UFC

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRARIAS
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE PESCA

CULTIVO, ADAPTAÇÃO E COMPOSIÇÃO PROTEICA DA

MICROALGA DunaIlea viridis EM DIFERENTES SALINIDADES

ANA CRISTINA DE AGUIAR SALDANHA PINHEIRO

Monografia apresentada ao Departamento de

Engenharia de Pesca Centro de Ciências
Agrárias da Universidade Federal do Ceará,
como parte das exigências para a obtenção
do titulo de Engenheiro de Pesca.

FORTALEZA-CEARA-BRASIL
MAIO / 2002
 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca Universitária
Gerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

P718 Pinheiro, Ana Cristina de Aguiar Saldanha.

Cultivo, adaptação e composição proteica da microalga Dunaliella viridis em diferentes
salinidades / Ana Cristina de Aguiar Saldanha Pinheiro. – 2002.
33 f. : il. color.

Trabalho de Conclusão de Curso (graduação) – Universidade Federal do Ceará, Centro

de Ciências Agrárias, Curso de Engenharia de Pesca, Fortaleza, 2002.
Orientação: Prof. Dr. Fernando Araújo Abrunhosa.

1. Engenharia de Pesca. I. Título.

CDD 639.2
COMISSÃO EXAMINADORA:

Prof. Fernando Araújo Abrunhosa, PhD.

Orientador/Presidente

Porf. José Wilson CaRope de Freitas, MSc.

Prof. Wladimir Ronald Lobo Farias, PhD.

VISTO:

Prof. Moisés Almeida de Oliveira, PhD

Chefe do Departamento de Engenharia de Pesca

Profa Maria e!ma Ribeiro Viana, MSc.

Coordenadora do Curso de Engenharia de Pesca
A minha mãe Edna Maria e ao meu pai
Francisco Pinheiro, por todo o esforço,
incentivo e amor dedicado, para que eu
alcançasse minha realização pessoal e
profissional "Só existem dois dias em que
não se pode fazer nada o ontem e o
amanhã" ( Dalai Lama)
 AGRADECIMENTOS

A Deus por iluminar meus caminhos e ter me dado forças em todos os

momentos da minha vida.
Ao meu orientador professor Fernando Araújo Abrunhosa, pela orientação
amizade e principalmente por ter acreditado e apostado no meu potencial durante
a realização deste trabalho,
Ao PARTEC, NUTEC em especial a UMITAKA pela contribuição no período
em que estagiei na empresa.
Ao professor Masayoshi Ogawa, pelo apoio durante esses quatro anos que
estive no laboratório de recursos aquáticos.
A professora Silvana Saker Sampaio pela atenção e auxilio na interpretação
dos dados estatísticas.
A Engenheira de pesca e colega Alessandra Cristina pela realização das
análises estatísticas.
Ao professor Everardo Lima pela ajuda e sugestões nas análises protéicas.
A todos os meus amigos do Laboratório, André, Janaína, Charles, Norma,
Luciana, Jacqueline e Neto, que contribuíram para a realização deste trabalho.
A minha amiga Paloma Almeida, pela valiosa amizade e por ter perdido
muitas noites de sono ao meu lado, ajudando na elaboração deste trabalho.
Ao Luis e a Rose do Laboratório de Carnes, do Departamento de
Engenharia de Alimentos, pela ajuda no uso da centrifuga e do liofilizador.
Aos meus amigos Irlanda Aguiar, Donaldson Matias, Erika Dourado, Fabiola
Gondim, Anibal Filho (bibal), Sergio Lustosa, Antônio Albuquerque (Tony), pela
grande amizade e por me ajudarem a desopilar nos momentos mais estressantes.
As minhas tias Eneida e Nakeida, por estarem sempre presentes em todos
os momentos da minha vida contribuindo para a minha formação.
Aos meus avós Geraldo, Elvira e Graça, por representarem muito em minha
vida e sempre acreditarem no meu futuro.
 Aos meus irmãos, Gustavo, Juliana e Felipe, pelo grande incentivo, ajuda e
presença nos momentos que mais precisei.
Ao Fernando pelo carinho e apoio, não só na minha vida pessoal como na
profissional.
A Mara pela paciência e por ter me ajudado na obtenção das
fotomicrografias.
Aos funcionários Leny e Edilson pela ajuda e paciência durante esses anos
acadêmicos
Aos meus amigos de curso, que são muitos, por terem participado da minha
vida de alguma maneira, contribuindo para a realização de momentos
inesquecíveis.
Enfim a todos aqueles que contribuíram de alguma maneira para o meu
sucesso, meus sinceros agradecimentos.
 SUMÁRIO

página
RESUMO
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS

1. INTRODUÇÃO 01
2. MATERIAIS E MÉTODOS 04
2.1 Preparação do meio de Cultura Conway (modificado) 04
2.2 Avaliação do crescimento algal 06
2.2.1 Determinação da densidade celular 06
2.2.2 Preparação das culturas 07
2.2.3 Determinação das curvas de crescimento 09
2.3 Combate aos protozoários ciliados 09
2.4 Determinação da composição protéica 09
2.5 Análise estatística 10
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES 12
3.1 Curvas de crescimento 12
3.1.1 Meio de salinidade de 35%o 13
3.1.2 Meio de salinidade de 30%0 13
3.1.3 Meio de salinidade de 25%0 14
3.1.4 Meio de salinidade de 20%0 14
3.1.5 Meio de salinidade de 15%0 14
3.1.6 Meio de salinidade de 10%0 15
3.1.7 Meio de salinidade de 5%0 15
3.1.8 Meio de salinidade de 0%0 15
3.2 Análise de Proteína 18
3.3 Controle de protozoários ciliados 19
3.4 Análise estatística 19
4. CONCLUSÕES 23
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 24
RESUMO

O Cultivo e adaptação da microalga, Dunaliella viridis teve como objetivo,

analisar o crescimento desta microalga em baixas salinidades, visando um cultivo
em massa, para uma posterior utilização desta espécie de microalga em cultivos
larvais de organismos aquáticos, principalmente crustáceos. A microalga foi
adaptada gradativamente às seguintes salinidades: 30, 25, 20, 15, 10, 5,
0%0,permanecendo em cada salinidade nove dias, observando e analisando a
curva de crescimento em cada uma das salinidades. O meio de cultivo utilizado foi
o Conway (WALNE, 1974), modificado. Os Cultivos foram conduzidos em
triplicatas, a partir de cepas em salinidade de 35%0, sob iluminação contínua de
intensidade luminosa igual à 1000 Lux. A temperatura variou entre 28° e 30°C e o
pH de 7,85 a 9,04. Ocorreram algumas contaminações por protozoários, o
tratamento utilizado neste caso foi o uso de sulfato de cobre na concentração de
0,2 g/L. A microalga D. viridis continuou crescendo em todas as salinidades, nas
salinidades de 35%0 e 30%0, a densidade máxima de células alcançada foi de 595
x 104 céllml e 603,33 x 104 cél./ml, no nono dia de cultivo. Na salinidade de 25%0,
foi de 590,33 x 104 céllml, no sétimo dia de cultivo. As salinidades de 20%0, 15%0,
10%, 5%0, e 0°k0, foram respectivamente de 619,33 x 104 cél./ml, 733 x 104céliml,
683 x 104 cél./ml, 732 x 104 cél./ml, 303x104 cél./ml, no oitavo dia de cultivo. Para
obtenção da biomassa a amostra foi centrifugada a 3000 g por 5 mim. As
biomassas obtidas para as salinidades de 35 e 0%, foram 1,29 e 0,98 g/l
respectivamente e os teores de proteína encontrados em Dunaliella viridis na
salinidade de 35 e 0 %c• foram 19,03 e 27, 90 % . A análise estatística revelou que
a microalga se desenvolveu melhor na salinidade de 5%0, obtendo um número
maior de células em quase todas as salinidades, o que viabiliza o uso desta
microalga em cultivos larvais de crustáceos.
LISTA DE FIGURAS
Pág.

FIGURA 01. Camara de Neubauer vista externa. 06

FIGURA 02. Câmara de Neubauer vista do microscópio. 06

FIGURA 03. Fluxograma de Cultivo. 07

FIGURA 04. Cultivo de D.viridis para obtenção de biomassa para

análise protéica. 08

FIGURA 05. Curva de crescimento de D.viridis em todas as

salinidades testadas. 16

FIGURA 06. Curva de crescimento de D. vitidis nas principais

Salinidades. 17

FIGURA 07. Microalga D.viridis na objetiva de 40x cultivada em

salinidade de 5%0. 21

FIGURA 08. Célula de D.viridis em divisão celular cultivada

em salinidade de 5%0. 21

FIGURA 09. Células de D.viridis na objetiva de 100x em salinidade

de 5%0. 22

FIGURA 10. Vista ampliada de células D.viridis na objetiva de 100x em

salinidade de 5%0. 22
LISTA DE TABELAS
Pág.

TABELA 01. Preparação do meio de Cultivo Conway (modificado). 04

TABELA 02. Dados dos valores transformados da curva de crescimento de

D.viridis em diferentes salinidades. 11

TABELA 03. Produção de biomassa e teor protéico da avitidis no meio

Conway em 35 e 0%. 18

TABELA 04. Resultado da analisa de variância do crescimento da D.virldis em

diferentes salinidades (ANOVA). 19

TABELA 05. Interação entre a concentração de sal do meio (0%) e os dias de

cultivo. 20
CULTIVO, ADAPTAÇÃO E COMPOSIÇÃO PROTEICA DA MICROALGA
DunaHeft viridis EM DIFERENTES SALINIDADES

Ana Cristina de Aguiar Saldanha Pinheiro

1. INTRODUÇÃO

Nos ecossistemas aquáticos naturais a perpetuação das espécies depende

do equilíbrio estabelecido entre os diferentes níveis da cadeia tráfica. Assim, o
desenvolvimento e sobrevivência de larvas e juvenis dependem da presença
de organismos que constituem o fitoplâncton e o zooplâncton, sendo que, estes
se desenvolvem em condições adequadas (TORRENTERA & TACON, 1989).
As microalgas, organismos microscópicos de tamanho variável, são objeto
de várias pesquisas em diferentes áreas de conhecimento tais como biologia, a
química, e em áreas específicas da bioquímica, da engenharia ambiental, da
oceanografia entre outras. Elas constituem a base da cadeia alimentar onde
servem de alimento para a maioria das espécies aquáticas, transformando os
minerais como a amônia, nitrito, nitrato e fosfato oriundos das atividades dos
outros seres vivos, em matéria orgânica.(BURI, 1978; KLEIN& SEBASTIEN,
1998a).
O crescimento de uma população de microalgas é resultado de uma
interação entre fatores biológicos, físicos e químicos. Os fatores biológicos
estão relacionados As próprias taxas metabólicas da espécie cultivada, bem
como a possível influência de outros organismos sobre o desenvolvimento
algal, enquanto que os principais fatores físico-químicos que afetam
crescimento das microalgas são reportados como luz, temperatura, e a
disponibilidade de nutrientes (GUILLARD, 1975).
A biomassa de microalga marinha constitui um potencial importante em
aquicultura, onde o fornecimento de alimento de alto teor protéico é
indispensável. 0 seu cultivo em massa tem sido utilizado em sistema de
aquicultura, como fonte de variados produtos (ABALDE et. al., 1991).
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 2

As microalgas não somente são importantes na aquicultura como fonte

alimentar, mas também auxiliam na manutenção da qualidade da água, pois
tem um papel fundamental no balanço de oxigênio, do dióxido de carbono e
dos componentes nitrogenados, sobretudo a amônia.
Mesmo existindo outras opções (alimento artificial), para se proporcionar
os nutrientes essenciais às larvas, principalmente os ácidos graxas
poliinsaturados, as microalgas cultivadas e empregadas vivas, continuam
sendo a base alimentar nas larviculturas comercias. Isto se deve tanto ao alto
grau de conhecimento técnico alcançado nos cultivos, aliado ao baixo custo de
produção.
0 principal problema na utilização de microalgas na aquicultura é a falta
de conhecimento do seu conteúdo bioquímico e das necessidades nutricionais
dos consumidores destas (DEPAUW & PERSOONE, 1988)
A utilização das microalgas como alimento na larvicultura sem o
conhecimento da sua composição nutricional, pode limitar a produtividade do
cultivo, afetando o crescimento e a sobrevivência das larvas (OLIVERA, et. al.
1998).
O gênero DunaIlea (Ordem, Volvocales: Classe, Chlorophyceae) inclui
uma série de espécies unicelulares. É um dos gêneros mais cultivados em
larga escala, devido ao seu elevado valor nutricional e principalmente devido às
facilidades de crescimento em larga escala e em diferentes meios de cultura.
As microalgas cloroficeas aparecem com um interesse especial por causa
da existência de técnicas de produção em larga escala. Elas são obviamente
mais importantes quando utilizadas como um componente da dieta e não como
alimento exclusivo (MESKE & PEFEFFER, 1978).
Dunaliella foi a primeira microalga a ser usada comercialmente para a
produção de importantes compostos como o R-caroteno e o glicerol, em
condições especificas de salinidade, temperatura e luminosidade pode
acumular até 40% de glicerol (GINZBURG, 1987).
A espécie Dunaliella viridis (TEODORESC0,1906), apresenta células de
coloração esverdeada e formato cilíndrico à ovóide, medem de 3-5tim de
largura e 6-8pm de comprimento. Possui dois flagelos iguais que permitem que
a célula se movimente (GINZBURG, op. cit.). A reprodução pode ser de forma
assexuada, com divisão longitudinal de células móveis ou ocorrem meioses
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 3

com a germinação do zigoto resultando na formação de células individuais

móveis (RICHMOND, 1996).
Fisiologicamente este gênero é distinguido pela habilidade de crescimento
em meios com alta concentração de sal, isto se deve a ausência de uma
parede celular rígida, que permite que o volume celular troque rapidamente em
resposta a trocas da pressão osmótica extracelular (GINZBURG, op. cit.).
Vários autores destacam Dunaliella tolerante a diversos graus de
salinidade (BEM-AMOTZ & AVRON, 1981), no entanto nenhum deles observou
o crescimento desta em salinidade a baixo de 20%.
0 presente trabalho analisa a adaptação e crescimento desta microalga
nas salinidades 35, 25, 20, 15, 10, 5 e 0 %o. 0 uso da microalga adaptada em
cultivos larvais de crustáceos, cujo desenvolvimento larval dar-se em
salinidades menores que a oceânica ainda é discutido.
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 4

2. MATERIAS E MÉTODOS

Todo o experimento foi realizado no laboratório de recursos aquáticos do

Departamento de Engenharia de Pesca e consistiu das seguintes etapas: (1)
Preparação do meio de cultivo, (2) Adaptação e Avaliação do crescimento
algal, (3) Tratamento dos protozoários chiados, (4) Determinação da
composição protéica e (5) Análises estatísticas.

2.1 Preparação do meio de cultura Conway (WALNE, 1974) modificado.

Este meio de cultura é classificado com semidefinido, pois é elaborado a

partir de água do mar enriquecida com uma mistura de substâncias orgânicas e
inorgânicas de composição conhecida.
A elaboração do meio consiste na preparação de quatro soluções, a
principal, a de traços metais, vitaminas e de silicatos que neste caso não foi
necessária, pois as microalgas cloroficeas não necessitam de silicatos para a
sua sobrevivência (TABELA 1).

TABELA 01. Preparação do meio de cultivo Conway (modificado).

Solução principal
Reagentes Quantidades
EDTA 90,00 g
H3Bo 67,20 g
NaNO3 200,00 g
Na2H2PO4. 2H20 40,00 g
MnC12. 4H20 0,72 g
FeCl3. 6H20 2,60 g
Agua destilada (Autoclavada) 2,00 Litros
Solução de traços metais 2,00 ml
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 5

Solução de tragos metais

Reagentes Quantidades
ZnCl2 0,21 g
CoCl2. 6H20 0,20 g
(NH4)11404024. 4H20 0,09 g
CuSO4. 5H20 0,20 g
Agua destilada 10,00 mi

Solução de vitaminas
Reagentes Quantidades
Citroneurim 5000 MERCK* 1 ampola
Agua destilada 50,00 mi
*Produto farmacêutico para uso humano (cianocobalanina e tiamina)

Solução de silicato (Somente para Diatomácias)

Reagentes Quantidades
Na2SiO3. 5H20 5,10 g
Agua destilada 100,00 mi

Para elaboração do meio

Solução principal 2,00 mi
Solução de vitaminas 0,10 mi
Solução de silicatos 1,5 mi
Agua do mar autoclavada 1000 ml
* neste caso não foi necessário

A solução principal e de traços metais devem ser autoclavadas logo após o seu
preparo.
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Proteica da Microalga... 6

2.2 Adaptação e Avaliação do crescimento algal

2.2.1. Adaptação das microalgas

As microalgas foram adaptadas gradativamente nas salinidades 35, 30,

25, 20, 15, 10, 5 e O %0 ficando nove dias em cada uma das salinidades,
período suficiente para adaptação e para determinação da densidade celular.

2.2.2. Determinação da densidade celular

Dentre os diversos métodos utilizados para a determinação da

densidade celular os mais utilizados são a numeração direta ao microscópio, o
emprego de contadores de partículas e a espectrofotometria (ALFONSO &
LEAL, 1995). Devido à simplicidade e ao custo reduzido, neste trabalho o
método empregado para a determinação da densidade celular foi a numeração
direta ao microscópio óptico binocular, com auxilio da camera de Neubauer
(FIGURA 01 e 02).
Foram preparados três tubos de ensaio para cada uma das salinidades,
que foram testadas gradativamente.
As contagens com a câmara de Neubauer foram feitas diariamente
durante nove dias, para cada uma das salinidades, com microscópio óptico
binocular, com objetiva de 40x. A partir dos dados obtidos com as contagens,
foram tragadas as curvas de crescimento da D. viridis em cada uma das
salinidades.

FIGURA 01. Camara de Neubauer vista externa

PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 7

FIGURA 02. Câmara de Neubauer vista do microscópio.

2.2.2 Preparação das culturas

As culturas foram iniciadas sempre com o mesmo volume de 30 ml, para

todas as salinidades e sempre com a mesma concentração de células 20 x 104
ml, seguindo o seguinte esquema de cultivo (FIGURA 03).

Tubos de cepas de 30m1

Tubos de produção de 30m1

Erlenmeyer de 250m1

Erlenmeyer de 1 L com aeração

Recipientes de 3L com aeração

FIGURA 03. Fluxograma de cultivo da microalga D. viridis em todas as

salinidades.

Nos tubos de ensaio foram preparadas 29 mi do meio de cultura com a

salinidade desejada, ajustada com água destilada autoclavada e medida com
refratômetro.
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 8

0 volume de microalga que seria inoculado ao tubo de ensaio com o

meio, foi calculado a partir da formula para cálculo da necessidade de algas
nos tanques de larvicultura (BARBIERI & OSTRENSKY, 2001).

VA = (VT x DD) / CA
VA = Volume de algas a ser adicionado
VT = Volume do tanque de larvicultura (volume do tubo de ensaio)
DD = Densidade algal desejada
CA = Concentração atual de células no inoculo

De acordo com o número de algas determinado na contagem da câmara

de Neubauer, determina-se o volume de microalga que deve ser ofertado nos
tubos de ensaio contendo o meio, para que estes se iniciem sempre com a
mesma densidade algal de 20 x 104 céliml em todas as salinidades testadas.
Foram mantidas culturas estoques de todas as salinidades, e foi a partir
dessas culturas que se iniciaram as repicagens sucessivas com objetivo de se
obter volumes maiores da microalga para a determinação do conteúdo protéico
(FIGURA 04).

FIGURA 04, Cultivo de D. viridis, para obtenção de biomassa para a anélise

protéica,
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 9

A assepsia no cultivo era assegurada pela esterilização de toda a

vidraria utilizada no laboratório em autoclave .6 111°C por 15 minutos. As
repicagens também obedeceram às condições de assepsia, sendo realizadas
com vidraria devidamente esterilizada e sempre na presença de uma chama.

2.2.3 Determinação das curvas de crescimento

A curva de crescimento é expressa como o incremento da biomassa ou

do número de organismos (densidade celular) no tempo.
As curvas de crescimento populacional da microalga foram feitas
baseadas no crescimento desta no intervalo de nove dias de cultivo a fim de
determinar a fase de crescimento exponencial e o período ideal para a retirada
do inoculo (SEBASTIEN, 1999).

2.3 Combate aos protozoários ciliados

Durante uma das adaptações ocorreu em alguns tubos contaminação

com protozoários que foi tratada com uma solução de sulfato de cobre na
concentração de 0,2 g/I. Depois de preparada a solução aplica-se um volume
desta referente a 10% do volume total de microalgas (KLEIN & SEBASTIEN,
1998b).
Os protozoários aparecem nas culturas geralmente através da vidraria
do laboratório, da água utilizada ou qualquer outro material que não esteja
devidamente esterilizado e que entre em contato com o meio de cultura.

2.4 Determinação da composição protéica

Para obtenção da biomassa algal, a microalga foi centrifugada a 3000 g

por cinco minutos, rotação e tempo suficientes para obtenção do concentrado
algal, sem causar danos à estrutura celular da mesma.
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 10

Após a obtenção do concentrado algal este foi separado do

sobrenadante, congelado e liofilizado, pesado e determinado o teor de
proteína.
A determinação do teor de proteína foi feita pelo método Micro-Kjedahl,
que consiste em pesar 0,2 g da amostra na qual acrescenta-se 2 g do
catalisador ( K2S0.4 + CuSO4) e 4m1 de H2SO4 concentrado. Depois a mistura é
levada para o digestor, ficando ate ocorrer o desaparecimento da cor escura.
Ao produto digerido é acrescentado 10 ml de ácido bórico a 2% com 3 gotas do
indicador misto. 0 produto destilado é titulado com HCI 0,02N ou 0,04
padronizado. 0 teor de proteína é calculado através da fórmula:

% NT =0. 056 x Vol- HCI

Peso da amostra

% PT = % NT x 6,25

NT= Nitrogênio total

PT = Proteína total

2.5 Análise estatística

Os dados do número de células por ml x 104, foram transformados em

logaritmo decimal para facilitar a execução dos cálculos estatísticos (TABELA
02).
Um esquema fatorial para verificar a existência de interação entre as
concentrações de sal do meio (35, 30, 25, 20, 15, 10, 5 e 0 %o) e os dias de
cultivo (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8) da microalga Dunaliella viridis, considerando o
logaritmo decimal do número de 104 células por ml foi utilizado.
O experimento foi conduzido segundo o delineamento inteiramente
casualizado, e a análise de variância, para o esquema fatorial 8 x 9 com 72
tratamentos (8 concentrações de sal do meio e 9 dias de cultivo) com 3
repetições, foi aplicada de acordo com SAMPAIO (1998), para um nível de
significância (a) de 5%.
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Proteica da Microalga... 11

No caso de rejeição da hipótese de nulidade (Ho), a diferença minima

significativa (DMS) foi calculada e as médias comparadas peio teste de Tukey,
para a = 0.

TABELA 02. Dados dos valores transformados da curva de crescimento de D.

viridis em diferentes salinidades

Dias de
Salinidade (%0)
Cultivo
35 30 25 20 15 10 5
5,30 5,30 5,30 5,30 5,30 5,30 5,30 5,30
1 5,94 5,99 5,77 5,69 5,95 5,93 5,69 5,64
2 6,00 6,06 6,03 6,02 6,05 6,01 6,27 5,95
3 6,34 6,36 6,44 6,44 6,54 6,50 6,71 6,30
4 6,38 6,46 6,48 6,49 6,68 6,60 6,75 6,32
5 6,54 6,58 6,68 6,69 6,74 6,68 6,80 6,37
6 6,57 6,60 6,77 6,77 6,83 6,78 6,83 6,42
7 6,64 6,68 6,76 6,79 6,86 6,83 6,86 6,48
8 6,77 6,78 6,70 6,78 6,83 6,77 6,84 6,37
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 12

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1. Curvas de crescimento

A curva de crescimento de um cultivo pode ter forma variada, em função

da espécie cultivada. Num cultivo do tipo estacionário, como o que foi
realizado neste trabalho, o crescimento apresenta cinco fases distintas.

Fase de indução ou Fase Lag: Corresponde a fase jovem fisiológica que

caracteriza o inicio do crescimento, em que ha divisão celular e as microalgas
se encontram em adaptação ao meio, permanecendo com um número
constante de células. Ocorre logo após a repicagem, não existe um incremento
liquido na população devido à adaptação das células algais as novas
condições de cultivo. Em alguns casos pode ocorrer a morte de uma parcela da
população.

. Fase de crescimento exponencial ou Fase Log: É a parte crescente da

curva. Nesta fase as microalgas após adaptação iniciam as divisões celulares.
O número de microalgas aumenta em progressão geométrica. Para o uso em
alimentação, extração de proteínas e outros, usam-se as amostras oriundas
desta fase, por serem compostas de células jovens.

Fase de redução de crescimento: Esta fase corresponde à parte crescente e

suave do gráfico. Ela se traduz pela redução da velocidade de crescimento e
pela diminuição do angulo da curva. Isto é conseqüência tanto da escassez de
alguns nutrientes que tornam o meio desfavorável ao desenvolvimento, como
do aumento da concentração de metabólitos e redução da atividade
fotossintética por incremento da densidade populacional, a qual diminui a
disponibilidade de luz por unidade de célula causando auto-sombreamento.

Fase estacionária: Esta fase corresponde a uma reta constante da curva de

crescimento. A taxa de crescimento esta compensada pela taxa de mortalidade
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 13

Fase estacionária: Esta fase corresponde a uma reta constante da curva de

crescimento. A taxa de crescimento está compensada pela taxa de mortalidade
celular, esta fase traduz um esgotamento dos nutrientes do meio, o número de
células permanece estável.

Fase de morte da cultura: É a parte decrescente da curve. É o resultado da

depleção dos nutrientes, as condições nutricionais do meio tornam-se tão
desfavoráveis que a morte e a lise das células predominam sobre o
crescimento o que facilita a rápida contaminação.

3.1.1 Meio com salinidade de 35%0

A salinidade de 35%o é do meio natural da microalga D. viridis. Na figura

05, o gráfico de crescimento mostrou que as células iniciaram as divisões
celulares desde o primeiro dia de cultivo, chegando à fase de máximo
crescimento exponencial no sétimo dia de cultivo com concentração de 375,33
x 104 (6,57 valor transformado), a partir deste dia houve uma redução da
velocidade de crescimento das células, elas continuaram crescendo até o nono
dia atingindo uma concentração de 595 x 104 cél./m1 (6,77 valor transformado).

3.1.2 Meio com salinidade de 30%0

Nesta salinidade o gráfico de crescimento não apresentou fase de

indução, a curva iniciou-se com crescimento brusco ou fase de crescimento
exponencial, que atingiu um máximo no sexto dia de cultivo com concentração
de 401 x 104 céll ml (6,58), a partir do sexto dia houve uma redução na
velocidade de crescimento ainda assim as células continuaram crescendo até
uma concentração de 603,33 x 104 céll ml (6,78) no Ultimo dia de cultivo.

3.1.3 Meio com salinidade 25%0

PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 14

A curva mostrada na figura apresentou um crescimento exponencial a

partir do primeiro dia de cultivo, atingindo o máximo desta fase no sexto dia
com concentração de 476 x 104 céllml (6,68). No sétimo dia as células
atingiram crescimento máximo de 590,33 x 104 cél./m1 (6,77), em seguida
iniciou-se a fase de morte do cultivo com diminuição do número de células, o
que mostra um declínio da curva de crescimento.

3.1.4 Meio com salinidade 20%0

A partir do segundo dia iniciou-se a fase de crescimento exponencial

atingindo o máximo desta fase no sexto dia de crescimento com densidade de
489,66 x 104 cél./m1 (6,69), as células continuaram crescendo, mas com uma
velocidade menor, caracterizando a fase de redução de crescimento, atingindo
no oitavo dia concentração máxima de cultivo de 619,33 x 104 céliml (6,79) em
seguida iniciou-se a fase de morte da cultura com redução do número de
células no cultivo.

3.1.5 Maio com salinidade 15%0

Nesta salinidade, logo no primeiro dia ás células iniciaram as divisões

celulares. A fase exponencial de crescimento atingiu seu máximo no sétimo dia
com concentração de 669,66 x 104 c61./m1(6,83), após este dia iniciou-se a fase
de redução do crescimento, as células continuaram crescendo até atingir a
concentração máxima de cultivo igual a 733 x 104 céllml (6,86). A partir do
oitavo dia caracterizou-se a fase de morte da cultura.

3.1.6 Maio com salinidade 10 %

Nesta salinidade, do primeiro para o segundo dia ocorreu um rápido

crescimento celular, caracterizando a fase de crescimento exponencial que
atingiu o seu máximo no sétimo dia de cultivo com concentração de 597,66 x
104 cél./m1 (6,78). 0 número máximo de células atingido no cultivo foi de 683 x
104 cél./ ml (6,83) no nono dia, a partir deste dia iniciou-se a fase de redução
do número de células, caracterizada pelo declínio da curva.
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 15

3,1.7 Melo corn salinidade de 5 %o

Na figura 5 o gráfico de crescimento celular nesta salinidade também

não apresentou fase de indução do crescimento, pois a partir do primeiro dia de
cultivo as células apresentaram rápido crescimento celular, caracterizando a
fase de crescimento exponencial da cultura, atingindo o seu ponto máximo no
quarto dia de cultivo com concentração celular de 514 x 104 céll ml (6,71), a
partir do terceiro dia as células continuaram crescendo com uma velocidade
menor atingindo uma concentração de 732 x 104 céll ml (6,86) no oitavo dia,
em seguida iniciou-se um rápido decréscimo no número de células, o que
caracterizou a fase de morte de cultura( FIGURA 7 e FIGURA 9).

31.8 Meio com salinidade de 0 %o

A curva de crescimento nesta condição (água doce), mostrou um

aumento discreto no número de células do primeiro ao segundo dia, o que
pode ter sido em decorrência de uma contaminação por protozoários. A partir
do segundo dia iniciou-se a fase de crescimento exponencial que atingiu o
máximo no quarto dia de cultivo com concentração de 199,33 x 104 céll ml
(6,30), em seguida as células continuaram crescendo com uma velocidade
menor atingindo uma concentração de 303,66 x 104 cél. / ml (6,48) no oitavo
dia de cultivo, em seguida as células iniciaram a fase de redução do
crescimento.
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 16

6,8

6,6

5,4

5,2
-4— 0 —E— 5 —-10 —X— 15 —20 —6— 25 -+ 30 35

o 1 2 3 4 5 6 7 8
Dias de cultivo

FIGURA 05. Curve de crescimento de D.viridis em todas as salinidades

testadas.
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 17

Logarftmo decimaldo número de cél./mL

o 1
, 2 3 4 5 6 7 8
Dias de cultivo

FIGURA 06. Curvas de crescimento de D.vindis nas principais salinidades.

Neste cultivo as células de Dunaliella viridis apresentaram comportamentos

diferentes de uma salinidade para outra. Nas salinidades de 15 %o e 5 Too as
células atingiram um máximo de 732 x 104 céll ml que correspondeu as mais
altas taxas de densidade do experimento.
Nenhuma fase estacionaria foi observada durante o experimento.
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composigão Proteica da Microalga... 18

3.2 Analise de proteína

A quantidade de matéria seca obtida após centrifugação e liofilização

das culturas e o teor de proteína encontrado em meio com ague salgada e com
água doce podem ser encontrados na tabela 03.

TABELA 3. Produção de biomassa e teor protéico de D. viridis, no meio

Conway, em 35 e 0 %o.

Salinidade %o 35 %o (agua do mar) 0%0 (agua doce)

Produção em WI 1,29 0, 98
Teor protéico (%) 19,03 27,90

A produção em peso seco na salinidade de 35%0, foi superior

encontrada por SEBASTIEN (op. cit.) 1,20 g/I com a espécie Dunaliella saline
usando o meio Erd Schereiber e inferior em relação ao teor protéico de
28,91%.
Segundo BEM-AMOTZ et. al. (op. cit., 1982) o teor protéico da microalga
D. salina encontra-se em torno de 30 a 40 % do peso seco na salinidae
oceânica. Comparando estes valores para a espécie D. viridis que foi de
19,03% em 35 %o, nota-se que ela apresentou conteúdo protéico menor.
0 valor referente ao conteúdo protéico da D. viridis em relação a D.
saline deve-se a diversos fatores como, o meio de cultura utilizado. Entre os
distintos componentes do meio de cultura, a fonte e ou concentração de
nitrogênio podem afetar o crescimento e a composição bioquímica das
microalgas em cultivo (UTTING, 1985).
Na salinidade de 0 %o (água doce), a produção em peso seco foi menor
do que na salinidade de 35 °I00, em compensação o teor protéico foi mais alto na
agua doce.
Na composição bioquímica de uma espécie de microalga, os
aminoácidos, o grau de insaturação dos ácidos graxos e o conteúdo em
vitaminas, dependem das condições de cultivo e do momento do ciclo de
crescimento em que se coleta a biomassa (BECKER, 1994).
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 19

A determinação do teor de proteína deve ser feita na fase de

crescimento exponencial onde a maioria das células são jovens. Este valor
varia em função da idade das células, da intensidade luminosa e da densidade
celular (RICHMOND, op. cit.).
A salinidade pode não ter sido o fator que influenciou no teor de proteína
e sim o período em que foi retirada a amostra para a análise, no caso da água
doce a amostra foi retirada no período de crescimento exponencial da cultura e
a quantidade de proteína foi maior do que em água salgada.
0 teor protéico encontrado nas algas cultivadas em água doce (27,90%)
está próximo ao o encontrado por SEBASTIEN (op. cit. 1999) para a D. salina
cultivada com o meio Erd Schereiber em salinidade de 35 %o que foi de
28,91%.

3.3 Controle de protozoários ciliados

Em cultivo de microalgas é comum â contaminação por protozoários

ciliados. A presença destes cilióforas no cultivo prejudica o crescimento das
células alterando a produção final devido ao fato destes organismos utilizarem
as microalgas como alimento.
Neste trabalho ocorreram algumas contaminações na salinidade de 0%0
(água doce), na fase de adaptação, mesmo utilizando sulfato de cobre foi muito
difícil eliminar os protozoários nesta fase. O cultivo em massa de D. viridis em
água doce também foi contaminado, mas ao contrário da fase de adaptação
este foi rapidamente controlado com a aplicação do sulfato de cobre.

3.4 Análise Estatística

0 resultado da análise de variância e da interação entre a concentração
de sal do meio e os dias de cultivo, podem ser vistos nas tabela 04 e 05.

TABELA 04. Resultado da análise de variância do crescimento de D. viridis em

diferentes salinidades (ANOVA).

Fonte de GL RO QM Fcalculado Ftabelado

variação
Total 216 53,303
Tratamento 71 50,922 0,717 43,376 1,388
Erro 144 2,381 0,0165
 PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Proteica da Microalga... 20

• C.V = I0,0l65 = 0,128 = 2,03%

1363,44 6,312

• DMS = 1,96 ii2x 0 0165 = 0,205

3
TABELA 05. Interação entre a concentração de sal do meio (Too) e os dias de
cultivo.

Logaritmo decimal de cel. /mix 104

Dias de cultivo
Sa I. (Too) 1 2 3 4 5 6 7 8
35 5,3081 5,941/1 6,00b2 6,34°2 6,38°2 6,54°2 6,57d2 6,64d2 6,77d1
30 5,30a1 5,99b1 6,061'2 6,36°2 6,46°2 6,58d2 6,60d2 6,68d1 6,78d1
25 5,3081 5,77b2 6,03°2 6,44d2 6,48d2 6,68e1 6,77e1 6,76e1 6,70e1
20 5,30a1 5,69b2 6,02°2 6,44d2 6,49d2 6,690 6,770 6,79e1 6,78e1
15 5,30° 5,95b1 6,05132 6,54°1 6,68°1 6,74°1 6,83d1 67 86d1 6,83d1
10 5,3081 5,93b1 6,01b1 6,50°2 6,60°1 6,68d1 6,78d1 6,83d1 6,77d1
5 5,30a1 69b2
5, 6,27°1 6,71d1 6,75d1 6,8061 6,83d1 6,86d1 6,84d1
0 5,3081 5,64b2 5,95°3 6,30d2 6,32d2 6,37d3 6,42d3 6,48d2 6,37d2
*Letras iguais nas linhas e números iguais nas colunas significam igualdade.

De acordo com as análises estatísticas, para as salinidades de 35, 15,

10 %0 o melhor dia para a retirada de ináculo foi o sétimo dia.
Nas salinidades de 30, 25 e 20 Too, o melhor dia para a retirada do
inóculo foi o sexto dia de cultivo e nas salinidades de 5 e O Too foi o quarto dia
de cultivo.
A salinidade de 5 %o, foi a salinidade que obteve o maior número de
células em quase todos os dias de cultivo, podendo ser usada já a partir do
quarto dia de cultivo.
 PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 21

FIGURA 7. Microalga D. viridis na objetiva de 40 x cultivada em salinidade de

5%0.

FIGURA 8. Célula de D. viridis em divisão celular, cultivada em salinidade de

5%0.
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da Microalga... 22

FIGURA 9. Células de D. viridis na objetiva de 100 x, em salinidade de 5 %o.

FIGURA 10. Vista ampliada de células de D. viridis, na objetiva de 100 x em

salinidade de 5%0.
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Protéica da IVIicroalga... 23

4. CONCLUSÕES

A microalga Dunaliella viridis demonstrou que pode tolerar e se

desenvolver em baixas salinidades.
Dentre as salinidades testadas a que apresentou melhor desempenho foi
a de 5 %o, que obteve uma maior número de células em quase todos os dias de
cultivo, podendo ser utilizada a partir do quarto dia de cultivo.
A análise de proteína demonstrou que houve diferença nas quantidades
de proteína encontrada no cultivo com água salgada e em água doce, onde
apresentaram respectivamente 19,03 e 27,90 % de proteína, o que foi sido em
decorrência do período do cultivo em que foi retirada a amostra.
0 teor protéico encontrado na microalga D. viridis cultivada em água
doce demonstra que é possível a aplicação desta microalga adaptada em
cultivos larvais de crustáceos.
Estudos mais aprofundados sobre a composição química e aplicação
desta microalga adaptada são necessários.
PINHEIRO, A. C. A. S. Cultivo, Adaptação e Composição Proteica da Microalga... 24

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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