, a sequência de grupos amino e acetamido (ex.: se
os resíduos acetilados estão distribuidos ao longo da cadeia principal randomicamente
ou em forma de blocos), e a pureza do produto (PILLAI et al., 2009; YI et al., 2005).
A Tabela 4 descreve valores para diferentes propriedades da quitosana, de
acordo com o grau de desacetilação.

Tabela 4. Características de quitosana com diferentes grau de desacetilção

Características Grau de desacetilação
75% 87% 96%
Densidade (g/L) 0,59 0,54 0,53
Cristalinidade (%) 30 35 38
Viscosidade (cPs) 78 73 77
Capacidade de retenção de gordura (%) 95 226 219

Na quitina, o grau de acetilação é tipicamente de 0,90, indicando a presença de

alguns grupos amino, como uma certa quantidade de desacetilação pode ocorrer
durante a extração, quitina pode também conter cerca de 5-15% de grupos amino
(BRITTO e CAMPANA-FILHO, 2007; DONG et al., 2002).
O produto N-desacetilado de quitina, a quitosana, é solúvel em soluções diluídas
de ácidos com pH abaixo de 6,0 (YI et al., 2005). A solubilização ocorre pela
protonação de grupos funcionais –NH2 posicionado no carbono 2 da D-glicosamina
(RINAUDO, 2006), devido a presença desses grupos aminos primários, com um pKa
de 6, a quitosana pode ser considerada uma base forte (YI et al., 2005).
A presença dos grupos aminos indica que o pH modifica substancialmente o
estado de carga e propriedades da quitosana. Em niveis de pH baixo estes grupos
ficam protonados, carregados positivamente, o que faz da quitosana um polieletrólito
catiônico solúvel em água. Por outro lado, com o aumento de pH próximo a
neutralidade ocorre uma desprotonação dos grupamentos amina da quitosana e o
polímero perde a sua carga, tornando-se insolúvel. A transição solúvel em insolúvel
ocorre no seu valor de pKa, num pH entre 6 e 6,5 (YI et al., 2005).

36
3.4.4.2 Massa molecular

A massa molecular da quitosana apresenta-se na faixa de 1x104 a 1x106 g.mol-1

(CUNHA et al., 2012). Esta depende da fonte inicial de quitina (camarão, caranguejo,
lagosta, entre outros.) e pode diminuir com o aumento do grau de desacetilação da
quitosana, influenciando nas características e propriedades do material (YUAN et al.,
2011).
A massa molecular da quitosana pode ser determinada por meio de diferentes
técnicas. Um dos métodos mais simples e rápidos para a determinação do peso
molecular do polímero é a viscosimetria, embora este não seja um método absoluto e
que requer a determinação de constantes (YACOB et al., 2013).
A viscosidade é determinada pela Equação de Mark-Houwink-Sakurada
(Equação 1).
𝜂 = 𝐾𝑀𝛼 Equação 1

em que M é a massa molecular viscosimétrica média, K e α são constantes para um

dado sistema polímero-solvente-temperatura. Essas constantes são determinadas
pela avaliação de um gráfico de log [η] versus log da massa molecular. Onde a massa
molecular tem sido determinado por um método absoluto, o método de espalhamento
de luz (YACOB et al., 2013).

3.4.4.3 Morfologia

Como a distribuição das unidades de amino e acetil-amino na estrutura da

quitosana é, em geral, aleatória, torna-se fácil de gerar conformações características
através das ligações de hidrogênio intra e inter-moleculares (ZHANG et al., 2010).
Estas ligações podem gerar moléculas mais rígidas, caracterizando a quitosana como
um polímero semi-cristalino, sendo o grau de cristalinidade uma função do grau de
desacetilação (FRANCIS e MATTHEW, 2000).
No estado sólido, a quitosana é caracterizada por uma estrutura fibrilar ordenada
com um elevado grau de cristalinidade e polimorfismo. As medições de difração de
raios-x da quitosana têm mostrado uma dupla-hélice estendida numa estrutura em
zigue-zague. O empacotamento do cristal é formado, principalmente, por cadeias de
quitosana dispostas de forma antiparalela. A estrutura cristalográfica da quitina e

37
quitosana têm também revelado que, embora ambos os biopolímeros exibam formas
hidratadas e anidras, a quitina ocorre exclusivamente na conformação convencional
helicoidal extendida, com 2-pregas. A presença de grupos amina livres na estrutura
da quitosana dá origem a diferentes tipos de conformações helicoidais em meio ácido.
A diversidade de tipos estruturais de quitosana dependem das condições
experimentais (tipo e concentração do ácido, a temperatura e a preparação de sais)
utilizadas para a conversão de quitina em quitosana. As propensas estruturas
helicoidais podem ser determinadas de acordo com a unidade de repetição e simetria
helicoidal observado nas estruturas cristalinas de quitosana (CUNHA et al., 2012).
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) de algumas amostras de quitosana
demonstram uma morfologia de superfície lisa, com mínimos resíduos (LONG, 2013).

3.5 Floculação de microalgas por utilização de quitosana

A quitosana é um agente de floculação química com vantagens sobre os

demais pelo fato de ser um polímero de fonte natural, e não apresentar toxicidade ao
produto obtido. Os gupos amino (NH3+) positivamente carregados na estrutura da
quitosona tem a capacidade de adsorver a superfície celular das microalgas,
carregadas negativamente. Quando a quitosana coexiste com células de microalgas
carregadas negativamente, a repulsão eletrostática entre essas células diminuem,
reduzindo o seu potencial zeta, e o pH do meio, o que conseqüentemente promove a
floculação (RASHID et al., 2013). O potencial zeta é a denominação dada à carga
elétrica na superfície das células de algas, o que gera uma força elétrica fundamental
para estabilizar a partícula enquanto em suspensão (MORALES et al., 1985).
Alguns fatores, como a concentração da quitosona adicionada, e o pH do meio,
desenpenham papel fundamental no processo de floculação pela utilização do
polímero catiônico quitosona, influenciando desta forma na eficiência da separação
de biomassa. Morales et al. (1985), em seus experimentos realizados com diferentes
espécies de microalgas marinhas, analisaram a eficiência da floculação como uma
função da concentração de quitosona utilizada, e do pH do meio. Foi necessário uma
concentração de 40 ppm de quitosona, para alcançar 100% de eficiência na floculação
de Chorella sp, e pH com valores abaixo de 7,5. Os autores enfatizam também a

38
importância de reduzir o pH a valores inferiores a 7,0 antes de adicionar o polímero, o
que resultaria num pH final de floculação no valor de 8,0. A redução do pH introduzida
como uma etapa prévia à adição da quitosona, produz duas conseqüências principais,
a primeira é referente ao aumento da atividade da quitosona pela redução de sua
viscosidade, e a segunda esta relacionada à indução da redução da carga superficial
celular e alteração de sua estabilidade. Porém o reajuste prévio de pH apresenta como
desvantagem a diminuição no tamanho dos flocos formados (MORALES et al.,1985).
Rashid et al. (2013) em seus experimentos com Chorella vulgaris relatam a
necessidade de uma concentração de 120 ppm para atingir uma eficiência de 99% de
floculação da biomassa, e pH ótimo de 6,0, segundo os autores, nesta faixa de pH
existem quantidades suficiente de cátions disponíveis para adsorver as cargas
superficias de Chorella vulgaris.
Ensaios realizados com culturas de Euglena gracilis por Gualtieri et al. (1988),
demonstram que o máximo grau de floculação foi obtido a uma concentração de 200
ppm de quitosona, acima dessa concentração, qualquer acréscimo de agente
floculante leva a uma parcial redispersão da massa celular de algas. Os autores
afirmam ainda que este processo de floculação para separação de biomassa de E.
gracilis é considerado viável apenas se o mesmo for realizado em condições ótimas
de operação, com uma concentração de 200 ppm de quitosana e pH 7,5.
Xu et al. (2012), relatam uma eficiência de floculação de 99%, para culturas de
Chlorella sorokiniana, utilizando uma concentração de 10 ppm de quitosona, em um
pH ótimo de 6,0. Os resultados de Xu et al. (2012) estão de acordo com os resultados
dos estudos de Rashid et al. (2013), e com as sugestões dadas por Morales et al.
(1985), o qual sugere que uma diminuição no pH a valores inferiores a 7,0 reflete num
aumento da atividade da quitosona e eficiência da floculação.
É importante observar também que a concentração de quitosana necessária
para alcançar uma eficiência máxima, varia com a espécie de microalga, como
mencionado e avaliado por Morales et al. (1985). A Tabela 5 demonstra um estudo
comparativo da eficiência de floculação para diferentes espécies de microalgas,
concentração de quitosana e pH.
Estudos realizados por Riaño et al. (2012) concluiu que a agitação possui pouca
influência na floculação de microalgas com a quitosana como agente floculante, e
sugere o desenvolvimento de um trabalho avaliando a concentração do floculante e

39
pH do meio através da Metodologia de Superfície de Resposta (MSR) como
ferramenta para melhorar a eficiência de floculação.

Tabela 5. Eficiência de floculação com quitosana para diferentes espécies de

microalgas e condições de pH e Concentração de quitosana (C).
C (ppm) pH Ef (%) Espécie da microalga Ref.
10 8,0 75 Rhodomonas báltica Lubían, 1989
10 6,0 99 Chlorella sorokiniana Xu et al., 2012
200 7,5 98 Euglena gracilis Gualtieri et al., 1988
20 9,9 80 Phaeodactylum tricornutum Sirin et al., 2012
10 7,0 100 Skeletonema costatum Morales et al., 1985
40 8,3 98,3 Chlorella sp. Morales et al., 1985
20 8,0 81 Chaetoceros calcitrans Harith et al., 2009
120 6,0 99 Chlorella vulgaris Rashid et al., 2013

40
 4. METODOLOGIA

O desenvolvimento do trabalho deu-se inicialmente através da propagação do

cultivo da microalga e aumento de escala para fotobiorreatores tubulares, com
avaliação do crescimento da microalga. Para tanto foi utilizada a determinação
periódica da densidade celular em câmera de Neubauer e análise de densidade ótica
do cultivo.
A segunda etapa compreendeu a caracterização da quitosana por meio de
microscopia eletrônica de varredura, espectroscopia na região do infra-vermelho,
calorimetria exploratória diferencial e análise termogravimétrica. Em seguida, foi
realizada uma revisão bibliográfica para determinação dos fatores envolvidos no
planejamento experimental de floculação, assim como aplicação do planejamento
fatorial Box Hunter & Hunter para fins de checagem de curvatura, aproximação do
domínio experimental e estudo da influência das variáveis independentes sobre a
variável resposta.
A terceira etapa compreendeu a maximização da eficiência de floculação,
utilizando um modelo matemático. Para tanto utilizou-se o Delineamento do Composto
Central Rotacionado (DCCR), com superficie de resposta e análise estatistica. Além
de estudar os mecanismos envolvidos no processo de floculação de Desmodesmus
sp de acordo com a variação da concentração de quitosana e pH do meio de cultivo.
A última etapa envolveu o reaproveitamento do meio de cultivo floculado.

4.1 Microalga

A microalga Desmodesmus sp utilizada pertence ao banco de microalgas do

Laboratório de Biocatálise e Energia (LABEC-UFBA), a mesma foi isolada do Dique
do Tororó (Salvador-BA), e em função do seu desempenho quanto a resistência e
contaminação, facilidade de reprodução e adaptação às condições ambientais em
comparação as outras microalgas, culminou-se em sua escolha. A cepa da microalga
é mantida em meio BBM (Bold’s Basal Medium) contido em erlenmeyers, dentro de
uma câmera de ambiente controlado. A composição do meio BBM pode ser
encontrada no ANEXO A.

41
4.2 Propagação das células para obtenção do inóculo e scale-up

Esterelizou-se Erlenmeyers de 250 mL de capacidade contendo 135 mL de

meio de cultura (BBM), lacrados com rodilhões de algodão e gases. Após
esterelização, esperou-se atingir a temperatura ambiente e os mesmos foram levados
para câmera de fluxo laminar onde foram inoculados 10% do volume total de operação
com cultura de microalga (volume de operação = 150 mL, 135 mL de meio BBM e 15
mL de inóculo). Os Erlenmeyers foram mantidos em ambiente climatizado com
temperatura controlada a 22±2 °C, aeração constante providas através de bombas de
aquário (conectadas por meios de filtros de ar), fotoperíodo 12:12 h e iluminação
fornecida por lâmpadas fluorescente com intesidade luminosa de 72 µmolFótons.m-
2.s-1 na parede externa do reator, onde apenas 51 µmolFótons.m -2.s-1 alcança a
superfície da parede interna do reator. O mesmo procedimento fora realizado para os
cultivos em Erlenmeyers de 500 mL e 2 L de capacidade.
O crescimento da cultura, bem como as fases da curva de crescimento foram
definidas através da densidade celular diária em câmara de Newbauer e microscópio
Zeiss Axiostar Plus, apenas para os cultivos em Erlenmeyers de 250 e 500 mL.
Também fora determinada a densidade ótica do cultivo utilizando espectrofotómetro
UV-Vis Agilent Cary 60, em comprimento de onda de 680 nm, que permite uma
correspondência adequada entre o aumento da densidade óptica e o aumento do
número de células no cultivo. A contagem celular com microscópio consistiu numa
forma de avaliar também a presença de bactérias contaminantes ou outras espécies
de microalgas no meio de cultivo.
Para os cultivos em Erlenmeyers de 250 mL, 500 mL foram calculados
produtividade (cel.mL-1.d-1), velocidade máxima específica de crescimento (d-1) e
tempo de geração (tg, d), de acordo com as Equações 2, 3 e 4, respectivamente,
sugeridas por Lourenço (2006).

𝑁𝑡− 𝑁0 Equação 2
𝑃=
𝑡 − 𝑡0
𝑁
Ln ( 𝑁𝑓 ) Equação 3
0
µ𝑚𝑎𝑥 =
𝑡𝑓 − 𝑡𝑖
Ln 2 Equação 4
𝑡𝑔 =
µ𝑚𝑎𝑥
42
 Onde Ni é a densidade celular inicial (cel.mL-1) e Nf a densidade celular no final
da fase exponencial e Nt densidade celular no intervalo de tempo t (dias).
Os cultivos realizados em Erlenmeyers de 250 mL foram utilizados como
inóculo para Erlenmeyers de 500 mL, enquanto estes ultimos foram utilizados como
inóculo para Erlenmeyers de 2 L e por fim, este fora utilizado como inóculo para os
reatores tubulares de 11 L de capacidade. Todos os reatores foram inoculados
sucetivamente com 10% de inóculo e as condições de cultivo foram mantidas
semelhante em todas as escalas, exceto para os reatores tubulares, onde as bombas
de ar de aquário foram substituida pelo borbulhamento com curtina de ar ascendente.
As mesmas análises realizadas nos primeiros cultivos foram realizadas nas demais
escalas.

4.3 Cultivo em fotobiorreatores tubulares

O reator tubular foi construído em material acrílico afim de permitir a passagem

de luminosidade através da superfície e facilidade de higienização do reator. As
chicanas que também constituem a mesma tubulação que garante a alimentação de
CO2, foram construídos com tubos em Aço Inox.
Um esquema do reator utilizado pode ser visualizado na Figura 5. Cada reator
com uma altura de 65 cm, diâmetro de 15 cm e um volume total de aproximadamente
11 L. O reator foi operado com 70% do seu volume total.

43
 Figura 5. Modelo de reator utilizado nos experimentos

O fotobiorreator utilizado pode ser caracterizado como um reator airlift com

septo de circulação interna, configuração tal que facilita a transferência de massa
entre a fase líquida e gasosa, e consequente dissolução do CO2 na fase líquida, bem
como difusão do O2 produzido da fotossíntese da fase líquida para a fase gasosa
(CHISTI,1989).
Além da avaliação do crescimento da microalga, densidade ótica, produtividade
em número de células, velocidade máxima específica de crescimento, e tempo de
geração como nas demais escalas de cultivo, para os reatores tubulares também fora
realizado o monitoramento da produtividade em relação à massa seca de suspensão
de microalgas, no primeiro e no último dia de cultivo. Este último procedimento deu-
se através da avaliação gravimétrica de amostra do cultivo. 1 mL de amostra do cultivo
foi filtrada em papel filtro previamente pesado, e colocada em estufa a uma
temperatura de 60°C durante 24 horas. Prosseguindo com a ambientação da
temperatura da amostra em dessecador, e posterior pesagem. A massa de biomassa
foi determinada por diferença de massa do papel filtro com biomassa seca e sem
biomassa.

44
 O cultivo de microalgas foi circulado entre as duas unidades do reator tubular,
por meio de uma bomba peristáltica, no intuito de previnir as céulas das forças de
cisalhamento e assegurar a integridade das mesmas.
Antes de ser inoculado, o fotobiorreator foi sanitizado com solução de
hipoclorito de sódio a 2,5% durante 24 horas, mantendo o sistema de aeração ligado
afim de gerar turbulência e maior eficiência no processo de higienização. Logo após,
o reator passou por enxágue com água, com posterior inoculação.

4.4 Floculação

4.4.1. Preparo da solução de quitosana

Foi preparada uma solução estoque de 1000 ppm de quitosana em solução de

ácido acético 1% e levada a agitação durante 30 min.
Os diversos grupos aminos da quitosana permitem que ela seja dissolvida em
baixas concentrações de ácidos carboxilícos (como o acético), a protonação dos
grupos aminos introduzem forças repulsivas entre as cadeias do polímero, fortes o
suficiente para dispersar o polímero em solução (FERNANDEZ e INGBER, 2014).

4.4.2. Caracterização da quitosana

A quitosana utilizada no estudo da floculação de Desmodesmus sp. foi

caracterizada através de determinações do grau de desacetilação, microscopia
eletrônica de varredura, análise termogravimética e calorimetria diferencial
exploratória.

4.4.2.1 Grau de desacetilação

O grau de desacetilação foi determinado através de Espectroscopia de

Infravermelho com Transformada de Fourrier (FTIR).
De acordo com Bezerra (2011), na técnica de FTIR os valores de absorbância
relativos aos comprimentos de onda associados às bandas do grupo carbonila (C=O)
45
(presente no N-acetil) e do grupamento hidroxila (OH), 1655 cm-1 e 3450 cm-1,
respectivamente, são utilizados para calcular o grau de desacetilação da amostra,
segundo a Equação 5 proposta por Domszy e Roberts (2003).

𝐴 100
𝐺𝐷(%) = 100 − [(𝐴1665 ) ∗ ] Equação 5
3450 1,33
𝐴1665
O valor 1,33 corresponde à constante que representa a razão para quitinas
𝐴3450

completamente acetiladas (DOMSZY e ROBERTS, 2003).

Os espectros de infravermelho com transformada de Fourrier foram obtidos em
um instrumento FT-IR MB100 Bomem, 4 mg de amostra foram diluídas em brometo
de potássio (KBr), usando uma varredura na faixa espectral de 4000 a 400 cm -1.

4.4.2.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

A análise morfológica da quitosana foi obtida por meio de imagens obtidas em

um microscópio Hitachi S-3400N. As amostras contendo 4 mg de quitosana foram
depositadas em fitas de carbono e submetidas à metalização com ouro, sob vácuo.

4.4.2.3 Análise Termogravimétrica (TG)

A análise de estabilidade térmica da quitosana foi realizada através de medidas

termogravimétricas, em uma termobalança de modelo ShimadzuTGA – 50. Foram
usados suporte de amostra de platina, com uma massa de amostra de
aproximadamente 7 mg, e razão de aquecimento de 10 °C.min-1 em atmosfera de N2.

4.4.2.4 Calorimetria exploratória diferencial(DSC)

A análise foi realizada para determinar temperaturas de transição do polímero.

A curva DSC foi obtida em um analisador térmico SII EXSTAR 6000 com módulo
calorimétrico DSC 6220. A amostra de massa inicial igual a 4 mg, foi submetida a uma
taxa de aquecimento igual 10 °C.min-1 e faixa de temperatura compreendida entre 25
a 500 °C.

46
4.4.3 Modelagem da eficiência de floculação por Metodologia de Superfície de
Resposta (MSR)

O estudo constituiu-se de diferentes etapas. Na primeira etapa foi realizado

uma seleção de variáveis, ou determinação dos fatores que influenciam na floculação
de Desmodemus sp. por utilização da quitosana. Na segunda etapa aplicou-se um
planejamento fatorial para determinação do domínio experimental das variáveis
identificadas na etapa anterior. Na etapa seguinte, fora realizado um delineamento
DCCR, acompanhado de uma avaliação dos resultados da ANOVA, MSR, culminando
na etapa de validação e aplicação do modelo predito.

4.4.3.1 Seleção das variáveis independentes

Foi realizado um estudo inicial a cerca das variáveis independentes para

identificar aquelas que desempenham uma influência na variável dependente, a
eficiência de floculação. De acordo com a revisão bibliográfica, os fatores que
apresentam grande influência é o pH e a concentração de quitosana (DIVAKARAN e
PILLAI, 2002). Segundo recomendações dadas nos estudos de Riaño et al. (2012),
uma aplicação da ferramenta Metodologia de Superfície de Resposta (MSR) para
avaliação da influência do pH e concentração de quitosana seria de grande
importância.

4.4.3.2 Planejamento Fatorial

Usou-se um planejamento fatorial de dois fatores e dois níveis (2k, onde k=2),
com um ponto central. Este tipo de planejamento permite a construção de modelos
lineares nos fatores através do método dos mínimos quadrados, os quais descrevem
superfícies de resposta planas (BARROS NETO et al., 1995). O planejamento fatorial
possui grande importância em investigações preliminares quando se deseja saber se
determinados fatores têm ou não influência sobre a resposta desejada, quando não
se está preocupado com uma descrição muito rigorosa dessa influência (BARROS
NETO et al., 1995), sendo uma maneira de prever interação entre fatores (CALADO e
MONTGOMERY, 2003), sem precisar realizar grande quantidade de ensaios. O ponto

47
central foi introduzido no planejamento com o intuito de avaliar a significância dos
efeitos ou coeficientes, além de checar a possibilidade de curvatura no modelo de
regressão (CALADO e MONTGOMERY, 2003).
Para analisar a variação média dos resultados e identificar quais variáveis
possuem efeitos significativo (principais e/ou interação) na variável dependente, foi
utilizada a tabela da Análise de Variância (ANOVA). Segundo Barros Neto et al. (2007)
a ANOVA é o método mais utilizado para avaliar numericamente se o modelo proposto
é significativo e analisar a qualidade do seu ajuste.
De acordo com a revisão bibliográfica e ensaios preliminares, definiu-se 5 ppm
e 75 ppm como limite inferior (-1) e superior (+1), respectivamente, para o fator
concentração de quitosana. Enquanto para o fator pH, 6 e 9 foram determinados como
nível inferior e nível superior, respectivamente. A Tabela 5 descreve os experimentos
realizados em duplicata.

Tabela 5. Delineamento experimental (2 fatores, 10 ensaios, duplicata do fatorial e

do ponto central)
Valores não-codificados Valores codificados
Experimento pH C(ppm) pH C
1 6,00 5,00 -1 -1
2 9,00 5,00 +1 -1
3 6,00 75,00 -1 +1
4 9,00 75,00 +1 +1
5 (C) 7,50 40,00 0 0

Para execução dos ensaios, 500 mL de suspensão de microalgas foi transferido

para um becker de 600 mL de capacidade. O pH das amostras foram ajustados
usando soluções de hidróxido de sódio ou ácido acético, com posterior adição de
solução de quitosana para obter a concentração final determinada pelo planejamento
experimental. Todas as amostras foram agitadas à mesma velocidade, 100 rpm
durante 1 min e em seguida a velocidade de agitação foi reduzida para 30 rpm, durante
15 min, para este propósito foi utilizado um modelo de teste Jar Nova Ética com 6
sondas. Depois da floculação, as amostras foram submetidas a sedimentação durante
15 min à temperatura ambiente, amostras do sobrenadante foram recolhidas e a
densidade ótica foi identificada através da análise de absorbância em comprimento
de onda de 680 nm, utilizando um espectrofotômetro UV-Vis Agilent Cary 60.

48
 A resposta final foi calculada como porcentagem de eficiência, através da
Equação 6

𝐷𝑂𝑖 −𝐷𝑂𝑓
%𝐸𝐹 = .100 Equação 6
𝐷𝑂𝑖

Onde,
DOi: densida ótica inicial
DOf: densida ótica final

Vale ressaltar que também foram realizados testes de branco e ensaios apenas
com modificação do pH para avaliar a influência destes na eficiência da floculação.

4.4.3.3 DCCR com aplicação da Metodologia da Superfície de Resposta (MSR)

Os resultados do planejamento fatorial, permiti uma sondagem do espaço

definido e demarcação de uma região para um estudo mais detalhado,deslocando o
delineamento para uma região mais promissora (BARROS NETO et al., 1995).
Após o desenvolvimento dos ensaios do planejamento fatorial, deu-se origem
a um segundo experimento seguindo o Delineamento de Composto Central
Rotacionado (DCCR), formado por uma parte fatorial 22, mais a mesma quantidade
de pontos axiais (±α,0) e (0, ±α), onde α corresponde a 1,414, e mais um ponto central
com n reproduções (BARROS NETO et al., 1995; MONTGOMERY, 2005). A análise
estatística do planejamento central é mais elaborada que análise de um planejamento
fatorial, pois permite detectar alguma inapropriedade do modelo que está sendo
ajustado (falta de ajuste) (OLIVERO et al., 1995).
Um pacote estatístico (STATISTICA 7) foi utilizado pra construir, analisar e
otimizar o design, acompanhado da MSR.
MSR é uma coleção de técnicas estatísticas e matemáticas úteis na
modelagem e análise de processos em que a resposta é influenciada por inúmeras
variáveis e o objetivo é otimizar esta resposta (MONTGOMERY, 2005).
Os ensaios de floculação foram executados de maneira semelhante ao
proposto no tópico anterior, e os cálculos para eficiência de floculação também foram
realizados como sugerido no tópico 4.4.3.2, utilizando a Equação 6.

49
4.5 Reutilização do meio floculado com quitosana

Neste trabalho também foram realizados testes de reutilização do meio, já que

a quitosana se apresenta como um agente floculante não-tóxico e com potencial
atividade antimicrobiana, fatores estes que podem favorecer a viabilidade do processo
em grande escala. Após o processo de floculação, o meio de cultivo sobrenadante foi
removido e o mesmo foi utilizado como meio de cultura para novos cultivos de
Desmodesmus sp. Os testes foram realizados em Erlenmeyers de 250 mL, os
recepientes foram inoculados com 10% de inóculo, com volume total de operação de
150 mL. Para avaliação do crescimento celular, amostras foram coletadas em dias
alternados com determinação da densidade celular através de contagem celular em
câmera de Neubauer.

4.5.1 Espectroscopia RAMAM de biomassa de meio reutilizado

A análise qualitativa de espectroscopia RAMAN foi realizada visando comparar

a biomassa de microalgas cultivada em meio BBM tradicional, e biomassa cultivada
em meio reaproveitado do processo de floculação com quitosana, para verificar se há
uma mudança em sinais característicos da microalga Desmodesmus sp.
O equipamento utilizado foi um espectrômetro dispersivo Raman (JASCO NRS-
5100) localizado no laboratório LAPO/LAMUME do Instituto de Física da UFBA. Os
espectros foram tomados com uma fonte laser de 782 nm utilizando um microscópio
com objetiva de imersão em água para enfocar as células. A região espectral utilizada
em todas as medições foi de (800 a 3050 cm-1).

50
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Propagação celular

Os gráficos das curvas de crescimento e avaliação da densidade ótica dos

cultivos em fase de propagação (Erlenmeyers de 250 e 500 mL) podem ser
encontrados nos APÊNDICES de A até D.
Após 14 dias de cultivo foi calculado a produtividade para todas escalas. Os
cultivos em Erlenmeyers de 250 mL apresentaram produtividade de 1,88 x105 cel.mL-
1.dia-1, velocidade máxima específica de crescimento de 0,17 d-1 e tempo de geração
de 0,25 d. Apesar de exibir velocidade máxima específica de crescimento e tempo de
geração um pouco maior do que na escala inferior (Erlenmeyer de 250 mL), 0,21 d-1
e 0,29 d, respectivamente, o cultivo de 500 mL apresentou uma redução na
produtividade (0,98 x 105 cel.mL-1.dia-1). Nesta escala a fase exponencial reduziu de
11 dias (Erlenmeyer de 250 mL), para 10 dias (Erlenmeyer de 500 mL). Esta redução
pode estar associada à menor concentração celular inicial do cultivo em Erlenmeyer
de 500mL (1,67 cel.mL-1) quando comparado a Erlenmeyer de 250 mL (6,50 cel.mL-
1). A mesma explicação é plausível para as diferenças encontradas na velocidade
máxima específica de crescimento e tempo de geração. Como a concentração de
célula inicial é menor, estas possuem maior disponibilidade de nutrientes para
reproduzir-se, provocando um aumento tanto na velocidade máxima específica de
crescimento como na quantidade de divisão celular diária.
A Figura 6 apresenta algumas imagens das diferentes fases da propagação e
aumento de escala do cultivo.

51
 (a) (b)

Figura 6. Fases da propagação do cultivo celular de

Desmodesmus sp. (a) cultivo em erlenmeyers de 250 mL; (b)
cultivo em erlenmeyers de 500 mL.

5.2 Cultivo em fotobiorreatores tubulares

A Figura 7 apresenta o cultivo da microalga Desmodesmus sp. em

fotobiorreatores tubulares. Este cultivo foi utilizado para os experimentos de floculação
da biomassa.

Figura 7. Cultivo de microalgas Desmodesmus sp. em reatores tubulares

As microalgas frequentemente excretam quantidades significativas de matéria

orgânica no meio de cultivo, a qual consiste de polissacarídeos de algas e proteínas
que podem competir com a superfície de células de algas por floculantes e, assim,
52
interferir no processo de floculação (VANDAMME et al., 2013). Devido a este fato, a
floculação deve ser realizada no início da fase estacionária. A curva de crescimento
apresenta fase exponencial mais tardia em comparação aos cultivos em Erlenmeyers
(correspondente ao período do 8° ao 13° dia de cultivo) (Figura 8). Este fato pode ser
explicado pela necessidade por parte das microalgas de adaptar-se ao design, forma
de aeração e extensão do reator tubular. O 15° dia ficou definido como período para
obtenção das amostras para os experimentos de floculação.

6
Densidade celular (cel.mL-1x105 )

0
0 5 10 15 20
Tempo (dias)

Figura 8. Curva de crescimento de Desmodesmus sp. em reatores tubulares.

O cultivo em reatores tubulares apresentou produtividade de 2,58 x 104 cel.mL-

1.dia-1, velocidade máxima específica de crescimento de 0,23 d-1 e tempo de geração
de 0,33 d. O reator apresentou-se como adequado para o cultivo de
Desmodesdesmus sp., porém alguns parâmetros que influenciam no crescimento
devem ser ainda ajustados, a fim de melhorar a produtividade de biomassa.
A análise gravimétrica da biomassa seca no primeiro dia e 15° dia de cultivo,
resultou em 0,2 e 1,45 g de biomassa seca por litro de cultivo, respectivamente, o que
representa uma produtividade de 0,089 g de biomassa seca por litro a cada dia de
cultivo em reator tubular.
Dados da densidade ótica à 680 nm medida diariamente para as amostras do
cultivo em fotobiorreator tubular encontram-se na Figura 9. Observou-se que as
microalgas apresentaram crescimento significativo, até atingir a fase estacionária
53
(após o 15° dia), porém, a densidade ótica continua a aumentar sua intensidade
mesmo após alcançar a fase estacionária, conforme atesta a Figura 9. Isto pode ser
explicado pelo fato que mesmo alcançando a fase estacionária, as microalgas
continuam a produzir grande quantidade de clorofila, componente que também é
quantificado no comprimento de onda de 680 nm.

1,2
Absorbância (680nm)

0,8

0,6

0,4

0,2

0
0 5 10 15
Tempo (dia)

Figura 9. Curva de crescimento de microalgas Desmodesmus sp., em função da

absorbância a 680 nm ao longo do período de cultivo em fotobiorreatores tubulares.

5.2. Caracterização da quitosana

5.2.1 Análise termogravimétrmica da quitosana (ATG)

A curva TG da amostra de quitosana (Figura 10) mostra a ocorrência de dois

eventos térmicos, porém a degradação térmica da quitosana em atmosfera de
nitrogênio ocorre basicamente em apenas uma etapa de reação (HONG et al., 2007).
O primeiro evento ocorre numa faixa de temperatura de 30 a 110 °C, com uma perda
de massa de aproximadamente 10%. Britto e Campana-Filho (2004) em seus estudos
com quitosana com grau de desacetilação de 78%, atribuiram este evento à
evaporação de água, onde o conteúdo de água presente na referida amostra esta

54
relacionado à morfologia, cristalinidade e hidrofilicidade do polímero. O segundo
evento térmico que ocorre na faixa de temperatura 220 a 400 °C, apresenta uma perda
de massa de aproximadamente 46%, que pode ser atribuido à futura desidratação,
desacetilação e despolimerização. A decomposição completa do polímero,
envolvendo o processo pirolítico e decomposição térmica residual ocorre em
temperaturas acima de 400 °C. Júnior (2016), estudando a cinética de degradação
térmica de amostras de quitosana, também encontrou curvas de TG com perfil
semelhante porém com porcentagem de perda de massas diferentes para diferentes
faixas de temperaturas, o primeiro evento na faixa de 25 a 125 °C, com perda de
massa de 12% e o segundo na faixa de 200 a 350 °C, com perda de massa de 48%,
estas diferenças podem estar associadas ao grau de desacetilação e massa molecular
de cada amostra.

Figura 10. Análise termogravimétrica da quitosana.

5.2.2. Análise Calorimétrica Diferencial da Quitosana (DSC)

Na Figura 11, observa-se um evento endotérmico em temperatura de

aproximadamente 430°C, que caracteriza a temperatura de fusão da porção cristalina
do polímero, além de uma mudança na linha de base a aproximadamente 175°C.
55
 Sakurai et al. (2000), em seus experimentos identificou a T g da quitosana em 203
°C. Dong et al. (2004), experimentando diferentes técnicas analíticas identificou a Tg
numa faixa de temperatura 140-150°C. Através de análise convencional de DSC,
Dhawade e Jagtap (2012) determinou a Tg da quitosana como 118 °C, porém ao
aplicar a análise de temperatura modulada por DSC identificou a T g da quitosana como
sendo 61°C. A diferença entre os resultados esta ligado ao efeito plastificante da água
na quitosana (RATTO e HATAKEYAMAT,1995). A água forma ligações de hidrogênio
intermoleculares com a quitosana através dos grupos amino e hidroxila presentes na
cadeia polimérica, o que ajuda no rearranjamento molecular e facilita a mobilidade das
cadeias de quitosana (DHAWADE e JAGTAP, 2012).
A temperatura de transição vítrea da quitosana ainda é um assunto de
controvérsia. A principal razão se encontra pelo fato de a quitosana ser um polímero
natural, logo algumas propriedades como cristalinidade, peso molecular, e grau de
desacetilação, pode apresentar uma variedade de valores, de acordo com a fonte e/ou
o método de extração e logo influenciará na Tg (NETO et al., 2005).
As características descritas na curva de DSC da quitosana está de acordo com o
perfil do polímero. A quitosana não é um polímero totalmente cristalino como afirmado
por Rao et al. (2014), mas sim um polímero parcialmente cristalino, e parcialmente
amorfo (DHAWADE e JAGTAP, 2012).

56
 Figura 11. Curva DSC da quitosana.

5.2.3 Grau de Desacetilação

A Figura 12 apresenta o espectro de FTIR para a quitosana. A partir das

intensidades das bandas de infravermelho nas freqüências 1655 e 3450 cm -1, foi
calculado o grau de desacetilação aplicando a Equação 5 descrita no tópico 4.4.2.1.
De acordo com os resultados, a quitosana possui grau de desacetilação igual a
65,36%. O grau de desacetilação encontra-se de acordo com a literatura, visto que
esta propriedade varia com as amostras de quitosana, a depender da fonte de matéria-
prima (caranguejo, camarão, lagosta, etc.), processo de extração da quitina e/ou
método de desacetilação (GAIKWAD et al., 2013).

57
 Figura 12. Espectro FTIR da quitosana.

5.2.4. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

A Figura 13 apresenta imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura da

Quitosana. De acordo com as imagens a quitosana apresenta uma superfície não
homogênea, com regiões rugosas, e morfologia aparentemente fibrilar.

Figura 13. Imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura da quitosana.

58
5.3. Planejamento fatorial

A Tabela 6 apresenta os resultados da ANOVA e identifica os efeitos principais,

com a checagem de curvatura, resultado proveniente do delineamento fatorial com
ponto central. Para um nível de confiabilidade em que 95% dos resultados são
verdadeiros, qualquer variável que apresentar um p-valor<0,05, é considerada
estatisticamente significativa (NETO, 2002).
Pode-se verificar na Tabela 6, que o pH, concentração e a interação entre estas
duas váriaveis independentes exercem efeitos estatisticamente significantes (p-
valor<0,05) na variável resposta (eficiência de floculação).
A curvatura é significante (p-valor<0,05) (Tabela 6) o que implica na existência de
um polinômio de segunda ordem que possa explicar os efeitos da concentração de
quitosana e do pH do meio sobre a eficiência da floculação.

Tabela 6. Resultado da ANOVA para o Planejamento Fatorial.

Fonte de Variância Soma Valor F p-valor
quadrática
Curvatura 223,304 15,9439 0,010396
pH 2305,545 164,6158 0,000051
C 2389,133 170,5840 0,000047
pH x C 2322,552 165,8301 0,000050
Erro Puro 70,028
Soma Quadrática 7310,651
Total
R2=0,99042; R2ajustado= 0,98276

A Figura 14 mostra o gráfico quadrado das médias, apresenta os valores das

médias dos experimentos para eficiência de floculação nos níveis inferior e superior
de concentração e pH. A partir da Figura 14 pode-se concluir que uma mudança do
nível inferior para o nível superior no fator pH leva a um aumento de 68,03% na
eficiência de floculação. O oposto é evidenciado para o fator concentração da
quitosana quando em pH 9, uma mudança do nível inferior para o nível superior levou
a uma redução de 68,64% na eficiência de floculação. Quando em pH 6, uma variação
na concentração de quitosana não influencia significativamente na eficiência de
floculação.

59
 Predicted Means for Variable: Ef (%)
2**(2-0) design; MS Pure Error=14,00561
Model includes: Main effects, 2-way inter.
(95,% confidence intervals are shown in parentheses)

18,53 18,40

Concentração de quitosana (ppm)

75

19,01 87,04
5

6,0 9,0
pH do meio

Figura 14. Gráfico quadrado das médias.

5.4. Modelagem da eficiência de floculação por MSR

Diante dos resultados expostos no tópico 5.3, um reajuste na faixa de trabalho

do fator concentração de quitosana é proposto. Os níveis para a concentração de
quitosana passaram a ser 1,72 ppm e 58,28 ppm, como nível inferior e superior,
respectivamente. A região de trabalho para o fator pH foi de 5,37 a 9,62.
Os ensaios do DCCR foram realizados no 15° dia de cultivo das microalgas.
Neste dia o pH original do cultivo foi identificado como 8,0, com concentração de
biomassa igual a 1,45 g de biomassa seca por litro de cultivo.
Na Tabela 7 pode ser encontrado o delineamento experimental, com os valores
originais e codificados para as variáveis independentes, além dos resultados
experimentais utilizados na determinanação dos efeitos das variáveis independentes,
e posterior predição do modelo. A matriz experimental consiste de 9 experimentos
todos realizados em duplicata, com exceção do ponto central em que fora realizada 6
repetições. Vale ressaltar que o experimento foi realizado de forma aleatória.
Os valores experimentais para eficiência de floculação obtidos no DCCR
(Tabela 7), variam de 11,78±3,93% a 99,89±0,03%. O ponto central apresenta desvio
padrão de 7,68 %. Numa avaliação do desvio da média das replicatas dentro de cada
ensaio, pode-se observar que no ponto de máxima eficiência de floculação (ensaio 4
da Tabela 7) o desvio é mínimo.

60
Tabela 7. Resultados para o delineamento experimental DCCR.
Ensaio Valores originais Valores codificados
pH C pH C Ef Desvio
Padrão
1 5,37 30 - 1,41 0 19,44 3,75
2 6,00 10 -1 -1 42,73 15,51
3 6,00 50 -1 +1 11,86 0,16
4 7,50 1,72 0 - 1,41 99,89 0,03
5 7,50 30 0 0 18,12 7,68
6 7,50 58,28 0 + 1,41 13,27 6,33
7 9,00 10 +1 -1 74,35 8,87
8 9,00 50 +1 +1 22,22 7,83
9 9,62 30 + 1,41 0 11,78 3,93
C=concentração de quitosana (ppm); Ef=Eficiência de floculação (%)

A estrutura da quitosana é fortemente influenciada pelo pH. Em pH ácido, a

quitosana apresenta uma conformação polimérica linear, na qual os grupos amina
tornam-se carregados positivamente, e repelem fortemente entre si, enfraquecendo
as fortes interações de hidrogênio intra e intermoleculares entre os grupos funcionais
amina e hidroxila (Gualtieri et al., 1988).
Os ensaios realizados em condições de pH levemente ácido (ensaios 1, 2 e 3
da Tabela 7), de uma forma geral, apresentam um baixo desempenho na eficiência
de floculação, nestas condições de pH, a máxima resposta encontrada para a
eficiência de floculação foi de 42,73%±15,51 (Tabela 7), quando pequenas
concentrações de quitosana são utilizadas. A floculação seria uma resposta ao
mecanismo de atração eletrostática entre a estrutura da quitosana com alta densidade
de carga e a superfície da microalga negativamente carregada (MILLEDGE e
HEAVEN, 2013). A carga total da superfície diminui proporcionalmente com a redução
do pH do meio (Gualtieri et al., 1988). Quando em condição levemente ácida, pH entre
5 a 6, os grupamentos funcionais na superfície celular negativamente carregada
(hidroxila, carboxílico, fosfato, amina) (MUYLAERT et al., 2015), são parcialmente
neutralizados pela presença de íons H3O+, o que desfavorece a interação eletrostática
entre a superfície das microalgas e a quitosana, e consequentemente dificulta a
61
floculação, como demonstrado também nos estudos realizados por Harith et al. (2009)
e Sirin et al. (2012). Ainda vale ressaltar que a interação entre as moléculas de água
e as moléculas de quitosana é favorecida, em baixos valores de pH, devido a
existência de interações de hidrogênio entre estas moléculas, dificultando também o
processo de floculação nestas condições de pH.
Em pH básico ocorre um aumento de cargas negativas no meio, e portanto uma
maior repulsão entre as células de microalgas. Nestas condições, a carga positiva na
estrutura da quitosana é parcialmente neutralizada por grupamentos hidroxilas em
solução (HARITH et al., 2009), e sua conformação tende a apresentar uma curvatura,
quando comparada a forma linear apresentada em meio ácido. Grande parte da
eficiência de floculação (ensaios 7, 8 e 9 da Tabela 7) deve-se ao mecanismo de
atração eletrostática, e possíveis interações de hidrogênio formadas entre
grupamentos funcionais- na quitosana (hidroxila e amina), e grupamentos funcionais
com cargas negativas na superfície celular, que em condições alcalinas apresentam
maior eletronegatividade e portanto disponibilidade para formar interações de
hidrogênio.
A influência de outros fatores, não devem ser negligenciados, como
contribuições de interações hidrofóbicas, forças de London, entre os átomos de
carbono da quitosana e de componentes da parede celular da microalga. Embora
estas interações individualmente possuam menor força que uma interação de
hidrogênio, estas ocorrem entre um grande número de átomos nas cadeias
carbônicas, o que torna seu valor total significativo no balanço de forças eletrostáticas.
Ainda, na presença de meio alcalino alguns íons proveniente do meio de cultivo
podem estar envolvidos na precipitação de biomassa de microalgas (SIRIN et al.,
2012). Estes fatos associados podem explicar a eficiência de floculação de 74,35 ±
8,87% encontrada no ensaio 7 (Tabela 7).
Quando em pH neutro ou levemente alcalino, as ligações de hidrogênio
formadas entre os grupamentos amina e hidroxila dentro da própria estrutura
polimérica da quitosana exercem uma força proponderante às forças das interações
de hidrogênio entre hidrogênios eletropositivos (grupamento amino na estrutrura da
quitosana) e oxigênios eletronegativos (na molécula de água), a quitosana inicia o seu
processo de insolubilização em água e arrasta consigo parte das microalgas adsorvida
em sua superfície.

62
 Dentro dos resultados do planejamento experimental DCCR (Tabela 7), a maior
eficiência de floculação ocorreu em pH 7,5 e concentração de 1,72 ppm de quitosana.
Nestas condições, a alta eficiência de floculação seria uma função da ação de três
mecanismos ocorrendo concomitantemente. Uma parte da floculação pode ser
explicada pela atração eletrostática mencionada anteriormente. De acordo com
Gualtieri et al. (1988), neste pH a superfície celular da microalga apresenta uma alta
densidade de carga negativa, simultaneamente a este fato, a distribuição dos grupos
positivos na estrutura da quitosana é mais eficiente para realizar o mecanismo de
ponte (ou bridging). A quitosana seria capaz de interagir fortemente com a superfície
da célula, o polímero formaria interações com mais de uma célula, criando pontes
entre as células até formar agregados maiores em forma de flocos (MUYLAERT et al.,
2015).
A contribuição de um outro mecanismo de floculação pode ser ressaltado no
aumento da eficiência de floculação em condições ideais, o mecanismo conhecido
como charge-patch (Figura 15). Neste mecanismo o polímero carregado
positivamente tem a capacidade de interagir com a superficie da célula carregada
negativamente e criar regiões na superfície da célula com cargas inversas (de
negativa para positiva). Cargas opostas do polímero adsorvido na superfície da célula
induzem a atração de outras células carregadas com cargas opostas. Este mecanismo
é favorecido durante condições de equilíbrio, baixa cobertura da superfície e quando
há uma força iônica no meio. Os flocos são conhecidos por serem reversíveis in natura
(quando exposto ao alto cisalhamento) e pela alta tendência de refloculação após
cisalhamento (FERNANDES, 2013).
A reversibilidade dos flocos foi observada neste trabalho. Após agitação do
meio floculado foi observada a destruição dos flocos e uma redispersão das partículas
no meio. Ao suprir a agitação ocorreu a restituição dos flocos.

63
 Figura 15. Mecanismos de floculação por charge-patch (HUBBE, 2016)

Os resultados deste estudo estão de acordo com os testes realizados por

Gualtieri et al. (1988), análises de mobilidade electroforética indicam uma máxima
eficiência de floculação num pH de 7,5. Segundo os autores uma diminuição na
eficiência de floculação a valores de pH menores ou maiores que 7,5, é uma resposta
à baixa densidade de carga negativa na superfície das células de microalgas e à uma
gradual neutralização dos grupos aminos da quitosona, respectivamente.
Ainda de acordo com os resultados da Tabela 7, verifica-se que independente
do pH, a eficiência de floculação tende a diminuir quando são utilizadas concentrações
de quitosana mais elevadas. Um aumento na concentração de quitosana acima de
sua condição ótima, leva a uma redução na eficiência de floculação (MORALES et al.,
1985; GUALTIERI et al., 1988). Em altas concentrações, a restabilização da
suspensão é indicada pela redução na eficiência de floculação, em geral as células
são carregadas negativamente e as interações eletrostáticas entre elas são
repulsivas. É necessário adicionar a quitosana para flocular as microalgas, porém uma
concentração do polímero além da necessária, causa uma recobertura da célula pelo
polímero e inverte a carga da superfície celular de negativa para positiva. Então as
células repelem umas das outras e ocorre a redisperção das células de microalgas no
meio (KASEAMCHOCHOUNG et al., 2006).
O aumento da concentração de quitosana no meio também acarreta um
aumento significativo na viscosidade do meio aquoso o que dificulta a sedimentação
dos flocos no meio.
Imagens das etapas do experimento podem ser encontradas na Figura 16, em
que mostram os testes de floculação em Jar Teste antes e depois da adição de
floculante, (a) e (b), respectivamente, sedimentação dos flocos em cones de
64
sedimentação (c) e biomassa de Desmodesmus sp. após floculação, sedimentação e
secagem. O perfil da microalga antes e depois da floculação são mostrados nas
Figuras 17 e 18, respectivamente.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 16. Etapas dos ensaios de separação de biomassa de Desmodesmus sp. (a)
Ensaios em Jar Teste antes da adição do floculante; (b) Ensaios em Jar Teste após
adição de floculante; (c) Flocos em cones de sedimentação; (d) Biomassa seca em
placas de petri

Figura 17. Imagem de microscopia RAMAM de

Desmodesmus sp. antes da floculação
65
 Figura 18. Imagem de microscopia RAMAM de flocos de
Desmodesmus sp. após floculação

5.4.1 Modelo matemático e Superfície de Resposta

O pacote estatístico faz uso do método dos mínimos quadrados para calcular a
ANOVA, determinando quais os fatores são estatisticamente significativos na variável
resposta (Eficiência de Floculação). Os efeitos linear e quadrático das variáveis
independentes (concentração de quitosana e pH) e suas interações na eficiência de
floculação foram calculados a partir do delineamento DCCR.
A Tabela 8 mostra os resultados da ANOVA para o planejamento DCCR.

Tabela 8. Resultados da ANOVA para o planejamento DCCR.

Fonte de variância Soma Quadrática Valor F p-valor
pH (L) 242,64 4,2310 0,0603
pH (Q) 7,77 0,1355 0,7187
C (L) 10556,94 184,0828 0,0000
C (Q) 4362,65 76,0721 0,000001
pH (L) x C (L) 226,20 3,9442 0,068534
Falta de ajuste 1099,46 6,3905 0,006775
Erro puro 745,54
Soma quadrática total 17773,62
R2 =0,89619; R2ajustado = 0,86376; (L)= termo linear; (Q)= termo quadrático;
66
 A partir da análise dos valores apresentados na Tabela 8, apenas os efeitos
linear e quadrático da concentração de quitosana apresentaram siginificância (p-
valor<0,05) na resposta (eficiência de floculação).
A medida da proporção da variabilidade da variável dependente Ef(%) que pode
ser explicada pela variabilidade das variáveis independentes (concentração e pH), ou
seja, o coeficiente de determinação R² encontrado pelo modelo foi de 89,62%, com
falta de ajuste significativa, devido aos valores de resíduos encontrados entre os
resultados preditos pelo modelo e os dados experimentais. Desta forma, apenas
10,38% dos resultados para eficiência de floculação não pode ser explicado pelo
modelo polinomial quadrático encontrado. O coeficiente de determinação ajustado,
R²-ajustado, foi de 86,37%, indica que 13,63% da variação total não é explicada pelo
modelo. De acordo com Haaland (1989), na prática, R2 deve ser de pelo menos 75%
ou superior, valores acima de 90% são considerados ótimos.
Apesar de possuirem p-valor>0,05, o efeito positivo linear do pH e a interação
entre os fatores não devem ser negligenciados, visto que na prática (como foi discutido
no tópico 5.4) é possível identificar a importância do pH do meio na eficiência de
floculação e a interdependência entre o pH e a quantidade de quitosana necessária
para alcançar uma resposta positiva na eficiência de floculação. Sendo assim, além
do fator concentração de quitosana (quadrática e linear), tanto o efeito de interação
linear (pHxC) como o efeito linear do pH foram incluídos no modelo matemático.
Os coeficientes de regressão para o estudo da influência do pH do meio e
concentração de quitosana estão dispostos na Tabela 9.

Tabela 9. Estimativa de efeitos do pH do meio e da concentração de quitosana

Termo Coeficiente p-valor

Constante 18,120 0,000056
pH (L) 7,788 0,060337
pH (Q) -1,659 0,718737
C (L) -51,374 0,000000
C (Q) 39,308 0,000001
pH (L) x C (L) -10,635 0,068534
C= Concentração de quitosana; (L)= termo linear; (Q)= termo quadrático

Através dos dados da Tabela 9, é possível observar que um aumento linear da

concentração de quitosana causa um efeito negativo na eficiência de floculação (efeito
justificado pela super dosagem e redispersão das microalgas), que é mais significativo
67
que o efeito positivo causado pelo aumento quadrático na concentração de quitosana
(devido ao reduzido valor de seu coeficiente).
Considerando um p-value<0,10, tanto o efeito linear do pH como a interação
linear pHxC passam a possuir efeito sobre a Eficiência de Floculação. A Equação 7
expressa o modelo matemático ajustado em termo dos valores codificados,
representado por uma equação polinômial de segunda ordem para a eficiência de
floculação em função da concentração de quitosana e pH do meio.

𝐸𝑓 (%) = 18,120 + 7,788(𝑝𝐻) − 51,374(𝐶) + 38,308(𝐶 2 ) − 10,635(𝑝𝐻)(𝐶) Equação 7

Na Figura 19 é traçado graficamente uma relação entre os valores observados

experimentalmente para eficiência de floculação de biomassa e aqueles estimados
pelo modelo. A linha sólida representa os valores estimados pelo modelo matemático,
e os ponto refere-se aos valores experimentais. Apesar de existirem alguns pontos
que apresentam uma discrepância maior com aqueles preditos, quanto mais a
eficiência se aproxima de seus valores máximos, menor é o desvio entre os dados
experimentais e os valores preditos pelo modelo matemático.
Observed vs. Predicted Values
2 factors, 1 Blocks, 22 Runs; MS Pure Error=57,34888
DV: EF (%)
100
90
80
Valores calculados

70
60
50
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Valores experimentais

Figura 19. Valores experimentais e valores estimados para eficiência de floculação

de biomassa de Desmodesmus sp. usando quitosana.

68
 A superfície de resposta e as curvas de contornos obtidas estão apresentadas nas
Figuras 20 e 21, respectivamente, construídas através do modelo polinominal
(Equação 7). A superfície de resposta resultou num ponto de mínimo. Porém de
acordo com os resultados preditos pelo modelo e representados pela superfície de
resposta (Figura 21), é possível identificar uma região ótima para a resposta.
As curvas de contorno na Figura 21 mostra uma visualização bidimensional da
relação entre a eficiência de floculação e as variáveis independentes (concentração e
pH). De acordo com a Figura 21 a máxima eficiência de floculação estaria na região
extrapolada pelo modelo, fora da região experimental, sugerindo concentrações de
quitosana abaixo de zero, ou seja, neste caso a floculação ocorreria apenas pela
atividade do pH (faixa de 8-10), o que não ocorre na prática. Eficiência de floculação
de aproximadamente 100% pode ser alcançada em concentrações mínimas de
quitosana, como é visualizado nos resultados do planejamento experimental (Tabela
7). Pode-se inferir que dentro da região de trabalho, a superfície de resposta
associada ao modelo quadrático proposto consegue refletir os resultados
experimentais.

2 factors, 1 Blocks, 22 Runs; MS Pure Error=57,34888

DV: EF (%)

160
140
120
100
80
60
40
20

Figura 20. Superfície de Resposta

69
 Fitted Surface; Variable: EF (%)
2 factors, 1 Blocks, 22 Runs; MS Pure Error=57,34888
DV: EF (%)
2,0

1,5
Concentração da quitosana
1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0 160
140
120
-1,5 100
80
-2,0 60
-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 40
20
pH do meio

Figura 21. Curvas de contorno

A validação do modelo predito foi realizada em três condições adversas

apresentadas na Tabela 10, e mais uma vez percebemos que quanto mais próxima
da condição ideal, menor é o desvio padrão.

Tabela 10. Validação do modelo polinomial.

C (ppm) pH EF experimental (%) EF (%) calculada Desvio Padrão
1,72 8 98,59825 97,44918 1,179148
1,5 7,4 98,2156 93,86491 4,635056
2,25 7,4 99,8052 90,84204 9,866753

5.5. Reaproveitamento do meio de cultivo

Os testes de reaproveitamento do meio de cultivo sobrenadante após o

processo de floculação revelaram resultados positivos, porém as microalgas
apresentaram um crescimento com coloração que difere do cultivo em realizado em
meio BBM normal, o que pode evidenciar estresse por falta de nutrientes no meio de
cultivo. Desmodesmus cultivadas em meio de cultivo restrito reduz significativamente
seu conteúdo de clorofila, biomolécula que caracteriza a coloração verde do cultivo

70
(SOLOVCHENKO et al., 2013). A Figura 22 mostra imagens do cultivo no primeiro e
último dia de experimento (após 12 dias).

Figura 22. Ensaios de reaproveitamento do meio de cultivo após floculação de

biomassa de Desmodesmus sp. (a) primeiro dia do experimento; (b) último dia do
experimento.

A Figura 23 apresenta um gráfico da curva de crescimento da microalga

cultivada em meio reaproveitado. Pode-se verificar aumento do número de células
durante o período que foi realizado o experimento, implicando que a quitosana não é
um produto tóxico às microalgas, além de permitir a separação da biomassa o
polímero ainda permite o reaproveitamento do meio de cultivo sobrenadante.

71
 30

Densidade celular (cel.mL-1x105)

25

20

15

10

5
0 5 10
Tempo (dias)

Figura 23. Curva de crescimento de microalgas Desmodesmus sp. em meio

reutilizado após floculação de biomassa pela utilização de quitosana.

Os espectros Raman de células de microalga Desmodesmus sp. in vivo em

meio de cultivo BBM, e meio de cultivo BBM reaproveitado após a floculação são
apresentados nas Figuras 24 e 25, respectivamente.

72
 1400

1200

1000

Intensidade(a.u.)
800

600

400

200

1000 1200 1400 1600 1800 2000

-1
Número de ondas (cm )

Figura 24. Espectro Ramam de microalgas Desmodesmus sp. em meio de cultivo

BBM

1400

1200

1000
Intensidade (a.u.)

800

600

400

200

0
1000 1250 1500 1750 2000
-1
Número de onda (cm )

Figura 25. Espectro Ramam de microalgas Desmodesmus sp. cultivada em meio de

cultivo BBM reaproveitado

73
 Foram destacadas apenas a região espectral que corresponde ao intervalo 850
a 2000 cm-1, uma vez que que não foi detectado nenhum sinal na região espectral
acima de 2000 cm-1.
Os sinais de Raman em 1006 cm-1, 1155 cm-1 podem ser indexados ao
estiramento C-H em moléculas de β-caroteno, enquanto 1520 cm-1se constitue no pico
de caroteno mais dominante (SHARMA et al., 2015). De acordo com Solovchenko et
al. (2013), luteína e β-caroteno prevalecem entre os carotenóides encontrados em
espécies de microalgas do gênero Desmodesmus.
Deslocamentos Raman na região 1004-1008 cm-1são atribuídos também a
picos característicos de aminoácidos de fenilalanina (WU et al., 2011), um dos
aminoácidos essenciais ao ser humano que também podem ser encontrados em
espécies de microalgas do gênero Desmodesmus (CHEBAN et al., 2015).
O meio de cultivo não modificou a região espectral dos sinais, porém os sinais
demonstraram-se menos intenso para as microalgas cultivadas em meio de cultivo
reaproveitado (Figura 25), este fato pode estar associado à restrição de nutrientes no
meio, levando a uma redução na produtividade das referidas biomoléculas.

74
6. CONCLUSÕES

Neste trabalho foi verificado que a quitosana possui uma alta capacidade de
floculação e ainda possibilita a reutilização do meio de cultivo sobrenadante após a
floculação. Pode-se identificar a condução da floculação e posterior sedimentação
como uma etapa capaz de concentrar a biomassa numa fração menor de volume,
reduzindo o tempo de operação do sistema e consequentemente a quantidade de
energia requerida na separação da biomassa de microalgas.
Em relação ao modelo proposto, 89,62% dos resultados para Eficiência de
Floculação poderam ser explicados pelo modelo polinomial quadrático encontrado.
Foram significativos apenas os efeitos linear e quadrátrico da concentração, no
entanto é nítido que o efeito linear do pH e o efeito de interação entre as variáveis
não podem ser negligenciados.
Finalmente, é importante salientar que os resultados apresentados aqui não
podem ser generalizados para outra espécie de microalga sem considerar as
variações nas propriedades da superfície celular, como composição, carga e
hidrofobicidade.

75
 7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Para melhor entendimento do mecanismo envolvido no processo de floculação,

sugere-se um estudo de caracterização da superfície microalgal e propriedades de
adsorção no intuito de compreender a natureza das interações envolvidas.
Ainda como trabalhos futuros, sugere-se um estudo sobre a reposição de
nutrientes no meio reaproveitado em prol de intensificar o metabolismo de
biomoléculas de interesse, com o acompanhamento do consumo de nutrientes
essenciais durante o cultivo da microalga. Também seria de suma importância a
realização de análises cromatográficas para identificar de forma mais detalhada o
perfil de pigmentos e ácidos graxos presentes na biomassa de microalgas
Desmodesmus sp.

76
8. Referências

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85
9. ANEXOS

Anexo A – Meio de cultivo BBM

Tabela 1. Meio BBM modificado

Estoque Solução Estoque mL/L
1. KH2PO4 8.75 g/500 mL 10 mL
2. CaCl2.2H2O 12.5 g/500 mL 1 mL
3. MgSO4.7H2O 37.5 g/500 mL 1 mL
4. NaNO3 125 g/500 mL 1 mL
5. K2HPO4 37.5 g/500 mL 1 mL
6. NaCl 12.5 g/500 mL 1 mL
7. Na2EDTA. 2H2O 10 g/L 1 mL
KOH 6.2 g/L
8. FeSO4.7H2O 4.98 g/L 1 mL
H2SO4 (concentrado) 1 mL/L 1 mL
9. Solução de metáis traço Tabela 2 1 mL
10. H3BO3 5.75 g/500 mL 0.7 mL

Tabela 2. Solução de metais traço

Substancia g/L
1. H3BO3 2.86 g
2. MnCl2.4H2O 1.81 g
3. ZnSO4.7H2O 0.222 g
4. Na2MoO4.2H2O 0.390 g
5. CuSO4.5H2O 0.079 g
6. Co(NO3)2.6H2O 0.0494 g

86
Anexo B – Densidade ótica utilizadas para cálculo da Eficiência de Floculação
do tópico 5.4

Ensaio pH C DOi DOf EF(%)

9 9,621320 30,00000 1,16436 0,99480 14,56300
3 9,000000 50,00000 1,16436 0,84115 27,75901
2 7,500000 1,71573 1,16436 0,00100 99,91412
7 7,500000 58,28427 1,16436 1,06200 8,791618
4 7,500000 30,00000 1,16436 0,92240 20,78097
5 6,000000 10,00000 1,16436 0,53920 53,69156
10 9,000000 10,00000 1,16436 0,37170 68,07707
18 7,500000 58,28427 1,22476 1,00740 17,74760
1 5,378680 30,00000 1,16436 0,96880 16,79597
11 7,500000 30,00000 1,16436 0,99820 14,27099
8 6,000000 50,00000 1,16436 1,02760 11,74601
6 7,500000 30,00000 1,16436 0,78430 32,64149
12 5,378680 30,00000 1,16436 0,90710 22,09499
15 7,500000 30,00000 1,22476 1,07530 12,20369
13 7,500000 1,71573 1,22476 0,00160 99,86936
17 7,500000 30,00000 1,22476 1,04735 14,48575
22 7,500000 30,00000 1,19640 1,02485 14,33885
20 9,621320 30,00000 1,19640 1,08870 9,002006
19 6,000000 50,00000 1,19640 1,05305 11,98178
21 9,000000 10,00000 1,19640 0,23170 80,63357
14 9,000000 50,00000 1,22476 1,02035 16,69025
16 6,000000 10,00000 1,22476 0,83580 31,75843

87
10. APÊNDICES

Apêndice A – Curva de crescimento de Desmodesmus sp. para cultivo em

Erlenmeyers de 250 mL

35
Densidade Celular (cel.mL-1 x105)

30

25

20

15

10

0
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (dias)

Apêndice B – Curva de crescimento de Desmodesmus sp., em função da

Absorbância a 680 nm ao longo do período de cultivo em Erlenmeyers de 250
mL

2,5
Absorbância (680nm)

1,5

0,5
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (dias)

88
Apêndice C – Curva de crescimento de Desmodesmus sp. para cultivo em
Erlenmeyers de 500 mL

25
Densidade Celular (cel.mL-1 x105)

20

15

10

0
0 5 10 15
Tempo (dias)

Apêndice D – Curva de crescimento de Desmodesmus sp., em função da

Absorbância a 680 nm ao longo do período de cultivo em Erlenmeyers de 500
mL

2,5

2
Absorbância (680nm)

1,5

0,5

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tempo (dias)

89